CN110934937A - 治疗乳癌的中草药组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种中草药萃取物，具有作为治疗或抑制个体的乳癌病症的药物的用途，其中，该中草药包含甘遂、大黄、芍药、姜半夏、及炙甘草。该乳癌病症包括乳癌细胞增殖及侵袭。

Description

治疗乳癌的中草药组成物
技术领域
本发明揭示一种中草药组成物，特别是一种用以治疗乳癌的中草药组成物。
背景技术
据中国台湾最新发布的2011年癌症登记统计数据显示，高居台湾女性癌症之首的乳癌，罹患人数首次突破1万人，共新增10056人，平均每天约有28名妇女罹患乳癌、每天有5名妇女死于乳癌。分析显示，国内乳癌患者平均发病年龄约为52岁，其中尤以45至49岁妇女的发生率最高，35岁至45岁的女性乳癌发生率为每10万人中有60至90人，和美国相当，显见乳癌防治已经刻不容缓。
乳癌大致上来说可分为三种：动情激素接受体(ER)阳性乳癌(estrogen receptorpositive)、人类表皮因子接受体(HER-2)阳性乳癌(HER-2 positive)、三阴性(triplenegative)乳癌。其中，ER阳性乳癌是最普遍的一种乳癌，而大概60～70％的病人均是患有此种乳癌。因此，ER乳癌相对而言是最容易治疗的。而患有HER-2阳性乳癌的患者大约有20～25％。然而，在亚洲乳癌患者(特别是中国地区患者)其罹患HER-2阳性乳癌的比率相较于ER阳性乳癌来的更高一些，约有25～30％的患者，且HER-2阳性乳癌比ER阳性乳癌所产生的病灶要来的更严重一些。其中，三阴性乳癌(triple negative)的患者占整体乳癌患者的比例仅只有大约10％。虽然其患者占整体患者总数最少，但是三阴性乳癌相较于前述两者是最难治疗的，也是最容易复发的。
三阴性乳癌，为动情激素受体(ER)、黄体激素受体(PR)、人类表皮因子受体(HER-2)三者皆为阴性。其中ER、PR均为荷尔蒙受体。乳癌细胞含有越多的荷尔蒙受体，它的治疗效果越好、预后优选。因此，乳癌一定要检测荷尔蒙受体的含量，才能决定后续的治疗方法。目前约有40％至50％的病人在检测荷尔蒙受体会呈现阳性反应，只有少数的病患是阴性反应。而人类表皮生长因子受体过度表达会加速癌细胞分裂、增加转移、造成抗药性，导致治疗失败，因此，乳癌一定要检测HER-2，作为治疗及预后的参考。目前约有20％的病人在检测此受体时会呈现阳性反应，这类病人可使用标靶药物(Herceptin、Lapatinip)进行治疗。所以HER-2阴性反应的病患并不适合使用药物进行治疗。
然而，三阴性乳癌在临床上预后极差，容易早期转移，转移至内脏的机率高达74％(相较于荷尔蒙受体阳性病人为54％)；转移至中枢神经系统的机率为46％。而转移的病人的平均寿命大约为13.3个月。目前三阴性乳癌的主要治疗方法仍以化学治疗为主，不像其他荷尔蒙受体阳性的乳癌还可利用其他方法(例如：荷尔蒙治疗和一些标靶治疗)治疗。
在肿瘤型态的表现上，相较于管腔型A型Luminal A(ER、PR阳性及Her-2 阴性)的肿瘤型态，三阴性乳腺癌肿瘤细胞本身恶性度高、复发率就较高，复发时间也相较的快，通常是1～3年间，如果是管腔型A型的复发时间通常为术后的7～8年，三阴性肿瘤复发部位也较为严重，常见是转移至脑、肺或肝，但是如果三阴性的病人通过了复发的高峰期前三年，之后的复发率会明显下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种可有效治疗患有三阴性乳腺癌患者的医药萃取物且该医药萃取物主要是由可食用医药植物中萃取而出。因此，该医药萃取物对于正常细胞不具毒性，但是对于三阴性乳腺癌细胞具有毒杀作用，故可以有效抑制三阴性乳腺癌细胞生长及活性。
本发明提供一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌的医药萃取物，其由以下列特定重量比例的原料依惯用方法制成：甘遂大约0.9～6克、大黄大约0.9～6克、芍药大约6～18克、姜半夏大约6～18克、炙甘草大约6～18克的萃取物；其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本发明还提供一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌的医药萃取物，其由以下列特定重量比例的原料及方法制成：步骤(A)将甘遂大约0.9～6克、大黄大约0.9 ～6克、芍药大约6～18克、姜半夏大约6～18克、炙甘草大约6～18克混合并加入逆渗透水均匀混合成原料混合液；步骤(B)将所述原料混合液以文火熬煮成萃取膏液；以及(C)将所述萃取膏液冷冻干燥成粉末；其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
在某些实施例中，医药萃取物的所述制造方法还包含：步骤(D)将所述粉末加入溶剂而制成萃取物溶液。
在某些实施例中，溶剂包含水或有机溶剂。
在某些实施例中，医药萃取物中甘遂为大戟科植物甘遂，大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄，炙甘草为豆科多年生草本甘草植物，芍药为毛茛科芍药属植物，姜半夏为天南星科半夏属植物。
在某些实施例中，医药萃取物中甘遂使用的部分为其干燥块根，大黄使用的部分为其干燥块根及根茎，炙甘草使用的部分为其干燥块根及根茎，芍药使用的部分为其干燥块根，姜半夏使用的部分为其干燥块茎。
在某些实施例中，医药萃取物为水性萃取物。
在某些实施例中，医药萃取物可抑制三阴性乳腺癌细胞的增生。
在某些实施例中，医药萃取物可抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭。
在某些实施例中，医药萃取物的有效剂量为大约8～75毫克/公斤体重。
在某些实施例中，医药萃取物的有效剂量为大约12～60毫克/公斤体重。
在某些实施例中，医药萃取物的有效剂量为大约16～50毫克/公斤体重。
在某些实施例中，哺乳动物为人类。
在某些实施例中，医药萃取物可进一步制成颗粒剂、胶囊剂、口服液或固体饮料。
在某些实施例中，医药萃取物由以下列特定重量比例的原料依惯用方法制成：甘遂大约1.5～3克、大黄大约1～2.5克、芍药大约9～15克、姜半夏大约6～12克、炙甘草大约9～15克的萃取物。
在某些实施例中，医药萃取物由以下列特定重量比例的原料依惯用方法制成：甘遂大约3克、大黄大约3克、芍药大约12克、姜半夏大约9克、炙甘草大约9克的萃取物。
附图说明
附图图片中通过示例而非局限性方法展示出了一个或多个实施例，其中具有相同参考数字标识的组别始终表示类似组别。附图并非等比例图，除非另有披露。
图1～2用以揭示不同剂量T33对MDA-MB231、MCF-7、HMEpiC细胞株生长能力的影响。其中，图1为以不同剂量T33处理三种细胞株(MDA-MB231、MCF-7、 HMEpiC)24小时后，三种细胞株的活性定量统计图。图2为以不同剂量T33处理三种细胞株(MDA-MB231、MCF-7、HMEpiC)48小时后，三种细胞株的活性定量统计图。
图3～6用以揭示不同剂量的大黄萃取物对MDA-MB231、MCF-7细胞株的生长活性的影响。其中，图3和4为以不同剂量大黄萃取物分别处理MCF-7细胞株 24小时(图3)和48小时(图4)后，MCF-7细胞株的活性定量统计图以及显微镜图。图5和6为以不同剂量大黄萃取物分别处理MDA-MB231细胞株24小时(图 5)和48小时(图6)后，MDA-MB231细胞株的活性定量统计图以及显微镜图。
