CN1728950A - 新颖的食物制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种涉及到至少一个加热步骤的食物制品制造方法，所述方法包括将一种或多种酶加入到所述生产方法的所述食物制品的中间产物形式中去，其中，所述的酶在加热步骤之前加入，酶的加入量对降低存在于所述食物制品的所述中间产物形式中涉及所述加热步骤中丙烯酰胺形成的氨基酸的水平是有效的。本发明还涉及从本发明的方法获得的食物制品。

Description

新颖的食物制造方法
本发明涉及制造食物制品的方法和由此获得的食物制品，所述方法涉及至少一个加热步骤。此外，本发明涉及适合于根据本发明的方法的新颖的酶，以及新鉴定出来的包含编码所述新颖的酶的基因的多核苷酸序列。
对丙烯酰胺进行商业生产已经有很长的时间了，其被用于很多不同的技术应用，因此，人们已对其毒性学背景进行了很好的评价。丙烯酰胺被用于生产聚丙烯酰胺，后种化合物被应用于饮用水生产、土壤稳定、工业废水处理和油脂提炼(winning)以及实验室应用。
丙烯酰胺被认为可能对动物和人类致癌。1991年，食品科学委员会已调查过接触食物材料的单体丙烯酰胺，在其评价中，丙烯酰胺被推断为遗传毒性致癌物。Bergmark et al.(Chem.Res.Toxicol.，10.78-84(1997))指出，丙烯酰胺还是烟草的烟的一种成分，这是丙烯酰胺的形成和对生物材料进行的加热之间的第一个联系。近来，丙烯酰胺在多种食物和烤箱制备的食物中的存在被公开(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13，517-522.(2000))，这引起了世界范围内的关注。进一步的研究揭示，在多种不同的烘焙、煎炸和烤箱制备的大众食物中都可检测到丙烯酰胺，并且表明食物中丙烯酰胺的存在是烘焙过程的结果。
英国对于食物制品中丙烯酰胺污染的官方限制被设定为10ppb(每千克10微克)，对很多制品来说，上面显示的值大大超过了这个设定值，尤其是谷物、面包制品和炸薯片。
在动物试验中已观察到了丙烯酰胺的服用剂量和肿瘤发生率之间的关系，其中，通过饮用水向大鼠喂饲丙烯酰胺，两年内大鼠死亡(Friedman，H.L.et al.，Fundam.Appl.Pharmacol.85：154-168.M.(1986)和Johnson et al.Toxicol.Appl.Pharmacol.85：154-168(1986))。对加入到Fischer 344大鼠的饮用水中的丙烯酰胺的慢性毒性和致瘤性的研究。
将上述数据与Tareke et.al.(其中，与血红蛋白(N-(2-氨基甲酰乙基)缬氨酸)结合的丙烯酰胺被用于研究含有丙烯酰胺的膳食对大鼠的作用)收集的结果结合起来，丙烯酰胺的每日吸收量就被计算为1.6μg丙烯酰胺/kg，这相应于人类一生暴露的癌症风险为7×10-3。
Mottram et al.Nature 419：448(2002)已提出了作为Maillard反应结果的从氨基酸和还原性糖来形成丙烯酰胺的途径。根据此假设，丙烯酰胺可以在Maillard反应期间形成。烘焙和焙烧期间，Maillard反应主要用于产生颜色、气味和味道。与Maillard反应相关的是氨基酸的Strecker降解，并且到丙烯酰胺的途径也被提出了。当温度超过120℃时，丙烯酰胺的形成就可以检测到了，在大约170℃时观察到最高的形成速率。当天冬酰胺和葡萄糖存在时，可以观察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量的丙烯酰胺。丙烯酰胺主要来自天冬酰胺和葡萄糖这个事实可以解释烤箱烹制的或焙烤的植物类制品等中丙烯酰胺的高水平。人们已知很多植物原材料都含有相当高水平的天冬酰胺。马铃薯中，天冬酰胺是占据优势的游离氨基酸(940mg/kg，相当于氨基酸总含量的40％)，在小麦面粉中，天冬酰胺以大约167mg天冬酰胺/kg面粉的水平存在，相当于游离氨基酸总量的14％(Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer NewYork，1999)。
因此，就公众健康方面而言，人们急需具有充分更低的丙烯酰胺水平或者优选完全没有丙烯酰胺的食物制品。第一个方面，已经开始了一些研究活动，以揭开食物制品中丙烯酰胺形成的机制。迄今为止，其结果还不能产生对该问题的满意解决方案。其次，食物公司正在调查通过降低烤箱烹制及焙烤过程的温度来避免丙烯酰胺形成的可能性。当然，上述改变肯定将导致食物制品具有改变的口味(较少的Maillard产物)，而且上述改变会增加微生物例如Salmonella污染增多的风险。
本发明提供了一种用于生产食物制品的方法，所述方法涉及至少一个加热步骤，所述方法包括在所述的生产过程中，将一种或多种酶加入到所述食物制品的中间产物形式中，其中，在所述加热步骤之前，将酶以一定量加入，所述的量对降低所述食物制品中的所述中间产物形式中存在的涉及所述加热步骤中丙烯酰胺形成的氨基酸的水平是有效的。
食物制品的中间产物形式在本文中被定义为：所述制造方法中，获得该食物制品的最终形式之前的所产生的任何形式。所述中间产物形式可以包含所用的原材料和/或其混合物和/或其与添加剂和/或加工助剂的混合物，或其后来经过加工的形式。例如，对食物制品面包而言，所述中间产物形式包含：例如，小麦、小麦面粉、它们与面包的其它成分的初始混合物，所述其它成分例如是水、盐、酵母和面包改良组合物、经混合的面团、经揉捏的面团、经发酵的面团和部分经烘焙的面团。
所述食物制品可制自至少一种植物来源的原材料，例如，马铃薯，烟草，咖啡，可可，水稻，谷物，例如小麦、黑麦粒、玉米、大麦、去壳麦粒、荞麦和燕麦。此处和下文中的小麦都包括Triticum属的所有已知的物种，例如，aestivum、durum和/或spelta。从超过一种的原材料制得的食物制品也被包括在本发明的范围内，例如，包含小麦(面粉)和马铃薯的食物制品。根据本发明的方法可适用的食物制品的例子是任何以面粉为基础的食品——例如：面包、油酥制品、蛋糕、椒盐脆饼干、面包圈、荷兰式蜜蛋糕、曲奇饼、姜面包、姜汁蛋糕和薄脆饼干，以及任何以马铃薯为基础的食品——例如：法式薯条、炸薯条、炸薯片、炸薯饼。
已知上文提到的原材料含有相当数量的涉及到所述制造方法加热步骤中丙烯酰胺形成的氨基酸。或者，上述氨基酸可以从所述食物制造方法中被用作添加剂的其它来源而不是原材料来产生，例如，从蛋白质水解物，例如酵母提取物、大豆水解物、酪蛋白水解物等来产生。优选的制造方法是对面包和其它烘焙制品的烘焙，所述其它烘焙制品是来源于小麦面粉和/或来自其它谷物来源的面粉的。另一种优选的制造方法是对来自马铃薯片的炸薯片的油炸。
优选的加热步骤是如下这些：其中，中间食物制品的至少一部分，例如，该食物制品的表面被暴露于促进丙烯酰胺形成的温度下，例如，110℃或更高，120℃或更高的温度。根据本发明的方法中的加热步骤可在烤箱中进行，例如，在180-220℃之间的温度，例如，用于对面包和其它烘焙制品的烘焙，或者，可在油中进行，例如油炸马铃薯片，例如，在在160-190℃之间。
用于本发明方法的酶优选是对涉及到制造方法中加热步骤期间丙烯酰胺形成的氨基酸的侧链进行修饰的酶，其中，所述氨基酸的降解产物不会导致丙烯酰胺的形成，或者，至少较之该氨基酸的未降解形式，更少导致丙烯酰胺形成。优选地，所述的酶对所述侧链的至少一个氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸)进行修饰。所述的酶可以作为酶制剂被添加，或者可通过能生产所述酶的微生物来原位制得。优选地，所述的酶制剂来自微生物，通过本领域内已知的发酵方法获得。所述的微生物可以是细菌、真菌或酵母。在本发明的一种优选实施方式中，所述方法包括加入天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)或谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)。
天冬酰胺酶可从多种不同的来源获得，例如从植物、动物和微生物获得，所述微生物例如Escherichia、Erwinia、Streptomyces、Pseudomonas、Aspergillus和Baccillus的种。合适的Escherichia菌株的例子是Escherichiacoli。合适的Erwinia菌株的例子是Erwinia chrysantheml。合适的Streptomyces菌株的例子是Streptomyces lividans或Streptomyces murinus。合适的Aspergillus菌株的例子是Aspergillus oryzae、Aspergillus nidulans或Aspergillus niger。合适的Bacillus菌株的例子是Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacilluscoagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillusmegateruim、Bacillus stearothemophilus、Bacillus subtilis或Bacillusthuringiensis。在WO03/083043中描述了从Bacillus、Streptomyces、Escheria或Pseudomonas菌株生产天冬酰胺酶的合适方法的例子。然而，WO03/083043并没有公开本发明所述的天冬酰胺酶降低食物中丙烯酰胺含量的用途。
优选地，使用食物级别的微生物，例如Aspergillus niger或Bacillussubtilis。
在第二个方面，本发明提供了新鉴定出来的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括编码新颖的天冬酰胺酶的基因，所述的天冬酰胺酶例如是能从Aspergillus niger来制造的。所述新颖的天冬酰胺酶可被用于本发明的制造食物的过程，例如用于从面团来制造烘焙制品。
                         多核苷酸
本发明还提供了编码新颖的天冬酰胺酶的新颖的多核苷酸。本发明提供了编码暂时被称为ASPA01的天冬酰胺酶的多核苷酸，所述天冬酰胺酶具有根据SEQ ID NO：3或其功能等同物的氨基酸序列。编码ASPA01的基因序列是通过对从Aspergillus niger获得的基因组克隆进行测序来确定的。本发明提供了包含编码ASPA01天冬酰胺酶的基因的多核苷酸序列以及包含其全长cDNA序列的多核苷酸序列和包含其编码序列的多核苷酸序列。因此，本发明涉及经过分离的包含根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其功能等同物的多核苷酸。
更具体地，本发明涉及：在严谨条件下，优选在高度严谨条件下，能与根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多核苷酸杂交的经过分离的多核苷酸。有利地，此类多核苷酸可以从丝状真菌获得，特别是从Aspergillusniger中获得。更具体地，本发明涉及下述经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
本发明还涉及下述经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据SEQID NO：3或其功能等同物的多肽的至少一个功能结构域。
在本文中使用的术语“基因”和“重组基因”指下述核酸分子：其可以从染色体DNA中分离出来，并包括编码蛋白质例如A.niger的天冬酰胺酶的开放阅读框。基因可以包括编码序列、非编码序列、内含子和调控序列。此外，基因表示如本文中定义的经过分离的核酸分子。
使用标准的分子生物学技术和本文中提供的序列信息，可以分离出本发明的核酸分子，例如，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其功能等同物的核酸分子。例如，用SEQ ID NO：1的核酸序列或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的全部或部分作为杂交探针，使用标准的杂交和克隆技术(例如，见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述)可以分离出根据本发明的核酸分子来。
此外，使用根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中含有的序列信息设计出来的合成寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，可以分离出包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的全部或部分的核酸分子。
可以用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，用适当的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术，来扩增出本发明的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析来鉴定。
此外，相应于根据本发明的核苷酸序列或者可以与根据本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸可以通过标准的合成技术来制备，例如，用自动DNA合成仪。
在一种优选的实施方式中，本发明的经过分离的核酸分子包含SEQID NO：2显示的核苷酸序列。SEQ ID NO：2的序列对应A.niger的ASPA01 cDNA的编码区域。该cDNA包含编码根据SEQ ID NO：3的A.niger ASPA01多肽的序列。
