CN103397012A - 新颖的天冬酰胺酶变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新颖的天冬酰胺酶变体及其用途。本发明涉及SEQ ID NO:3的新鉴定出的天冬酰胺酶多肽变体以及编码此类新颖的天冬酰胺酶变体的多核苷酸序列。此外,本发明涉及这些新颖的天冬酰胺酶变体在工业工艺中的用途。
Description
本发明是申请日为2008年4月17日、申请号为200880012810.1、题为“新颖的天冬酰胺酶变体及其用途”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新鉴定出来的天冬酰胺酶多肽变体和包含编码这些天冬酰胺酶变体的基因的多核苷酸序列。本发明涉及鉴定合适的天冬酰胺酶变体的方法。本发明还涉及在工业工艺中使用这些变体蛋白的方法。本发明还包括经根据本发明的多核苷酸转化过的、适于生产这些蛋白的细胞以及其中已根据本发明对蛋白进行了遗传修饰以增强或降低其表达水平和/或活性的细胞。本发明还涉及在工业工艺中使用这些蛋白的方法。
发明背景
近来,公开了丙烯酰胺在很多经加热食物产品中的出现(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13,517-522(2000))。鉴于丙烯酰胺被认为可能对动物和人致癌,该发现导致产生了世界范围的关注。进一步的研究揭示,在多种经烘焙、煎炸和烤箱制备的常见食物中可检测到相当含量的丙烯酰胺,并且显示,食物中丙烯酰胺的出现是加热工艺的结果。
Mottram et al.Nature419:448(2002)已提出了作为Maillard反应的结果从氨基酸和还原糖形成丙烯酰胺的途径。根据该假说,丙烯酰胺可在Maillard反应期间形成。在烘焙和烘烤(roasting)期间,Maillard反应负责颜色、气味和味道。与Maillard相关的反应是氨基酸的Strecker降解,提出了形成丙烯酰胺的途径。当温度超过120℃,可检测到丙烯酰胺的形成,在170℃左右观察到了最高的形成速率。当存在天冬酰胺和葡萄糖时,可观察到最高的丙烯酰胺水平,而芥氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量。
EU中针对丙烯酰胺从食物接触的塑料迁移进食物的官方迁移限制被设置为10ppb(每kg10微克)。虽然对烹饪期间形成的丙烯酰胺尚没设置官方限制,但是很多产品(尤其是谷物类、面包产品和基于马铃薯或玉米的产品)超过该值这一事实导致了人们的关注。
已知若干植物原材料含有较高水平的天冬酰胺。在马铃薯中,天冬酰胺是占主要的游离氨基酸(940mg/kg,对应总氨基酸含量的40%),在小麦面粉中,天冬酰胺以大约167mg/kg的水平存在,对应于总游离氨基酸的14%(Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer New York,1999)。丙烯酰胺主要从天冬酰胺(组合还原糖)形成,这一事实可解释经煎炸、烤箱烹饪或烘烤的植物产品中丙烯酰胺的高水平。因此,就公众健康方面的兴趣而言,急切需要具有低得多的丙烯酰胺水平,或者优选全无丙烯酰胺的食物产品。
已经提出了多种减少丙烯酰胺含量的解决方案,或者通过改变加工变量,例如,加热步骤的温度或持续时间,或者通过化学方式或酶促方式防止丙烯酰胺形成或者通过除去形成的丙烯酰胺来实现。
在若干专利申请中,已经公开了天冬酰胺酶用于减少天冬酰胺水平以及由此减少形成的丙烯酰胺的量的用途。已从若干种真菌来源产生了用于该目的的合适的天冬酰胺酶,例如,从Aspergillus niger(WO2004/030468中)和Aspergillus oryzae(WO04/032648中)。
虽然所有L-天冬酰胺酶都催化同样的化学转化,但这并不意味着它们适合用于同样的应用。多种不同的应用对酶被操作的必要条件提出了不同的要求。可能影响到酶促转化速率的物理和化学参数是温度(对化学反应速率有正面影响,但是可能对酶稳定性有负面影响)、水分含量、pH、盐浓度、食物基质的结构整合性、酶的活化剂或抑制剂的存在、底物和产物的浓度等。
因此,人们正需要改进的天冬酰胺酶,用于具有改进性质的多种应用。
发明目的
本发明的一个目的是提供新颖的天冬酰胺酶变体多肽和编码此类变体的多核苷酸。另一个目的是提供产生此类天冬酰胺酶变体的重组菌株。鉴定变体的方法、制造和使用根据本发明的多核苷酸和多肽的方法也是本发明的一部分。
发明内容
本发明提供了具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的多肽变体,其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于氨基酸41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371中任何的氨基酸残基的取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
本发明还提供了:
-编码此类变体的核酸序列;
-核酸构建体,其中包含编码本发明变体的核酸序列,所述核酸序列与能指导天冬酰胺酶在合适表达宿主中表达的一种或多种控制序列可操作地连接;
-重组表达载体,其包含此类核酸构建体;
-重组宿主细胞,其包含此类表达载体;
-生产天冬酰胺酶的方法,所述方法包括在有益于生产所述天冬酰胺酶的条件下培养宿主细胞,以及回收所述天冬酰胺酶;
-生产天冬酰胺酶多肽变体的方法,所述方法包括:
a)选择亲本天冬酰胺酶多肽;
b)取代对应于41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371中任何位置的至少一个氨基酸残基,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
c)任选地,对b)中定义的一个或多个另外的氨基酸进行取代;
d)制备从步骤a)-c)产生的变体;
e)测定变体的比活性和/或pH最优值;
以及
f)选择较之亲本天冬酰胺酶多肽具有增加的比活性和/或pH最优值的变体,由此产生天冬酰胺酶多肽变体。
-组合物,其包含本发明的变体或通过本发明的方法获得的变体;
-本发明的组合物在生产食物产品中的用途;
以及
-本发明的组合物用于降低基于含有天冬酰胺的原材料的经热加工食物产品中形成的丙烯酰胺的量的用途。
发明详述
在本发明说明书和所附权利要求全文中,“包含”和“包括”以及其各种词性形式都表示包括在内。即,这些词语用于表示在情况允许时可能包括没有具体提到的其它元件或整数。
本发明涉及具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的多肽变体。所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于氨基酸41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371中任何的氨基酸残基的取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
即,当变体天冬酰胺酶序列与SEQ ID NO:3的天冬酰胺酶序列比对时,变体将在对应于SEQ ID NO:3中上文示出的位置之一的(变体中的)位置包含至少一处取代。“取代”在上下文中表示,变体中对应于SEQ ID NO:3中上文示出的位置之一的位置包含在亲本多肽的该位置不出现的氨基酸残基(所述亲本多肽可以是SEQ ID NO:3)。
本发明的变体天冬酰胺酶多肽中,对应于SEQ ID NO:3中上文示出的位置的那些位置可这样鉴定出来:通过使用例如与通过GAP程序(关于该程序的细节见下文)发现的最同源的序列的GAP比对,将变体多肽的序列与SEQ ID NO:3的序列加以比对。对应于上文示出的SEQ IDNO:3中位置的变体中的位置由此可被鉴定出来,并被称为参照SEQ IDNO:3定义的那些位置。
