CN1733097A - 黄连、吴茱萸药对提取物在制备防治癌症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄连、吴茱萸的药对水提物具有抑制结肠癌症生成作用，因此黄连、吴茱萸的药对水提物可用于制备防治癌症的药物。尤其可用于制备抑制结肠癌症前变的药物，有较好的临床前景。

Description

黄连、吴茱萸药对提取物在制备防治癌症药物中的应用

技术领域：

本发明涉及中药技术领域。具体涉及黄连、吴茱萸的药对提取物在制备防治癌症药物中的应用。

背景技术：

结肠腺癌是西方国家和发达国家恶性肿瘤中引起死亡的第二大杀手。在美国，每年约有5-6万人死于结肠腺癌和15万的新患者。目前，中国随着经济的高速发展，人们生活环境的改变，饮食结构的变化以及工作节奏的加快，结肠腺癌的发病率逐年递增，已成为威胁人们健康的主要病种之一，对其进行深入的研究和提出防治策略，是人们关注的问题。

黄连、吴茱萸两味药构成的药对，配比不同，其组成的复方亦各不相同。黄连、吴茱萸构成比例为6∶1时，组成左金丸《丹溪心法》；其构成比例为1∶1时，组成戊己丸《古今医统》、抑青丸《张氏医通》和赤龙丹《圣济总录》。左金丸的主要功效为清肝泻火，降逆止呕；主治肝郁化火，胃失和降，吞酸嘈杂，呕吐胁痛等；现代临床主要用于治疗胃和十二指肠溃疡、急慢性胃炎、食道炎和腹泻等。许多实验研究已证明黄连、吴茱萸两味药组成的左金丸对胃溃疡和胃炎具有良好的止酸作用。戊己丸、抑青丸和赤龙丹的主要功效为调和肝脾、运化水湿；主治胃痛吞酸、腹痛泄泻等。最近，本发明人研究了黄连、吴茱萸两味药总提物、总生物碱不同配伍对胃粘膜、结肠粘膜分泌和胃肠平滑肌的作用，证明黄连、吴茱萸具有很强的抑制结肠分泌和松弛胃肠平滑肌的功能以及抑制受体激活造成的胃粘膜酸分泌的增加，这些作用潜在地说明了黄连吴茱萸具有抗结肠腺癌的作用。

对中药黄连的化学研究表明，黄连中的所含的主要有效成分为小檗碱、巴马丁碱、药根碱、黄连碱、甲基黄连碱等，其抗癌作用可能是上述成分的总合作用。目前，美国已将黄连水提物投放I期临床，旨在通过黄连水提物对各种癌症病人肿瘤活检组织周期素B1表达的下调作用结果的观察和分析，制定抑制细胞周期特异性激酶从而达到阻制肿瘤细胞生长的抗肿瘤新药的研发战略。对黄连有效成分的研究表明，小檗碱能够抑制人结肠癌细胞株COX-2转录活性；诱导人白血病HL-60细胞的凋亡，其凋亡可能涉及到细胞周期S期停滞xx。对原小檗碱型生物碱的研究表明表小檗碱(epiberberine)和groenlandicine具有抑制哺乳动物中DNA拓扑异构酶I的活性。9-去甲小檗碱对DNA拓扑异构酶II具有抑制作用。由此表明，原小檗碱型生物碱是一类DNA拓扑异构酶I、II抑制剂。Kang MR和Chung IK发现berberrubine(小檗红碱)是DNA拓扑异构酶IIα抑制剂，能够明显地下调结肠腺癌细胞(AMC5)DNA拓扑异构酶IIα基因表达。综上所述，黄连提取物和有效成分原小檗碱型生物碱抑制细胞增殖的作用是多方面的，但确切的机制仍有待于进一步的揭示。