在另一种优选的实施方式中，本发明的经过分离的核酸分子包含是下述核苷酸序列的互补体的核酸分子，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所显示的或是这些核苷酸序列的功能等同物。
与另一条核苷酸序列互补的核酸分子是与所述的另外的核苷酸序列高度互补的，以至于其可以与所述的另外的核苷酸序列杂交，进而形成稳定的双链体。
本发明的一个方面涉及：编码本发明的多肽或其功能等同物例如生物活性片段或结构域的经过分离的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴别编码本发明的多肽的核酸分子的核酸分子，和适于用作对核酸分子进行的扩增或突变的PCR引物的此类核酸分子的片段。
“经过分离的多核苷酸”或“经过分离的核酸”是这样的DNA或RNA：在从其中得到所述DNA或RNA的生物体的天然存在的基因组中，所述DNA或RNA与两条(5’端的一条和3’端的一条)编码序列直接相邻，而对“经过分离的多核苷酸”或“经过分离的核酸”而言，所述DNA或RNA与这两条编码序列并不直接相邻。因此，在一种实施方式中，经过分离的核酸包括与编码序列直接相邻的5’非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。该术语因此包括，例如，被包括进载体、自主复制的质粒或病毒、原核生物或真核生物的基因组DNA等的重组DNA，或者作为不依赖其它序列的独立分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA)而存在的重组DNA。该术语还包括作为杂种基因(hybrid gene)一部分的重组DNA，所述杂种基因编码另外的多肽，所述的多肽充分去除了细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术进行生产时)，或化学前体或其它化学制品(当化学合成时)。此外，“经过分离的核酸片段”并非是天然就作为片段存在的，而且其也不能在自然状态被发现。
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”意在包括DNA分子(例如cDNA和基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物生产出的DNA或RNA类似物。所述的核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链的DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，次黄苷或硫代磷酸核苷酸)来合成所述的核酸。例如，此类寡核苷酸可被用于制备碱基配对能力有所改变或对核酸酶抗性增加的核酸。
本发明的另一种实施方式提供了经过分离的核酸分子，所述核酸分子反义于ASPA01核酸分子，例如，ASPA01核酸分子的编码链。本发明的范围内还包括了本文中描述的核酸分子的互补链。
                         测序错误
本文中提供的序列信息不应被狭义地解释为需要将非正确鉴别的碱基包括在内。可以很容易地用本文公开的特定序列从丝状真菌中分离出完整的基因，特别是从Aspergillus niger中；然后可以很容易地对所述基因进行进一步的序列分析，从而鉴别出测序的错误来。
除非另外指明，本文中所有通过对DNA分子进行测序测定出的核苷酸序列都是用自动DNA测序仪来测定的，所有由此处所确定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来预测的。因此，如本领域内所已知的那样，对任何通过该自动手段来测定的DNA序列而言，本文中测定的任何的核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动操作测定的核苷酸序列与被用来测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％相同，更典型地，至少约95％到至少约99.9％相同。可通过其它手段更精确地测定所述的实际序列，所述手段包括本领域中公知的手工DNA测序方法。如本领域中还已知的那样，如果测定出的核苷酸序列较之实际序列有一个插入或缺失，在该核苷酸进行翻译时就会导致移码(frame shift)，从插入或缺失点开始，预测得到的测定出的核苷酸序列所编码的氨基酸序列就将完全不同于被用于测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
本领域内的技术人员能够鉴别出此类非正确鉴别的碱基，而且知道如何改正此类错误。
                   核酸片段、探针和引物
本发明的核酸分子可以仅仅包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中显示的核酸序列的片段或一部分，例如，可以被用作探针或引物的片段，或编码ASPA01蛋白质的一部分的片段。对ASPA01基因以及cDNA的克隆测定出的核苷酸序列可用来产生探针和引物，所述探针和引物是为鉴定和/或克隆ASPA01家族的其它成员以及来自其它物种的ASPA01的同源体而设计的。典型地，所述探针/引物包含经过充分纯化的寡核苷酸，典型地，所述寡核苷酸包含优选在高度严谨条件下，与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2中显示的核苷酸序列或其功能等同物的至少约12或15个，优选约18或20个，优选约22或25个，更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多的连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
基于ASPA01核苷酸序列的探针可被用于检测例如在其它生物中编码同样的蛋白质或同源蛋白质的转录物或基因组ASPA01序列。在优选的实施方式中，所述探针进一步地包含连接到其上的标记基团，例如，所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。此类探针还可被用作诊断试验试剂盒的一部分，用于鉴别表达ASPA01蛋白质的细胞。
           同一性(identity)和同源性(homology)
术语“同源性”或“百分比同一性(percent identity)”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义：为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，本着最优比较的目的(例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口(gap)，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的对齐)，将所述序列进行对齐(align)。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数×100)。优选地，该两条序列长度相同。
技术人员会知道有若干不同的计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的对齐和对两条序列间百分比同一性的确定。在一种优选的实施方式中，使用Needleman andWunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的百分比同一性，所述算法已被包括进GCG软件包(可从http：//www.gcg.com获得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到上述的所有不同参数将产生有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体百分比同一性不会有显著改变。
在又一种实施方式中，使用GCG软件包(可从 http：//www.gcg.com获得)的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的百分比同一性，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的百分比同一性，所述算法已被包括进ALIGN程序(2.0版)(可从http：//vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得)中，其中使用PAM120加权残基表，缺口长度惩罚(penalty)为12，缺口惩罚为4。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列”来开展对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用NBLAST程序，在分数(score)＝100，字长(word length)＝12的情况下来开展BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的ASPA01核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，在分数＝50，字长＝3的情况下来开展BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的ASPA01蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的对齐，可以利用Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
                           杂交
本文中用到的术语“杂交”被用来描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50％、至少约40％、至少约70％、更优选为至少约80％、进一步优选为至少约85％到90％、更优选为至少95％的核苷酸序列保持相互杂交的状态。
对此类杂交条件而言，其中一个优选的非限制的例子是在6×氯化钠/柠檬酸钠(sodium chloride/sodium citrate，SSC)中，大约45℃下杂交，随后在1×SSC、0.1％SDS中，50℃下进行一次或多次洗涤，优选在55℃下，优选在60℃下，进一步优选在65℃下。
高度严谨条件包括：例如，在68℃下于5×SSC/5×Denhardt’s溶液/1.0％SDS中进行杂交，室温下于0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，洗涤可以在42℃展开。
本领域技术人员知道何种条件适用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中不难获得其它关于此类条件的指导，例如，在Sambrook etal.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。
当然，仅与poly A序列(例如mRNA的3’末端poly(A)区)或仅与T(或U)残基的互补性延伸区段(stretch)杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列(例如，实际上是任何双链的cDNA克隆)杂交。
               获得来自其它生物的全长DNA
采用典型手段，可以对从其它生物，例如从丝状真菌，特别是从Aspergillus的种所构建的cDNA文库进行筛选。
例如，可以通过Northern印迹分析来对Aspergillus的菌株进行筛选，以获得同源的ASPA01多核苷酸。在检测到与根据本发明的多核苷酸同源的转录物之后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由分离自合适菌株的RNA来构建cDNA文库。或者，可以使用能与根据本发明的ASPA01多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。
例如，可以通过使用两套简并的寡核苷酸引物组(primer pool)开展PCR，来分离出同源的基因序列，所述引物组是基于本文所教导的核苷酸序列而设计的。
用于所述反应的模板可以是通过对mRNA进行反转录所获得的cDNA，所述mRNA是从已知能表达或被怀疑能表达本发明多核苷酸的菌株中制备得到的。PCR产物可被用于亚克隆或测序，以确保扩增出的序列代表新的ASPA01核酸序列或其功能等同物的序列。
然后可以通过一系列已知方法，用所述的PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，可对扩增出的片段进行标记，并将其用于对噬菌体cDNA文库或粘粒cDNA文库的筛选。或者，经过标记的片段可被用于筛选基因组文库。
PCR技术还可被用于从其它生物中分离全长cDNA序列。例如，可以遵循标准工序，从适当的细胞源或组织源分离出RNA。用寡核苷酸引物对所述RNA进行反转录反应，所述引物特异于扩增片段的最靠近5’末端的序列，用于引导第一链合成。
然后可以用标准的末端转移酶反应，给得到的RNA/DNA杂交体(hybrid)“加上尾巴”(例如，用鸟嘌呤)，所述的杂交体可被RNaseH消化，然后第二链合成得以被引导(例如，用poly-C引物)。因此，可以很容易地分离出处于扩增片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见例如前述的Sambrook et al.和前述的Ausubel et al.。
同源DNA片断是否编码ASPA01功能蛋白质，可以使用本领域公知的方法方便地检测。
                           载体