可用于本发明的亲本天冬酰胺酶多肽可以是任何天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)。合适的天冬酰胺酶多肽可从多种来源获得,例如从植物、动物或微生物获得。例如,天冬酰胺酶可从Escherichia、Erwinia、Streptomyces、Pseudomonas、Aspergillus和Bacillus的物种获得。合适的Escherichia菌株的例子是Escherichia coli。合适的Erwinia菌株的例子是Erwinia chrysanthemi。合适的Streptomyces菌株的例子是Streptomyceslividans和Streptomyces murinus。合适的Aspergillus菌株的例子是Aspergillus oryzae、Aspergillus nidulans或Aspergillus niger。合适的Bacillus菌株的例子是Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillusstearothermophilus、Bacillus subtilis或Bacillus thurigiensis。
适于从菌株获得天冬酰胺酶的方法的例子在WO03/083043中有所描述。适于从Aspergillus获得天冬酰胺酶的方法的例子在WO2004/030468和WO04/032468中有所描述。
适用于本发明的一种优选的亲本天冬酰胺酶多肽是这样的多肽,其具有SEQ ID NO:3所示的序列,或者与SEQ ID NO:3具有至少80%的同源性,例如,与SEQ ID NO:3具有至少85%的同源性,例如,与SEQ IDNO:3至少85%同源性,与SEQ ID NO:3至少90%同源性,例如,与与SEQ ID NO:3至少95%,至少98%或者至少99%的同源性。
本发明变体中较之SEQ ID NO:3所示序列被取代的氨基酸残基是对应于相对于SEQ ID NO:3来定义的位置41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371的那些。
变体可在所述位置中的一处或多处包含取代,例如,所述位置中的两处、三处、四处、至少5处、至少10处、至少15处、至少20处、至少25处、至少30处、至少35处、至少40处、至少45处、至少50处、至少55处、至少60处、至少65处、至少70处或者全部。
用于取代的位置的一个优选亚组由相对于SEQ ID NO:3来定义的位置41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、214、215、216、218、220、228、232、233、262、267、293、295、297、298、299、300、301、303、304、310、314、317、319、321、324、330、332、333、334或371界定。
变体可在所述位置中的一处或多处包含取代,例如,所述位置中的两处、三处、四处、至少5处、至少10处、至少15处、至少20处、至少25处、至少30处、至少35处、至少40处、至少45处或者全部。
用于取代的位置的一个更优选的亚组由相对于SEQ ID NO:3来定义的位置41、53、63、64、66、73、74、76、77、88、90、91、101、106、111、119、122、123、132、140、145、161、170、195、211、218、228、232、233、262、267、293、295、297、299、300、301、303、304、310、314、317、321、324、330、332、333或371界定。
用于取代的位置的一个进一步更优选的亚组由相对于SEQ ID NO:3来定义的位置53、63、64、66、73、74、76、77、88、101、140、170、293界定。
变体可在所述位置中的一处或多处包含取代,例如,所述位置中的两处、三处、四处、至少5、至少10、至少15、至少20处或者全部。
本发明的变体可包含如上文所定义的一处或多处取代。“取代”在上下文中表示,变体中对应于SEQ ID NO:3中上文示出的位置之一的位置包含在亲本多肽的该位置不出现的氨基酸残基(所述亲本可以是SEQ IDNO:3)。
优选取代示于下表中(位置相对于SEQ ID NO:3所示的序列来定义)
位置 | 最优选 | 更优选 | 优选 |
41 | I | IN | |
53 | Y | LY | |
62 | GAT | GATFK | |
63 | GVS | GASV | GASIVE |
64 | P | ANDP | |
66 | P | NKP | |
70 | AS | ||
71 | N | ASNE | |
73 | K | QNKE | HSNDQERK |
74 | A | AV | |
76 | T | STV | STVQNKE |
77 | I | IL | |
88 | YP | YPE | |
90 | V | VYF | |
91 | E | SNE | |
101 | V | VSTDH |
位置 | 最优选 | 更优选 | 优选 |
102 | S | SRK | |
103 | I | LIFMT | |
104 | ND | AND | |
106 | P | PQ | GAKESTNPQ |
107 | N | SNE | |
108 | VM | VML | |
109 | NS | RDGNS | |
111 | G | GS | GSTH |
119 | N | TN | TNMQER |
122 | H | EH | ADEHK |
123 | A | ALT | |
132 | S | ||
140 | N | ||
142 | M | ||
143 | D | DSAG | |
145 | S | S | |
161 | L | VL | VLFM |
162 | T | AT | |
163 | A | ||
164 | S | GS | |
168 | A | AGT | |
169 | S | AGS | |
170 | T | ST | EGST |
195 | D | ||
211 | S | SV | SVMINQ |
213 | S | SIM | |
214 | H | SH | |
215 | ST | ||
216 | ST | STVLF | |
217 | SN | ASNDK | |
218 | V | VLT | |
219 | NQE | ASNQE | |
220 | AS | ||
228 | H | NH | ASNH |
232 | V | VI | VIF |
233 | V | VH | VHLREYFS |
234 | ND | GND | |
235 | GS | GSDI | |
262 | CH | ||
267 | Y | Y |
位置 | 最优选 | 更优选 | 优选 |
268 | NAG | GANTF | |
269 | HF | ||
270 | Q | ASIQ | |
271 | N | NE | |
272 | A | AIDQ | |
273 | QTS | QTSPDE | |
293 | SV | SVET | SVETML |
295 | S | NS | |
297 | S | NSTA | |
298 | ILM | ILMWFT | |
299 | S | SDA | SDAPHYN |
300 | I | SI | EDHKANQIS |
301 | P | TPAGD | GATPNRDEYK |
302 | Y | QNHWVIY | |
303 | S | YFS | GLKEDIAYFS |
304 | T | ATSD | ATSDNKP |
310 | V | ATV | AVMT |
314 | D | SND | GASNDQH |
317 | I | I | |
318 | MIA | ||
319 | ATLR | ATLRVIYH | |
321 | T | ST | STHRKA |
323 | VS | IVS | |
324 | G | GP | MAGP |
325 | AST | ASTDEW | |
327 | M | MIPYSARVT | |
328 | ST | STI | |
329 | AT | ATLG | |
330 | S | PSYTIL | DERQVPSYTIL |
