CN1729394A - 薄型分析用具 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种配置有试药部(33)而且具备有用于保持试料液的反应空间(6)的分析用具(1)。试药部(33)构成为在所述反应空间(6)内保持试料液时溶解。反应空间(6)的一部分被互相相对的第一以及第二面(31c、5a)所规定,而且将所述第一以及第二面(31c、5a)的相对距离(H1)设定在45μm以下。相对距离(H1)例如被定为从所述第一或者第二电极(31、32)的上面(31c、32c)到所述第二板材(5)的与该电极(31、32)的上面(31c、32c)相对的部分(5a)为止的最小距离。
Description
技术领域
本发明涉及在分析血液等试料液中的特定成分(例如葡萄糖、胆固醇)的浓度时所使用的分析用具。
背景技术
对于糖尿病患者来说,为了管理血糖值而在平日掌握自己的血糖值是很重要的。但由于频繁地到医院去是非常麻烦的,所以一种患者可以自己进行简单血糖值测定且在外出时也可以轻松进行血糖值测定的、能够放在手掌里那样大小的便携式简易血糖值测定装置就得到了应用。对于使用这种血糖值测定装置进行的血糖测定,是将提供酶反应场的葡萄糖传感器安装在血糖值测定装置上、并通过向葡萄糖传感器提供血液(检体)来进行的。
作为葡萄糖传感器,构成为使用安培法或者库仑法为代表的电化学方法来在简易血糖值测定装置中测定葡萄糖浓度。这种葡萄糖传感器例如构成为包括一对电极(作用极以及对极)、试药层、以及将该试药层收容在内部的毛细管。
在采用安培法的情况下,作用极以及对极例如横向排列在同一平面,或者互相相对配置;在采用库仑法的情况下,作用极以及对极一般以相对的方式配置。试药层构成为含有氧化还原酶以及电子传导物质,通常,采用GOD作为氧化还原酶,采用铁氰化钾作为电子传导物质。在这种葡萄糖传感器中,当利用毛细管向试药层供给检体时,通过氧化还原酶,例如使葡萄糖的氧化反应被得到催化,而电子传导物质的还原反应得到催化。
对于向葡萄糖传感器的血液供给,一般是通过切开测定者的皮肤使血液流出,并将该血液导入葡萄糖传感器来进行的。在该方法中,从减小血液采取对测定者的负担的角度出发,优选应采取的血液量较少。因此,为了降低检体量而进行了各种改良研究(例如参照日本国特表2000-509507号公报以及美国专利申请公开第2002/0092612号说明书)。
在日本国特表2000-509507号公报中,揭示有一种相对配置作用极以及对极、并使电极间的距离在50μm以下的葡萄糖传感器,使得能够利用库仑法以较少的样本量来测定葡萄糖浓度。在该葡萄糖传感器中,虽然能够减少应使用的血液量,但是因为库仑法是使几乎所有的葡萄糖反应的方法,所以存在测定时间明显变长的问题。
与其相对,在美国专利申请公开第2002/0092612号说明书中,揭示有一种将样本量减少至1.5μm以下、并将测定时间缩短为十秒的葡萄糖传感器。在该葡萄糖传感器中,在基板和盖体之间形成有配置了作用极、对极以及试药层的毛细管,使基板和盖体之间的距离在200μm以下。在该葡萄糖传感器中,试药层例如以包含葡萄糖氧化酶以及铁氰化物的状态而被固定在作用极的表面,并呈非水溶性。
然而,即使对于美国专利申请公开第2002/0092612号说明书所揭示的葡萄糖传感器,也很难就判断已经充分缩短了测定时间,此外,在测定精度上仍有改进的余地。
发明内容
本发明的目的在于能够缩短测定时间、并能够通过微量的试料液高精度地进行浓度测定。
本发明者为了实现上述目的而进行了仔细研究的结果是,注意到现有葡萄糖传感器不能缩短测定时间的原因之一在于试药层的结构上这一点,从而完成了本发明。
即,在现有葡萄糖传感器的试药层上,由于将试药层固定在作用极的表面,所以葡萄糖与葡萄糖氧化酶的反应仅仅发生在作用极的表面,葡萄糖与葡萄糖氧化酶的反应需要时间,所以测定时间变长。为了消除这种不良情况,可以考虑通过试料液(血液)而易于溶解试药层的结构。在这种情况下,由于电子传导物质在试料液(血液)中扩散,所以有必要排除影响电子传导物质扩散的因子,例如试料液中的固体成分(血液中的血球成分等)的比例的影响,或者排除试料液温度的影响。此外,如果使用铁氰化物那种对血液的溶解性较小的物质,则溶解时间变长,从而测定时间变长。
本发明者还得到了改善以下说明的几点会有利于提高测定精度这样的结论。即,第一,如果使用铁氰化物那种对血液的溶解性较小的物质,则会因为溶解性偏差而造成测定精度恶化。另外,铁氰化物的保存性差,在保存时容易转化为还原体,在这一点上也存在测定精度下降的问题。第二,由于葡萄糖氧化酶与葡萄糖的反应速度较小(Km(米氏常数)大),所以,使用葡萄糖氧化酶对缩短测定时间是不理想的。
