CN1767864A - 弹性蛋白成型体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

通过使用平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成的纤维结构体作为支撑衬底，制成柔软且具有生物体吸收性能，并且具有在实际应用中可以进行缝合的撕裂强度的弹性蛋白成型体。该弹性蛋白成型体具有能被生物体吸收的性能，可以作为具有能承受手术时等的缝合的撕裂强度和柔软性的体内移植用管或人造血管用原材料使用。

Description

弹性蛋白成型体及其制备方法

技术领域

本发明涉及以由平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成的纤维结构体作为支撑衬底，通过该支撑衬底增强的弹性蛋白成型体。

现有技术

近年来，作为大损伤或缺失的生物体组织和脏器的治疗方法之一，正在广泛开展利用细胞的分化和生长能力，重新构建原来的生物体组织和脏器的技术的再生医疗研究。神经再生也是研究的内容之一，目前正广泛进行在神经组织被切断的患者的神经缺失部位用人造材料构成的管对断开的端头间进行桥连，来诱导神经组织的研究。作为管，可以使用硅、聚氨酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯，其共聚物或复合物组成的，并在其内面涂敷胶原或层粘连蛋白的管。

此外在血管再生中，作为人造材料管，可以使用聚氨酯、聚四氟乙烯、聚酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯，其共聚物或复合物组成的，并在其内面涂敷明胶、白蛋白、胶原、层粘连蛋白的管。

特开平8-33661号公报中，介绍了在由合成树脂构成的人造血管衬底的内腔面涂敷明胶或胶原之后，用交联剂进行固定之外，或直接使水溶性弹性蛋白凝聚，并通过交联剂进行固定的人造血管。

特开平9-173361号公报中，介绍了在由合成树脂构成的人造血管衬底的内腔面涂敷白蛋白，经加热或加热后再用交联剂进行交联构建的白蛋白层上使水溶性弹性蛋白凝聚，并通过交联剂进行固定的人造血管。但是前述的硅、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚酯不具备被生物体吸收的性能，所以在长期安全性方面存在问题，还存在有压迫或阻碍再生的神经或血管的问题。另外，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯的共聚物或复合物，虽然具有被生物体吸收的性能，但是在压缩强度方面存在问题，也存在着压迫再生的神经或血管的问题。附带说明，向体内移植的管或人造血管所需要的杨氏模量为1×10⁴～2×10⁶Pa。

对于前面叙述的材料，宫本等人在国际公开第02/096978号公报中报导了具有被生物体吸收的性能，并且压缩强度优异，还可以通过与细胞生长因子进行杂交而使其具有逐渐释放细胞生长因子功能的弹性蛋白交联体。但是，这种弹性蛋白交联体在撕裂强度方面存在问题，所以在手术时，很难进行缝合，存在着其在生物体内的应用受到限制的问题。

在手术中进行缝合时，理想的撕裂强度为0.3MPa或其以上。

发明公开

本发明的主要目的在于提供成为具有被生物体吸收的性能，具有能够承受手术时等缝合的撕裂强度和柔软性的体内移植用管或人造血管用原材料的弹性蛋白成型体。

本发明的另一个目的在于提供制备本发明上述成型体的方法。

通过以下说明，本发明的其它目的和优点将更加明确。

如果按照本发明，本发明的上述目的和优点，第1是通过平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成纤维结构体的支撑衬底，和弹性蛋白交联体构成的弹性蛋白成型体而实现的。

如果按照本发明，本发明的上述目的和优点，第2是通过弹性蛋白成型体的制备方法而实现的，该制备方法的特征是使平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成的纤维结构体，浸渍水溶性弹性蛋白和1种或1种以上的交联剂，并使其进行交联反应，形成弹性蛋白交联体。

如上所述，如果按照本发明，通过使用平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成的纤维结构体作为支撑衬底，可以提供柔软的、具有被生物体吸收的性能，并且具有可以进行实际缝合的撕裂强度的弹性蛋白成型体。

附图的简单说明

图1是在实施例中，使纺丝液喷出到静电场中的静电纺丝法中所使用的装置的简略图。

图2是在实施例中，在静电纺丝法中所使用的另一装置的简略图。

发明的优选方案

以下对本发明进行详细叙述。其中这些实施例等和说明，仅仅表示本发明的示例，并不限定本发明的范围，只要和本发明的宗旨一致，其它实施方案当然也属于本发明的范畴。

作为本发明所使用的纤维结构体，可以列举由单独或多数纤维经集聚而形成的，具有形状保持性的结构体。纤维可以是如表面平滑纤维、多孔纤维或中空纤维。作为结构体的形态，可以列举纤维经例如叠层或集积法集聚而成的无纺布、网布、管等。作为结构体优选如管的三维结构体。

