CN105560258A - 罗汉果皂甙提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了罗汉果皂甙提取物一种新用途，具体涉及罗汉果皂甙提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。本发明研究表明，罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制，且对α-葡萄糖苷酶内源性荧光产生强烈的静态猝灭作用。提示罗汉果皂甙提取物可在制备治疗及辅助治疗Ⅱ型糖尿病的食品、保健食品及药品中应用。

Description

罗汉果皂甙提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及罗汉果皂甙提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

背景技术

糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种综合病症。主要是由于体内胰岛素相对或绝对不足所引起的糖代谢紊乱所致。糖尿病患者在长期高血糖的状态下可产生多种并发症。现今所报道的各种降糖物质的机制有所差异，常为多靶点、多效应、多途径的综合作用，其中通过抑制a-葡萄糖苷酶的活性，延缓总体碳水化合物的消化时间，降低餐后高血糖，防治糖尿病并减少糖尿病并发症，被认为是控制Ⅱ型糖尿病的理想途径。临床上应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物主要为：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。由于阿卡波糖等均为合成药物，口服时会出现恶心、呕吐等胃肠道不良反应。因此，越来越多的学者开始青睐于从药用植物中筛选天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂，以期待寻找到安全并有效的药物。

罗汉果(Siraitiagrosvenorii(swingle)C.Jeffrey)为广西特色中药，研究表明，强甜味的非糖物质三帖类成分罗汉果皂甙是其主要的有效成分，具有多种生物活性。目前关于罗汉果皂甙降血糖方面，有研究表明罗汉果皂甙粗提物在高血糖环境中能有效地保护血管的内皮细胞，增强血管自身的舒张因子功能。周英等发现罗汉果提取物对于在体外培养的胰岛β细胞具有刺激其胰岛素分泌的作用。Suzuk等认为罗汉果提取物有抑制麦芽糖酶的活性，从而能抑制大鼠进食麦芽糖后的血糖生成。何伟平等研究发现罗汉果皂甙能降低血清中游离脂肪酸，并减轻糖尿病发展过程中的氧化应激，减轻血管内皮损伤。张丽勤等研究表明罗汉果皂甙粗提物对于糖尿病小鼠具有降血糖，降血脂，调节免疫及抗氧化功能。而有关罗汉果粗提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的相关研究尚未见有关报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗汉果皂甙提取物的新应用，具体为罗汉果皂甙在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

本发明通过下述技术方案实现技术目标：

罗汉果皂甙提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

其中所述的罗汉果皂甙提取物的药物和保健品的剂型是胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液中任意一种。

所述的罗汉果皂甙提取物用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂由下列方法制备：

(1)挑选果龄为40～50d的罗汉果鲜果，清洗去毛后，真空冷冻干燥，粉碎机粉碎，过20～100目筛，备用；

(2)取粉碎后的罗汉果粉末，按照1:30～60(w/v)的料液比，加入60～80％的乙醇，70～80℃的水浴锅中加热回流提取1～3h，过滤，得滤液，滤渣重复提取1～3h，过滤，合并前后两次滤液，3000～5000r/min离心20～40min，得上清液，真空浓缩干燥后备用；

(3)取一玻璃层析柱，大孔吸附树脂湿法装柱，将上述提取物用水溶解后上柱，流速为1～2mL/min，上样结束后，用纯水冲洗柱子至流出液无色，然后用3～5倍柱体积60～70％乙醇溶液进行洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，旋转蒸发浓缩，得浓缩液；

(4)取一玻璃层析柱，离子交换树脂湿法装柱，取得到的上述浓缩液上样，流速为1～2mL/min，吸附完成后，用纯水以5～7mL/min的流速洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，经旋转蒸发浓缩和真空干燥，得到罗汉果皂甙粗提物粉末，所述的罗汉果皂甙粗提物粉末中罗汉果皂甙V含量为30～35％、罗汉果皂甙IV含量为10～14％和罗汉果皂甙III的含量为10～14％。