鉴于以上的情况,在本发明中,提供了一种薄型分析用具,它是具备用于保持试料液的反应空间的分析用具,其中,在所述反应空间配置有当保持有试料液时便溶解的试药部,上述反应空间的一部分由互相相对的第一以及第二面所规定,而且将上述第一以及第二面的相对距离设定为45μm以下。相对距离优选在25~45μm的范围。
本发明的薄型分析用具,例如构成为具有以互相相对的状态隔开间隔而配置的、并规定上述反应空间的第一以及第二板材。在这种情况下,第一以及第二面是沿着例如与第一以及第二板材的厚度方向垂直的方向而扩展的面。
本发明的薄型分析用具,构成为例如还具有第一以及第二电极,被设置在第一板材的一面上、并且至少一部分邻接反应空间,同时,用于向试料液施加电压而被利用。在这种情况下,相对距离被定义为从第一或者第二电极的上面(例如相当于第一面),到第二板材的与该电极的上面相对的部分(例如相当于第二面)的最小距离。
本发明的薄型分析用具,可以构成为还具有设置在第一板材上的第一电极,以及以与第一电极相对的方式而被设置在第二板材上、并用于与第一电极一起向试料液施加电压而被利用的第二电极。在这种情况下,相对距离被定义为第一电极的上面(例如相当于第一面)与第二电极的上面(例如相当于第二面)之间的最小距离。
反应空间构成为例如可以通过毛细管力而使试药移动。优选使用Ru化合物作为电子传导物质。能够使用下述化学式(1)所表示的物质作为Ru化合物,
[Ru(NH3)5X]n+ …… (1),
在化学式(1)中,X为NH3、卤离子、CN、吡啶、烟酰胺、或者H2O。化学式(1)的n+表示由X的种类所决定的氧化型Ru(III)络合体的价数。
在分析对象成分是葡萄糖的情况下,优选使用具有葡萄糖脱氢活性的的GDH作为氧化还原酶。优选使用以FAD作为补缺因子的葡萄糖脱氢酶(αGDH)作为GDH。另外,优选使用细胞色素C与αGDH接合的GDH(CyGDH)作为GDH。作为CyGDH以及αGDH可以列举出在国际公开第WO02/36779号小册子中公开的物质。虽然优选使用来源于属于伯克霍尔德菌属的微生物的GDH作为GDH,但是也可以使用来源于与CyGDH以及αGDH相同具有FAD以及细胞色素C的其他类的微生物的GDH作为GDH。作为其他类的例子,可以举出Ralstonia类或者Pseudomonas类中具有病原性的革兰(Gram)阴性菌。
例如αGDH是包含作为具有葡萄糖脱氢活性的辅助单元,而在还原条件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝胶电泳的分子量约为60kDa的GDH活性蛋白质(α辅助单元)。另外,CyGDH是包含α辅助单元以及在还原条件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝胶电泳的分子量约为43kDa的电子传递蛋白质(细胞色素C)而作为辅助单元的。可以使用还具有α辅助单元和细胞色素C以外的辅助单元作为αGDH或者CyGDH。
CyGDH可以通过精制例如属于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)的微生物分泌到菌体外的酶,或者精制该菌体的菌体内酶而得到。另外,αGDH可以通过形成植入将从属于洋葱伯克霍尔德菌的微生物中采取的αGDH编码的遗传基因形质转换体,精制从形质转换体向外部分泌的酶,或者精制该形质转换体的菌体内酶而得到。
作为属于洋葱伯克霍尔德菌的微生物,例如可以使用洋葱伯克霍尔德菌KSI株。该KSI株以微生物受托号第FERM BP-7306号而于平成12年9月25日被寄托在独立专利法人产业技术综合研究所专利寄托中心(
305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。
作为试料液,可以举出例如血液、尿、唾液以及其他调整液等的生化试料液,作为分析对象成分可以举出葡萄糖、胆固醇、乳酸以及抗坏血酸。
附图说明
图1是本发明的生物传感器的整体立体图。
图2是沿着图1的II-II线的截面图。
图3是图1所示生物传感器的分解立体图。
图4是表示将图1至图3所示的生物传感器安装到浓度测定装置的状态的图,对于生物传感器是用平面图表示,而对于浓度测定装置是用框图表示。
图5A以及图5B是用于说明生物传感器的作用的图,是生物传感器的主要部分的截面图。
图6A以及图6B表示的是生物传感器的其他例子的图。