本发明的另一个方面是关于载体的，优选为表达载体，所述载体含有编码ASPA01蛋白质的核酸或其功能等同物。在本文中用到的术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，“质粒”指环状的双链DNA环，另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体，其中，另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体以及游离的哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离的哺乳动物载体)在被引入宿主细胞之后就被整合到了宿主细胞的基因组中，因此它们与宿主基因组一同复制。此外，某些载体能指导可操作地连接到其上的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用到的载体形式。然而，本发明也将包括能提供等同功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达，这意味着该重组表达载体包括一段或多段调控序列，所述序列是基于被用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“可操作地连接”被用来表示：人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上，所述的连接以允许该核苷酸序列表达的方式(例如，在体外转录/翻译系统中或在载体被引入的宿主细胞中)进行。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。例如，在Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调控序列，也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可能依赖于以下因素：对将被转化的宿主细胞的选择，期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，以生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如，ASPA01蛋白质，ASPA01蛋白质的突变形式，其片段、变异体或功能等同物等)。
为了在原核细胞或真核细胞中表达ASPA01蛋白质，可以对本发明的重组表达载体加以设计。例如，ASPA01蛋白质可在细菌细胞(例如是E.coli)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中对合适的宿主细胞进行了进一步的讨论。或者，所述的重组表达载体可在体外进行转录及翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件的载体，源自病毒，例如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒(papova virus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
插入的DNA应当被可操作地连接到合适的启动子上，例如：噬菌体的lambda PL启动子，E.coli的lac启动子、trp启动子和tac启动子，SV40的早期启动子和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。技术人员知道其它合适的启动子。在一种具体的实施方式中，优选的启动子是能指导天冬酰胺酶在丝状真菌中高水平表达的启动子。此类启动子为本领域所已知。所述的表达构建体可以含有用于转录起始和终止的位点，还在转录区域含有用于翻译的核糖体结合位点。由该构建体表达的成熟转录物的编码部分包括处于起点的用于起始翻译的AUG以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。
可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入原核细胞或真核细胞。在此使用的“转化”和“转染”指一系列本领域内已知的用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。
对哺乳动物细胞的稳定转染而言，人们已知，仅有一小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中，这取决于所用的表达载体和转染技术。为鉴别和选择出上述整合体，通常将编码选择性标志(例如对抗生素的抗性)基因与人们感兴趣的基因一起引入到宿主细胞中。优选的选择性标志包括赋予对药物抗性的标志，所述药物例如是G418、潮霉素和甲氨蝶呤(methatrexate)。编码选择性标志的核酸可以在与编码ASPA01蛋白质的载体相同的载体上被转移到宿主细胞中，或者，所述核酸可以在单独的载体上被转移进去。经过被引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴别(例如，已经插入了选择性标志基因的细胞将存活，而其它细胞则会死亡)。
蛋白质在原核生物中的表达通常是在E.coli中开展的，其中使用了含有组成型或诱导型启动子的载体，用于指导蛋白质的表达。
如本文所指出的，所述表达载体将优选含有选择性标志。此类标志包括：用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性以及用于在E.coli和其它细菌中进行培养的四环素抗性或氨苄青霉素抗性。合适的宿主的代表性例子包括细菌细胞，例如E.coli、Streptomyces和Salmonellatyphimurium；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，例如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的合适的培养基和培养条件都是本领域内已知的。
载体中优选用于细菌的是可从Qiagen获得的pQE70、pQE60和pQE-9，可从Stratagene获得的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A，可从Pharmacia获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是可从Stratagene获得的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1和pSG，以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它适合的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。
用于本发明的已知的细菌启动子包括E.coli的lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，lambda PR、PL启动子和trp启动子，HSV胸苷激酶启动子，SV40的早期启动子和晚期启动子，逆转录病毒LTR的启动子例如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的启动子以及金属硫蛋白启动子，例如小鼠的金属硫蛋白-I启动子。
将增强子序列插入到载体中可以增强编码本发明多肽的DNA在更高等真核生物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常从10bp至300bp，其在特定的宿主细胞类型中发挥作用，以增加启动子的转录活性。增强子的例子包括处于复制起点晚期一侧(late side)第100bp至270bD处的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子的增强子、处于复制起点晚期一侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。
为使翻译的蛋白质能分泌到内质网的腔、胞质间隙或胞外环境中，可以将适当的分泌信号插入到表达的多肽中。所述的信号对该多肽而言可以是内源的，也可以是异源信号。
所述的多肽可以以经修饰的形式表达，并且其不仅可以包括分泌信号，还可以包括其它的异源功能区域。因此，例如，可以将其它氨基酸特别是带电荷的氨基酸区域加入到所述多肽的N-末端，以增加其在宿主细胞中、在纯化期间或在随后的操作及贮藏期间的稳定性和持久性(persistence)。此外，还可以将肽部分(moieties)加入到所述多肽上，以协助进行纯化。
                      本发明的多肽
本发明提供了具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的经过分离的多肽，可通过在合适的宿主中表达SEQ ID NO：1的多核苷酸而获得的氨基酸序列，以及可通过在合适的宿主中表达SEQ ID NO：2的多核苷酸序列而获得的氨基酸序列。此外，包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也被包含于本发明中。上述多肽被共同包含于术语“本发明的多肽”中。
(如通常所承认的一样，)术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的，当上下文中需要指出通过肽键结合起来的至少两个氨基酸的链时，两个术语可以互换使用。“多肽”这个词在本文中被用于指含有超过七个氨基酸残基的链。本文中所有寡肽和多肽的分子式或序列都是从左至右书写的，而且是从氨基端到羧基端的方向。本文中使用的单字母氨基酸代码在本领域中是公知的，其可以在Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)中找到。
“经过分离的”多肽或蛋白质被用于指从其天然的环境中移出来的多肽或蛋白质。例如，出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的经重组生产的多肽和蛋白质被认为是经过分离的；已用任何合适的技术进行了充分纯化的天然或重组多肽也被认为是经过分离的，所述技术例如是在Smith andJohnson，Gene 67：31-40(1988)中公开的一步纯化法。
可通过公知的方法从重组细胞培养物中回收及纯化根据本发明的ASPA01天冬酰胺酶，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子交换层析或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，使用高效液相色谱(HPLC)来进行纯化。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成工序的产物以及从原核或真核宿主中通过重组技术生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的多肽可以是经过了糖基化的，或者可以是未经过糖基化的，这取决于在重组生产工序中所使用的宿主。此外，本发明的多肽还可以包括初始修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况下作为宿主介导的过程的结果。
                         蛋白质片段
本发明还公开了根据本发明的多肽的具有生物活性的片段。
本发明多肽的具有生物活性的片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与ASPA01蛋白质的氨基酸序列充分相同或来自ASPA01蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：3的氨基酸序列)，所述片段包括的氨基酸较之所述的全长蛋白质要少，其显示了相应全长蛋白质的至少一种生物活性。典型地，具有生物活性的片段包含具有ASPA01蛋白质的至少一种活性的结构域或基元(motif)。
本发明蛋白质的具有生物活性的片段可以是多肽，所述多肽的长度例如为10、25、50、100或更多个氨基酸。此外，可以通过重组技术来制备其它具有生物活性的部分，所述部分中被去除了所述蛋白质的其它区域；对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性而言，可以对所述部分进行评估。
本发明还公开了编码上述ASPA01蛋白质的具有生物活性的片段的核酸片段。
                      功能等同物
术语“功能等同物”和“功能变异体”在本文中可以互换使用。ASPA01 DNA的功能等同物是经过分离的DNA片段，所述片段对展示了本文中定义的ASPA01 A.niger天冬酰胺酶特定功能的多肽进行编码。本发明的ASPA01多肽的功能等同物是展示了本文中定义的A.niger天冬酰胺酶的至少一种功能的多肽。因此，功能等同物也包括具有生物活性的片段。
蛋白质或多肽的功能等同物可以含有：仅对SEQ ID NO：3的一个或多个氨基酸进行了保守替代的氨基酸序列或仅对非关键氨基酸进行了替代、插入或缺失的氨基酸序列。因此，非关键氨基酸是SEQ ID NO：3中可被改变的残基，但所述改变基本不会改变生物功能。例如，对本发明的ASPA01蛋白质而言是保守的氨基酸残基，就被预测为是尤其不能进行改变的残基。此外，对根据本发明的ASPA01蛋白质和其它天冬酰胺酶而言是保守的氨基酸，也不太可能易于被改变。
术语“保守替代”用来指一种替代，其中，所述的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换。上述族系已为本领域所已知，其包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β支链形式的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