图7～10用以揭示不同剂量的甘遂半夏汤萃取物对MDA-MB231、MCF-7细胞株的生长活性的影响。其中，图7和8为以不同剂量甘遂半夏汤萃取物分别处理 MCF-7细胞株24小时(图7)和48小时(图8)后，MCF-7细胞株的活性定量统计图以及显微镜图。图9和10为以不同剂量甘遂半夏汤萃取物分别处理MDA -MB231细胞株24小时(图9)和48小时(图10)后，MDA-MB231细胞株的活性定量统计图以及显微镜图。
图11～12用以揭示不同剂量T33对MDA-MB231、MCF-7细胞株侵袭能力的影响。其中，图11为不同剂量T33对MDA-MB231细胞株侵袭能力影响的定量统计图，而图12为不同剂量T33对MCF-7细胞株侵袭能力影响的定量统计图。
图13用以揭示不同剂量T33对MDA-MB231、MCF-7细胞株的细胞自噬能力的影响。
图14～15用以揭示不同剂量T33诱发MDA-MB231细胞株自噬能力的效果。其中，图14为西方点墨法(Western bolt)结果用以揭示，MDA-MB231细胞株在不同剂量T33处理下，其体内的细胞微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-I)和细胞微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)蛋白表现变化，而图15为表现量改变的量化统计结果。
图16～17用以揭示不同剂量T33诱发MCF-7细胞株自噬能力的效果。其中，图16为西方点墨法(Western bolt)结果用以揭示，MCF-7细胞株在不同剂量 T33处理下，其体内的细胞微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-I)和细胞微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)蛋白表现变化，而图17为表现量改变的量化统计结果。
图18～19用以揭示不同剂量T33抑制MDA-MB231细胞株在BALB/c裸鼠上生长的能力。其中，图18为肿瘤大小变化统计图。图19为不同处理下的BALB/c 裸鼠中重新取回的异体移植肿瘤的图像。
图20～21用以揭示不同剂量T33抑制MCF-7细胞株在BALB/c裸鼠上生长的能力。其中，图20为肿瘤大小变化统计图。图21为不同处理下的BALB/c裸鼠中重新取回的异体移植肿瘤的图像。
具体实施方式
以下内容详细讨论了本专利申请说明中实施例的相关制造和使用。然而，应当理解以下实施例提供了许多可实施的发明概念，此类概念可能体现在各类具体情况中。以下所讨论的具体实施例仅说明了制造和使用实施例的具体方式，且未进一步限制本专利申请说明的范围。
在各类视图和说明性实施例中，类似的参考数字用于表示类似组件。接下来我们将详细参考附图中所示的典型实施例。附图和描述中尽可能使用相同的参考数字来表示相同或相似部件。在附图中，出于清晰和方便目的，形状和厚度可能会放大。根据本专利申请说明，本专利申请说明的描述将特别针对构成装置的一部分、或直接与装置一同工作的组件。应当理解，对于未具体表示或描述的组件，其形式可能多种多样。本专利申请说明中，「一项实施例」或「某一实施例」的引用是指关于该实施例所描述的某一特定特征、结构、或特性包含于至少一项实施例中。因此，本专利申请说明中不同位置出现的短语「在一项实施例中」或「在某一实施例中」不一定均指同一实施例。此外，上述特定特征、结构或特性可通过任何适宜方式在一项或多项实施例中进行组合。应当理解，以下附图未按比例绘制；更准确地说，此类附图仅可用于说明。
在附图的各类视图中，类似参考编号用于标示相同或相似的组件，同时表示和描述了本专利申请说明的说明性实施例。附图不一定按比例绘制，且在某些情况下，为达到说明目的，附图已放大和/或简化。本领域中的普通技术人员须根据本专利申请说明的以下说明性实施例来理解本专利申请说明的多种可能的应用和变体。
定义说明
应当理解，除非上下文另有明确指示，否则单数形式「一」、「某」、「该」、「所述」也包含复数形式。
本文中所使用的「大约」和「约」为当涉及例如：数量、持续时间等可测之值时，其意味着涵盖范围为指定值的±10％，更佳地为指定值的±5％的范围，且最佳地为指定值的±1％的范围。因为这样的范围内适于达成所公开的方法。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括科技术语)的意义与本专利申请说明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。应当进一步理解，常用词典中定义的术语的含义应当与相关领域和本专利申请说明的上下文中的含义一致，且不会解释地过于理想化或过于正式，除非本文中明确定义。
详细说明
甘遂(Kansui Radix)为大戟科植物甘遂(Euphorbia kansui TN Liou ex TPWang)的干燥块根，具有通里攻下、泻水逐饮的作用。临床研究上，甘遂不仅能促进胃肠道积聚的宿便、毒素的排出，且还可吸收腹腔内液体和毒素自肠道排出，增强胃肠蠕动，促进急性胰脏炎患者腹膜炎的消退及腹水消失，缓解全身中毒症状的作用，避免发炎介质和细胞因子(TNF-α)进入血液循环，刺激发炎介质的『瀑布效应』，避免造成组织器官损伤而导致多重器官衰竭。
此外，根据先前研究指出甘遂其主要化学成分为二萜类化合物及三萜类化合物。二萜类化合物有较强的刺激作用，具有抑制细胞分裂活性、抗驱线虫活性、抗病毒活性、抗肿瘤活性等等药理作用。三萜类化合物则具有阻止细胞分裂的功能，研究指出从甘遂分离出13种三萜类化合物，具有抗肿瘤的活性，其中以大戟二烯醇的活性最强，且对血压具调节作用。
大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎。在心血管系统方面，大黄目前已知的功效有以下：能够显著抑制血管生成；可通过改善血脑屏障损伤减轻脑水肿，大黄改善血脑屏障破坏的作用可能是通过抑制AQP-4 基因转录和翻译实现的；大黄素及大黄酸通过清除氧自由基抑制LIGHT的单核细胞的转移而起到抗动脉粥样硬化作用；大黄通过消炎及降血脂的作用起到抗动脉粥样硬化及稳定血小板作用。大黄具保护心血管作用，与清除自由基、降血脂及抑制血管生成等作用有关。
细胞自噬作用是一种大分子物质的分解机制，细胞藉由自噬体其双层膜状构造包围细胞质的物质，并和溶小体融合以分解物质，其整体过程受一组称为ATGs 的基因控制着。同时，细胞自噬作用在细胞存活、生长调控和蛋白质代谢中，扮演十分重要的角色，更能够维持细胞物质合成、分解和循环的平衡。游离于细胞质的LC3-I与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺(Periyasamy-Thandavan,Jiang et al.)共价结合形成LC3-II，并调节自噬体膜的形成与延伸。更明确来说，LC3(酵母菌Atg8同源蛋白)先经过蛋白酶Atg4切割，在Atg7与Atg3(E2 ubiquitin-like-conjugating enzyme)的媒介下，LC3-I型与phosphatidylethanolamine结合形成LC3-II型，并结合到新形成的自噬体膜上。LC3-II型转化是自噬体形成所必需的步骤，直至自噬体成熟形成密闭的囊泡会一直保留在自噬体膜上，因此被认为是自噬体形成的指标性分子。最后在成熟降解阶段自噬体会聚集在细胞核周围的微管组织(microtubules)，与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome)(Mizushima et al.,2011)。