图7表示的是血液的血细胞比容值对本方案的生物传感器1的影响的图。
图8表示的是血液的血细胞比容值对本方案的生物传感器2的影响的图。
图9表示的是血液的血细胞比容值对比较生物传感器1的影响的图。
图10表示的是血液的温度对本方案的生物传感器1的影响的图。
图11表示的是血液的温度对本方案的生物传感器2的影响的图。
图12表示的是血液的温度对比较生物传感器1的影响的图。
图13表示的是对本方案的生物传感器1的测定范围的评价结果的图
图14表示的是将对本方案的生物传感器3的再现性作为响应电流的时间变化曲线来评价的结果的图。
图15表示的是将对本方案的生物传感器4的再现性作为响应电流的时间变化曲线来评价的结果的图。
图16表示的是将对比较生物传感器1的再现性作为响应电流的时间变化曲线来评价的结果的图。
图17表示的是将对本方案的生物传感器3、生物传感器4以及比较生物传感器2的再现性作为C.V.的时间变化曲线来评价的结果的图。
具体实施方式
以下,参照附图对用于实施本发明的最佳方式进行具体说明。在本实施方式中,虽然以构成为测定血糖值的葡萄糖传感器为例进行说明,但是本发明并不局限于测定血糖值的情况,也能够适用于分析血液中的其他成分或者血液以外的试料液的分析用具。
图1至图3所示的葡萄糖传感器1是安装在浓度测定装置2上来使用的(参照图4),具有介于隔板4而在矩形的基板3上层叠有盖体5的形态。在该葡萄糖传感器1中,由各要素3~5规定反应空间6。该反应空间6被规定为具有矩形截面的柱形空间,能够利用毛细管力使从开口部(导入口)61导入的试料液移动,并保持导入的试料液。
隔板4用于规定从基板3的上面30到盖体5的下面5a的距离,即反应空间6的高度尺寸。在该隔板4上形成有前端部开放的切口41。切口41用于规定反应空间6的宽度尺寸,切口41的前端的开放部用于构成使试料液导入反应空间6的内部的导入口61。
盖体5具有排气口51。排气口51用于将反应空间6的内部气体排出到外部,其与反应空间6的内部连通。因此,当经由导入口61向反应空间6内导入试料液时,依靠在反应空间6内产生的毛细管力,使试料液在反应空间6的内部向着在盖体5上形成的排气口51移动。
如图3所清楚地表示那样,在基板3的上面30形成有作用极31、对极32以及试药部33。作用极31以及对极32作为整体而沿着基板3的长度方向延伸。作用极31以及对极32的端部31a、32a沿着基板3的宽度方向延伸且并列于长度方向。另一方面,作用极31以及对极32的端部31b、32b构成用于与后述浓度测定装置2的第一以及第二端子20a、20b(参照图4)接触的端子部。
作用极31以及对极32例如通过丝网印刷、镀、或者溅射而使得厚度尺寸D(参照图2)在20μm以下。优选将作用极31以及对极32的厚度尺寸D设定在1~10μm。将从作用极31的上面31c到盖体5的下面5a的相对距离H1(参照图2)设定在45μm以下,优选在25~45μm。这是因为若相对距离H1不合适地过大,则如后述那样容易受到血液温度和血细胞比容值的影响,相反,若相对距离H1不合适地过小,则不能使血液在反应空间6的内部适当移动。
试药部33形成为例如含有媒介物(电子传递物质)以及相对较少的氧化还原酶的固体状态,如图2以及图3清楚地表示那样,以搭桥作用极31以及对极32的端部31a、32a的方式来设置。该试药部33采用容易溶解于血液的物质。因此,在将血液导入到反应空间6内的情况下,构筑成包含媒介物、氧化还原酶以及葡萄糖的液相反应体系。在该液相反应体系中,不仅在作用极31的上面31c,而且在反应空间6的大范围内均发生葡萄糖的氧化反应以及电子传递物质的还原反应。因此,与在作用极的表面固定媒介物和氧化还原酶的情况相比,能够以更短的时间使更多的葡萄糖氧化。从而能够缩短测定时间。
优选使用Ru化合物作为媒介物。作为Ru化合物,例如列举有Ru络合体。作为Ru络合体,虽然只要是能够作为电子传递物质而起作用即可,对其配位子的种类没有特别的限定,但是优选以氧化型的状态而被包含于试药部33,例如氧化型使用下述化学式(2)所示的物质,
[Ru(NH3)5X]n+ …… (2)。
作为在化学式(2)中的X,虽然列举出NH3、卤离子、CN、吡啶、烟酰胺或者H2O,但是优选NH3或者卤离子。另一方面,在化学式中的n+表示由X的种类所决定的氧化型(III)络合体的价数。