331 | AT | ATGNDEKR | |
332 | A | A | ANSGEKPQ |
333 | E | EDS | EDSIFAGK |
334 | GTDE | GTDEPVI | |
335 | TGD | ||
371 | M | AIM |
根据本发明的变体可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含第41位的I1e、第53位的Tyr、第63位的G1y或Val或Ser、第64位的Pro、第66位的Pro、第73位的Lys、第74位的Ala、第76位的Thr、第77位的Ile、第88位的Tyr或Pro、第90位的Val、第91位的Glu、第101位的Val、第106位的Pro、第111位的Gly、第119位的Asn、第122位的His、第123位的Ala、第132位的Ser、第140位的Asn、第145位的Ser、第161位的Leu、第170位的Thr、第195位的Asp、第211位的Ser、第218位的Val、第228位的His、第232位的Val、第233位的Val、第262位的Cys或His、第267位的Tyr、第293位的Ser或Val、第295位的Ser、第297位的Ser、第299位的Ser、第300位的Ile、第301位的Pro、第303位的Ser、第304位的Thr、第310位的Val、第314位的Asp、第317位的Ile、第321位的Thr、第324位的Gly、第330位的Ser、第332位的Ala、第333位的Glu或第371位的Met中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
在一种优选的实施方式中,根据本发明的变体可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含第53位的Tyr、第63位的Gly或Val、第64位的Pro、第66位的Pro、第73位的Lys、第74位的Ala、第76位的Thr、第77位的Ile、第88位的Tyr或Pro、第101位的Val、第140位的Asn、第170位的Thr、第293位的Ser或Val中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
在一种优选的实施方式中,根据本发明的变体可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第63位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第63位的Gly或Val,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第63位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代D63G和G132S的多肽(暂时称为ASN01),包含取代D63G、D111G和R122H的多肽(暂时称为ASN02),包含取代D63V和T300I的多肽(暂时称为ASN03)。
在另一实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第64位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第64位的Pro,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第64位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代S64P和I310V的多肽(暂时被称为ASN04)。
在又一实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第66位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第66位的Pro,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第66位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代T41I、S66P和V371M的多肽(暂时被称为ASN05)。
在又一实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第73、74、293位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第73位的Lys,第74位的Ala,第293位的Ser或Val中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第73、74或293位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代G195D和A293V的多肽(暂时被称为ASN14),包含取代T73K、S74A和A293S的多肽(暂时被称为ASN15)或包含取代T73K、S74A、E106P、A293S、G297S、T299S、Q319A、M321T和V324G的多肽(暂时被称为ASN16)。
在另一实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第76或101位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第76位的Thr或第101位的Val中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第76或101位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ IDNO:3)的例子是包含取代A76T和A101V的多肽(暂时被称为ASN06)。
在又一实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第77位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第77位的Ile,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第77位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代V77I、V123A和E314D的多肽(暂时被称为ASN07)。
在一种实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第88位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第88位的Tyr或Pro,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第88位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代S88Y的多肽(暂时被称为ASN08)或包含取代S88P、I161L和R262C的多肽(暂时称为ASN09)。
在另一实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第140位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第140位的Asn,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第140位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代D140N的多肽(暂时称为ASN10)。
在一种实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第170位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第170位的Thr,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第170位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代D91E、A170T和R262H的多肽(暂时称为ASN11)。