形成该纤维结构体的高分子化合物是脂肪族聚酯。

作为脂肪族聚酯，可以列举如聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚琥珀酸亚丁酯、聚琥珀酸亚乙酯以及它们的共聚物等等。其中优选聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物以及聚己内酯，其中特别优选聚乳酸和聚己内酯。

本发明中的纤维结构体，是由平均纤维直径为0.05～50μm的纤维形成的。如果低于0.05μm，则在生物体内的分解性增大，分解所需要的时间过短，是不理想的。如果平均纤维直径大于50μm，则成型为管等过程中的伸缩性低，具有妨碍表达弹性蛋白特有的弹性的倾向，所以是不理想的。更优选平均纤维直径为0.2～25μm，进一步优选平均纤维直径为0.2～20μm，特别优选平均纤维直径为0.3～10μm。其中纤维直径表示由外周限定的纤维截面的等效圆直径。

作为制备本发明纤维结构体的方法，例如可以列举静电纺丝法、纺粘法、熔喷法和闪蒸纺丝法等方法。其中优选静电纺丝法。静电纺丝法可以参照美国专利第1975504号说明书中公开的方法。

静电纺丝法例如可以按照下面所述的方法进行。把脂肪族聚酯溶解在挥发性溶剂中，形成溶液，使该溶液从喷嘴中喷出到电极之间形成的静电场中，喷出的溶液向电极方向抽丝，通过收集所形成的纤维状物质就可以得到。所谓纤维状物质，不仅是指已馏除溶液的溶剂而形成纤维结构体的状态，而且还表示仍含有溶液的溶剂的状态。本发明中所用的电极，无论是金属、无机物或有机物的任何一种，只要显示导电性即可。还可以是在绝缘物上具有显示导电性的金属、无机物或有机物的薄膜的。本发明中的静电场是在一对或多个电极之间形成的，可以对任一电极施加高压电。其中包括使用例如电压值不同的，如15kV和10kV，2个高电压电极和接地电极，总计为3个电极的情况，还包括使用超过3个电极的情况。

在静电纺丝中所用的脂肪族聚酯溶液中脂肪族聚酯的浓度优选为1～30重量％。如果脂肪族聚酯的浓度低于1重量％，则由于浓度太低，很难形成纤维结构体，是不理想的。另外如果超过30重量％，则所得纤维结构体的纤维直径太大，也是不理想的。更优选脂肪族聚酯的浓度为2～20重量％。

形成本发明静电纺丝中所用的脂肪族聚酯溶液的挥发性溶剂是溶解脂肪族聚酯，优选在常压下的沸点为200℃或其以下、并且在27℃时为液体的物质。

作为具体的挥发性溶剂，可以列举如二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甲苯、四氢呋喃、1，1，1，3，3，3-六氟异丙醇、水、1，4-二噁烷、四氯化碳、环己烷、环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈等等。其中从脂肪族聚酯的溶解性等方面考虑，特别优选使用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮。

这些溶剂，可以单独使用，也可以组合多种溶剂使用。此外在本发明中，只要在无损于本发明的范围内，还可以配合其它溶剂使用。

把该溶液喷到静电场中时，可以采用任意的方法。例如以图1为一个实例进行如下说明。通过把脂肪族聚酯在挥发性溶剂中的溶液2供给喷嘴1，将溶液置于静电场中的适当位置，通过电场作用从该喷嘴对溶液进行抽丝而形成纤维。为了达到这一目的，可以采用适当的装置，例如在注射器的圆筒形的溶液贮槽3的顶端部，设置适当的装置，例如用高电压发生器6施加电压的注射针状溶液喷出喷嘴1，将溶液导入至该顶端部。将该喷出喷嘴1的顶端设置在距离接地的纤维状物质收集电极5的适当位置处，当溶液2从该喷出喷嘴1的顶端喷出时，在该顶端和纤维状物质收集电极5之间，挥发性溶剂挥发，形成纤维状物质。

也可以采用本领域已知的方法将该溶液的微细液滴导入到静电场中。以图2为一个实例进行以下说明。此时唯一的要件是把溶液置于静电场中，且将其保持在距纤维状物质捕集电极5一段可以引起纤维化的距离处。为了把溶液置于静电场中，例如，可以在具有喷嘴1的溶液贮槽3中的溶液2中直接插入与纤维状物质捕集电极相反的电极4。