因为还原型(II)不稳定,所以Ru络合体通常以氧化型(III)而存在着。因此,即使在葡萄糖传感器1的试药部33上使Ru络合体混合存在的状态下而暴露在光或者水中,媒介物也不会简单还原。因此能够抑制因媒介物的暴露而产生的测定误差。此外,Ru络合体还具有不容易结晶而能够适当地维持在微粉末状态的特性。因此,若使用Ru络合体,则在保存时试药部33的溶解性不会恶化。而且,对于Ru络合体和αGDH或者CyGDH的组合来说,由于Ru络合体的电子传递速度高,所以具有能够缩短测定时间的优点。
如图4所示的那样,浓度测定装置2包括:第一以及第二端子20a、20b,电压施加部21,电流值测定部22,检测部23,控制部24,计算部25,以及显示部26。
第一以及第二端子20a、20b在将葡萄糖传感器1安装在浓度测定装置2上时,用于与葡萄糖传感器1的作用极31以及对极32的端部31b、32b接触。
电压施加部21使用在经由第一以及第二端子20a、20b向葡萄糖传感器1的作用极31以及对极32之间施加电压时。作为电压施加部21例如可以采用干电池或者蓄电池等直流电源。
电流值测定部22用于将在向作用极31以及对极32之间施加电压时的作用极31和电子传递物质之间的电子授受量作为响应电流值来测定。
检测部23在将葡萄糖传感器1安装在浓度测定装置2上后,用于基于电流值测定部22所测定的电流值来确认是否向试药部33(参照图1到图3)供给有试料液。
控制部24控制电压施加部21,选择在作用极31以及对极32之间施加电压的状态(闭回路)和不施加电压的状态。
计算部25根据由电流值测定部22测定的响应电流值来进行葡萄糖浓度的计算。计算部25构成为例如能够通过安培法来计算葡萄糖浓度。如果使用安培法的话,则与库仑法相比,能够在短时间进行浓度测定。
虽然检测部23、控制部24以及计算部25各自例如由CPU以及ROM或者RAM等存储器构成,但是也可以通过向一个CPU连接多个存储器而构成检测部23、控制部24以及计算部25的整体。
显示部26除了用于显示计算部25得到的计算结果外,例如还显示错误信息和操作顺序等,例如由液晶显示装置构成。
接下来,对使用葡萄糖传感器1以及浓度测定装置2进行的葡萄糖浓度的测定顺序进行说明。
如图4所清楚表示的那样,首先将葡萄糖传感器1安装在浓度测定装置2上。这样的话,葡萄糖传感器1的作用极31以及对极32的端部31b、32b与浓度测定装置2的第一以及第二端子20a、20b接触。在该状态下,可以经由第一以及第二端子20a、20b向作用极31以及对极32之间施加电压。在实际测定中,从葡萄糖传感器1被安装在浓度测定装置2上的时候起,向作用极31和对极32之间施加电压。由于Ru络合体在低电压时会产生媒介作用(mediation),所以在使用Ru络合体的情况下,施加在作用极31以及对极32之间的定电压例如被设定在100~500μm的范围内。在本实施方式中,向作用极31以及对极32之间的定电压的施加,一直持续到用于计算葡萄糖浓度的响应电流值被测定为止。
接下来,通过葡萄糖传感器1的导入口61将血液导入到反应空间6内。血液在反应空间6内通过毛细管力而从导入口61向着形成于盖体5上的排气口51行进。在这个过程中,血液使试药33溶解。
另一方面,若向试药部33供给血液,则通过氧化还原酶而使葡萄糖被氧化为葡糖酸内脂,同时,使媒介物成为还原型。其中,葡糖酸内脂成为非酶的葡糖酸。
还原型的媒介物在经由作用极31以及对极32的端部31b、32b向作用极31以及对极32施加定电压的状态下,向作用极的端部31a侧移动,向该端部31a放出电子而成为氧化型的媒介物。所以,在通过电压施加部21向作用极31以及对极32之间施加定电压的状态下,从还原型媒介物所给与的电子量经由作用极31以及第一端子20a,在电流值测定部22作为响应电流值而被测定。该响应电流值与源于通过施加电压而在试药部33移动了的还原型的媒介物有关,被称为所谓的扩散电流。
另一方面,在电流值测定部22中所测定的响应电流值,在检测部23中被监视,当响应电流值超过阈值时,检测部23检测出血液被供给到试药部33,试药部33溶解。在检测部23检测到供给了血液的情况下,通过检测部23来判断从该检测起是否经过了一定的时间。
当在检测部23判断出经过了一定时间的情况下,在电流值测定部22测定响应电流值,基于该响应电流值来在计算部25中计算葡萄糖浓度。葡萄糖的计算是在将响应电流值换算为电压值之后,通过将该电压值与预先作成的表示电压值和葡萄糖浓度之间关系的检测线对比来计算的。将计算部25的计算结果例如显示在显示部26。
虽然与作用极31接触的还原型媒介物立刻向作用极31放出电子而成为氧化型,但是也可以是距离作用极31一定距离的还原型媒介物向作用极31放出电子而成为氧化型。以下,将还原型媒介物能够向作用极31放出电子的区域称为放出电子区域,而将还原型媒介物不能向作用极31放出电子的区域称为非放出电子区域。