在再一种实施方式中,根据本发明的多肽可具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第53位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,优选地,包含第53位的Tyr,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述变体的亲本多肽优选对应于SEQ ID NO:3。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第53位氨基酸的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代F53Y和K119N的多肽(暂时称为ASN13)。
具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体(其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于第41、53、63、64、66、73、74、76、77、88、90、91、101、106、111、119、122、123、132、140、145、161、170、195、211、218、228、232、233、262、267、293、295、297、299、300、301、303、304、310、314、317、321、324、330、332、333或371位氨基酸中任何的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽对应于SEQ ID NO:3)的例子是包含取代L90V、K119N、Y228H和R262C的多肽(暂时称为ASN12)。
本发明的变体较之亲本还可在并非上面指出的位置包含另外的修饰,例如,一种或多种另外取代、添加或缺失。本发明的变体可包含不同类型的这类修饰的组合。变体可包含一处、两处、三处、四处、至少5处、至少10处、至少15处、至少20处、至少25处、至少30处或更多此类修饰(它们全部可以是相同类型的修饰,或者可以是不同类型的修饰)。典型地,另外的修饰可以是取代。
根据本发明的变体可与亲本天冬酰胺酶多肽具有至少80%的同源性,例如与亲本多肽至少85%的同源性,例如与亲本多肽至少90%的同源性,与亲本多肽至少95%的同源性,与亲本多肽至少98%的同源性,或例如与亲本多肽至少99%的同源性。
本发明的变体典型地保留了天冬酰胺酶活性(EC3.5.1.1)。即,本发明的变体典型地将能催化天冬酰胺水解为天冬氨酸。本发明的变体因此典型地能修饰下述天冬酰胺酶的侧链,所述天冬酰胺酶参与对涉及至少一个加热步骤的食物产品的生产期间的丙烯酰胺形成。
优选地,本发明的变体典型地将展示出较之其源于的亲本天冬酰胺酶多肽而言改进的性质。如果变体按照下文所述来使用的话,例如,在制备食品的方法中使用的话,此类改进的性质典型地将是相关的性质。
此类性质包括但不限于:增加的比活性(从而在制备食品的方法中,较之需要的亲本天冬酰胺酶的量而言,可使用较少量的变体),提高或减小的pH最优值,更特别地,更适用于制备食品的方法的pH最优值(较之亲本天冬酰胺酶而言),以及增加的热稳定性。
在一种实施方式中,根据本发明的变体蛋白可具有比亲本多肽更高或比亲本多肽更低的pH最优值。优选地,变体蛋白的pH最优值比亲本多肽的更高。优选地,亲本多肽是根据SEQ ID NO:3的多肽。例如,来自A.niger的野生型天冬酰胺酶(如SEQ ID NO:3所公开的)具有pH4至pH5的pH最优值。本发明的变体可比此类野生性酶更亲碱性,即,可例如具有pH5至pH8的pH最优值,优选地,pH6至pH7。任选地,本发明的变体蛋白可比野生型天冬酰胺酶更亲酸性。
优选地,根据本发明的变体天冬酰胺酶可具有这样的pH,其比pH最优值要高,并且,在这样的pH下,仍存在50%的天冬酰胺酶活性(下文中称为碱性pH),其比亲本天冬酰胺酶的这种pH要高。当亲本天冬酰胺酶是根据SEQ ID NO:3的时,变体蛋白可观察到活性的50%的碱性pH,其是至少6.9,优选地至少7.0,至少7.5,优选至少8。
相对于亲本天冬酰胺酶展示出改进的性质的变体是这样的变体,其显示出可测量到的、相对性质的降低或增加,典型地,使得所述变体更适于下文所述的用途,例如在生产食品的方法中。
优选地,在同样的pH下测量时,根据本发明的变体可具有比亲本多肽更高的比活性。变体蛋白的比活性在本文中表示变体蛋白的天冬酰胺酶活性,其是以单位/mg纯蛋白测量的。优选地,在至少一个pH下根据本发明的变体蛋白的比活性比相同pH下测量的亲本多肽的比活性高,优选地,在4至8之间的pH下。
在本发明的另一实施方式中,变体天冬酰胺酶比亲本天冬酰胺酶多肽更嗜热。
该性质因此可减少至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%或至少99%。或者,该性质可增加至少10%,至少25%,至少50%,至少100%,至少200%,至少500%或至少1000%。在本方面的百分比减少或增加表示较之亲本天冬酰胺酶多肽而言的百分比减少或增加。本领域技术人员公知如何测量此类百分比改变——这是对亲本天冬酰胺酶和变体天冬酰胺酶活性的比较。
本文描述的变体被共同包含在术语“根据本发明的多肽”或“根据本发明的变体”中。
(如通常所公认的一样,)术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的,当上下文中需要指出通过肽键偶联起来的至少两个氨基酸的链时,两个术语可以互换使用。“多肽”这个词在本文中被用于指含有超过七个氨基酸残基的链。本文中所有寡肽和多肽的分子式或序列都是从左至右并且从氨基端到羧基端的方向书写的。本文中使用的单字母氨基酸代码在本领域中是公知的,其可以在Sambrook,et al.(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd,ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中找到。
“经分离的”多肽或蛋白表示从其自然环境中移出来的多肽或蛋白。例如,出于本发明的目的,在宿主细胞中表达的经重组生产的多肽和蛋白被认为是经过分离的;已用任何合适的技术进行了基本纯化的天然或重组多肽也被认为是经过分离的,所述技术例如是在Smith and Johnson,Gene67:31-40(1988)中公开的一步纯化法。
可通过已知的方法从重组细胞培养物中回收及纯化本发明的多肽变体。最优选地,使用离子交换色谱或高效液相色谱(HPLC)来进行纯化。
本发明的多肽包括化学合成流程的产物以及通过重组技术从原核或真核宿主中生产的产物,所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物。本发明的多肽可以是经过了糖基化的,或者可以是未经过糖基化的,这取决于在重组生产流程中所使用的宿主。此外,本发明的多肽还可以包括初始的经修饰的甲硫氨酸残基,在某些情况下这是宿主介导的过程的结果。
本发明还涉及根据本发明的多肽变体的生物活性片段。术语“本发明的变体”包括此类片段。
本发明多肽变体的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与本发明的变体蛋白的氨基酸序列充分相同或源于本发明的变体蛋白的氨基酸序列,所述片段包括的氨基酸较之全长蛋白要少,但显示出相应全长蛋白的至少一种生物活性。典型地,生物活性片段包含具有相应全长蛋白的至少一种生物活性的结构域或基元(motif)。本发明的蛋白的生物活性片段可以是多肽,其长度例如为10、25、50、100或更多个氨基酸。此外,可以通过重组技术来制备其它生物活性部分,所述部分中被去除了所述蛋白的其它区域,并可针对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性,对所述部分进行评估。
典型地,本发明的蛋白片段将包含本文定义的取代中的一种或多种。