本发明提供一种可以用以治疗哺乳动物的乳腺癌的医药萃取物(例如：中草药萃取)，其萃取物的主要原料包含：甘遂、大黄、芍药、姜半夏、炙甘草。其中，哺乳动物的乳腺癌是指三阴性乳腺癌(即乳癌细胞上的ER、PR、HER-2三者皆为阴性)。而其中，萃取物主要原料的比例重量为甘遂大约1.5～3克、大黄大约1～2.5克、芍药大约9～15克、姜半夏大约6～12克、炙甘草大约9～15克，并且上述的主要原料是依中草药萃取惯用方法制成中草药萃取物(例如：药粉、萃取溶液、萃取药膏)。进一步地，中草药萃取物对于正常细胞不具毒性，但是对于乳癌细胞特别是三阴性乳癌细胞具有细胞毒性。
本发明还提供另一种可以用以治疗哺乳动物的乳腺癌的医药萃取物(例如：中草药萃取)，该医药萃取物依下述方法步骤所制得：步骤(A)为首先将原料以下述特定重量比例混合，甘遂大约1.5～3克、大黄大约1～2.5克、芍药大约9 ～15克、姜半夏大约6～12克、炙甘草大约9～15克，以上原料混合之后再加入逆渗透水均匀混合成原料混合液；步骤(B)为将原料混合液以文火熬煮并浓缩成萃取膏液；步骤(C)为将萃取膏液冷冻干燥成粉末。
在某些实施例中，医药萃取物的制得方法步骤还包含：步骤(D)为将所述粉末加入溶剂混合均匀而制成萃取物溶液。而进一步地，在某些实施例中，溶剂可以包含水或是有机溶剂。在某些优选实施例中，医药萃取物优选为溶剂是使用水而制成的水性萃取物。
因此，医药萃取物可应用于癌症治疗当中，例如：治疗具有乳癌或是三阴性乳癌的哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物为人类，因此医药萃取物可应用于治疗具有乳癌或是三阴性乳癌的病患。
在某些实施例中，前述医药萃取物的主要原料(甘遂、大黄、芍药、姜半夏、炙甘草)是取自特定种类植物而制成，更明确来说，甘遂为大戟科植物甘遂，大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄，炙甘草为豆科多年生草本甘草植物，芍药为毛茛科芍药属植物，姜半夏为天南星科半夏属植物。
在某些实施例中，前述医药萃取物的主要原料(甘遂、大黄、芍药、姜半夏、炙甘草)是取自特定植物的特定部位而制成，更明确来说，甘遂使用的部分为其干燥块根，大黄使用的部分为其干燥块根及根茎，炙甘草使用的部分为其干燥块根及根茎，芍药使用的部分为其干燥块根，姜半夏使用的部分为其干燥块茎。
进一步地，在某些优选实施例中，前述医药萃取物的主要原料(甘遂、大黄、芍药、姜半夏、炙甘草)是取自特定种类植物的特定部位而制成，更明确来说，甘遂为大戟科植物甘遂的干燥块根，大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥块根及根茎，炙甘草为豆科多年生草本甘草的干燥块根及根茎，芍药为毛茛科芍药属植物的干燥块根，姜半夏为天南星科半夏属植物的干燥块茎。
在某些实施例中，医药萃取物可以用于治疗具有乳癌或三阴性乳癌的患者，这是因为医药萃取物可抑制所述三阴性乳腺癌细胞的增生或活性。
在某些实施例中，医药萃取物可以用于治疗具有乳癌或三阴性乳癌的患者，这是因为医药萃取物可抑制所述三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力。
在某些实施例中，医药萃取物的有效剂量为大约100～700毫克/公斤体重。在某些优选实施例中，医药萃取物的优选有效剂量为大约200～600毫克/公斤体重。在某些更佳实施例中，医药萃取物的更佳有效剂量为大约200～500毫克 /公斤体重。
在某些实施例中，医药萃取物在活体实验中抑制乳癌细胞形成肿瘤的有效剂量为大约100～700毫克/公斤体重、100～600毫克/公斤体重、100～500毫克 /公斤体重、100～400毫克/公斤体重、100～300毫克/公斤体重、100～200 毫克/公斤体重、200～700毫克/公斤体重、300～700毫克/公斤体重、400 ～700毫克/公斤体重、500～700毫克/公斤体重、600～700毫克/公斤体重。
在某些实施例中，医药萃取物在活体实验中抑制乳癌细胞形成肿瘤的有效剂量为大约100毫克/公斤体重、大约125毫克/公斤体重、大约150毫克/公斤体重、大约175毫克/公斤体重、大约200毫克/公斤体重、大约225毫克/公斤体重、大约250毫克/公斤体重、大约275毫克/公斤体重、大约300毫克/ 公斤体重、大约325毫克/公斤体重、大约350毫克/公斤体重、大约375毫克 /公斤体重、大约400毫克/公斤体重、大约425毫克/公斤体重、大约450 毫克/公斤体重、大约475毫克/公斤体重、大约500毫克/公斤体重、大约 525毫克/公斤体重、大约550毫克/公斤体重、大约575毫克/公斤体重、大约600毫克/公斤体重、大约625毫克/公斤体重、大约650毫克/公斤体重、大约675毫克/公斤体重、大约700毫克/公斤体重。
在某些实施例中，医药萃取物抑制乳癌细胞侵入的有效剂量为大约0.1～ 10.0毫克/毫升、大约0.5～5.0毫克/毫升、大约1.0～4.0毫克/毫升、大约2.0～3.0毫克/毫升、大约0.5～5.0毫克/毫升、大约0.5～5.0毫克/毫升、大约0.5～5.0毫克/毫升。
在某些实施例中，医药萃取物抑制乳癌细胞侵入的有效剂量为大约0.1毫克 /毫升、大约0.5毫克/毫升、大约0.6毫克/毫升、大约0.7毫克/毫升、大约0.8毫克/毫升、大约0.9毫克/毫升、大约1.0毫克/毫升、大约1.5毫克 /毫升、大约2.0毫克/毫升、大约2.5毫克/毫升、大约3.0毫克/毫升、大约3.5毫克/毫升、大约4.0毫克/毫升、大约0.17毫克/毫升、大约0.18 毫克/毫升、大约0.19毫克/毫升、大约0.20毫克/毫升、大约4.5毫克/毫升、大约5.0毫克/毫升、大约10.0毫克/毫升。更进一步，在某些优选实施例中，医药萃取物抑制乳癌细胞侵入的有效剂量为大约0.5毫克/毫升、大约 2.5毫克/毫升、大约5.0毫克/毫升。
在某些实施例中，医药萃取物抑制乳癌细胞活性的有效剂量为大约0.1～ 5.0毫克/毫升、大约0.2～5.0毫克/毫升、大约0.3～5.0毫克/毫升、大约 0.4～5.0毫克/毫升、大约0.5～5.0毫克/毫升、大约0.6～5.0毫克/毫升、大约0.7～5.0毫克/毫升、大约0.8～5.0毫克/毫升、大约0.9～5.0毫克/ 毫升、大约1.0～5.0毫克/毫升、大约1.5～5.0毫克/毫升、大约2.0～5.0 毫克/毫升、大约2.5～5.0毫克/毫升、大约3.0～5.0毫克/毫升、大约3.5 ～5.0毫克/毫升、大约4.0～5.0毫克/毫升、大约4.5～5.0毫克/毫升。
在某些实施例中，医药萃取物抑制乳癌细胞活性的有效剂量为大约0.1毫克 /毫升、大约0.2毫克/毫升、大约0.3毫克/毫升、大约0.4毫克/毫升、大约0.5毫克/毫升、大约0.6毫克/毫升、大约0.7毫克/毫升、大约0.8毫克 /毫升、大约0.9毫克/毫升、大约1.0毫克/毫升、大约1.5毫克/毫升、大约2.0毫克/毫升、大约2.5毫克/毫升、大约3.0毫克/毫升、大约3.5毫克 /毫升、大约4.0毫克/毫升、大约4.5毫克/毫升、大约5.0毫克/毫升。
在某些实施例中，医药萃取物可进一步加工制成颗粒剂、胶囊剂、口服液或固体饮料。