如从后述实施例推测的那样,放出电子区域距离作用极的表面的距离不小于45μm。因此,如图5A所示那样,当从作用极31的上面31c到盖体5的下面5a的相对距离H1较大时,例如相对距离H1在50μm以上的情况下,在作用极31的正上方,在电子放出区域70的上方存在非放出电子区域71。
与其相对,如本专利申请的葡萄糖传感器1那样,当将从作用极31的上面31c到盖体5的下面5a的相对距离H1设定在45μm以下的情况下,如图5B所示那样,位于电子放出区域70的作用极31的正上方部分的厚度尺寸(以下简称为“放出电子区域70的厚度尺寸”)与相对距离H1一致,该放出电子区域70的厚度尺寸与图5A所示的情况相同或者比其小。
这样,在相对距离H1较大的情况下(参照图5A)和相对距离H1较小的情况下(参照图5B),作用极31的正上方的状况是不同的。其结果,也可以如从后述本发明的实施例推测的那样,因为相对距离H1的大小不同,所以还原型媒介物消耗的状况也不同。
这里,在不施加电压的状态下,认为存在于放出电子区域的还原型媒介物(以下称“非扩散媒介物”)的浓度与存在于非放出电子区域的还原型媒介物(以下称“扩散媒介物”)的浓度是相同的。
在图5所示的相对距离H1较大的情况下,因为放出电子区域70(被虚线包围的部分)的厚度尺寸大,所以在施加电压时,非扩散媒介物不会被全部氧化。所以,非扩散媒介物只消耗一定量,因此,在放出电子区域70和非放出电子区域71之间产生了还原型媒介物的浓度差。因此,扩散媒介物从其上方以及侧面向放出电子区域70扩散。然后,存在于放出电子区域70的还原型媒介物的氧化以及向放出电子区域70的媒介物的扩散重叠地产生。因此,在相对距离H1较大的情况下,大致划分为:初期是非扩媒介物的消耗,中期是非扩散媒介物以及扩散媒介物的消耗,后期是扩散媒介物的消耗的过程。
这里,扩散媒介物的扩散速度除了受放出电子区域70与非放出电子区域71之间的还原型媒介物浓度差影响外,还受扩散媒体(血液)的温度或者移动阻抗(血液的血细胞比容值)的影响。所以,在相对距离H1较大的情况下,血液的温度或者血细胞比容值的影响随时间而逐渐变大。
与其相对,在相对距离H1较小的情况下(参照图5B),因为放出电子区域70的厚度尺寸较小,所以非扩散媒介物在初期几乎全部被消耗,接下来,产生扩散媒介物向放出电子区域的扩散以及消耗。因此,在相对距离H1较小的情况下,大致划分为:初期是非扩散媒介物的消耗,后期是扩散媒介物的消耗的过程。因此,在相对距离H1较小的情况下,可以分为不容易受到血液温度或者血细胞比容值影响的阶段和受它们影响较大的阶段。
在相对距离H1与放出电子区域的厚度尺寸一致的情况下,扩散媒介物向放出电子区域的扩散只从放出电子区域的侧面进行。因此,与相对距离H1比放出电子区域的尺寸大、扩散媒介物从放出电子区域的侧面以及上方扩散的情况相比,可以说在相对距离H1较小的情况下,扩散媒介物的扩散速度等对测定电流值的影响较小。特别是,在不容易受到血液温度或者血细胞比容值影响的阶段,扩散媒介物的举动对测定电流值的影响小。因此,若使相对距离H1与放出电子区域的厚度尺寸相同或者比其小,则难以受到血液温度或者血细胞比容值影响,在从施加电压开始的短时间范围内(测定时间短的范围)的再现性良好。
本发明的葡萄糖传感器不限于上述实施方式,可以进行各种设计变更。例如,作用极31以及对极32只要至少一部分在反应空间6内即可,例如可以采用图6A以及图6B所示的结构。
图6A所示的葡萄糖传感器1’在基板3’上形成有凹部35’、36’,在该凹部35’、36’内埋设形成有作用极31’以及对极32’。
作用极31’以及对极32’的上面31c’、32c’既可以如图示那样与基板3’的上面30’是同一个面,也可与基板3’的上面不是同一个面。
在该葡萄糖传感器1’中,相对距离H1’被定义为从作用极31’的上面31c’到盖体5的下面5a’的距离,在作用极31’以及对极32’的上面31c’、32c’与基板3’的上面30’是同一个面的情况下,相对距离H1’与基板3’和盖体5’之间的距离H2’一致。
另一方面,图6B所示的葡萄糖传感器1”是在基板3”上形成有作用极31”,在盖体5”上形成有对极32”的结构。当然,也可以在基板上形成对极,在盖体上形成作用极。
在该的葡萄糖传感器1”中,相对距离H1”被定义为作用极31”的上面31c”和对极32”的上面32c”之间的距离。
本发明并不局限于通过隔板来规定反应空间的高度尺寸的分析用具,也可以适用于在形成有作为反应空间的凹部的基板上接合盖体而构成的分析用具。