典型地，核酸的功能等同物可以含有沉默突变或不改变被编码多肽的生物功能的突变。因此，本发明提供了编码ASPA01蛋白质的核酸分子，所述蛋白质含有氨基酸残基的改变，所述氨基酸残基对特定的生物活性来说是非必要的。此类ASPA01蛋白质与SEQ ID NO：3的氨基酸序列不同，但所述的蛋白质仍然保留有至少一种生物活性。在一种实施方式中，所述经过分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸分子，其中，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：3中显示的氨基酸序列具有至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的基本同源的氨基酸序列。
例如，在Bowie，J.U.et al.，Science 247：1306-1310(1990)中提供了关于如何制造表型沉默的氨基酸替代的指导，其中，作者指出，有两种主要的手段可以用于研究氨基酸序列对改变的容忍度(tolerance)。第一种方法依赖于进化过程，其中，突变或者被自然选择所接受，或者被其拒绝。第二种方法则是利用遗传工程向被克隆基因的特定位点引入氨基酸改变，然后进行选择或筛选，以鉴别出保留了功能性的序列。如作者所言，上述研究已揭示，蛋白质对氨基酸替代有着惊人的容忍度。作者还进一步指出了哪些改变可能被允许进行于蛋白质的特定位置上。例如，大多数隐蔽的(buried)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面上的侧链通常很少是保守的。在前述的Bowie et al和本文引用的参考文献中，描述了其它的表型沉默替代。
编码与根据SEQ ID NO：3的蛋白质同源的ASPA01蛋白质的经过分离的核酸分子，可以通过下述方法来制造：向根据SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的编码核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替代、增加或缺失，从而向被编码的蛋白质中引入一个或多个的氨基酸替代、缺失或插入。可以通过标准技术来引入此类突变，所述技术例如是定点诱变和PCR介导的诱变。
术语“功能等同物”还包括A.niger的ASPA01蛋白质的直向同源体(orthologue)。A.niger的ASPA01蛋白质的直向同源体是可以从其它菌株或物种中分离得到的蛋白质，且所述蛋白质具有相似或相同的生物活性。此类直向同源体包含与SEQ ID NO：3基本同源的氨基酸序列，因此所述同源体不难被鉴别出来。
如本文所定义，术语“基本同源”指：第一条氨基酸或核苷酸序列与第二条氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的或最低要求数目的相同或等同(例如，具有相似侧链)的氨基酸或核苷酸，从而，所述的第一条和第二条氨基酸或核苷酸序列具有共同(common)结构域。例如，含有具有约40％，优选为65％，更优选为70％，进一步优选为75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性的共同结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文中就被定义为基本相同。
此外，编码ASPA01家族其它成员的，因此具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的ASPA01蛋白质的，因此具有与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。
使用本文中公开的cDNA或其合适的片段作为杂交探针，优选在高度严谨杂交条件下，按照标准的杂交技术，可以分离出与本发明ASPA01DNA的变异体(例如，天然的等位基因变异体)及同源体相应的核酸分子，所述分离基于所述核酸分子与本文中公开的ASPA01核酸分子的同源性。
除ASPA01序列的天然存在的等位基因变异体之外，技术人员将知道：通过突变向SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列引入改变，由此可以导致ASPA01蛋白质的氨基酸序列改变，但ASPA01蛋白质的功能却没有实质性变化。
在本发明的另一个方面，提供了经过改进的ASPA01蛋白质。改进的ASPA01蛋白质是其中至少一种生物活性经过了改进的蛋白质。此类蛋白质可以通过向ASPA01编码序列的全部或一部分上随机引入突变来获得，例如通过饱和诱变来获得，得到的突变体可被重组表达，并被用于进行对生物活性的筛选。例如，本领域提供了用于测量天冬酰胺酶酶活性的标准检测方法，因此可以很容易地选出经过改进的蛋白质。
在一种优选的实施方式中，ASPA01蛋白质具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列。另一种实施方式中，ASPA01多肽与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列基本同源，并且保留有根据SEQ ID NO：3的多肽的至少一种生物活性，但因为上述的天然变异或诱变，其氨基酸序列仍有不同。
在另外一种优选实施方式中，ASPA01蛋白质具有由经过分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述核酸片段能与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的核酸杂交，所述杂交优选于高度严谨的杂交条件下进行。
因此，ASPA01蛋白质是包含与SEQ ID NO：3中显示的氨基酸序列具有至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白质，并且其还保留有根据SEQ ID NO：3的多肽的至少一种功能活性。
根据本发明的蛋白质的功能等同物还可以通过多种方式被鉴定出来，例如通过对本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合(combinatorial)文库针对天冬酰胺酶活性进行筛选。在一种实施方式中，通过核酸水平上的组合诱变产生了变异体的杂色文库(variegatedlibrary)。变异体的杂色文库可以通过多种方式来产生，例如，通过用酶将合成的寡核苷酸混合物连接到基因序列上，使得一套可能是蛋白质的简并序列可作为单个的多肽表达。有很多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列来生产可能是本发明多肽变异体的文库。用于合成简并寡核苷酸的方法在本领域中是已知的(见：例如，Narang(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura etal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。
另外，本发明多肽编码序列的片段的文库也可用于制造多肽的杂色群(variegated population)，以在随后对变异体的选择中进行筛选。例如，编码序列片段的文库可以通过如下方法来生成：在其中对每个分子而言，切口(nick)仅出现大约一次的处理条件下，用核酸酶处理人们感兴趣的编码序列的双链PCR片段；对所述双链DNA进行变性；对所述DNA进行复性，以形成双链DNA，所述双链DNA可能包括来自不同切口产物的同义/反义对；通过S1核酸酶处理，从重新形成的双链体中除去单链的部分；将得到的片段文库与表达载体连接起来。通过此种方法，可以得到一种表达文库，所述文库编码人们感兴趣的蛋白质的多种不同大小的N-末端片段及内部片段。
本领域中已知的若干技术都可用于筛选组合文库的基因产物及筛选cDNA文库，以得到具有选定属性的基因产物，所述组合文库是通过截短点突变来制造的。典型地，使用最广泛的用于筛选大基因文库并适用于高通量分析的技术包括：将所述基因文库克隆到可复制表达载体中；用得到的载体文库去转化合适的细胞；在一定条件下表达所述的组合基因，在所述表达条件下，对人们想要的活性进行的检测，有助于分离出编码其产物被检测到的基因的载体。递归总体诱变(recursive ensemble mutagenesis，REM)技术能增强功能突变体在文库中出现的频率，所述技术可与筛选试验一起使用，以鉴定出本发明蛋白质的变异体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave et al.(1993)ProteinEngineering 6(3)：327-331)。
除SEQ ID NO：1中显示的ASPA01基因序列之外，在给定的群中，可能存在DNA序列多态性，其可能导致ASPA01蛋白质氨基酸序列的改变，这点对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类遗传多态性可能由于天然的等位基因变异而存在于来自不同群的细胞中，或者存在于一个群中。等位基因变异体还可以包括功能等同物。
根据本发明的多核苷酸的片段还可以包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可以用作探针或用作PCR反应的引物。
对根据本发明的核酸而言，不管其编码功能多肽或非功能多肽，都可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)的引物。不编码具有ASPA01活性的多肽的本发明的核酸分子的用途包括：(1)从cDNA文库中分离编码ASPA01蛋白质的基因，或其等位基因变异体，例如，来自其它生物而不是A.niger的cDNA文库；(2)如Verma et al.，Human Chromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述，对中期染色体扩展(spreads)进行的原位杂交(例如FISH)，以提供对ASPA01基因的精确染色体定位；(3)Northern印迹分析，用于检测ASPA01的mRNA在特定组织和/或细胞中的表达；以及(4)可作为诊断工具使用的引物和探针，以分析能在给定的生物(例如组织)样品中与ASPA01探针杂交的核酸是否存在等。
本发明中还包括一种方法，所述方法是用于获得ASPA01基因或cDNA的功能等同物的。该方法需要：获得经过标记的探针，所述探针包括经过分离的核酸，所述核酸编码根据SEQ ID NO：3的序列或其变异体的全部或一部分；用所述经过标记的探针对核酸片段文库进行筛选，其中，筛选是在允许探针与文库中核酸片段杂交的条件下进行的，从而形成核酸双链体，并且由任何经过标记的双链体中的核酸片段制备出全长基因序列，以获得与ASPA01基因相关的基因。
在一种实施方式中，本发明的ASPA01的核酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2中显示的核酸序列或其互补序列具有至少40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在另一种优选的实施方式中，本发明的ASPA01的多肽与SEQ IDNO：3中显示的的氨基酸序列具有至少40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
                         宿主细胞
在另一种实施方式中，本发明描述了含有本发明中包括的核酸的细胞，例如经过转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。“经过转化的细胞”或“重组细胞”是通过重组DNA技术，向其中(或其祖代中)引入了根据本发明的核酸的细胞。原核细胞和真核细胞都被包括在内，例如，细菌、真菌、酵母等，特别优选的是来自丝状真菌的细胞，特别是Aspergillusniger。
可以对宿主细胞加以选择，选出能调节插入序列表达的宿主细胞或能以特异性的、令人期待的方式对基因产物进行修饰或加工的宿主细胞。此类对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可以促进蛋白质的机能最优化。
多种宿主细胞都具有特征性的及特异性的用于对蛋白质及基因产物的翻译后加工和修饰的机制。可以选出分子生物学和/或微生物学领域的技术人员熟悉的合适的细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白质的修饰和加工是令人期望的及正确的。为达成此目标，可以使用具有胞内加工系统(machinery)的真核宿主细胞，所述加工系统用于对初级转录物的正确加工、对基因产物的糖基化和磷酰化。此类宿主细胞是本领域中公知的。
宿主细胞还包括但不限于：哺乳动物细胞系，例如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。
如果需要的话，可通过稳定转染的细胞系来生产根据本发明的多肽。大量适于对哺乳动物细胞进行稳定转染的载体都是公众可获得的，构建此类细胞系的方法也为公众所已知，例如在(前述的)Ausubel et al.中。
在另一个方面，本发明提供了可通过前文所述的本发明的方法来获得的食物制品，或者可通过使用前文所述的用于制造食物制品的新颖的天冬酰胺酶来获得的食物制品。通过将上述食物制品与下述生产方法获得的食物制品进行比较，上述食物制品的特征在于显著降低的丙烯酰胺水平，所述生产方法中不包括以能有效降低所述加热步骤期间涉及丙烯酰胺形成的氨基酸的水平的量添加一种或多种酶。根据本发明的方法可被用于使生产出的食物制品中丙烯酰胺的含量降低，较之用传统方法获得的食物制品，该含量降低优选为超过50％，更优选为超过20％，进一步优选为10％，最优选为超过5％。