当把该溶液由喷嘴供给至静电场中时，可以使用多个喷嘴以提高纤维状物质的生产速度。电极间的距离与带电量、喷嘴尺寸、纺丝液流量和纺丝液浓度等有依赖关系，当电压为10kV左右时，距离以5～20cm为宜。另外，所施加的静电电势例如为3～100kV，优选5～50kV，进一步优选5～30kV。可以采用任意的适当方法得到所需的电势。

上述说明是指电极兼为收集器的情况，但是也可以通过在电极间设置能成为收集器的物体，以把收集器和电极分开单独设置。通过选择收集器的形状，可以得到片状、管。还可以例如通过在电极间设置带状物质作为收集器，进行连续生产。

本发明中，在使该溶液向收集器抽丝的过程中，根据条件，溶剂蒸发而形成纤维状物质。如果是在一般的室温条件下，在被捕集到收集器上之前的过程中，溶剂完全蒸发，但是有时为了使溶剂充分蒸发，也可以在减压条件下进行抽丝。抽丝温度与溶剂的蒸发情况或纺丝液的粘度有依赖关系。例如为0～50℃。并且纤维状物质被集积到收集器上，而制备纤维结构体。

本发明中所得到的纤维结构体，可以单独使用，也可以根据操作性或其它要求事项，与其它构件配合使用。例如通过作为收集器使用能形成支撑衬底的无纺布、织造布、薄膜等，在其上面形成纤维结构体，由此可以制成支撑衬底和该纤维结构体组合的构件。

本发明中使用的水溶性弹性蛋白没有特别限定，但是通过对弹性蛋白进行水解而获得的。具体可以采用对动物的颈部韧带等进行热草酸处理得到的α-弹性蛋白或β-弹性蛋白，对弹性蛋白进行碱乙醇处理所得到的κ-弹性蛋白，通过弹性蛋白酶进行酶处理的水溶性弹性蛋白和弹性蛋白生物合成途径中的前体弹性蛋白原等中的至少1种或1种以上的弹性蛋白。对于弹性蛋白原没有特别限定，即使是来源于动物细胞的提取物，也可以使用通过基因重组法得到的弹性蛋白原基因产物的至少1种或以上。

本发明中的弹性蛋白交联体，可以用水溶性交联剂对至少1种水溶性弹性蛋白进行交联而获得。

水溶性弹性蛋白是总重量的约94％为疏水性氨基酸，约1％为侧链上含有氨基的氨基酸例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸形成的疏水性蛋白质。

本发明中所用的水溶性交联剂，只要是能够与水溶性弹性蛋白侧链上的氨基反应，进行交联反应的物质，则任何水溶性交联剂都可以。作为该水溶性交联剂，可以列举如戊二醛、亚乙基缩水甘油醚以及下述化学式所示的在分子中心区域具有疏水性部分，在两末端具有活性酯基的化合物等等。其中如果使用下述式(1)所示的化合物作为交联剂，则可以获得具有适合于生物体的弹性，并且成型性好的成型体，所以是理想的。

式中，R¹和R³各自独立地表示下述式(1)-1所示的结构；

式中，R⁴和R⁵各自独立地表示H、CH₃或C₂H₅，或下述式(1)-2所示的结构，

R₂为下述式(1)-3所示的结构，

式中，n为1～20，或下述式(1)-4所示的结构，

式中，m和1相互独立地表示0～15的整数，x和Y相互独立地表示CH₂或O的任意一个，Z为C或N的任意一个，R⁶、R⁷、R⁸和R⁹相互独立地表示H、CH₃、C₂H₅的任意一个。

分子中心区域具有疏水性部分的化合物，与含有大量疏水性氨基酸的弹性蛋白，通过疏水性相互作用，形成牢固而稳定的结构体。

但是含有大量疏水性部分的化合物，通常溶于有机溶剂，但难溶于水或不溶于水，不便于在水体系中操作。水溶性交联剂，例如可以通过使用4-羟基苯基二甲基-锍甲基硫酸盐(以下简称为DSP)对相应二羧酸化合物两末端进行活性酯化处理而制备。该水溶性交联剂，既具有与含大量疏水性氨基酸的弹性蛋白形成牢固而稳定的结构体的疏水性部分，并且还具有可以在水体系中使用的特征。

本发明中，水溶性交联剂，其化学结构式两末端的活性酯基与水溶性弹性蛋白的氨基酸形成肽键而交联。对交联反应条件，没有特别限定，在常压或高压釜等加压条件下，反应温度范围优选为4～150℃，特别是从交联操作性角度考虑，优选10～120℃。