对中药吴茱萸的化学研究表明，吴茱萸中所含的有效成分主要为柠檬苦素、吴茱萸内脂、吴茱萸碱、羟基吴茱萸碱和吴茱萸次碱等。对吴茱萸有效成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱的研究表明，仅有吴茱萸碱能够抑制26-L5结肠癌细胞株、B16-F10黑素瘤细胞株和Lewis肺癌细胞株侵入和转移，其作用可能与吴茱萸碱在N-14位具有甲基团和C13b位具有存在1个氢原子有关。对吴茱萸有效成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸胺的研究表明，吴茱萸碱能够抑制HeLa和黑素瘤A375-S2细胞株的增殖和诱导其凋亡，对这两种细胞，吴茱萸碱诱导调亡的机制是不同的；在HeLa细胞，吴茱萸碱诱导caspase-3，8依赖性调亡与细胞周期G2/M期停滞相关；而在A375-S2细胞，吴茱萸碱诱导caspase-3，8依赖性调亡涉及到MAPK-介导的坏死xx。吴茱萸碱抑制人前列腺癌细胞株LNCap的研究表明，吴茱萸碱加速细胞周期的G2/M期和诱导细胞凋亡。由此可见，在不同的细胞，吴茱萸碱诱导细胞凋亡的机制是不同的。新近的报道认为吴茱萸次碱是一种新的COX-2抑制剂，但是否能够抑制肿瘤细胞特别是结肠癌细胞COX-2的表达，目前是不清楚的，有待于进一步的探讨。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于研究设计黄连、吴茱萸在制备防治癌症药物中的应用。

为解决上述问题，本发明人应用二甲肼(1，2-dimethylhydrazine)诱发的大鼠异变结肠肠腺病灶(aberrant crypt foci，ACF)的形成，即公认的结肠癌癌前病损，观察到由1∶1组成的黄连吴茱萸药对能够较强地抑制结肠腺癌的生成。当前的研究已证明黄连、吴茱萸均具有抑制肿瘤的作用。黄连提取物具有抑制氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)诱导的ACF形成。对胃、乳腺和结肠癌细胞株的生长抑制的研究证明黄连提取物抑制的靶点可能为细胞周期的G2/M期中周期素-依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1)；在同一研究中，发现小檗碱抑制癌细胞生长的作用远弱于黄连提取物，说明黄连通过抑制G2/M期中周期素-依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1)和抑制周期素B1(cyclinB1)蛋白而间接完成癌细胞生长的有效成分并非是小檗碱，而是黄连提取物中各种成分的总合作用。

本发明人设计了具体的实验方案如下：

应用二甲肼(1，2-dimethylhydrazine、DMH，Fluka)诱发大鼠结肠上皮增殖与凋亡以及结肠腺癌癌前病变(异变肠腺病灶)；观察1)黄连吴茱萸对药水提物对二甲肼诱发大鼠结肠上皮增殖与凋亡的作用，2)对异常肠腺病灶(ACF)形成的抑制作用；说明黄连吴茱萸药对抑制大鼠结肠癌癌前病变的作用，阐明黄连吴茱萸药对治疗结肠腺癌的应用前景和开发的价值。

一、实验材料与方法

1.实验材料

1)实验动物

雄性Wistar大鼠，体重125-150g，饲养条件为室温21℃，昼夜各12小时，动物喂药的时间控制在上午9:00至11:30。喂药结束后，动物处死的时间同样控制在上午9:00至下午1:30。所有的动物编号，喂养的笼子亦编号。喂药动物每周称重1次，记录在案。动物购入后，饲养1周，开始实验。

2)实验用药

从市场购置黄连(产地为四川)、吴茱萸(产地为贵州)两味药，经水提后，过滤滤液。浓缩至干品，按水提物(g)/生药(g)换算。

黄连、吴茱萸两味药的临床用药剂量为黄连3.0g，吴茱萸3.0g。按60公斤计算，黄连为0.05g/kg，吴茱萸为0.05g/kg。由于以上是饮片的剂量，药物经水提后，再进行计算。