                          材料和方法
                       对丙烯酰胺的测量
样品预处理
用5ml milliQ水对600mg干燥均质的样品进行提取。将1μg处于溶液(CIL)中的内标物13C3丙烯酰胺加入到提取物中。离心(6000rpm)10分钟后，将3ml上清层上到Extreluut-3BT柱(Merck)中。用15ml乙酸乙酯从所述的柱中洗脱出丙烯酰胺。乙酸乙酯在缓和的氮气流下蒸发，至大约0.5ml。
色谱条件
用气相色谱来分析该乙酸乙酯溶液。用5.4ml/分钟的持续氦气流作为载气，用CP-Wax 57(Varian)柱(长度为25m，内径0.32mm，薄膜1.2μm)来实现分离。不分流(split-less)注射3μl。烤箱温度在50℃保持1分钟，之后其按照30℃/分钟上升至220℃。220℃的温度持续12分钟之后，在下一次注射之前对烤箱进行冷却和稳定。用甲烷作为电离气体，使用在线化学电离质谱仪，阳离子模式来进行检测。监测特征离子m/z 72(丙烯酰胺)和m/z 75(13C3丙烯酰胺)，以进行定量。
使用的设备
GC：                                  HP6890(Hewlet Packard)
MSD(物质选择检测仪，
mass selective detector)：            HP5973(Hewlet Packard)
                     对天冬酰胺酶活性的测量
根据Shirfrin et al.(Shirfrin，S，Parrott，C.L.，and Luborsky，S.W.(1974)，Journal of Biological Chemistry 249，1445-1340)，来测量天冬酰胺酶的活性。该酶试验的背景是对天冬酰胺酶活性导致释放的NH3的测定。
为检测释放出的NH3，遵循下述移液管计划表：
溶液A：0.1M柠檬酸+0.2M Na2HPO4·2H2O，pH 5.5
溶液B：0.189M L-天冬酰胺(Sigma)
溶液C：0.006M(NH4)2SO4(Merck)
溶液D：25％(v/v)三氯乙酸(Merck)
溶液E：氨显色试剂(Aldrich)
对天冬酰胺酶活性测量而言，所述溶液必须是新鲜制备的。
表1中概括了用于校正曲线(CP＝校正点)的溶液。
表1校正溶液计划表
  加入的溶液(ml)   CP 1   CP 2   CP 3   CP 4   对照酶试验   酶试验
  A   1   1   1   1   1   1
  B   0   0   0   0   0.2   0.2
  C   0   0.25   0.5   1   0   0
  去离子水   1.1   0.85   0.6   0.1   0.8   0.8
  酶溶液的限制反应速率量的体积(Volume of reaction ratelimiting amount of the enzymesolution) 0 0 0 0 0 0.1
根据表1的溶液立即被颠倒，并倒置于37℃下培养。30分钟后加入0.1ml溶液D来终止反应。之后将0.1ml酶溶液加入对照酶试验中。溶液被立即混合，离心以去除任何沉淀物。用移液管将0.2ml上清液转移至含有4.3ml去离子水和0.5ml溶液E的试管中。上述混合物被立即混合，一分钟后，测量校正样品、对照和试验组的A 436nm。
按照下述来制作校正曲线：
     ΔA 436nm校正点＝A 436nm校正点-A 436nm校正点1
通过绘制标准的ΔA 436nm对氨(NH3)浓度的曲线图来制作标准曲线。
酶活性按照如下来计算：
      ΔA 436nm酶试验＝A 436nm试验-A 436nm试验对照
用标准曲线来确定被释放的NH3的μmol：
    单位/毫升＝(被释放的NH3的μmol×Vs)/(Vt×ti×Ve)
其中，Vs＝反应溶液体积(计划表中的+0.1ml溶液D)；2.2ml
Vt＝用于第二次反应以测定NH3的反应溶液体积；0.2ml
ti＝培养时间，以分钟计；30
Ve＝待测酶样品体积；0.1
         比酶活性＝(单位/毫升酶)/(mg蛋白质/ml酶)
如无特别指明，一个单位的天冬酰胺酶活性被定义为：在37℃时，pH 5.5下，每分钟从L-天冬酰胺释放出1μmol NH3。面团的pH为大约5.5，故而该pH在测量中是优选的。然而，对于具有不同pH值的其它底物，该不同的pH是优选用于对天冬酰胺酶活性的测定的。
如无特别指明，用ppm表示的量基于面粉的量。
                          材料
天冬酰胺酶获得自Escherichia coli(Sigma，具有285单位/毫克的比活性)、Erwinia chrysanthemi(Sigma，具有100单位/毫克的比活性)、Bacillus subtilis或Aspergillus niger(发酵细节见实施例)。
CSL培养基由以下物质组成(以每升中的量表示)：100g玉米浸出固体(Roquette)、1g Na2HPO4·H2O、15g MgSO4·7H2O、10g葡萄糖·H2O和0.25g Basildon(消泡剂)。上述成分被溶解于去盐水(demi-water)中，用NaOH或H2SO4将pH调为5.8；向带有挡板和泡沫球的100ml烧瓶中填充20ml的发酵培养液，并在120℃灭菌20分钟，之后，冷却到室温后，向每只瓶中加入200μl含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的溶液。
CSM培养基由以下物质组成(以每升中的量表示)：150g麦芽糖·H2O、60g大豆胨(蛋白胨)、1g Na2HPO4·H2O、15g MgSO4·7H2O、0.08g Tween 80、0.25g Basildon(消泡剂)、20g MES、1g L-精氨酸。上述成分被溶解于去盐水中，用NaOH或H2SO4将pH调为6.2；向带有挡板和泡沫球的500ml烧瓶中填充100ml的发酵培养液，并在120℃灭菌20分钟，之后，冷却到室温后，向每只瓶中加入1ml含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的溶液。
              实施例1 Aspergillus niger的发酵
由本文提供的核苷酸序列编码的天冬酰胺酶通过下述方法获得：构建含有所述DNA序列的表达质粒，用该质粒转化A.niger菌株，按照如下方式来培养Aspergillus niger菌株。
在20ml CSL-培养基(100ml烧瓶，挡板)中培养A.niger菌株的新鲜孢子(106-107)，在34℃和170rpm下培养20-24小时。将5-10mlCSL预培养物接种到100ml CSM培养基(500ml烧瓶，挡板)中之后，在34℃和170rpm下对菌株进行3-5天的发酵。
用50ml Greiner管进行离心(30分钟，5000rpm，4℃)，获得不含细胞的上清液，所有后续步骤都在冰上进行。用GF/A Whatman Glass微纤维过滤器(150mm)对上清液进行预过滤，以去除大颗粒，用4NKOH将pH调至5(如果必要的话)，在带有泵的0.2μm(带盖)过滤器上进行过滤灭菌，以去除真菌物质。上清液被贮藏于4℃(或-20℃)。
测量超滤物中Aspergillus niger天冬酰胺酶的含量和天冬酰胺酶活性
步骤1-制备超滤物
对实施例1中获得的培养物的上清液进行超滤，以获得较高的酶浓度并去除掉可能干扰酶活性测定和烘焙试验的低分子污染物。在装备有分离点为10kDa的过滤器的Millipore Labscale TFF系统中对300ml上清液进行超滤。
用10-30ml冷的去矿物质水对样品进行3-5次洗涤，这取决于样品的颜色和体积。酶溶液的终体积为10-30ml，其被进一步地称为“超滤物”。
步骤2-利用A280和HPSEC测定天冬酰胺酶的浓度
超滤物中Aspergillus niger天冬酰胺酶的浓度是从归因于天冬酰胺酶的280nm处的消光(A280)和计算得到的天冬酰胺酶的分子消光系数来计算的。对A280的测量是在Uvikon XL Secomam分光光度计(Beun deRonde，Abcoude，荷兰)中进行的。
酶的摩尔消光系数可从每个酶分子的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基的数量来计算(S.C.Gill and P.H.von Hippel，Anal.Biochem.182，319-326(1989))。上述氨基酸的摩尔消光系数分别为1280、5690和120M-1·cm-1。本发明的Aspergillus niger天冬酰胺酶的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基的数量可从SEQ ID NO：3中给出的蛋白质序列推断出来。表2中是计算出的本发明的Aspergillus niger天冬酰胺酶的消光系数。
表2A.niger天冬酰胺酶的消光系数
酶   SEQ IDNO：        #氨基酸   计算出的M.W.(Da)       计算出的280nm消光系数
 Trp  Tyr  Cys   M-1·cm-1   (1mg/ml)-1·cm-1
  天冬酰胺酶   3  0  9  2   39584   11760   0.3
归因于天冬酰胺酶的所述超滤物在280nm的消光取决于酶样品的纯度。该纯度是用带有TSK SW-XL柱(300×7.8mm；MW范围为10-300kDa)的HPSEC(High Performance Size Exclusion Chromatography，高效尺寸排阻色谱)来测定的；洗脱缓冲液由pH 6.0的25mM磷酸盐缓冲液组成，以1ml/分钟的流速使用。注射5-100μl的样品。测量280nm处的吸收。
归因于本发明天冬酰胺酶的超滤物A280是从色谱图中各个天冬酰胺酶的峰的峰表面积与280nm处吸收峰总表面积的比率得到的。然后通过将超滤物的A280乘以上述比率再除以0.3(计算得到的消光系数)计算出每种天冬酰胺酶在超滤物中的浓度。所述溶液中含有40mg蛋白质/ml。
步骤3-测定天冬酰胺酶活性
pH 5.5时，Aspergillus niger天冬酰胺酶溶液显示出了40000U/ml的活性。因此，用40mg/ml的蛋白质含量来计算，可以得出1000单位/毫克蛋白质的比活性。
        实施例2 Aspergillus niger天冬酰胺酶的最优pH
在此实施例中，在多种不同的pH值对活性进行测量。为保持pH恒定及校正缓冲液影响，在不同缓冲液中于同一pH值进行了多次对天冬酰胺酶活性的测量。
三种不同的缓冲液被用于测量pH范围为5-9时的天冬酰胺酶活性：
1.柠檬酸/磷酸盐缓冲液(pH 5-6.2)；
2.磷酸盐缓冲液(pH 8.5-7.6)；和
3.tris缓冲液(pH 7.2-8.9)。
底物浓度为17.2mM的天冬酰胺。表3中展示了从A.niger中获得的天冬酰胺酶的天冬酰胺酶活对pH的关系。
表3适合的缓冲液中不同pH值下测出的Aspergillus niger天冬酰胺酶的活性。酶试验中柠檬酸、磷酸和三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(tris缓冲液)的最终浓度分别为0.05、0.1和0.025M。
pH值                天冬酰胺酶活性(以U/ml表示)
  柠檬酸/磷酸盐缓冲液   磷酸盐缓冲液   Tris缓冲液
  5.0   45700   -   -
  5.2   38000   -   -
  5.4   40600   -   -
  5.6   30500   -   -
  5.8   26800   24200   -
  6.0   31900   23000   -
  6.2   23900   21800   -
  6.8   -   14400   -
  7.2   -   8600   11300
  7.6   -   -   8700
  8.0   -   -   6400
  8.4   -   -   4200
  8.9   -   -   2600
如数据所示，本Aspergillus niger天冬酰胺酶非常适于烘焙应用，因为该酶在5.5左右的面团pH值处显示了相对高的酶活性。
   实施例3 Escherichia coli和Aspergillus niger的天冬酰胺酶的KM
                            和Vmax值
在37℃，pH为5.5时，通过对Escherichia coli或Aspergillus niger的天冬酰胺酶的天冬酰胺酶活性分别进行测量来测定KM和Vmax。表4中概括了上述测量的结果。
表4Escherichia coli或Aspergillus niger的天冬酰胺酶的KM和Vmax
  天冬酰胺酶来源   Vmax(U/mg)   KM(mM)
  E.coli   300+/-30   1.4+/-0.6
  A.niger   1100+/-40   2.4+/-0.3
A.niger的天冬酰胺酶较之E.coli的天冬酰胺酶显示了明显更高的活性。
实施例4制备batard类型的面包以及Erwinia、Escherichia coli和 Aspergillus niger的天冬酰胺酶对外壳和碎屑中丙烯酰胺水平的影响
用2000g面粉(100％)、1040ml水(57％)、44g新鲜的Konings酵母、40g盐(5％)、136mg抗坏血酸(68ppm)和前述量的本发明的天冬酰胺酶来制备面团，所述天冬酰胺酶来自Erwinia(Sigma)或Aspergillus niger。用螺旋混合机Diosna SP 12将所述成分混合成面团(速度为1时混合2分钟，接着在速度2，混合时间为直至总的能量输入达到85wh)。此后，在32℃将整个面团发酵15分钟。接着，将350g的面团块用手弄圆，在32℃发酵15分钟。之后，将面团块弄圆成型，接着进行75分钟的最终发酵。发酵之后，在面团块的上表面的长度方向上切出深度为1cm的切口。烘焙之前取面团样品以测定丙烯酰胺含量。面团块在烤箱中于240℃被烘焙30分钟。