(实施例)
以下,通过实施例1~4,对本发明的葡萄糖传感器在测定响应电流值时,受血液中的血球和温度的影响小、以及能够在短时间内高精度地测定葡萄糖浓度这一点进行说明。
(葡萄糖传感器的制作)
在实施例1~4中,是使用与图1至图3所示相同结构的葡萄糖传感器来进行评价的。在各实施例中使用的葡萄糖传感器的反应空间6的长度尺寸L(参照图2)、宽度尺寸W(参照图1)、作用极31以及对极32的厚度尺寸D(参照图2)为3.4mm、1.5mm、10μm。对于葡萄糖传感器的相对距离H1、基板3与盖体5之间的距离H2(参照图2)、以及试药部33的结构,如下表1所示。
表1
葡萄糖传感器的结构 | |||
相对距离H1 | 反应空间的高度尺寸H2 | 试药部的结构 | |
本案葡萄糖传感器1 | 23μm | 33μm | 含酶层/电子传递层 |
本案葡萄糖传感器2 | 35μm | 45μm | 含酶层/电子传递层 |
本案葡萄糖传感器3 | 23μm | 33μm | 仅有液相电子传递层 |
本案葡萄糖传感器4 | 44μm | 54μm | 仅有液相电子传递层 |
比较葡萄糖传感器1 | 47μm | 57μm | 含酶层/电子传递层 |
比较葡萄糖传感器2 | 47μm | 57μm | 仅有液相电子传递层 |
对于本案葡萄糖传感器1、2以及比较葡萄糖传感器1来说,试药部33采用的是由电子传递层以及含酶层所组成的双层结构。电子传递层通过在基板3上涂敷0.4μL含有电子传递物质的第一材料液后、对第一材料液进行送风干燥(30℃、10%Rh)而形成。含酶层通过在电子传递层上涂敷0.3μL含氧化还原酶的第二材料液后、对第二材料液进行送风干燥(30℃、10%Rh)而形成。
第一材料液通过这样调制而成:将按照其号码顺序混合下表2的①~④所示的材料的混合液放置1~3天后,向该混合液添加电子传递物质。使用[Ru(NH3)6]Cl3(同仁化学研究所制“LM722”)作为电子传递物质。
表2:第一材料液的组成(除电子传递物质)
①SWN溶液 | ②CHAPS溶液 | ③蒸馏水 | ④ACES溶液 | |||
浓度 | 容量 | 浓度 | 容量 | 浓度 | 容量 | |
1.2% | 250μL | 10% | 25μL | 225μL | 200mM | 500μL |
在表2等中,SWN是产品“ル一センタイトSWN”的缩写,而CHAPS是3-[(胆氨基丙基)二甲氨]丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)的缩写,ACES是N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid)的缩写。使用コンプケミカル(株)制的“3150”作为SWN,使用同仁化学研究所制的“KC062”作为CHAPS,使用同仁化学研究所制的“ED067”作为ACES。另外,将ACES溶液调制成pH为7.5。
另外,第二材料液通过使氧化还原酶溶解于0.1%的CHAPS中而调制成。使用CyGDH(葡萄糖脱氢活性为800U/mg)作为氧化还原酶。对于CyGDH来说,是如上述那样的。
与其相对,对于本案葡萄糖传感器3、4以及比较葡萄糖传感器2,是试药部3采用铁氰化钾与氰亚铁酸钾共存的结构。这是为了除去氧化还原酶的催化能等其他因素的影响,而单纯地判断相对距离H1的高度对再现性的影响。更加具体地说,试药部33通过使材料液在基板3上保持而形成液相。使用按照铁氰化钾为20mM、氰亚铁酸钾为24mM、氯化钾为1.5M那样调制而成的液体作为材料液。
实施例1(血细胞比容值的影响的研究)
在本实施例中,使用本案葡萄糖传感器1、2以及比较葡萄糖传感器1来评价血细胞比容值(Hct值)对响应电流值的影响。
在该评价中,作为血液,使用葡萄糖浓度为412mg/dL、Hct值为19%、42%或者69%中的任意一个。
向作用极31和对极32之间施加电压,使施加电压值为200mV并与供应血液同时开始,在从开始施加电压起的五秒、七秒以及十秒后测定响应电流值。对各个Hct值的血液各测五次响应电流值。
对于响应电流值的测定结果,在图7、图8、图9中分别表示本案葡萄糖传感器1、本案葡萄糖传感器2、比较葡萄糖传感器1。另外,在图7~图9中,横轴表示时间(sec)、纵轴表示Bias(%)。Bias(%)是以Hct值为42%时的响应电流值为基准值,相对该基准值的偏移量,在各图中,Bias(%)表示五次测定的平均值。