本发明还涉及编码上述生物活性片段的核酸片段(所述生物活性片段自身是本发明的变体)。
如上文所示,本发明提供了编码本发明的变体多肽的多核苷酸。本发明还涉及经分离的多核苷酸,其编码本发明的多肽变体的至少一种功能结构域。典型地,此类结构域将包含本文所述的取代中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中,根据本发明的核酸序列编码包含下述氨基酸序列的多肽,其中,所述氨基酸序列较之亲本天冬酰胺酶而言具有一处或多处截短,和/或至少一处氨基酸取代、缺失和/或插入。但是,此类多肽典型地包含本文所述的取代中的一种或多种。
在本文中使用时,术语“基因”和“重组基因”指下述核酸分子,其包括编码本文所述的变体的开放读码框。基因可包括编码序列、非编码序列、内含子和调控序列。即,本文中使用时,“基因”可表示如本文所定义的经分离的核酸分子。因此,术语“基因”在本申请上下文中不仅仅指天然存在的序列。
可使用本领域技术人员公知的标准分子生物学技术,组合本文提供的序列信息,来产生本发明的核酸分子。
例如,可使用标准合成技术,从头合成需要的核酸分子。此类合成工艺典型地将是自动工艺。
或者,可通过对已有核酸分子(例如野生型核酸分子)的定点诱变,来产生本发明的核酸分子。可使用本领域技术人员公知的多种技术来进行定点诱变。
在一种此类方法中,仅举例而言的话,使用编码想要的取代的寡核苷酸“引物”,在质粒模板上进行PCR。鉴于引物是新合成的链的末端,在合成模板DNA的第一个循环期间将有错配,第一轮之后,基于引物的链(含有突变)将与原来的模板浓度相等。后续循环后,其将指数级增长,25个循环后,将在8百万:1的区间超过原来的未突变的链,从而产生近乎均匀的经突变的扩增片段。可通过酶促消化,例如使用仅切割甲基化的DNA的限制性酶(例如Dpn1),来除去模板DNA。源于碱性裂解质粒制备物并由此被甲基化的模板在该步被破坏,但是经突变的质粒得以保留,因为其是体外产生的,因此是未甲基化的。
在此类方法中,可在单次PCR反应中向核酸分子中引入超过一处突变(编码本文所述的取代),例如通过使用每种包含一种或多种错配的一种或多种寡核苷酸来实现。或者,可通过进行超过一次PCR反应来向核酸分子中引入超过一处的突变,每次反应引入一处或多处突变,使得以顺序的、反复的方式向核酸中引入改变的核酸。
可使用eDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板,使用合适的错配寡核苷酸引物,根据上文所述的定点诱变技术,来产生本发明的核酸。以这种方式获得的核酸分子可被克隆进合适的载体,并可通过DNA序列分析来对其加以表征。
较之亲本天冬酰胺酶,本发明的核酸序列可包含一处或多处缺失,即,缺口。还可使用合适的寡核苷酸,利用定点诱变,来产生此类缺失/缺口。用于产生此类缺失的技术是本领域技术人员公知的。
此外,可通过标准合成技术,例如,使用自动DNA合成仪,来制备对应于根据本发明的核苷酸或能与根据本发明的核苷酸杂交的寡核苷酸。
此外,本发明包括互补核酸序列。与另一条核苷酸分子互补的核酸分子是与另一核苷酸序列充分互补的,从而,其可与另一核苷酸序列杂交,由此形成稳定的二体。
本发明的一个方面涉及编码本发明的变体或其生物活性片段或结构域的经分离的核酸分子,以及足以用作为杂交探针以鉴定编码本发明的多肽的核酸分子的核酸分子,和适于用作为PCR引物以扩增或突变核酸分子(例如,用于制备本发明的核酸分子)的此类核酸分子的片段。
“经分离的多核苷酸”或“经分离的核酸”是这样的DNA或RNA,其与所述DNA或RNA所源于的生物体的天然存在的基因组中所述DNA或RNA直接相邻的两条(5’端的一条和3’端的一条)编码序列并不直接相邻。因此,在一种实施方式中,经分离的核酸包括与编码序列直接相邻的5’非编码(例如,启动子)序列的一部分或全部。因此该术语包括,例如,插入到载体中的重组DNA,插入到自主复制质粒或病毒中的重组DNA,或插入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA,或作为不依赖其它序列的独立分子(例如,通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)而存在的重组DNA。该术语还包括作为杂种基因(hybrid gene)一部分的重组DNA,所述杂种基因编码另外的多肽,所述的多肽基本去除了细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术生产时),或化学前体或其它化学制品(当化学合成时)。此外,“经离的核酸片段”并非是天然就作为片段存在的,而且其也不能在自然状态被发现。
在本文中使用时,术语“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如cDNA和基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物生产出的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的,但优选是双链的DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(次黄苷或硫代磷酸核苷酸)来合成核酸。例如,此类寡核苷酸可被用于制备碱基配对能力有所改变或对核酸酶抗性增加的核酸。
本发明的另一种实施方式提供了经过分离的核酸分子,其反义于本发明的核酸分子。
术语“同源性”或“百分比同一性”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言,在此定义:为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性,本着最优比较的目的(例如,可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口,以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对),将所述序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一条序列上的位置被与第二条序列中相应位置处相同的氨基酸或核苷酸残基占据,那么这两条分子在该位置是相同的。两条序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即,%同一性=相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数x100)。优选地,两条序列长度相同。
可在被比较的两条序列全长上或两条序列片段上进行序列比较。典型地,在被比较的两条序列的全长上进行比较。但是,可在例如二十个、五十个、一百个或更多个相邻的氨基酸残基的区域上确定序列同一性。
技术人员将知道,有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如,可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间百分比同一性的确定。在一种优选的实施方式中,使用Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的百分比同一性,所述算法已被加入到GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中,其中使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵,缺口权重为16、14、12、10、8、6或4,长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员将知道,所有这些不同的参数将导致有细微区别的结果,但是使用不同算法时两条序列的总体百分比同一性不会有显著改变。