在某些实施例中，一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌之中草药组成物中仅由甘遂、大黄、芍药、姜半夏、炙甘草所组成，并且系以下列特定重量比例的原料依惯用方法制成者：甘遂为0.9～6克、大黄为0.9～6克、芍药为6～18克、姜半夏为6～18克、炙甘草为6～18克的萃取物；其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌，其中，甘遂为大戟科植物甘遂，大黄选自蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄中的至少一种，炙甘草为豆科多年生草本甘草植物，芍药为毛茛科芍药属植物，姜半夏为天南星科半夏属植物。
实验示例(EXPERIMENTAL EXAMPLE)
本专利申请进而透过以下实验示例进一步详细描述本发明。因此，以下的示例仅为了说明的目的而提供，除非另有规定，否则并不限制本专利申请的范围。因此，本发明绝不应被解释为仅限于以下的示例，而应理解为包括本专利申请中所提供的教示，以及其他对所属领域的通常知识者显而易见的任何变化。
不透过进一步的揭露，相信所属领域的一般技术人员仍可以藉由本专利申请中前述的内容和以下说明实施例进一步制备和利用本专利申请的目标，并且实践所要求保护的方法。因此，以下实验实施例具体指出了本专利申请中优选的实施方式，但是其不应被解释为以任何方式限制本专利申请的其余部分。
以下揭露本专利申请的实验中所使用的材料和方法。
材料及方法(MATERIAL AND METHOD)
细胞株
MCF-7细胞株(Estrogen dependent细胞)的生长特性为贴附型的细胞，其具有雌激素接受体(Estrogen receptor；ER)并且过度表现ER(ER+)，为雌激素依赖型乳癌细胞株，但是其仅有极低的ErbB-2接受器表现。MDA-MB231细胞株(Estrogen independent细胞)的生长特性也为贴附型的细胞，具有突变的 p53和缺乏功能性的雌激素接受体ER(ER—)。因此，本研究利用MCF-7细胞株与MDA-MB231细胞株作为乳癌细胞株代表，更进一步地，利用MDA-MB231细胞株作为代表三阴性乳癌细胞。MDA-MB231细胞株、MCF-7细胞株以及HMEpiC细胞株均购自American Type Culture Collection(ATCC；Rockville,MD)。MDA-MB231 细胞株培养于Leibovitz's L-15 Medium(ATCC；Rockville,MD)培养基中， MCF-7细胞株则培养于Eagle's Minimum Essential Medium(ATCC；Rockville, MD)培养基中，HMEpiC细胞株培养于Mammary Epithelial Cell Medium(MEpiCM, Cat.No.:7611)；而上述两种培养基均添加10％胎牛血清(FBS；Gibco,Carlsbad, CA)和100mg/ml penicillin/streptomycin(Gibco,Carlsbad,CA)。并且上述两种细胞均放置于含5％CO2、37℃和高湿度的恒温培养箱中。
中草药萃取物
T33中药萃取物的材料包括：甘遂、大黄、芍药、姜半夏和炙甘草，其上述由中医师刘育德博士所提供。简言之，依实验所需将上述材料以比例1:2:6:4:6 (甘遂：大黄：芍药：姜半夏：炙甘草)置于1000ml的逆渗透水中以100℃进行熬煮浓缩至总体积为250ml以获得浓缩萃取液。进一步将浓缩萃取液藉由 Whatman滤纸过滤分离出未溶解的物质，并且随后在无菌条件下利用孔径为0.22 μm滤膜过滤出分离萃取液。然后分离萃取液利用冷冻干燥法将分离萃取液制成 2g冷冻干燥粉末。最后，将冷冻干燥的T33中药萃取物溶解于PBS中至实验所需的浓度。
甘遂半夏汤萃取物的材料包括：甘遂、姜半夏、芍药、炙甘草，而其使用比例为1:6:4:6(甘遂：芍药：姜半夏：炙甘草)。更进一步地，其萃取干燥粉末之方式同上所述。置于1000ml的逆渗透水中以100℃进行熬煮浓缩至总体积为 250ml以获得浓缩萃取液。进一步将浓缩萃取液藉由Whatman滤纸过滤分离出未溶解的物质，并且随后在无菌条件下利用孔径为0.22μm滤膜过滤出分离萃取液。然后分离萃取液利用冷冻干燥法将分离萃取液制成2g的冷冻干燥粉末。最后，将冷冻干燥粉末溶解于PBS中至实验所需之浓度。
试管中功能试验(In vitro functional assays)
细胞存活率分析(MTT assay)
首先，将MDA-MB231细胞株和MCF-7细胞株培养于96孔微孔盘(1×104cells /well)中，并且再加入20μl/well的噻唑蓝(即MTT溶液)。进一步将含有 MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株的96孔微孔盘放入细胞培养箱于37℃、5％CO2条件下培养2～3小时。然而培养时间长短可视MTT代谢后所产生深蓝色结晶的量而进行调整。培养过后，取出96孔微孔盘并且小心抽干上层黄色MTT溶液，并且尽可能不抽走底层细胞及MTT结晶。最后，于96孔微孔盘中加入200μl/ well的二甲基亚砜(DMSO)及25μl/well的Sorenson’s glycine buffer，以震荡器摇动96孔微孔盘大约10分钟使MTT结晶完全溶解扩散均匀即可。当 MTT结晶完全溶解于DMSO中时则呈紫色。利用Microplate reader(BIO-RAD， Model 450)，以570nm波长读取其吸光值。
细胞侵入实验(Invasion Assay)
先在transwell中覆盖一层细胞外基质(matrigel)后，再利用细胞计数盘，计算细胞量后，取总共5×104的MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株溶在不含胎牛血清的培养基中，并将细胞株种到chamber上层，而下层加入800ul/well 含有20％胎牛血清的培养基，经过12小时培养后，利用结晶紫(crystal violet) 染色或用胰蛋白酶(trypsin)将爬过chamber的细胞分离下来，最后利用细胞计数盘计算多少颗细胞即可知侵犯能力。
西方墨点法(Western Blot)
组织蛋白电泳：取制备好的细胞株均质液(60μg)加入适当量的5倍(5X) samplebuffer，并置于加热板上煮5分钟，消旋(spin down)后注入铸好的 12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)胶体中，以80伏特进行电泳约45分钟，之后加高伏特电量至120伏特再进行电泳约4.5～5小时。
转印：裁与胶等大小的3M paper共6张(以transfer buffer浸润)，及1 张PVDF膜(以甲醇活化)。将跑完电泳的SDS-PAGE取出，去除多余的胶，在最下层垫三张3M paper，再依序垫PVDF membrane、胶，最后于最上层放三张3M paper，置于石墨电极上(semi-drytransfer)，以面积x1.4mA/cm2的电流转印1小时10分钟。
免疫反应：将转印后的PVDF membrane取出，置于5％脱脂牛奶/PBST中作用一小时。将PVDF paper取出，置于一级抗体(anti-Arf1,Epitomics.Inc., 1：2000稀释于5％脱脂牛奶中)4℃反应隔夜后，取出PVDF membrane，以PBST 清洗3次，每次10分钟。再将PVDFpaper取出，置于二级抗体(HRP-goat anti-rabbit IgG1：4000稀释于PBST)室温中作用一小时后，将PVDF membrane 以PBST清洗3次，每次10分钟后取出PVDF membrane。尽量滴干PVDF membrane 上的液体，置于保鲜膜上，将2X Luminol/Enhancer solution及2X Stableperoxide solution(Amershan)等体积混合后，均匀滴在PVDF paper上，将溶液吸干，至暗房压片30秒至1分钟，然后以显影液及定影液冲片晾干后判读。