通过比较图7~图9可知,不论施加电压的时间如何,具有相对距离H1越小、则Bias(%)越小的倾向。因此,可知具有相对距离H1越小、则Hct值的影响越小的倾向。
实施例2(温度的影响)
在本实施例中,使用本案葡萄糖传感器1、2以及比较葡萄糖传感器1来评价血液温度(Hct值)对响应电流值的影响。
在该评价中,作为血液使用Hct值为42%,葡萄糖浓度为100mg/dL、422.0mg/dL、或者636.0mg/dL中的任意一个,而使温度为5℃、25℃或者45℃。
向作用极31和对极32之间的电压施加是以200mV为施加电压值并从血液的供应起开始进行的,响应电流值是在开始施加电压起五秒后测定的。对各葡萄糖浓度的血液各测定五次响应电流值。
对于响应电流值的测定结果,在图10、图11、图12中分别表示本案葡萄糖传感器1、本案葡萄糖传感器2、比较葡萄糖传感器1。另外,在图10~图12中,以横轴表示温度(℃)、纵轴表示Bias(%)来分别表示各葡萄糖浓度。Bias(%)表示的是以温度为25℃时的响应电流值为基准值,相对该基准值的偏移量,在各图中,Bias(%)表示五次测定的平均值。
通过比较图10~图12可知,不论葡萄糖浓度以及施加电压的时间如何,具有相对距离H1越小、则Bias(%)越小的倾向。所以,可知具有相对距离H1越小、则血液温度的影响越小的倾向。
实施例3(测定范围的评价)
在本实施例中,使用本案葡萄糖传感器1对测定范围进行了评价。通过葡萄糖浓度和响应电流值之间的关系(线性)评价了测定范围。
在该评价中,使用Hct值为42%,葡萄糖浓度为0mg/dL、100mg/dL、200mg/dL、400mg/dL、610mg/dL、805mg/dL或者980mg/dL的血液。向作用极31和对极32之间的电压施加,是以施加的电压值为200mV而从供应血液起开始进行的,在从电压的施加起三秒后测定响应电流值。对每个葡萄糖浓度的血液各测十次响应电流值。
响应电流值的测定结果表示在图13中。但是,在图13中,响应电流值(μA)表示的是十次测定的平均值。
从图13中可以得知,在葡萄糖传感器1中,在葡萄糖浓度为0~1000mg/dL的范围内表现出很高的直线性,可以说即使在葡萄糖浓度较大的情况下(大于600mg/dL),也可以良好地测定葡萄糖浓度。因此,如本案葡萄糖传感器1所示那样,若使用CyGDH作为氧化还原酶,使用Ru络合体作为媒介物,则即使相对距离H1设定得小,也可以在三秒左右的短时间内良好地测定0~1000mg/dL范围内的葡萄糖浓度。
实施例4(再现性的评价)
在本实施例中,使用本案葡萄糖传感器3、4以及比较葡萄糖传感器2,基于多次的响应电流值测定的时间变化过程以及相对标准差C.V(%)的时间变化过程来评价响应电流值的再现性。
在该评价中,使用Hct值为42%,葡萄糖浓度为412mg/dL的血液。向作用极31和对极32之间的电压施加是以所施加电压值为200mV而从血液的供给起五秒后开始进行的,从开始施加电压开始,每隔50msec测定一次响应电流值。
时间变化曲线的测定结果表示在图14~图16中。在这些图中,同时表示五次测定的响应电流值的时间变化曲线,图14、图15、图16中分别表示本案葡萄糖传感器3、本案葡萄糖传感器4、比较葡萄糖传感器2。另外,图17表示C.V(%)的时间变化曲线。该时间变化曲线基于为了得到响应电流值的时间变化曲线而进行的五次响应电流值的测定而制成。
从图14~图16可知,在本案葡萄糖传感器3、4中,与比较葡萄糖传感器2相同,在响应电流值上几乎看不到偏差,能够在多次测定中得到良好的再现性。另外,从图17可知,在本案葡萄糖传感器3中,在施加电压开始的初期、即从开始施加电压的0.5~3.0(sec)的时间范围内,与本案葡萄糖传感器4以及比较葡萄糖传感器2相比,C.V.小,C.V.值大约小于2.5%。在本案葡萄糖传感器4中,在从开始施加电压起3.0~7.0(sec)的时间范围内,与比较葡萄糖传感器2相比,C.V.小,C.V.值大约小于2.5%。从这些结果可知,如果相对距离H1设定得小,则在开始施加电压起的很短的时间范围内,再现性良好。所以,从再现性的角度出发,可以说将相对距离H1设定得较小的葡萄糖传感器适于短时间的测定。
Claims (18)
1.一种薄型分析用具,它是具备用于保持试料液的反应空间的分析用具,其特征在于:
在所述反应空间配置有当保持有试料液时溶解的试药部,
所述反应空间的一部分由互相相对的第一以及第二面所规定,而且将所述第一以及第二面的相对距离设定为45μm以下。
2.如权利要求1所述的薄型分析用具,其特征在于:
具有以互相相对的状态隔开间隔而配置的、并规定所述反应空间的第一以及第二板材,
所述第一以及第二面是沿着与所述第一以及第二板材的厚度方向垂直的方向而扩展的面。
3.如权利要求2所述的薄型分析用具,其特征在于:
还具有第一以及第二电极,被设置在所述第一板材的一面上、并且至少一部分邻接所述反应空间,同时,用于向试料液施加电压而被利用,
所述相对距离是从所述第一或者第二电极的上面到所述第二板材的与该电极的上面相对部分的最小距离。
4.如权利要求3所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述相对距离在25~45μm的范围内。
5.如权利要求2所述的薄型分析用具,其特征在于:
还具有设置在所述第一板材上的第一电极,以及以与所述第一电极相对的方式而被设置在所述第二板材上、并用于与所述第一电极一起向试料液施加电压而被利用的第二电极,
所述相对距离为所述第一电极与所述第二电极之间的最小距离。
6.如权利要求5所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述相对距离在25~45μm的范围内。
7.如权利要求1所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述反应空间构成为通过毛细管力来使试料移动。
8.如权利要求1所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述试药部包含电子传递物质以及氧化还原酶。
9.如权利要求8所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述电子传递物质为Ru化合物。
10.如权利要求9所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述Ru化合物是以下述化学式(1)所表示的物质:
[Ru(NH3)5X]n+ ……(1),
在所述化学式(1)中,X为NH3、卤离子、CN、吡啶、烟酰胺或者H2O,n+表示由X的种类所决定的氧化型Ru(III)络合体的价数。
11.如权利要求10所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述化学式(1)的X为NH3或者卤离子。
12.如权利要求8所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述氧化还原酶具有葡萄糖脱氢活性。
13.如权利要求12所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述氧化还原酶是来源于属于伯克霍尔德菌属的微生物的葡萄糖脱氢酶。
14.如权利要求13所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述氧化还原酶具有葡萄糖脱氢活性,而且具有在还原条件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝胶电泳的分子量约为60kDa的α辅助单元。
15.如权利要求14所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述氧化还原酶具有在所述还原条件下的SDS-聚丙烯酰酸胺凝胶电泳的分子量约为43kDa的细胞色素C。
16.如权利要求8所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述电子传递物质是Ru化合物,
所述氧化还原酶是来源于属于伯克霍尔德菌属的微生物的葡萄糖脱氢酶。
17.如权利要求16所述的薄型分析用具,其特征在于:
所述Ru化合物是以下述化学式(2)所表示的物质,
所述氧化还原酶具有葡萄糖脱氢活性,而且具有在还原条件下的SDS-聚丙烯酸酰胺凝胶电泳的分子量约为60kDa的α辅助单元,以及在所述还原条件下的SDS-聚丙烯酰酸胺凝胶电泳的分子量约为43kDa的细胞色素C,
[Ru(NH3)5X]n+ ……(2),
在化学式(2)中的X为NH3、卤离子、CN、吡啶、烟酰胺、或者H2O,n+表示由X的种类所决定的氧化型Ru(III)络合体的价数。
18.如权利要求1所述的薄型分析用具,其特征在于:
使用血液、尿、唾液或者它们的调整液等的生化试料液作为试料液,构成为能够分析葡萄糖、胆固醇、乳酸或者抗坏血酸。
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