本发明的有益效果：

本发明研究表明，罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制，且对α-葡萄糖苷酶内源性荧光产生强烈的静态猝灭作用。提示罗汉果皂甙提取物可在制备治疗及辅助治疗Ⅱ型糖尿病的食品、保健食品及药品中应用。

附图说明

图1为本发明的罗汉果皂甙V的标准曲线图；

图2为本发明的罗汉果皂甙IV的标准曲线图；

图3为本发明的罗汉果皂甙III的标准曲线图；

图4为本发明的阿卡波糖(a)及罗汉果皂甙粗提物(b)对α-葡萄糖苷酶的抑制效果图；

图5为本发明的罗汉果皂甙粗提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线；

图6为本发明的罗汉果粗提取物在310K下对α-葡萄糖苷酶荧光的猝灭作用(c)和在298K、303K、310K下与α-葡萄糖苷酶作用的荧光猝灭曲线(d)。

具体实施方式

为了更详细的说明本发明，给出下述实例，实例中所用的罗汉果皂甙提取物即为上述方法制备的罗汉果皂甙粗提物，罗汉果皂甙粗提物的有益效果可以说明罗汉果皂甙提取物的有益效果，但本发明的范围并不局限于此实施例。

实施例：罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制

1.1试剂及主要仪器

4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(CAS：3767-28-0)、α-葡萄糖苷酶(CAS：9001-42-7)均购于美国sigma公司；阿卡波糖购于德国拜耳公司；其它试剂均为国产分析纯。美国Bio-tekSynergyTMHT超级多功能酶标仪，美国Biotek公司；瑞士TecanInfinite200PRONanoQuant酶标仪，瑞士Tecan集团公司。

1.2实验方法

1.2.1罗汉果皂甙提取物的制备

(1)挑选果龄为40～50d的罗汉果鲜果，清洗去毛后，真空冷冻干燥，粉碎机粉碎，过40目筛，备用。

(2)取粉碎后的罗汉果粉末，按照1:40(w/v)的料液比，加入70％的乙醇，80℃的水浴锅中加热回流提取2h，过滤，得滤液，滤渣重复提取2h，过滤，合并前后两次滤液，4500r/min离心30min，得上清液，真空浓缩干燥后备用。

(3)取一玻璃层析柱，LXA-8大孔吸附树脂湿法装柱，将上述提取物用水溶解后上柱，流速为2mL/min。上样结束后，用纯水冲洗柱子至流出液无色，然后用三倍柱体积60％乙醇溶液进行洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，旋转蒸发浓缩，得浓缩液。

(4)取一玻璃层析柱，700B离子交换树脂湿法装柱。取得到的浓缩液上样，流速为2mL/min。吸附完成后，用纯水以5mL/min的流速洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，经旋转蒸发浓缩和真空干燥，可得罗汉果皂甙粗提物粉末，总皂甙的含量在75％以上。

1.2.2制作标准曲线

用10％的乙腈做溶剂，准确称取一定量的罗汉果皂甙粗提取物，配制成浓度为1mg/mL的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，待测。

(1)高效液相色谱条件为：色谱柱，WatersODSC₁₈(4.6mm×150mmI.D.5μm)；流速：0.8mL/min；检测波长：203nm；进样量：10μL；流动相：0.1％(v/v)磷酸水(A)和乙腈(B)梯度洗脱，0min：10％B；10min，17％B；20min，17％B；30min，20％B；40min，20％B；50min，23％B；60min，23％B；70min，26％B；80min，26％B。

(2)标准曲线的制作：用10％的乙腈作溶剂，分别配制浓度为0mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的罗汉果皂甙V、罗汉果皂甙IV和罗汉果皂甙III的标准溶液，按上述液相色谱条件，以高效液相色谱峰面积-含量分别作罗汉果皂甙V、罗汉果皂甙IV和罗汉果皂甙III的标准曲线，得到三种标准品的标准曲线方程。