此后，从外壳(外层2mm)取样，按照前文所述对丙烯酰胺进行分析。所述外壳取自batard面包的上表面，选择显示出平均的褐色色泽的外壳部分，不要太黑也不要太白。就丙烯酰胺测定而言，下表5、6和7中展示了对每种条件下的两块面包块以及一块面包块的两次测量的平均值。
表5若干种天冬酰胺酶对面包中丙烯酰胺的形成的影响
  天冬酰胺酶的来源   天冬酰胺酶(ppm)  外壳中的丙烯酰胺(ppb)
  面包块1   -   0  74
  面包块2   Erwinia   1.75  51
  面包块3   E.coli   1.00  60
  面包块4   A.niger   0.20  60
从上表可以推断出若干种天冬酰胺酶包括新颖的ASPA01的使用有降低外壳中形成的丙烯酰胺的量的效果。
表6Erwinia天冬酰胺酶的量对丙烯酰胺形成的影响
  天冬酰胺酶(ppm)  外壳中的丙烯酰胺(ppb)
  面团   0  ＜30
  面包块1   0  74
  面包块5   0.0875  66
  面包块6   0.25  59
  面包块2   1.75  51
从上表可以推断出，增加天冬酰胺酶的量会降低外壳中形成的丙烯酰胺的量。
实施例5在加有天冬酰胺的batard面包中天冬酰胺酶对丙烯酰胺水平的
                           影响
用与实施例4相同的手段来制备面团、面包块和样品，其中，按照与加入天冬酰胺酶的步骤相同的步骤，将L-天冬酰胺(Sigma)加入到面团中去，表7中给出了加入量。测定得到的样品中的丙烯酰胺，其结果见下表。
表7额外添加天冬酰胺对外壳中丙烯酰胺形成的影响
  加入的L-天冬酰胺(ppm)   天冬酰胺酶的来源   天冬酰胺酶(ppm)   外壳中的丙烯酰胺(ppb)
  面包块1   0   -   0   74
  面包块7   600   -   0   1265
  面包块8   600   Erwinia   0.2   482
  面包块9   600   A.niger   2   159
  面包块10   600   A.niger   5   105
  面包块11   600   A.niger   10   80
  面包块12   1500   -   0   5095
  面包块13   1500   Erwinia   0.5   3790
从表7可以推断出，将天冬酰胺这种氨基酸添加到面包中会显著提高面包外壳中丙烯酰胺的含量。然而，天冬酰胺酶的使用会使其重新降低。
    实施例6多种不同的参数对外壳中丙烯酰胺水平的影响
用2000g全麦面粉(100％)(Linde-Meneba，荷兰)或普通白面粉(Kolibri-Meneba，荷兰)、1140ml水(57％)、47g新鲜的Koningsgist、40g盐(1.75％)、136mg抗坏血酸(34ppm)和前述量的L-天冬酰胺(Sigma)以及从Aspergillus niger获得的天冬酰胺酶ASPA01来制备面团。用螺旋混合机Diosna SP 12将所述成分混合成面团(速度为1时混合2分钟，接着在速度2，混合时间为直至总的能量输入达到85wh)。此后，在32℃将整个面团发酵15分钟。接着，将350g的面团块用手弄圆，在32℃发酵15分钟。之后，将面团块弄圆成型，接着进行90分钟的最终发酵。发酵之后，在面团块的上表面的长度方向上切出深度为1cm的切口。在烤箱中烘焙所述的面团块。
使用三种烘焙过程
1.240℃，30分钟
2.300℃，20分钟
3.320℃，20分钟
烘焙之后，按照实施例4所述，从面包外壳取样。下面给出了对样品中丙烯酰胺分析的结果。即将进行烘焙之前对面团中丙烯酰胺的量进行测量。每个数据是对每种条件下一块面包块的两次测量的平均值。
表8烘焙过程对基于无天冬酰胺或添加天冬酰胺酶的普通面粉的面包外壳中形成的丙烯酰胺量的影响
  面包块编号   烘焙过程   外壳中的丙烯酰胺(ppb)
  1   1   74
  14   2   85
  15   3   175
从表8可以推断出，丙烯酰胺的形成取决于所使用的烘焙过程。在热而短的过程中，外壳中的丙烯酰胺的形成就比较低温度烘焙时明显要高。烘焙过程3导致非常黑的面包块。因此，在此烘焙条件下没有进行进一步的实验。
表9对于无天冬酰胺或添加天冬酰胺酶的烘焙过程1，面粉类型对面包外壳中丙烯酰胺水平的影响
  面包块编号   面粉类型   外壳中的丙烯酰胺(ppb)
  1   普通   74
  16   全麦   227
表9清晰显示，面粉种类对形成的丙烯酰胺的量是有影响的。
表10糖对基于普通面粉的面包外壳中丙烯酰胺水平的影响和增加的丙烯酰胺量对A.niger天冬酰胺酶的效率的影响
  面包块编号   烘焙过程   加入的蔗糖(g/kg面粉)   加入的天冬酰胺(ppm)  Aspergillus niger天冬酰胺酶(ppm)   外壳中的丙烯酰胺(ppb)
  1   1   0   0  0   74
  17   1   250   0  0   220
  18   1   250   0  5   110
  19   1   250   600  0   847
  20   1   250   600  5   97
  14   2   0   0  0   85
  21   2   250   0  0   161
  22   2   250   0  5   120
  23   2   250   600  0   1001
  24   2   250   600  5   132
糖的存在激发了丙烯酰胺的形成。如果额外添加了天冬酰胺的话，该效应会更显著。当Aspergillus niger天冬酰胺酶被加入到富含糖的面团系统中后，面包外壳中丙烯酰胺的水平会显著降低。令人惊奇地，丙烯酰胺相对富集的面包块的丙烯酰胺降低会更多，虽然使用的是同样数量的来自Aspergillus niger的天冬酰胺酶。
               实施例7荷兰式蜜蛋糕的制备
对荷兰式蜜蛋糕的制备分两个阶段进行。第一个阶段，按照下述来制备预混合物(per batter)：将4kg Koekzoet(Atlanta Dethmers B.V.，Groningen-荷兰)和500g切碎的荷兰式蜜蛋糕加入到两升水中，加热，直到温度达到116C。加入5kg黑麦面粉，混合直至混合物光滑。此后，将该面团冷却，并在室温贮藏1-2天。
向每2750克该预混合物加入下述成分：500克Koekzoet、27.5g筛过的荷兰式蜜蛋糕香料(spices)、22g筛过的Karam烘焙粉、16.5gVulkaan烘焙粉(全都是Atlanta Dethmers的)。此外，加入了不同数量的Aspergillus niger天冬酰胺酶，酶活性为40000U/ml(酶活性是按照实施例1在pH 5.5时来测量的)。
在SD 12型Diosna混合仪(Diosna，Dierks & Shne，Osnabrück-德国)中，以104rpm对该混合物进行6分钟的混合。称取3250g混合物出来，在外面弄湿，置于蛋糕盘上烹饪。此后，在30℃保温105分钟。此后，在180℃对此混合物进行60分钟的烘焙。该荷兰式蜜蛋糕的外层和内部(“碎屑”)样品被用来分析丙烯酰胺的存在情况。
烘焙之后，从外壳(外面的2mm)和碎屑(来自蛋糕中心)取样，并按照上面描述的那样对样品进行丙烯酰胺分析。对外壳样品而言，外壳取自该蛋糕的上表面，并选择显示平均色泽的外壳部分。
表11荷兰式蜜蛋糕的外壳和碎屑中丙烯酰胺的含量和不同的Aspergillus niger剂量的影响
  加入的天冬酰胺酶(mg) 样品中的丙烯酰胺(ppb) 丙烯酰胺的降低(％)*
  外壳   碎屑   外壳   碎屑
  对照   1077   3411
  40   75   172   93   95
  100   85   158   92   95
  200   74   156   93   95
*丙烯酰胺的降低是通过如下公式来计算的：
丙烯酰胺的降低＝((经过天冬酰胺酶处理的蛋糕中丙烯酰胺的含量)/(对照的丙烯酰胺含量))×100％
如本实施例中所示，较之没有被处理的荷兰式蜜蛋糕，Aspergillusniger天冬酰胺酶的加入使得丙烯酰胺的含量被降低至5％。此外，令人惊奇的是在荷兰式蜜蛋糕的碎屑中发现了高水平的丙烯酰胺。在所有面包试验中，丙烯酰胺在碎屑中的量都低于丙烯酰胺分析的检测极限(＜30ppb)，即使天冬酰胺或糖加入的情况下。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120>新颖的食物制造方法
<130>21401WO
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3223
<212>DNA
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>1
tggggggaac ttgcatctga gagcatcata ctagttacta ctactactac tacttgccga    60
tgaataaaca tcctgcttgt actacgcatc gccgtcttgc tgacatggag atatattttg    120
ggctccgaga gttttgatag cagtagccaa ttaactagta gatgctagta ctactctagt    180
aatttggggg cgaatgttga atccagctca tgccaattga catctggaga tctccacgag    240
acaacgagat aagatgaaat attgctgtca tgggtgataa ctagatgctt cgagaaggat    300
tcttgaggat tgcctcatcg catgggataa tatcaccctc gggtggacct tcccggctgt    360
tggggcttat cgtggaagag tcacccccga tatcggtggg ccaagccctt tatcaatcat    420
catcctatca gtttccaccc acaagatagc ctatggaccc tgattccctt ctagccacag    480
agactagtac tagtctatca tgtcgactcc atgtggagaa accctgataa gaccatgtgg    540
aggaggagat agcaagcctc cacagaaaca atatcatctc cacctgcaat cacggttgga    600
ttccgaatac acccgccgcc tggcaagcac atggggtata aaatgctgaa accaggcaag    660
atgaattgga agagaagcca gcagagacca tcgcatccgt cttcatcatg cctctcaagc    720
cgattctcct gtctgccctg gccagtctcg cctcggcctc tccgctgctc tactcgcgga    780
ccaccaatga aaccttcgtc ttcaccaatg ccaatggcct caacttcacc cagatgaaca    840
ccaccctgcc gaacgtgacc attttcgcaa cgggtaggtg gaccgagtat acctcaggta    900
gtgcgaccga tagttaaccg caactcacag gtggtaccat cgcgggctcc gattccagct    960
caaccgccac gaccggctac acctccggag cagtcggggt cctgtccctc atcgatgcgg    1020
tgccatccat gctggatgtg gccaatgttg ccggcgtcca ggtggccaac gtgggaagcg    1080
aggatatcac ctctgacatc ctgatttcca tgtccaagaa gctgaaccgc gttgtatgtg    1140
aggacccgac catggccggt gctgtcatca cccacggcac cgacaccctc gaggagactg    1200
ccttcttcct ggacgccact gtcaactgtg gcaagccaat tgtcatcgtg ggtgccatgc    1260
gcccatccac ggccatctca gctgacgggc ccttcaatct gctcgaagcc gtgacggtgg    1320
ctgcctccac gtcggcgcgc gatcgcggtg ccatggtggt catgaacgat cgcattgcct    1380
cggcctacta tgtgaccaag accaatgcca acactatgga caccttcaag gccatggaga    1440
tgggctacct tggcgagatg atctccaaca cccctttctt cttctacccg cccgtcaagc    1500
caaccggtaa ggtggccttt gacatcacca acgtgactga gatcccccgt gtggacattc    1560
tgttttctta tgaggacatg cacaacgaca ccctctacaa cgccatctcc agtggtgccc    1620
agggaattgt ggtgagtgtg atttccttga tctctctcta taaaacttgg aatggacgct    1680