乳腺瘤动物实验(Xenogeneic Breast tumor Models)
我们使用免疫缺陷小鼠(简称BALB/c裸鼠)－乳腺瘤异种移植模式实验来测试不同剂量的T33医药萃取物在活体内的抗肿瘤作用成效。因此，BALB/c裸鼠(品系：CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlBltw)则用于上述实验中，并且相关实验均依照中山医学大学动物护理和使用委员会的要求而进行(IACUC approval number: 1743)。
而本实验的第一步是将MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株植入小鼠中。因此，MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株(每只小鼠注射100μl PBS含有5×106 个细胞)藉由皮下注射(s.c.)注射至雌性BALB/c裸鼠(8～10周龄；中国台湾国家实验动物中心)的第二乳房脂肪垫内。而植入的MDA-MB231细胞株或MCF-7 细胞株所形成的肿瘤则使用量尺做进一步测量其大小。当小鼠将进行安乐死，或者如果它们生理数值提早显示需要进一步提早安乐死的征兆，则小鼠将提早进行安乐死。当小鼠藉由安乐死而牺牲后，其体内所形成的肿瘤则进一步被取出并拍照测量其实际大小。
统计分析
本实验中的统计分析则是使用学生T检验(Student's t-test)来统计样本之间差异的显著性，并且当P<0.05(即符号＊和#)则代表两者间具有显著差异。在淋巴瘤动物实验中的生物冷光影像结果，则是使用平均值±s.d来总结每组小鼠于不同时间点时期所发出的信号强度。
实验(EXAMPLES)
实验一：T33中草药萃取物抑制乳腺癌细胞生长
乳腺癌细胞株(MDA-MB231细胞株和MCF-7细胞株)和正常细胞珠(HMEpiC 细胞株)分别依前述培养方式培养于96孔微孔盘中至八成满。确定所有组别的细胞株均生长至差不多一样量时，再分别将0.1mg/ml、0.5mg/ml、2.5mg /ml、5mg/ml、10mg/ml的T33中草药萃取物添加至MDA-MB231细胞株或MCF-7 细胞株或HMEpiC细胞株中共同培养24小时或48小时。并且，分别于共同培养 24小时或48小时后收取细胞以显微镜拍照之外，更进一步用细胞存活率分析(如图1为三种细胞株与T33中草药萃取物共同培养24小时结果；如图2为三种细胞株与T33中草药萃取物共同培养48小时结果)来验证T33中草药萃取物抑制乳腺癌细胞生长。其中，每个实验进行三重复，*及#：p<0.05。
如图1和2中所揭示，提高培养基中T33中草药萃取物的浓度均会对三种细胞株(MDA-MB231、MCF-7、HMEpiC细胞株)的活性产生影响，更明确来说，提高T33中草药萃取物的浓度会抑制三种细胞株的活性。
如图1与表一中所揭示，当培养基中所添加的T33中草药萃取物浓度为5 mg/ml然后培养细胞株24小时后，HMEpiC细胞株(正常细胞株)的细胞活性会接近50％(即IC50数值)。以上目的是为了确保日后所使用的浓度不会造成正常细胞的毒性。因此我们进一步观察相同浓度(5mg/ml)的T33中草药萃取物对于两个乳癌细胞株(MDA-MB231、MCF-7细胞株)的影响是如何。由图1与表一所揭示，MDA-MB231细胞株的细胞活性显著性的下降至40％(即剩下40％的细胞存活)；而MCF-7细胞株之细胞活性显著性的下降至20％(即剩下20％的细胞存活)。因此，T33中草药萃取物浓度的确可显著抑制乳癌细胞(尤其是三阴性乳癌细胞)的活性。此外，我们也发现到MCF-7细胞株对于T33中草药萃取物的感受性非常的敏感。由图1与表一中可发现，使用0.5mg/ml的T33中草药萃取物处理MCF-7 细胞株24小时后即可使其细胞活性剩下50％左右。而使用T33中草药萃取物处理MDA-MB231细胞株24小时后可造成其活性剩下50％的浓度为大约介于2.5～5 mg/ml。因此，综合上述我们可以很清楚地得知利用T33中草药萃取物处理乳癌细胞24小时下，T33中草药萃取物能够有效抑制乳癌细胞或三阴性乳癌细胞的有效剂量为0.1～5mg/ml。更进一步说明，此处的有效剂量是指T33中草药萃取物对于正常细胞HMEpiC细胞株的活性抑制不高于50％(≤50％)，但是对于乳癌细胞或三阴性乳癌细胞能够产生显著抑制其活性的效果相较于控制组 (control)。
表一
Figure BDA0002102719040000101
Figure BDA0002102719040000111
＊：该组别与HMEpiC细胞组相比其P<0.05
#：该组别与MDA-MB231细胞组相比其P<0.05
如图2中所揭示，我们将使用T33中草药萃取物培养三种细胞株的时间延长至48小时，并且再进一步观察三种细胞株(MDA-MB231、MCF-7、HMEpiC细胞株) 的活性变化。整体来说，T33中草药萃取物对于三种细胞株的影响是一致的，即会抑制细胞活性。如同上述，我们一样先找出T33中草药萃取物对于HMEpiC细胞株(正常细胞株)的细胞活性会抑制接近50％(即IC50数值)的浓度为何。由图2及表二中所揭示，该浓度大约介于2.5～5mg/ml，大约为2.25mg/ml。而在以2.25mg/ml的T33中草药萃取物处理下，MDA-MB231细胞株的细胞活性降至30％左右，而MCF-7细胞株的细胞活性降至20％以下。因此，综合上述我们可以很清楚地得知利用T33中草药萃取物处理乳癌细胞48小时下，T33中草药萃取物能够有效抑制乳癌细胞或三阴性乳癌细胞的有效剂量为0.1～2.25 mg/ml。更进一步说明，此处的有效剂量是指T33中草药萃取物对于正常细胞 HMEpiC细胞株的活性抑制不高于50％(≤50％)，但是对于乳癌细胞或三阴性乳癌细胞能够产生显著抑制其活性的效果相较于控制组(control)。另外，以0.5 mg/ml的T33中草药萃取物培养MDA-MB231、MCF-7细胞株48小时后均可以使其两者的细胞活性剩下50％左右。更进一步，我们发现2.5mg/ml的T33中草药萃取物能显著抑制MDA-MB231细胞株的活性，因为由图2中其活性曲线斜率骤减，而在浓度2.5mg/ml之后又趋缓。
表二
Figure BDA0002102719040000112
Figure BDA0002102719040000121
＊：该组别与HMEpiC细胞组相比其P<0.05
#：该组别与MDA-MB231细胞组相比其P<0.05
因此，由本实验结果可以得知T33中草药萃取物可以有效抑制乳腺癌细胞 (MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株)的活性或生长能力。
实验二：T33中草药萃取物抑制乳腺癌细胞的具体显著功效
为了更进一步证明T33中草药萃取物中的组成相较于单一成分或是其中任意组合更具显著功效且更具协同效应(Synergistic Effect)，我们更进一步将T33 中草药萃取物与其中单一成分的大黄或甘遂半夏萃取物搭配如实验一中的细胞存活率分析来进行其各自对于抑制乳癌细胞生长的功效。