本发明中，弹性蛋白交联体，除了水溶性弹性蛋白和交联剂之外，还可以含有其它的第3成分。

作为第3成分，可以列举胶原、明胶、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、酪蛋白、角蛋白、丝胶蛋白、凝血酶等蛋白质，和/或聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸等聚氨基酸，和/或聚半乳糖醛酸、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸化纤维素、藻酸、葡聚糖、羧甲基壳多糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯胶、黄蓍胶、茱萸烷(ジエラン)胶、硫酸茱萸烷、梧桐胶、鹿角菜胶、琼脂、黄原胶、カ一ドラン、プルラン、纤维素、淀粉、羧甲基纤维素、甲基纤维素、葡甘露聚糖、壳多糖酶、脱乙酰壳多糖、木糖型葡聚糖、蘑菇多糖等糖质，和/或FGF(纤维芽细胞生长因子)、EGF(上皮生长因子)、PDGF(血小板源生长因子)、IGF(胰岛素样生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、TGF-β(β型转化生长因子)、NGF(神经生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、BMP(骨形成因子)等细胞生长因子等。

其中，优选明胶、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸软骨素等细胞外基质成分或FGF(纤维芽细胞生长因子)、EGF(上皮生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、NGF(神经生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)等细胞生长因子，这是由于它们可以提高细胞的粘附和生长。

本发明中，水溶性弹性蛋白相对于弹性蛋白交联体的比率范围优选为0.5～99.5重量％，更优选1～95重量％，如果该比率在这一范围之内，则可以获得具有适合于生物体的弹性的成型性好的成型体。

本发明中，就制备用纤维结构体增强的弹性蛋白成型体的方法而言，并没有特别限定，可以列举使用一般用于合成树脂成型的成型用模具的方法。例如在成型用的模具中，预先放置纤维结构体，然后把水溶性弹性蛋白和水溶性交联剂混合，得到水溶性弹性蛋白水溶液，然后将该溶液引入到成型模具内，通过高压釜等进行加热交联，就可以得到与铸模相应的膜状、棒状、丸状、或管状等的弹性蛋白成型体。

本发明中，用水溶性交联剂交联得到的弹性蛋白交联体，具有在生物体内容易生物分解的特征。其生物分解速度，与弹性蛋白交联体的交联度有关系，所以可以通过改变交联条件，改变交联度来控制该生物分解速度。

本发明中的弹性蛋白交联体是弹性优异的交联体，为了使其容易与生物体相适应，优选其杨氏模量范围是1×10²～1×10⁷Pa，特别优选范围是1×10³～2×10⁶Pa。

如果按照本发明，则如上所述，通过使用由脂肪族聚酯形成、平均纤维直径为0.05～50μm的中空纤维或多孔纤维等各种纤维组成的纤维结构体作为支撑衬底，可以保持弹性蛋白所具有的弹性·柔软性，并且使弹性蛋白交联体具有能够进行缝合的撕裂强度。这种弹性蛋白成形体可以作为血管和神经再生中的人造材料使用。

实施例

以下通过实施例更具体说明本发明的详细情况。但是本发明并不受这些实施例的限定。

本发明中使用的聚乳酸(LACTY9031)是(株)岛津制作所制造的，弹性蛋白是ELASTIN PRODUCTS公司制造的，二氯甲烷(特级)、草酸(特级)、纤维素性透析管(分级(分画)分子量6,000～10,000)、十二烷二羧酸、4-羟基苯基二甲基-锍甲基硫酸盐、二环己基碳二亚胺、乙腈(特级)、三乙胺为和光纯药工业(株)的产品。

聚乳酸管的制备方法

把聚乳酸1g、二氯甲烷8g、在室温(25℃)下混合，制备纺丝原液。使用如图2所示的装置，把该纺丝原液喷出到每分钟旋转60次的纤维状物质捕集电极5(直径2mm，长度为200mm)上5分钟。喷出喷嘴1的内径为0.8mm，电压为12kV，从喷出喷嘴1到纤维状物质捕集电极5的距离是10cm，所得聚乳酸管的内径为2mm，长度为20mm，关于目付值，可以通过变化喷出时间来进行控制，制备目付值为20g/m²和40g/m²的两种样品。

水溶性弹性蛋白的制备方法

对于弹性蛋白(ELASTIN PRODUCTS公司制造)20g添加0.25M草酸150ml，用100℃处理1小时。冷却后进行离心分离(3,000rpm，30min)收集上层清液，加入到纤维素性透析管中，相对于去离子水进行48小时透析，除去草酸。然后进行冷冻干燥，得到水溶性弹性蛋白。