gatgagaata gattgccggg gctggtgctg gaggcgtcac aacctccttc aatgaggcta    1740
tcgaggatgt catcaaccgt ttggagatcc ctgtcgtgca gagtatgcgc acagtcaatg    1800
gggaagtgcc actgtcagac gtgagcagcg acaccgccac ccacatcgcc agtggatacc    1860
taaacccgca gaagtcccgc attctgttgg gattgctgct atcccaggga aagaatatca    1920
ccgaaatcgc tgacgtgttt gctctgggca cggatgcgta ggtgtcgata gaaccattgt    1980
atataataat gaccggatat tatgatcatg atagattgca atagaaagtg actggataca    2040
catcagcaaa ggataccgag ttttgccctc aggcgttcgt agaaaaagtg tatcctactg    2100
aagatcatga atcatgtctt atcttctggc cccctcgtat ccagggtgtt ggacatgcag    2160
ggtgctttgc gtctgaagga tccgagatca aattgacacg agccagagtc tgatacatcc    2220
ataatagtgg gtatatttga agtccattga tagtccttgt ttgtgtcggg caattgggtt    2280
agctagggcc tggcttggtg gcatatcgtt ggactaatag atggtagttc aattaccgac    2340
gggactgtct cccgccatta ttctcacaat tcttatcagc acattttccc tgtcgcgctt    2400
ggatctgcaa tatttatttc cctcgtcatc acattcccac gaaaagacca tccagacatc    2460
ttgctcggta ttctggaccg taagactgtt ttgaaaggca aatgtaaagc gtgattggtc    2520
gacgtcaagc ctgaccaatc tagtaagctg gtcttacttt gggtgtagac ggaggtatta    2580
ggtagtatta aggcagctag ttcgcctgca ttaccaccca ggcgaggcac gccactgctg    2640
atcaggcgcg aaatggaacg aagtgcgagg tccacttaac atgatgcgcg cggatactaa    2700
ggcgaccaag accctggatt gatcgctatg attcgcggaa ccccgcgggt tcttcacggc    2760
tttcgataac gcaggattgg atcctcccag cctcgtctct gcaagtggga ccctgaaggg    2820
ctctcctgca cgtcattact cagacactcc catcttttgc ttatttgcaa tgaatcttat    2880
gggctgaccc tcagctcggc gtgggatgcc tgaatcgttg gtgaaagtct atttgagcaa    2940
tcctagcctg ctggtagagg cggatgatta taataatcaa agcaccctat cgtaaggatg    3000
aaggcttgtc cctggtcaac catcactctg gttattgact agttgtgttt gggagacagc    3060
tgaagcccat tgtcggtaat cgtccccaaa gaatctgccc ctgcatcatg gagtcaggaa    3120
agaccgggtt tcgcacggtc gcagaaccgc atccaacacg tctagtagaa ggaggggtag    3180
ggatactcat ccgtctattg tgtatatctg caacgactaa tgt                      3223
<210>2
<211>1137
<212>DNA
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1137)
<400>2
atg cct ctc aag ccg att ctc ctg tct gcc ctg gcc agt ctc gcc tcg    48
Met Pro Leu Lys Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser
1               5                   10                  15
gcc tct ccg ctg ctc tac tcg cgg acc acc aat gaa acc ttc gtc ttc    96
Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Asn Glu Thr Phe Val Phe
            20                  25                  30
acc aat gcc aat ggc ctc aac ttc acc cag atg aac acc acc ctg ccg    144
Thr Asn Ala Asn Gly Leu Asn Phe Thr Gln Met Asn Thr Thr Leu Pro
        35                  40                  45
aac gtg acc att ttc gca acg ggt ggt acc atc gcg ggc tcc gat tcc    192
Asn Val Thr Ile phe Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ser
    50                  55                  60
agc tca acc gcc acg acc ggc tac acc tcc gga gca gtc ggg gtc ctg    240
Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Leu
65                  70                  75                  80
tcc ctc atc gat gcg gtg cca tcc atg ctg gat gtg gcc aat gtt gcc    288
Ser Leu Ile Asp Ala Val Pro Ser Met Leu Asp Val Ala Asn Val Ala
                85                  90                  95
ggc gtc cag gtg gcc aac gtg gga agc gag gat atc acc tct gac atc    336
Gly Val Gln Val Ala Asn Val Gly Ser Glu Asp Ile Thr Ser Asp Ile
            100                 105                 110
ctg att tcc atg tcc aag aag ctg aac cgc gtt gta tgt gag gac ccg    384
Leu Ile Ser Met Ser Lys Lys Leu Asn Arg Val Val Cys Glu Asp Pro
        115                 120                 125
acc atg gcc ggt gct gtc atc acc cac ggc acc gac acc ctc gag gag    432
Thr Met Ala Gly Ala Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu
    130                 135                 140
act gcc ttc ttc ctg gac gcc act gtc aac tgt ggc aag cca att gtc    480
Thr Ala Phe Phe Leu Asp Ala Thr Val Asn Cys Gly Lys Pro Ile Val
145                 150                 155                 160
atc gtg ggt gcc atg cgc cca tcc acg gcc atc tca gct gac ggg ccc    528
Ile Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro
                165                 170                 175
ttc aat ctg ctc gaa gcc gtg acg gtg gct gcc tcc acg tcg gcg cgc    576
Phe Asn Leu Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Ala Ser Thr Ser Ala Arg
            180                 185                 190
gat cgc ggt gcc atg gtg gtc atg aac gat cgc att gcc tcg gcc tac    624
Asp Arg Gly Ala Met Val Val Met Asn Asp Arg Ile Ala Ser Ala Tyr
        195                 200                 205
tat gtg acc aag acc aat gcc aac act atg gac acc ttc aag gcc atg    672
Tyr Val Thr Lys Thr Asn Ala Asn Thr Met Asp Thr Phe Lys Ala Met
    210                 215                 220
gag atg ggc tac ctt ggc gag atg atc tcc aac acc cct ttc ttc ttc    720
Glu Met Gly Tyr Leu Gly Glu Met Ile Ser Asn Thr Pro Phe Phe Phe
225                 230                 235                 240
tac ccg ccc gtc aag cca acc ggt aag gtg gcc ttt gac atc acc aac    768
Tyr Pro Pro Val Lys Pro Thr Gly Lys Val Ala Phe Asp Ile Thr Asn
                245                 250                 255
gtg act gag atc ccc cgt gtg gac att ctg ttt tct tat gag gac atg    816
Val Thr Glu Ile Pro Arg Val Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Glu Asp Met
            260                 265                 270
cac aac gac acc ctc tac aac gcc atc tcc agt ggt gcc cag gga att    864
His Asn Asp Thr Leu Tyr ASn Ala Ile Ser Ser Gly Ala Gln Gly Ile
        275                 280                 285
gtg att gcc ggg gct ggt gct gga ggc gtc aca acc tcc ttc aat gag    912
Val Ile Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Val Thr Thr Ser Phe Asn Glu
    290                 295                 300
gct atc gag gat gtc atc aac cgt ttg gag atc cct gtc gtg cag agt    960
Ala Ile Glu Asp Val Ile Asn Arg Leu Glu Ile Pro Val Val Gln Ser
305                 310                 315                 320
atg cgc aca gtc aat ggg gaa gtg cca ctg tca gac gtg agc agc gac    1008