1.2.3罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的分析

反应体系以4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物建立筛选模型。在96孔板上加入α-葡萄糖苷酶(0.32U/mL，10μL)、不同浓度罗汉果提皂甙提取物样品溶液(10μL)与pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液(50μL)于37℃中孵育10min，再加入4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(10μL，2.5mM)，放入37℃恒温TecanInfinite200PRONanoQuant酶标仪中反应15min，以NaOH(20μL0.2M/mL)溶液终止整个反应体系，在405nm波长下测其吸光度。同时做样品、空白、本底对照，每组设3个平行。IC₅₀为酶活性被抑制50％时的抑制剂浓度。实验选用阿卡波糖为阳性对照。按下列公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率：

式中，A_B-对照组吸光值；A_S-样品组吸光值；A₀-本底组吸光值。

1.2.4酶促动力学研究

在α-葡萄糖苷酶浓度(0.32U/mL)不变的情况下，选用不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mM)4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，添加或不添加罗汉果皂甙提取物的条件下，测定α-葡萄糖苷酶酶促反应速率(V)，对罗汉果皂甙提取物进行抑制类型的判定，以PNPG底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，作Lineweaver-Burk双倒数图。按公式(2)计算最大反应速度V_max和米氏常数K_m。

$V=\frac{V_{\max }\[S\]}{K_m+\[S\]}---\left(2\right)$

1.2.5罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭作用

以287nm为激发波长，335.6nm为发射波长，记录在光程10mm、波长为250～550nm范围内α-葡萄糖苷酶(0.5U/mL)与不同浓度罗汉果皂甙提取物(0-16mg/mL)混合反应15min后体系的荧光发射光谱强度，激发和发射波长之间的狭缝宽度为5nm。以相应浓度的罗汉果皂甙提取物溶液为本底组，以α-葡萄糖苷酶(0.5U/mL)为对照组。测量三个不同温度下不同浓度罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响。

1.3实验结果

1.3.1罗汉果皂甙粗提取物中成分分析

由高效液相色谱法获得三种罗汉果皂甙的标准曲线，如图1、图2和图3。由图1知罗汉果皂甙V的标准曲线的线性方程为y＝271285x-38885，由图2知罗汉果皂甙IV的标准曲线的线性方程为y＝249809x-25082，由图3知罗汉果皂甙III的标准曲线的线性方程为y＝256655x-35219，其中y为高效液相色谱的峰面积，x为皂甙含量，三种罗汉果皂甙标准曲线的线性相关系数R²均大于0.998，表明线性关系良好。根据标准曲线最终分别得到罗汉果皂甙粗提取物中罗汉果皂甙V含量为30～35％、罗汉果皂甙IV含量为10～14％和罗汉果皂甙III的含量为10～14％，以上三种罗汉果皂甙为罗汉果皂甙粗提取物中的主要有效成分。

1.3.2罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由图4可知，在一定的实验浓度范围内，阿卡波糖和罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，且其抑制效果与质量浓度间呈现良好的剂量效应关系，其IC₅₀值分别为212.451μg/mL、9.125mg/mL，表明罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制效果。

1.3.3罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制的动力学分析

先固定α-葡萄糖苷酶浓度(0.32U/mL)，以确定罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。在不添加或添加不同浓度的罗汉果皂甙提取物的条件下，改变底物的浓度(0.5～3.5mM)，测定了不同底物浓度下反应体系的反应速度，作A-t图，得到不同底物浓度下的反应速率，再以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作图，得到α-葡萄糖苷酶在有无罗汉果皂甙提取物存在时的Lineweaver-Burk双倒数图(见图5)，由图5可计算出不同浓度的罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶抑制的米氏常数(见表1)。

采用Lineweaver-Burk双倒数作图，当获得一组斜率不同并且相交于Y轴的直线，其最大反应速度(V_max)不变，米氏常数值(K_m)增大时，为竞争性抑制；当获得一组斜率不同并且相交于X轴的直线，最大反应速度V_max减小，米氏常数值K_m不变，则为非竞争性抑制；当获得一组斜率不同，相交于第二或第三象限的直线，最大反应速度V_max减小，米氏常数值K_m增大或减小，则为混合型抑制；如果获得一组平行的直线，最大反应速度V_max和米氏常数值K_m均减小，则为反竞争性抑制。由图5和表2可知，罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，随着罗汉果皂甙提取物浓度的增大，最大反应速度(V_max)减小，米氏常数(K_m)值增大，因此推断它对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为混合型抑制。