如同实验一中所述，乳腺癌细胞株(MDA-MB231细胞株和MCF-7细胞株)分别依前述培养方式培养于96孔微孔盘中至八成满。确定所有组别的细胞株均生长至差不多一样量时，再分别将特定剂量之大黄萃取物(0.0065mg/ml、0.0325 mg/ml、0.1625mg/ml、0.325mg/ml、0.65mg/ml)或甘遂半夏萃取物(0.0935 mg/ml、0.4675mg/ml、2.3375mg/ml、4.675mg/ml、9.35mg/ml)添加至MDA-MB231 细胞株或MCF-7细胞株中共同培养24小时或48小时。并且，分别于共同培养 24小时或48小时候收取细胞以显微镜拍照之外，更进一步用细胞存活率分析(如图3、4分别为MCF-7细胞株与大黄萃取物共同培养24及48小时结果；如图5、 6分别为MDA-MB231细胞株与大黄萃取物共同培养24及48小时结果；如图7、8 分别为MCF-7细胞株与甘遂半夏萃取物共同培养24及48小时结果；如图9、10 分别为MDA-MB231细胞株与甘遂半夏萃取物共同培养24及48小时结果)来验证大黄萃取物及甘遂半夏萃取物抑制乳腺癌细胞生长的效果。其中，每个实验进行三重复，＊：p<0.05。
表三：
Figure BDA0002102719040000122
＊：该组别与Control组相比其P<0.05
请参阅图3、4和上述表三，由实验结果可清楚得知当以大黄萃取物浓度至少0.65mg/ml培养时，MCF-7细胞株的生长活性才会显著受到抑制，无论是培养24小时还是培养48小时。更明确来说，当以0.65mg/ml的大黄萃取物培养 MCF-7细胞株24小时后，其细胞生长活性剩下85.67±0.44％；若以相同浓度的大黄萃取物培养MCF-7细胞株48小时后，其细胞生长活性剩下95.67± 1.56％。另外，培养48小时的抑制效果低于培养24小时。
请参阅图5、6和上述表三，由实验结果可清楚得知当以大黄萃取物培养 MDA-MB231细胞株24小时后，仅0.0325mg/ml的大黄萃取物可显著抑制 MDA-MB231细胞株(细胞生长活性剩下93.33±1.11％)。但是，更高浓度的大黄萃取物无法抑制MDA-MB231细胞株的生长活性。更明确来说，由表三的统计结果中可清楚看出，较高浓度的大黄萃取物反而略微增加MDA-MB231细胞株的生长活性。另外，当以大黄萃取物培养MDA-MB231细胞株48小时后，仅0.65mg/ml 的大黄萃取物可显著抑制MDA-MB231细胞株(细胞生长活性剩下94.00±0.67％)。虽然由上述结果可得知大黄可抑制MB231细胞株的生长活性，但是由统计结果中可清楚得知大黄萃取物抑制MB231细胞株生长活性的效果不是非常显著，其最大抑制效果仅能抑制约6％的MDA-MB231细胞株生长活性。
因此，由上述实验结果我们可清楚的了解T33中草药萃取物相较于大黄萃取物具有更高的抑制乳癌细胞(MCF-7细胞株和MDA-MB231细胞株)的生长效果。更明确来说，0.5mg/ml的T33中草药萃取物培养乳癌细胞24小时后可让 MDA-MB231细胞株剩下80％生长活性，而让MCF-7细胞株剩下约50％生长活性；若以相同浓度培养乳癌细胞24小时后则可让MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株剩下约50～60％生长活性。然而差不多浓度(0.65mg/ml)的大黄萃取物均无法使乳癌细胞株的生长活性降低至75％以下或是60％左右。
更进一步，我们用相同实验证明T33中草药萃取物同样相较于甘遂半夏汤萃取物具有更佳的抑制乳癌细胞生长活性之效果。
表四：
Figure BDA0002102719040000131
＊：该组别与Control组相比其P<0.05
请参阅图5、6和表四，由实验结果可得知当以甘遂半夏汤萃取物培养MCF-7 细胞株24小时后，仅以甘遂半夏汤萃取物浓度为9.35mg/ml的组别其乳癌细胞生长活性才会显著受到抑制，其细胞生长活性剩下40.33±3.11％。而在以甘遂半夏汤取物培养MCF-7细胞株48小时后，仅浓度为4.675mg/ml和9.35mg/ml 之组别其乳癌细胞生长活性才会显著受到抑制，其细胞生长活性分别剩下89.33 ±0.44％、40.00％。
请参阅图7、8和表四，由实验结果可清楚得知当以甘遂半夏汤萃取物培养 MDA-MB231细胞株24或48小时后，当甘遂半夏汤萃取物浓度为2.3375mg/ml 以上(2.3375mg/ml、4.675mg/ml、9.35mg/ml之组别)时可显著抑制MDA-MB231 细胞株的生长活性。
然而，由以上结果可清楚得知T33中草药萃取物相较于甘遂半夏汤萃取物具有更佳的抑制乳癌细胞生长活性的效果。更明确来说，由图1A和1B中可得知，当以2.5mg/ml的T33中草药萃取物培养乳癌细胞(MCF-7细胞株或MDA-MB231 细胞株)24或48小时后，乳癌细胞株生长活性剩下60％左右。但是，如果以相近浓度的甘遂半夏汤萃取物(2.3375mg/ml)培养24小时或48小时后，其均无法显著抑制乳癌细胞株生长活性。更进一步，虽然以9.35mg/ml的甘遂半夏汤萃取物培养乳癌细胞24或48小时后可让乳癌细胞细胞活性显著地减少至50％左右。但是，如果以T33中草药萃取物培养乳癌细胞株24或48小时后而使乳癌细胞株的生长活性低于50％的浓度为少于5mg/ml。更明确来说，以T33中草药萃取物培养24小时的条件下，仅需约2.75mg/ml的T33中草药萃取物就可让 MDA-MB231细胞株的生长活性剩下50％，另外仅需约0.5mg/ml的T33中草药萃取物就可让MCF-7细胞株的生长活性剩下50％。另一方面，以T33中草药萃取物培养48小时的条件下，仅需约2.55mg/ml的T33中草药萃取物就可让MDA-MB231 细胞株的生长活性剩下50％，另外仅需约0.5mg/ml的T33中草药萃取物就可让 MCF-7细胞株的生长活性剩下50％。因此，由上叙述可清楚知道T33中草药萃取物相较于甘遂半夏汤萃取物更具有抑制乳癌细胞的效果。
实验三：T33中草药萃取物抑制乳腺癌细胞的侵入能力
为了近一步验证T33中草药萃取物不只可以抑制乳腺癌细胞的生长或活性之外，更进一步可以抑制其他功能(例如侵入的能力)。因此我们利用细胞侵入实验来检测T33中草药萃取物是否可抑制乳腺癌细胞的侵入能力。乳腺癌细胞株 (MDA-MB231细胞株和MCF-7细胞株)分别依前述培养方式培养至八成满。确定所有组别的细胞株均生长至差不多一样量时，再分别将0.1mg/ml、0.5mg/ml、 2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的T33中草药萃取物添加至MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株中共同培养48小时。共同培养48小时后，收取细胞并以如上述的细胞侵入实验检测其侵入能力。实验后分别以显微镜(400倍放大倍率)拍照后再进一步统计量化。而图11(MDA-MB231细胞株)和图12(MCF-7细胞株)为统计过后量化结果。其中，每个实验进行三重复，*：p<0.05。
如图11和表五中所揭示，0.1mg/ml的T33中草药萃取物即可显著性的抑制MDA-MB231细胞株其侵入的能力，更明确来说，相较于控制组(无T33处理组别)可以抑制大约40％的MDA-MB231细胞株侵入，而2.5mg/ml的T33中草药萃取物更可进一步抑制大约50％的MDA-MB231细胞株侵入。当以10mg/ml的T33 中草药萃取物处理MDA-MB231细胞株，其侵入的细胞相较于控制组不到5％。
表五：MDA-MB231细胞株的侵入能力
Figure BDA0002102719040000151
＊：与Control组别相比其P<0.05