根据人的临床用药，推算大鼠的用药剂量如下：

黄连3.0g÷60公斤×6倍＝0.3g/kg，吴茱萸3.0g÷60公斤×6倍＝0.3g/kg。

以0.3g/kg的黄连、吴茱萸作为中剂量，0.9g/kg作为大剂量，0.1g/kg作为小剂量。

3)药物制备

黄连、吴茱萸水提物制备

黄连、吴茱萸经水煎、浓缩和冷冻干燥制成水提物，以水提物(g)/生药(g)定量地表示实验中的用药含量。

黄连经水提后，得到水提物(0.238g)/生药(g)。吴茱萸经水提后，得到水提物(0.472g)/生药(g)。黄连、吴茱萸水提物HPLC检测分析其含量、成分等。

2.实验设计

实验1：雄性Wistar大鼠，自购入后，饲养1周，喂药1周后，按30mg/kg的DMH经皮下注入大鼠的颈背，1周后注入第2次DMH。在第2次注入DMH后24、48小时，处死动物，观察药物对肠腺细胞增殖和凋亡的影响。正常对照组和模型组动物数各5个，中剂量用药组动物数各为10个，其中5个在24小时时处死，另5个在48小时时处死，动物总数为40个。

DMH溶解于25mM EDTA+137mM NaCl溶液中，重量/容积比为3mg/ml，pH为6.4。

实验2：雄性Wistar大鼠，自购入后，饲养1周，在第2周和第3周的第1天，按30mg/kg的DMH经皮下注入大鼠的颈背，制作异常肠腺病灶(aberrant crypt foci，ACF)模型。在饲养的第4周的第1天开始给药，共给药6周。整个实验周期为9周。本实验每组的动物数为10-15个，其中对照组、模型组、中剂量组动物数各为15个，10个作ACF的测定，另5个作分子生物学测定。大、小剂量组动物数各为10个，仅作ACF的测定。

3.实验分组

实验1的动物数共为40只。实验2的动物数共为105只。

正常组：每天灌胃2ml蒸馏水1次。

模型组：造模后，给予与正常组等剂量的蒸馏水。

黄连：灌胃的药量溶解于2ml蒸馏水中。造模后4周给药。

剂量(大)：黄连0.9g/kg，剂量(中)：黄连0.3g/kg，剂量(小)：黄连0.1g/kg。

吴茱萸：灌胃的药量溶解于2ml蒸馏水中。造模后4周给药。

剂量(大)：吴茱萸0.9g/kg，剂量(中)：吴茱萸0.3g/kg，剂量(小)：吴茱萸0.1g/kg。

黄连吴茱萸1∶1药对组：灌胃的药量溶解于2ml蒸馏水中。造模后4周给药。

剂量(大)：黄连0.9g/kg，吴茱萸0.9gkg。

剂量(中)：黄连0.3g/kg，吴茱萸0.3g/kg

剂量(小)：黄连0.1g/kg，吴茱萸0.1g/kg

4.实验方法

1)结肠肠腺增殖与凋亡的分析

动物喂药结束后，腹腔注射25％乌拉坦(0.5ml/100g体重)麻醉。剖腹，切断盲结肠交界处和肛直肠处，取出结肠，用Krebs-Ringer液(mM：NaCl 115，NaHCO3 25，K2HPO4 2.4，KH2PO4 0.4，CaCl2 1.2，MgCl2 1.2，葡萄糖10)清洗，测量结肠全长，沿着纵轴剖开整段结肠，使粘膜面朝上，以升结肠为起点，以降结肠末端为终点。在结肠的55％处和90％处，取1cm长的结肠一段，分别定为中段结肠、降结肠标本，所有标本的厚度为0.5cm。平整地铺在滤纸上，用乙醇∶乙酸(75∶25)液固定过夜，标本逐次编号。