本发明的蛋白序列或核酸序列还可被用作“查询序列”来开展对公众数据库的搜索,例如,以鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)来开展此类搜索。可以用BLASTP程序,以分数=50,字长=3来进行此类BLAST蛋白搜索,以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的,为获得有缺口的比对,可以利用Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时,可以使用各个程序(例如BLASTP和BLASTN)的缺省参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
本发明的另一个方面涉及载体,优选为表达载体,所述载体含有编码本发明的变体天冬酰胺酶的核酸。
在本文中使用时,术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”,“质粒”指环状的双链DNA环,另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体,其中,另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如,具有细菌的复制起点的细菌载体以及游离的哺乳动物载体)。其它一些载体(例如,非游离的哺乳动物载体)在被引入宿主细胞之后就被整合到了宿主细胞的基因组中,由此它们与宿主基因组一同复制。此外,某些载体能指导可操作地连接到其上的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言,在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最常用到的载体形式。然而,本发明也将包括其它形式的表达载体,例如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒),所述载体能提供等同的功能。
本发明的重组表达载体包含以适于所述核酸在宿主细胞中表达的形式存在的本发明的核酸,这意味着所述重组表达载体包括一段或多段调控序列,调控序列是基于被用于表达的宿主细胞来选择的,其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中,“可操作地连接”表示:人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上,所述的连接以允许该核苷酸序列表达的方式(例如,在体外转录/翻译系统中或在载体被引入的宿主细胞中)进行。术语“调控序列”意欲包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如,聚腺苷酸化信号)。例如,在Goeddel;Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型或诱导型表达的调控序列,也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如,组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到,对表达载体的设计可能依赖于以下因素:对将被转化的宿主细胞的选择,期望获得的蛋白的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞,以生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如,根据SEQ ID NO:3的天冬酰胺酶变体或其变体,例如功能等同物或片段,或包含此类变体中一种或多种的融合蛋白)。
可以针对本发明的变体蛋白在原核细胞或真核细胞中的表达,而对本发明的重组表达载体加以设计。例如,本发明的蛋白质可在细菌细胞(例如E.coli)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在Goeddel;Gene Expression Technology:Methods inEnzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中对合适的宿主细胞进行了进一步的讨论。或者,重组表达载体可在体外进行转录及翻译,例如,使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
可用于本发明的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体,例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件的载体,源自病毒,例如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒(papova virus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体和源自上述物质的组合的载体,例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体,例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
插入的DNA应当被可操作地连接到合适的启动子上,例如:噬菌体的λPL启动子,E.coli的lac启动子、trp启动子和tac启动子,SV40的早期启动子和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等。技术人员知道其它合适的启动子。在一种具体的实施方式中,能指导脂肪分解酶在有丝真菌中高水平表达的启动子的启动子是优选的。此类启动子为本领域所已知。表达构建体可以含有用于转录起始和终止的位点,以及在转录区域可以含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录本的编码部分包括处于起点的用于起始翻译的AUG以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码。
可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入原核细胞或真核细胞。在本文中使用时,术语“转化”和“转染”指本领域内已知的一系列用于将外来核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook,et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd,ed.ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989),Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。
对哺乳动物细胞的稳定转染而言,人们已知,仅有一小部分的细胞可以将外来DNA整合到其基因组中,这取决于所用的表达载体和转染技术。为鉴别和选择出上述整合体,通常将编码选择性标记物(例如对抗生素的抗性)基因与人们感兴趣的基因一起引入到宿主细胞中。优选的选择性标记物包括赋予药物抗性的标记物,所述药物例如是G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择性标记物的核酸可在与编码本发明蛋白质的载体相同的载体上被转移到宿主细胞中,或者,可在另外的载体上被转移进去。可通过药物选择来鉴定经引入的核酸稳定转染的细胞(例如,已并入了选择性标记物基因的细胞将存活,而其它细胞则会死亡)。
蛋白在原核生物中的表达通常是在E.coli中开展的,其中使用含有组成型或诱导型启动子的载体,以指导融合蛋白或非融合蛋白的表达。融合载体将多个氨基酸加入到被编码的蛋白上,例如,加入到重组蛋白的氨基末端。典型地,此类融合载体用作三种目的:1)以增强重组蛋白的表达;2)以增加重组蛋白的溶解度;和3)通过在亲和纯化中作为配体以协助重组蛋白的纯化。通常,在融合表达载体中,向融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白酶剪切位点,以在融合蛋白被纯化之后能使重组蛋白与融合部分分离。