如图12和表六中所揭示，0.1mg/ml的T33即可显著性的抑制MCF-7细胞株其侵入的能力，更明确来说，相较于控制组(无T33中草药萃取物处理组别) 可以抑制大约20％的MCF-7细胞株侵入，而只要0.5mg/ml的T33中草药萃取物更可进一步抑制大约50％的MCF-7细胞株侵入。当以至少2.5mg/ml的T33中草药萃取物处理MCF-7细胞株，其侵入的细胞相较于控制组不到5％。
表六
Figure BDA0002102719040000152
＊：与Control组别相比其P<0.05
因此，由本实验结果可以得知T33中草药萃取物可以有效抑制乳腺癌细胞 (MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株)的侵袭能力。0.1mg/ml的T33中草药萃取物对于两种乳腺癌细胞株均有显著性地抑制效果。
实验四：T33中草药萃取物诱导乳腺癌细胞自噬的能力
为了确定T33是藉由诱导乳腺癌细胞自噬而进一步抑制乳腺癌细胞的细胞增生，我们利用免疫荧光染色以及西方点墨法检测经由T33中草药萃取物处理过后的乳腺癌细胞体内影响细胞自噬能力的蛋白(例如：LC3-I和LC3-II)表现量。
在利用免疫荧光染色检测乳腺癌细胞体内影响细胞自噬能力的蛋白(例如： LC3-I和LC3-II)表现量的实验中，我们以0.1mg/ml、0.5mg/ml、2.5mg/ml、 5mg/ml、10mg/ml的T33中草药萃取物培养乳腺癌细胞(MDA-MB231细胞株或 MCF-7细胞株)共48小时，之后进一步利用可以专一性辨认乳癌细胞中LC3-II 蛋白的抗体以及DAPI对乳癌细胞进行染色，之后再利用荧光显微镜进行观察并拍照。
如图13所揭示，在MDA-MB231细胞株处理组别中，以0.5mg/ml的T33中草药萃取物培养MDA-MB231细胞株48小时后可造成大量乳癌细胞中LC3-II蛋白表现。另外，在MCF-7细胞株处理组别中，同样以0.5mg/ml的T33中草药萃取物培养MCF-7细胞株48小时后可造成大量乳癌细胞中LC3-II蛋白表现。
在利用西方点墨法检测乳腺癌细胞体内影响细胞自噬能力的蛋白(例如： LC3-I和LC3-II)表现量的实验中，首先，我们以0.1mg/ml、0.5mg/ml、2.5 mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的T33中草药萃取物处理乳腺癌细胞(MDA-MB231 细胞株或MCF-7细胞株)共24小时，之后进一步利用西方点墨法分析处理过后的MDA-MB231细胞株或MCF-7细胞株中LC3-I和LC-II蛋白的表现量，如图14 (MDA-MB231细胞株)和图16(MCF-7细胞株)中所揭示。而图15(MDA-MB231 细胞株)和图17(MCF-7细胞株)所揭示为将LC3-I和LC-II蛋白表现统计量化后的结果。其中，每个实验进行三重复，*：p<0.05。
如图14和15中所揭示，在以2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的T33中草药萃取物处理MDA-MB231细胞株的组别中均观测到LC3-II蛋白质表现量均有显著增加。
如图16和17中所揭示，同样在以2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的T33 中草药萃取物处理MCF-7细胞株的组别中也均观测到LC3-II蛋白质表现量均有显著增加。
因此，根据本实验结果证实T33中草药萃取物可以诱导MDA-MB231细胞株或 MCF-7细胞株中的LC3-II的蛋白表现量上升而进一步诱导乳腺癌细胞产生细胞自噬现象。因此进一步造成乳腺癌细胞死亡。
实验五：利用小鼠肿瘤模式验证T33中草药萃取物抑制乳腺癌成长的能力
为了进一步确认T33中草药萃取物于活体状态(in vivo)中可产生与试管 (invitro)中实验所得到的相似结果，我们进一步利用前述的小鼠肿瘤模式实验来验证T33中草药萃取物于活体中是否可以抑制乳腺癌细胞的生长和活性。首先，我们藉由皮下注射方式将5×106的乳腺癌细胞(MDA-MB231细胞株或MCF-7 细胞株)打入BALB/c裸鼠腹部皮下中来建立肿瘤异体移植。而当肿瘤大小达到接近50mm3大小时，分别每天口服施予带有肿瘤小鼠PBS(控制组)、200mg/Kg、或600mg/Kg的T33中草药萃取物。如图10和图12肿瘤体积统计图所揭示，相较施予小鼠PBS(控制组)的组别，口服200mg/Kg或600mg/Kg的T33中草药萃取物的小鼠中均呈现肿瘤生长大小变低的趋势。
如图18和表七中所揭示，无论是口服200mg/Kg或600mg/Kg的T33中草药萃取物的组别均可抑制MDA-MB231肿瘤成长速率。而口服600mg/Kg的T33 中草药萃取物的小鼠其身上MDA-MB231肿瘤成长速率于第5周时相较于口服PBS 组别即有显著性被抑制。而口服200mg/Kg的T33中草药萃取物的小鼠则于第6 周时相较于口服PBS组别也开始有显著性抑制效果。更进一步，口服600mg/Kg 的T33中草药萃取物的小鼠其身上MDA-MB231肿瘤大小并无明显增加趋势。在实验终点时(第7周)各组肿瘤小鼠先拍照，并且在小鼠牺牲后将MDA-MB231细胞株所形成肿瘤取出再拍照记录(如图19所揭示)。根据图18和图19的结果均显示，T33中草药萃取物可以在活体中有效抑制MDA-MB231肿瘤的成长。
表七：
Figure BDA0002102719040000161
Figure BDA0002102719040000171
＊：该组别与Control细胞组相比其P<0.05
#：该组别与200mg/kg细胞组相比其P<0.05
如图20和表八中所揭示，无论是口服200mg/Kg或600mg/Kg的T33中草药萃取物的组别均可抑制MCF-7肿瘤成长速率。而口服600mg/Kg的T33中草药萃取物的小鼠其身上MCF-7肿瘤成长速率于第5周时相较于口服PBS组别即有显著性被抑制。而口服200mg/Kg的T33中草药萃取物的小鼠则于第6周时相较于口服PBS组别也开始有显著性抑制效果。更进一步，口服600mg/Kg的T33中草药萃取物的小鼠其身上MCF-7肿瘤大小并无明显增加趋势。在实验终点时(第8 周)各组肿瘤小鼠先拍照，并且在小鼠牺牲后将MDA-MB231细胞株所形成肿瘤取出再拍照记录(如图21所揭示)。根据图20和图21的结果均显示，T33中草药萃取物可以在活体中有效抑制MCF-7肿瘤的成长。
表八：
Figure BDA0002102719040000172
＊：该组别与Control细胞组相比其P<0.05
#：该组别与200mg/kg细胞组相比其P<0.05
由动物实验的结果显示(图18～19和图20～21)，无论口服给予肿瘤小鼠 (MDA-MB231或MCF-7)高剂量(600mg/Kg)或是低剂量(200mg/Kg)的T33 中草药萃取物均可使平均肿瘤体积有显著下降。由图18、20的结果显示，让带有肿瘤的小鼠口服低剂量(200mg/Kg)T33中草药萃取物可以使肿瘤大小缩小至大约一半大小，无论是带有MDA-MB231或MCF-7细胞株所诱导的肿瘤。而在口服喂食高剂量(600mg/Kg)T33中草药萃取物更可以使肿瘤大小缩小至大约1 /4左右。因此由此可证中草药萃取物T33可有效抑制乳腺癌肿瘤的生长。另外，动物实验的结果(图18～21)可清楚得知口服T33中草药萃取物抑制MDA-MB231 或MCF-7乳癌细胞的有效剂量分别为至少200mg/kg。更进一步说明，此处有效剂量为至少可抑制肿瘤体积成长一半相较于控制组(control)。

Claims (20)