Met Arg Thr Val Asn Gly Glu Val Pro Leu Ser Asp Val Ser Ser Asp
                325                 330                 335
acc gcc acc cac atc gcc agt gga tsc cta aac ccg cag aag tcc cgc    1056
Thr Ala Thr His Ile Ala Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Gln Lys Ser Arg
            340                 345                 350
att ctg ttg gga ttg ctg cta tcc cag gga aag aat atc acc gaa atc    1104
Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ser Gln Gly Lys Asn Ile Thr Glu Ile
        355                 360                 365
gct gac gtg ttt gct ctg ggc acg gat gcg tag                        1137
Ala Asp Val Phe Ala Leu Gly Thr Asp Ala
    370                 375
<2l0>3
<211>378
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>3
Met Pro Leu Lys Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Asn Glu Thr Phe Val Phe
            20                  25                  30
Thr Asn Ala Asn Gly Leu Asn Phe Thr Gln Met Asn Thr Thr Leu Pro
        35                  40                  45
Asn Val Thr Ile Phe Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ser
    50                  55                  60
Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Leu
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ile Asp Ala Val Pro Ser Met Leu Asp Val Ala Asn Val Ala
                85                  90                  95
Gly Val Gln Val Ala Asn Val Gly Ser Glu Asp Ile Thr Ser Asp Ile
            100                 105                 110
Leu Ile Ser Met Ser Lys Lys Leu Asn Arg Val Val Cys Glu Asp Pro
        115                 120                 125
Thr Met Ala Gly Ala Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu
    130                 135                 140
Thr Ala Phe Phe Leu Asp Ala Thr Val Asn Cys Gly Lys Pro Ile Val
145                 150                 155                 160
Ile Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro
                165                 170                 175
Phe Asn Leu Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Ala Ser Thr Ser Ala Arg
            180                 185                 190
Asp Arg Gly Ala Met Val Val Met Asn Asp Arg Ile Ala Ser Ala Tyr
        195                 200                 205
Tyr Val Thr Lys Thr Asn Ala Asn Thr Met Asp Thr phe Lys Ala Met
    210                 215                 220
Glu Met Gly Tyr Leu Gly Glu Met Ile Ser Asn Thr Pro Phe phe Phe
225                 230                 235                 240
Tyr Pro Pro Val Lys Pro Thr Gly Lys Val Ala Phe Asp Ile Thr Asn
                245                 250                 255
Val Thr Glu Ile Pro Arg Val Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Glu Asp Met
            260                 265                 270
His Asn Asp Thr Leu Tyr Asn Ala Ile Ser Ser Gly Ala Gln Gly Ile
        275                 280                 285
Val Ile Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Val Thr Thr Ser Phe Asn Glu
    290                 295                 300
Ala Ile Glu Asp Val Ile Asn Arg Leu Glu Ile Pro Val Val Gln Ser
305                 310                 315                 320
Met Arg Thr Val Asn Gly Glu Val pro Leu Ser Asp Val Ser Ser Asp
                325                 330                 335
Thr Ala Thr His Ile Ala Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Gln Lys Ser Arg
            340                 345                 350
Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ser Gln Gly Lys Asn Ile Thr Glu Ile
        355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Ala Leu Gly Thr Asp Ala
    370                 375

Claims (30)

1.用于生产食物制品的方法，其中涉及到至少一个加热步骤，所述方法包括将一种或多种酶加入到所述生产方法的所述食物制品的中间产物形式中去，其中，所述的酶在加热步骤之前加入，加入量对降低存在于所述食物制品的所述中间产物形式中涉及所述加热步骤中丙烯酰胺形成的氨基酸的水平是有效的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的食物制品是从至少一种植物原材料来制备的。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的植物原材料是谷物面粉，优选是小麦面粉或者马铃薯。
4.如前面任何一项权利要求所述的方法，其中，所述的酶能修饰该生产方法中加热步骤期间涉及丙烯酰胺形成的氨基酸的侧链，并且，上述氨基酸的降解产物不会导致丙烯酰胺的形成，或者，至少较之该氨基酸的未改变的形式，更少导致丙烯酰胺形成。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述的酶修饰天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸中的至少一种的侧链。
6.如前面任何一项权利要求所述的方法，其中所述的酶以酶制剂的形式加入，或者通过能生产所述酶的微生物原位产生。
7.如权利要求7所述的方法，其中所述的酶制剂从微生物中获得。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述的微生物是细菌、真菌或酵母。
9.如前面任何一项权利要求所述的方法，其中所述的酶是天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)或谷氨酰胺酶(EC 3.4.1.2)。
10.一种能与SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交的经过分离的多核苷酸。
11.如权利要求10所述的经过分离的多核苷酸，能在高度严谨条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸杂交。
12.如权利要求10或11所述的经过分离的多核苷酸，可从丝状真菌中获得。
13.如权利要求12所述的经过分离的多核苷酸，可从Aspergillus niger获得。
14.一种编码天冬酰胺酶的经过分离的多核苷酸，所述天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其功能等同物。
15.一种经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码天冬酰胺酶的至少一个功能结构域，所述天冬酰胺酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其功能等同物。
16.一种经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其功能等同物。
17.一种由SEQ ID NO：1构成的经过分离的多核苷酸。
18.一种载体，包含如权利要求10至17所述的多核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的载体，其中如权利要求10至17所述的多核苷酸序列被可操作地连接到调控序列上，所述调控序列适于在合适的宿主细胞中表达所述多核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的载体，其中所述的合适的宿主细胞是丝状真菌。
21.一种制造如权利要求10-17中任意一项所述的多核苷酸或如权利要求18-20中任意一项所述的载体的方法，所述方法包括以下步骤：培养经过所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，从所述宿主细胞中分离出所述多核苷酸或所述载体。
22.一种经过分离的天冬酰胺酶，其具有SEQ ID NO：3或其功能等同物的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的经过分离的天冬酰胺酶，可从Aspergillusniger获得。
24.一种经过分离的天冬酰胺酶，可通过在适当的宿主细胞中，例如在Aspergillus niger中，表达如权利要求10-17中任意一项所述的多核苷酸或如权利要求18-20中任意一项所述的载体来获得。
25.重组的天冬酰胺酶，其中包含如权利要求22-24中任意一项所述的任何天冬酰胺酶的功能结构域。
26.一种用于制造如权利要求22-25中任意一项所述的天冬酰胺酶的方法，所述方法包括以下步骤：用如权利要求10-17中任意一项所述的经过分离的多核苷酸或如权利要求18-20中任意一项所述的载体来转化合适的宿主细胞，在允许所述多核苷酸表达的条件下培养所述的宿主细胞，以及，可选地，从所述细胞或培养基中纯化出被编码的多肽。
27.一种重组宿主细胞，其中包括如权利要求10-17中任意一项所述的多核苷酸或如权利要求18-20中任意一项所述的载体。
28.一种重组宿主细胞，其表达如权利要求22-25中任意一项所述的多肽。
29.如权利要求22-25中任意一项所述的天冬酰胺酶在用于如权利要求1-9中任意一项所述的生产食物制品的方法中的用途。
30.一种食物制品，所述食物制品可通过权利要求1-9中任意一项方法或权利要求29所述的方法来获得。
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