表1罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线方程

1.3.4罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭作用

蛋白质的内源荧光主要是由色氨酸和酪氨酸产生。图6为罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的内源荧光猝灭光谱。在激发波长为287nm时，α-葡萄糖苷酶的荧光峰位于335.6nm。由荧光光谱扫描图可知小分子物质在α-葡萄糖苷酶荧光峰附近有荧光发射峰。随着罗汉果皂甙提取物浓度的增加，α-葡萄糖苷酶的荧光发射峰强度有规律地降低，并且罗汉果皂甙提取物使α-葡萄糖苷酶的最大发射波长红移，说明罗汉果皂甙提取物与α-葡萄糖苷酶之间发生了相互作用。

1.3.5荧光猝灭机制

荧光猝灭机制主要有动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移三种：动态猝灭是由蛋白质激发态分子和药物由于热运动发生碰撞引起的，其作用过程符合Stern-Volmer方程。

$\frac{F_0}{F}=1+K_{SV}\[Q\]=1+K_q{z}_0\[Q\]---\left(3\right)$

其中F₀，F分别表示α-葡萄糖苷酶与罗汉果皂甙提取物反应前后的荧光强度；[Q]为罗汉果皂甙提取物的浓度；τ₀为猝灭剂不存在时荧光物质的平均寿命；对于生物大分子τ₀≈10^-8s；K_SV为动态猝灭常数，随温度的升高而升高，静态猝灭常数与此相反；由图6中F₀/F～[Q]可计算出罗汉果皂甙提取物与α-葡萄糖苷酶作用的动态猝灭常数和相关系数，结果见表2。

表2罗汉果皂甙提取物与α-葡萄糖苷酶作用的动态猝灭常数K_sv和相关系数

实验结果表明：罗汉果皂甙提取物表现出抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，其IC₅₀值为9.125mg/mL，但效果低于阿卡波糖。此外动力学及荧光光谱法分析表明，罗汉果皂甙提取物与α-葡萄糖苷酶的作用是通过静态荧光猝灭进行的，其抑制作用为混合型抑制。

Claims (3)

1.罗汉果皂甙提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的罗汉果皂甙提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述的罗汉果皂甙提取物是由下列方法制备的：

(1)挑选果龄为40～50d的罗汉果鲜果，清洗去毛后，真空冷冻干燥，粉碎机粉碎，过20～100目筛，备用；

(2)取粉碎后的罗汉果粉末，按照1:30～60(w/v)的料液比，加入60～80％的乙醇，70～80℃的水浴锅中加热回流提取1～3h，过滤，得滤液，滤渣重复提取1～3h，过滤，合并前后两次滤液，3000～5000r/min离心20～40min，得上清液，真空浓缩干燥后备用；

(3)取一玻璃层析柱，大孔吸附树脂湿法装柱，将上述提取物用水溶解后上柱，流速为1～2mL/min，上样结束后，用纯水冲洗柱子至流出液无色，然后用3～5倍柱体积60～70％乙醇溶液进行洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，旋转蒸发浓缩，得浓缩液；

(4)取一玻璃层析柱，离子交换树脂湿法装柱，取得到的上述浓缩液上样，流速为1～2mL/min，吸附完成后，用纯水以5～7mL/min的流速洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，经旋转蒸发浓缩和真空干燥，得到罗汉果皂甙粗提物粉末，所述的罗汉果皂甙粗提物粉末中罗汉果皂甙V含量为30-35％、罗汉果皂甙IV含量为10-14％和罗汉果皂甙III的含量为10-14％。

3.根据权利要求1所述的罗汉果皂甙提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述的罗汉果皂甙提取物的剂型是胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液中任意一种。