1.一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌的中草药组成物，其特征在于，由以下特定重量比例的原料依惯用方法制成者：
甘遂为0.9～6克、大黄为0.9～6克、芍药为6～18克、姜半夏为6～18克、炙甘草为6～18克的萃取物；其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌，并且所述甘遂为大戟科植物甘遂，所述大黄选自蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄中的至少一种，所述炙甘草为豆科多年生草本甘草植物，所述芍药为毛茛科芍药属植物，所述姜半夏为天南星科半夏属植物。
2.一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌的中草药组成物，其特征在于，由以下列特定重量比例的原料及方法制成：
(A)将0.9～6克的甘遂、0.9～6克的大黄、6～18克的芍药、6～18克的姜半夏、6～18克的炙甘草混合并加入逆渗透水均匀混合成原料混合液；
(B)将所述原料混合液以文火熬煮成萃取膏液；以及
(C)将所述萃取膏液冷冻干燥成粉末；
其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌，并且所述甘遂为大戟科植物甘遂，所述大黄选自蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄中的至少一种，所述炙甘草为豆科多年生草本甘草植物，所述芍药为毛茛科芍药属植物，所述姜半夏为天南星科半夏属植物。
3.如权利要求1或2所述的中草药组成物，其特征在于：
其中，所述甘遂使用的部分为其干燥块根，所述大黄使用的部分为其干燥块根和/或根茎，所述炙甘草使用的部分为其干燥块根和/或根茎，所述芍药使用的部分为其干燥块根，所述姜半夏使用的部分为其干燥块茎。
4.一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌的中草药组成物，其特征在于，包含：
如权利要求1或2所述的中草药组成物；以及
溶剂。
5.如权利要求4所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述溶剂包含水或有机溶剂。
6.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物抑制乳腺癌细胞侵入的有效剂量为0.1～10mg/ml。
7.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物抑制乳腺癌细胞侵入的有效剂量为0.1～5mg/ml。
8.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物抑制乳腺癌细胞并且对正常细胞活性影响小于50％的有效剂量为0.1～5mg/ml。
9.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物抑制乳腺癌细胞并且对正常细胞活性影响小于50％的有效剂量为0.1～2.5mg/ml。
10.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
11.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物通过诱导所述乳腺癌产生细胞自噬而进一步抑制所述乳腺癌增生。
12.如权利要求5所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物抑制所述乳腺癌的肿瘤体积成长速率。
13.如权利要求12所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物是利用口服方式进入受试者体内。
14.如权利要求12所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物的有效剂量为100～700毫克/公斤体重。
15.如权利要求12所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物的有效剂量为200～600毫克/公斤体重。
16.如权利要求12所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述哺乳动物为人类。
17.如权利要求12所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述中草药组成物可进一步制成颗粒剂、胶囊剂、口服液或固体饮料。
18.如权利要求1或2所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述甘遂为1.5～3克、所述大黄为1～2.5克、所述芍药为9～15克、所述姜半夏为6～12克、所述炙甘草为9～15克。
19.如权利要求1或2所述的中草药组成物，其特征在于：其中，所述甘遂为3克、所述大黄为3克、所述芍药为12克、所述姜半夏为9克、所述炙甘草为9克。
20.一种用以治疗哺乳动物的乳腺癌之中草药组成物，其特征在于，由以下列特定重量比例的原料依惯用方法制成者：
甘遂为0.9～6克、大黄为0.9～6克、芍药为6～18克、姜半夏为6～18克、炙甘草为6～18克的萃取物；
其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌，并且所述中草药组成物由所述甘遂、所述大黄、所述芍药、所述姜半夏、所述炙甘草所组成，
所述甘遂为大戟科植物甘遂，所述大黄选自蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄中的至少一种，所述炙甘草为豆科多年生草本甘草植物，所述芍药为毛茛科芍药属植物，所述姜半夏为天南星科半夏属植物。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1095274A (zh) * 1992-08-18 1994-11-23 林哓玲 一种抗癌拮抗药的配制方法
CN1660219A (zh) * 2004-12-17 2005-08-31 李国良 治疗消化道疾病的中药及其配制方法
TW201827064A (zh) * 2017-01-26 2018-08-01 劉育德 中草藥萃取物用於製備治療乳癌藥物的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1095274A (zh) * 1992-08-18 1994-11-23 林哓玲 一种抗癌拮抗药的配制方法
CN1660219A (zh) * 2004-12-17 2005-08-31 李国良 治疗消化道疾病的中药及其配制方法
TW201827064A (zh) * 2017-01-26 2018-08-01 劉育德 中草藥萃取物用於製備治療乳癌藥物的用途
CN108355027A (zh) * 2017-01-26 2018-08-03 刘育德 一种中草药萃取物及其用于制备治疗三阴性乳腺癌的药物的用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
宫庆林: "对"十八反"的我见", 《中兽医学杂志》 *
张喜云，李戈，钟国城: "调和承气汤治疗急症胃腹痛150例临床观察", 《中国中西医结合消化杂志》 *

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