水溶性交联剂的制备方法

把十二烷二羧酸0.64g(2.5mmol)和4-羟基苯基二甲基-锍甲基硫酸盐1.33g(5mmol)于60℃下溶解于乙腈35ml中，放置冷却后，加入二环己基碳二亚胺1.03g(5mmol)，于25℃下搅拌5小时。然后用玻璃过滤器过滤除去反应中生成的二环己基脲。再把滤液滴入到乙醚70ml中，使其固化。对该固体物进行减压干燥，得到水溶性交联剂1.4g。通过¹H-NMR检测，所得交联剂的纯度为98％。

实施例1

在去离子水1ml中，加入水溶性弹性蛋白200mg，进行搅拌，得到20％水溶性弹性蛋白水溶液。使该水溶液的温度达到25℃，在该水溶液中加入水溶性交联剂72μmol(该水溶液中的弹性蛋白的氨基量(24μmol)的3倍量)，搅拌5分钟。接着加入三乙胺24μmol再搅拌5分钟，然后把该溶液倒入到设置有聚乳酸管(目付值为20g/m²)的直径为2.2mm、长度为30mm的圆筒状模板中，静止放置2天，使其凝胶，用去离子水进行充分洗涤，得到乳白色的富有弹性的圆筒状弹性蛋白成型体。在110℃下，对所得到的弹性蛋白成型体进行10分钟的高压灭菌处理，得到形状没有发生变化的消毒弹性蛋白成型体。所得弹性蛋白成型体的杨氏模量为1×10⁵Pa。

对于所得的成型体，以DIN53507、53504作参考，使用テンシロン装置(INSTRON)进行撕裂强度测定。把结果出示在表1中。

实施例2

使聚乳酸管的目付值为40g/m²，除此之外进行与实施例1相同的处理。所得弹性蛋白成型体的扬氏模量为1×10⁶Pa。

比较例1

对以实施例1为参考制备的弹性蛋白进行撕裂强度测定。

                      表1

Claims (12)

1.弹性蛋白成型体，它包含由平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成的纤维结构体的支撑衬底和弹性蛋白交联体。

2.根据权利要求1中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述脂肪族聚酯是聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯或它们的共聚物。

3.根据权利要求1中所述的弹性蛋白成型体，其中，纤维为表面平滑纤维、多孔纤维或中空纤维。

4.根据权利要求1中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述弹性蛋白交联体包含水溶性弹性蛋白和1种或1种以上交联剂的反应生成物。

5.根据权利要求4中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述交联剂是下述式(1)所示的水溶性化合物：

式中，R¹和R³各自独立地表示下述式(1)-1所示的结构：

式中，R⁴和R⁵各自独立地表示H、CH₃或C₂H₅，

或下述式(1)-2所示的结构：

R²为下述式(1)-3所示的结构：

式中，n为1～20，或下述式(1)-4所示的结构：

式中，m和1相互独立地表示0～15的整数，X和Y相互独立地表示CH₂或O的任意一个，Z为C或N的任意一个，R⁶、R⁷、R⁸和R⁹相互独立地表示H、CH₃、C₂H₅中的任意一个。

6.根据权利要求1中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述弹性蛋白交联体还含有选自蛋白质、聚氨基酸、糖质和细胞生长因子的至少一种。

7.根据权利要求6中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述蛋白质是胶原、明胶、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶或层粘连蛋白中的任意一种。

8.根据权利要求6中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述聚氨基酸是聚赖氨酸或聚谷氨酸中的任一种。

9.根据权利要求6中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述糖质是透明质酸、硫酸软骨素、肝素、藻酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、纤维素或淀粉中的任一种。

10.根据权利要求6中所述的弹性蛋白成型体，其中，前述细胞生长因子是FGF(纤维芽细胞生长因子)、EGF(上皮生长因子)、PDGF(血小板源生长因子)、IGF(胰岛素样生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、TGF-β(β型转化生长因子)、NGF(神经生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)或BMP(骨形成因子)中的任一种。

11.弹性蛋白成型体的制备方法，其特征是对由平均纤维直径为0.05～50μm的脂肪族聚酯纤维组成的纤维结构体浸渍水溶性弹性蛋白和1种或1种以上的交联剂，进行交联反应，而形成弹性蛋白交联体。

12.根据权利要求11中所述的方法，其中，纤维是表面平滑纤维、多孔纤维或中空纤维。

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