如所指出的,表达载体将优选含有选择性标记物。此类标记物包括:用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性,以及用于在E.coli和其它细菌中培养的四环素抗性或氨苄青霉素抗性。合适的宿主的代表性例子包括:细菌细胞,例如E.coli、Streptomyces Salmonella typhimurium和某些Bacillus的种;真菌细胞,例如Aspergillus的种,例如A.niger、A.oryzae和A.nidulans,例如酵母,例如Kluyveromyces,例如K.lactis和/或Puchia,例如P.pastoris;昆虫细胞,例如Drosophila S2和SpodopteraSf9;动物细胞,例如CHO、COS和Bowes黑色素瘤;以及植物细胞。用于上述宿主细胞的合适的培养基和培养条件都是本领域内已知的。
优选用于细菌的载体是例如在WO-A1-2004/074468(通过引用并入本文)中公开的那些。其它适合的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。
适用于本发明的已知的细菌启动子包括WO-A1-2004/074468(通过引用并入本文)中公开的那些。
可通过将增强子序列插入到载体中,来增强编码本发明变体的DNA在高等真核生物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件,其通常为10bp至300bp,其在给定的宿主细胞类型中发挥作用,以增加启动子的转录活性。增强子的例子包括处于复制起点晚期一侧(late side)第100bp至270bp处的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子的增强子、处于复制起点晚期一侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。
为使翻译的蛋白质能分泌到内质网的腔、胞质间隙或胞外环境中,可以将适当的分泌信号插入到表达的多肽中。所述的信号对多肽而言可以是内源的,也可以是异源信号。
本发明的变体可以以下述形式表达,所述形式使得其可包括其它异源功能区域,例如,分泌信号。本发明的变体还可包含,例如,加入到多肽N-末端的其它氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)的区域,以增加在宿主细胞中、在纯化期间或在随后的操作及贮藏期间的稳定性和持久性(persistence)。此外,还可以将肽的部分加入到所述多肽上,以协助进行纯化,例如通过添加组氨酸残基或T7标签来实现。
本发明的变体,例如本发明的蛋白或其功能等同物,例如其生物活性部分和片段,可被可操作地连接到非变体多肽(例如,异源氨基酸序列)上,以形成融合蛋白。“非变体多肽”在上下文中指具有对应于与本发明的变体天冬酰胺酶不基本同源的蛋白的氨基酸序列。
在融合蛋白内,本发明的变体可对应于本发明多肽的生物活性片段的全长序列。在一种优选的实施方式中,本发明的融合蛋白包含至少两个生物活性部分。在融合蛋白中,术语“可操作地连接”用来表示:变体多肽和非变体多肽以符合读码框的方式相互融合。非变体多肽可以被融合到变体多肽的N-末端或C-末端上。
例如,在一种实施方式中,融合蛋白是这样的融合蛋白,其中,变体序列被融合到GST序列的C-末端上。此类融合蛋白可以协助对根据本发明的重组变体的纯化。在另一种实施方式中,所述的融合蛋白是在其N-末端含有异源信号序列的本发明的变体。可以通过使用异源信号序列,来增加本发明的变体在某些宿主细胞(例如,哺乳动物宿主细胞和酵母宿主细胞)中的表达和/或分泌。
在另一个例子中,杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可被用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.,JohnWiley&Sons,1992)。真核异源信号序列的其它例子包括蜂毒肽的分泌序列和人类胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene;La Jolla,California)。在又一个例子中,有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(前述的Sambrook et al.)和蛋质A分泌信号(Pharmacia Biotech;Piscataway,NewJersey)。
信号序列可被用于协助本发明变体的分泌及分离。典型地,信号序列的特征为具有疏水氨基酸核心,分泌期间,在一次或多次切割事件中,通常可将所述信号序列从成熟蛋白质上切割掉。此类信号肽含有加工位点,允许信号序列在通过分泌途径之时被从成熟蛋白上切割掉。信号序列可指导变体的分泌,例如从转化进表达载体的真核宿主中分泌,信号序列随后或同时被切割掉。然后通过本领域公知的方法,可以很容易地从胞外培养基中纯化出本发明的变体。或者,可以用能协助纯化的序列,例如用GST结构域将信号序列连接到人们感兴趣的变体上。因此,例如,编码本发明变体的序列可与标记物序列(例如编码能促进本发明的融合变体的纯化的肽的序列)融合。在本发明这一方面的某些优选的实施方式中,标记物序列是六组氨酸肽,例如pQE载体(Qiagen,Inc.)中提供的标签;很多标记物序列都是可以购买到的。例如,如Gentz et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)所述,六组氨酸为融合蛋白提供了方便的纯化。HA标签是另一种有利于纯化的肽,其对应于来自流感血凝素蛋白质的表位,这已例如被Wilsonet al.,Cell37:767(1984)进行了描述。
本发明的融合蛋白可通过标准的重组DNA技术来产生。例如,按照传统技术,将编码不同多肽序列的DNA片段以符合读码框的方式连接到一起,例如,通过采用平末端或交错切口末端用于连接;采用限制性酶消化以提供合适的术端,或根据需要填平粘末端;采用碱性磷酸酶处理,以避免人们不想要的结合或酶连接。在另一种实施方式中,可以通过传统技术(包括自动DNA合成仪)来合成融合基因。或者,可以使用锚定引物(anchor primer)来对基因片段进行PCR扩增,所述引物能在两段连续的基因片段之间产生互补突出端(overhang),随后可以进行退火和再次扩增,以产生出嵌合基因序列(例如,见Current Protocols in MolecularBiology,eds.Ausubel et al.John Wiley&Sons:1992)。此外,还可以通过商业获得很多已经编码有融合部分(例如,GST多肽)的表达载体。编码变体的核酸可被克隆进此类载体,以使得融合部分以符合读码框的方式与所述变体连接起来。
术语“功能等同物”和“功能变体”在本文中可以互换使用。根据本发明的功能等同物是编码展示出本文定义的变体的特定功能的多肽的经分离的DNA片段。功能等同物因此还包括生物活性片段,它们自身也包括在术语本发明的“变体”的范围内。
优选地,本发明的功能等同物包含本文所述的取代中的一种或多种。但是,功能等同物还可包含除了上述取代之外的一种或多种修饰。
典型地,核酸功能等同物可以含有沉默突变或不改变所编码多肽的生物功能的突变。因此,本发明提供了编码变体天冬酰胺酶蛋白的核酸分子,其含有对特定生物活性来说非必要的氨基酸残基的改变。此类脂肪分解酶蛋白质与其所源于的亲本天冬酰胺酶序列的氨基酸序列不同,但仍保留其至少一种生物活性,优选地,它们至少保留天冬酰胺酶活性。在一种实施方式中,经分离的核酸分子包含编码下述蛋白的核苷酸分子,其中,所述蛋白包含与亲本氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:3所示的)至少大约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。
如本文所定义,术语“基本同源”指:第一条氨基酸或核苷酸序列与第二条氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的或最低要求数目的相同或等同(例如,具有相似侧链)的氨基酸或核苷酸,从而,所述的第一条和第二条氨基酸或核苷酸序列具有共同结构域。例如,含有共同结构域,且具有约60%,优选为65%,更优选为70%,进一步优选为75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性的氨基酸序列或核苷酸序列,在本文中就被定义为充分相同。