应用形态学的方法测定经过细微分离获得的完整肠腺内凋亡细胞和有丝分裂细胞的频率和空间分布。通过乙醇∶乙酸(75∶25)液固定的标本经50％乙醇和蒸馏水重新水合后，用60℃的1M HCl脱水7分钟。然后，用Fuelgen试剂(15mM碱性品红、45mM焦亚硫酸钾、5％1N HCl溶解于双蒸水中)染色标本30分钟，保存在45％乙酸溶液中。在体视显微镜下，用精细的镊子将结肠标本的肌层分离掉，将去肌层的粘膜平铺在载玻片上，通过微细的分针将粘膜中的肠腺拨开。随后，用盖玻片轻轻地盖在粘膜条上，显示出各自分离的肠腺。每个动物随机地挑选10-20条肠腺进行测定。肠腺的长度通过已校正的显微镜目镜测微尺计算，在光学显微镜(放大倍数×400)下，计算每条肠腺中凋亡核和有丝分裂状的数目。有丝分裂状细胞的特征为所有处于分裂早期、中期、后期和末期的核都归属于有丝分裂细胞。凋亡细胞的特征为呈现密集的椭圆形或月牙形凋亡小体，或者出现微小的、排列不规则的颗粒，这些颗粒表示凋亡后期由于吞噬作用和溶酶体消化呈现出的固缩核染质。利用显微镜目镜测微尺测定肠腺中凋亡核和有丝分裂核的位置，每条肠腺的纵向长度从底部至开口处，被分成10个等份，计算每个等份中的凋亡核和有丝分裂核的数目。

2)异变肠腺病灶(aberrant cryptfoci，ACF)的测定

动物喂药结束后，腹腔注射25％乌拉坦(0.5ml/100g体重)麻醉。剖腹，取出整段结肠，用Krebs-Ringer液(mM：NaCl 115，NaHCO3 25，K2HPO4 2.4，KH2PO4 0.4，CaCl2 1.2，MgCl2 1.2，葡萄糖10)清洗，测量结肠全长，沿着纵轴剪开整段结肠，使粘膜面朝上，平整地铺在滤纸上，用10％中性福尔马林固定，并逐次编号。若干天后，将固定的结肠，撤去滤纸，用0.2％甲基蓝(methylene blue)染色结肠6分钟，然后，移至载璃片上，使结肠的粘膜面朝上。在光学显微镜(放大倍数×40)下，观察ACF数量。ACF区别于临近的非累及肠腺的特征是具有裂纹样开口，染色变深，肠腺和肠腺周带增大。记录每条结肠中每一个ACF中的肠腺(有些ACF中包含了多个肠腺)。所有的结肠通过盲法由一个观察者计算，并由另一个观察者复核。

二、实验结果

实验1：

黄连吴茱萸药对水提物对二甲肼诱发大鼠结肠上皮增殖的影响

正常动物饲养24小时和48小时中结肠肠腺细胞增殖数分别为1.96±0.46(均数±标准误，下同)和1.72±0.26，DMH组的动物分别为5.1±0.22和5.24±0.65，黄连组分别为2.56±0.51和3.2±0.42，吴茱萸组分别为2.76±0.43和3.26±0.21，药对组分别为1.62±0.26和2.22±0.23；以上各组与DMH组比较，存在明显的差异。

正常动物饲养24小时和48小时降结肠肠腺细胞增殖数分别为1.14±0.33和1.56±0.18，

DMH组的动物分别为4.56±0.34和4.24±0.73，黄连组分别为2.42±0.75和2.16±0.29，吴茱萸组分别为1.84±0.36和2.22±0.13，药对组分别为1.42±0.13和2.18±0.22；以上各组与DMH组比较，存在明显的差异(图1)。与DMH组比较：^*P＜0.05、^**P＜0.01、^***P＜0.001

(2)黄连吴茱萸药对水提物对二甲肼诱发大鼠结肠上皮凋亡的影响

正常动物饲养24小时和48小时的中结肠肠腺细胞凋亡数分别为1.24±0.22和1.22±0.13，DMH组的动物分别为1.22±0.13和1.46±0.25，黄连组分别为1.32±0.29和1.38±0.13，吴茱萸组分别为2.26±0.09和2.10±0.12，药对组分别2.62±0.15和2.18±0.19；吴茱萸组和药对组与DMH组比较，存在明显的差异。

正常动物饲养24小时和48小时的降结肠肠腺细胞凋亡数分别为0.86±0.23和1.1±0.14，DMH组的动物分别为1.4±0.19和1.44±0.27，黄连组分别为1.16±0.23和1.16±0.15，吴茱萸组分别为1.68±0.15和1.48±0.29，药对组分别2.44±0.15和1.92±0.11；吴茱萸组和药对组与DMH组比较，存在明显的差异(图2)。

与DMH组比较：^*P＜0.05、^**P＜0.01、^***P＜0.001

实验2：黄连吴茱萸药对抑制大鼠结肠癌癌前病变(ACF)的作用

黄连吴茱萸药对抑制大鼠结肠癌癌前病变的结果(图3、表1)表明：在大剂量和中剂量时，无论黄连、吴茱萸、还是药对，与DMH组比较，都具有明显地抑制ACF形成的作用(P＜0.01)。在小剂量时，仅有黄连组与DMH组比较，存在显著性差异(P＜0.05)。从整个研究结果证明药对组的效果明显优于黄连组和吴茱萸组。

  表1.黄连吴茱萸药对抑制大鼠结肠癌癌前病变(ACF、X±SE)的作用

组别                       n         剂量(mg/kg)  ACF数量

对照                       10        -            -

DMH                        10        -            37.7±2.6

黄连水提物(S)              10        100          28.3±2.6^*

黄连水提物(M)              9         300          26.8±2.6^**

黄连水提物(L)              10        900          22.5±2.5^**

吴茱萸水提物(S)            10        100          30.6±2.9

吴茱萸水提物(M)            10        300          26.4±2.4^**

吴茱萸水提物(L)            9         900          16.9±2.3^**

黄连吴茱萸水提物药对(S)    10        100          33.4±3.7

黄连吴茱萸水提物药对(M)    9         300          16.7±1.2^**

黄连吴茱萸水提物药对(L)    9         900          15.6±1.5^**

与DMH组比较：^*P＜0.05、^**P＜0.01

小结：

本研究证明致癌剂二甲肼能够促进大鼠结肠粘膜上皮增殖，黄连、吴茱萸和黄连吴茱萸药对均有抑制二甲肼所致的结肠粘膜上皮增殖，其中药对的作用优于黄连或吴茱萸单味药。在促进凋亡方面，发现黄连基本无促进凋亡的作用，而吴茱萸单味药和黄连吴茱萸药对具有明显的促进结肠上皮凋亡的作用，药对的作用优于吴茱萸单味药，以上结果表明尽管黄连单味药无促进细胞凋亡作用，但能够配合吴茱萸增强促进细胞凋亡的作用。

黄连、吴茱萸和药对抑制大鼠结肠癌癌前病变的结果表明黄连、吴茱萸和药对具有剂量-依赖性抑制二甲肼所致的异变肠腺病灶(ACF)的形成，其中，药对的作用明显优于黄连或吴茱萸单味药，提示临床如果应用药对治疗肿瘤，其作用将明显超过单味药的作用。本发明人第一次提出应用黄连吴茱萸药对治疗结肠癌。可进一步开发成用于治结肠癌的药物组合物。

附图说明：

图1：黄连、吴茱萸药对水提物对二甲肼诱发大鼠结肠上皮增殖的影响。

图1A为中结肠，图1B为降结肠，

■表示24小时数据，□表示48小时数据。

与DMH组比较：^*P＜0.05、^**P＜0.01、^***P＜0.001

图2：黄连、吴茱萸药对水提物对二甲肼诱发大鼠结肠上皮凋亡的影响。

图2A为的数据为中结肠，图2B的数据为降结肠。

■表示24小时数据，□表示48小时数据。

与DMH组比较：^*P＜0.05、^**P＜0.01、^***P＜0.001

图3：黄连、吴茱萸药对水提物对二甲肼诱发大鼠结肠上皮癌症前病变的影响。

■表示大剂量，□表示中剂量，

表示小剂量。

与DMH组比较：^*P＜0.05、^**P＜0.01

上述实验结果表明黄连、吴茱萸药对水提物具有抑制大鼠结肠癌癌前病变的作用，因此可以开发黄连、吴茱萸药对提取物用于制备防治癌症药物中的新用途。

Claims (3)

1、一种黄连、吴茱萸的药对提取物在制备防治癌症药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的一种黄连、吴茱萸的药对提取物在制备防治癌症药物中的应用，其特征在于其中所述的提取物为黄连、吴茱萸的药对水提物。

3、根据权利要求1所述的一种黄连、吴茱萸的药对提取物在制备防治癌症药物中的应用，其特征在于其中所述的药物为抑制结肠癌的药物。

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