技术人员将知道,可通过在根据本发明的核苷酸序列中的突变来引入改变,由此在得到的蛋白的氨基酸序列中产生改变,而基本不影响此类蛋白的功能。
因此,本发明的天冬酰胺酶变体优选是包含下述氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与亲本氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:3所示的)至少大约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源,并且,典型地,还保留亲本多肽的至少一种功能活性。
本发明的变体,例如根据本发明的蛋白的功能等同物,还可以通过下述方法被鉴定出来,例如通过针对天冬酰胺酶活性,对本发明蛋白的突变体,例如截短突变体的组合文库进行筛选。在一种实施方式中,通过核酸水平上的组合诱变产生了变体的杂色文库(variegated library)。变体的杂色文库可以通过下述方式来产生,例如,通过酶促将合成的寡核苷酸混合物连接到基因序列上,使得一套可能是蛋白的简并序列可作为单个的多肽表达,或者,作为一套较大的融合蛋白表达(例如,用于噬菌体展示时)。有很多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列来生产可能是本发明多肽变体的文库。用于合成简并寡核苷酸的方法在本领域中是已知的(见:例如,Narang(1983)Tetrahedron39:3;Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura et al.(1984)Science198:1056;Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11:477)。
另外,编码本发明多肽的序列的片段的文库也可用于制造多肽的杂色群(population),以在随后对变体的选择中进行筛选。例如,可通过如下方法来制造编码序列片段的文库:在对每个分子而言,切口(nick)仅出现大约一次的条件下,用核酸酶处理人们感兴趣的编码序列的双链PCR片段;对双链DNA进行变性;对DNA进行复性,以形成双链DNA,所述双链DNA可能包括来自不同切口产物的同义/反义对;通过S1核酸酶处理,从重新形成的双链体中除去单链的部分;将得到的片段文库与表达载体连接起来。通过此种方法,可以得到编码多种不同大小的感兴趣蛋白的N-术端片段及内部片段的表达文库。
本领域中已知的多种技术都可用于针对具有选定属性的基因产物来筛选通过截短点突变来制造的组合文库的基因产物,以及筛选cDNA文库。典型地,使用最广泛的用于筛选大基因文库并适用于高通量分析的技术包括:将所述基因文库克隆到可复制表达载体中;用得到的载体文库去转化合适的细胞;在一定条件下表达所述的组合基因,在所述表达条件下,针对人们想要的活性进行的探测,有助于分离出编码其产物被探测到的基因的载体。递归总体诱变(recursive ensemble mutagenesis,REM)技术能增强功能突变体在文库中出现的频率,其可与筛选检验一起使用,以鉴定出本发明蛋白的变体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgrave et al.(1993)Protein Engineering6(3):327-331)。
根据本发明的多核苷酸的片段还可以包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可以用作探针或用作PCR反应的引物。
对本发明的核酸而言,不管其编码功能多肽或编码非功能多肽,都可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)的引物。不编码具有天冬酰胺酶活性的多肽的本发明的核酸分子的用途,包括:(1)如Verma et al.,Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,NewYork(1988)所述,对中期染色体扩展(spreads)进行的原位杂交(例如FISH),以提供对天冬酰胺酶编码基因的精确染色体定位;(2)Northern杂交印迹分析,用于检测天冬酰胺酶mRNA在特定组织和/或细胞中的表达;(3)可作为诊断工具使用的引物和探针,以分析能在给定的生物(例如组织)样品中与此类探针或引物杂交的核酸是否存在。
给定的亲本天冬酰胺酶的变体可通过下述标准流程获得:
-诱变(易错、掺杂寡核苷酸(doped oligo)、测试信号寡核苷酸(spiked oligo))
-初级筛选
-鉴定改进的变体(例如,相对于比活性而言)
-保持(例如,在甘油培养物、LB-Amp板、Mini-Prep中)
-在另一检验板上划线-二次筛选
-DNA测序
-在例如Aspergillus中转化
-培养,例如,以100ml的规模培养,纯化,DSC
在一种实施方式中,本发明涉及生产根据本发明的天冬酰胺酶多肽变体的方法,所述方法包括:
a)选择亲本天冬酰胺酶多肽;
b)取代对应于氨基酸41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371中任何位置的至少一个氨基酸残基,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义;
c)任选地,对b)中定义的一个或多个另外的氨基酸进行取代;
d)制备从步骤a)-c)产生的变体;
e)测定变体的pH最优值和/或在至少一个pH下的比活性;
以及
f)选择在至少一个pH下较之亲本天冬酰胺酶多肽具有增加的比活性和/或较之亲本天冬酰胺酶多肽具有增加的pH最优值的变体,由此产生天冬酰胺酶多肽变体。
在一种优选的实施方式中,生产根据本发明的天冬酰胺酶多肽变体的方法中,亲本天冬酰胺酶具有SEQ ID NO:3所示的序列。
更优选地,在根据本发明的方法的步骤b)中,对应于氨基酸41、53、63、64、66、73、74、76、77、88、90、91、101、106、111、119、122、123、132、140、145、161、170、195、211、218、228、232、233、262、267、293、295、297、299、300、301、303、304、310、314、317、321、324、330、332或333、371中任何位置的至少一个氨基酸残基被取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且,其中,所述亲本多肽与SEQ ID NO:3具有至少80%的同源性。
进一步更优选地,在根据本发明的方法的步骤b)中,被取代的氨基酸残基对应于第41位的Ile、第53位的Tyr、第63位的Gly或Val或Ser、第64位的Pro、第66位的Pro、第73位的Lys、第74位的Ala、第76位的Thr、第77位的Ile、第88位的Tyr或Pro、第90位的Val、第91位的Glu、第101位的Val、第106位的Pro、第111位的Gly、第119位的Asn、第122位的His、第123位的Ala、第132位的Ser、第140位的Asn、第145位的Ser、第161位的Leu、第170位的Thr、第195位的Asp、第211位的Ser、第218位的Val、第228位的His、第232位的Val、第233位的Val、第262位的Cys或His、第267位的Tyr、第293位的Ser或Val、第295位的Ser、第297位的Ser、第299位的Ser、第300位的Ile、第301位的Pro、第303位的Ser、第304位的Thr、第310位的Val、第314位的Asp、第317位的Ile、第321位的Thr、第324位的Gly、第330位的Ser、第332位的Ala、第333位的Glu或第371位的Met中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
在本发明的工艺的一种实施方式中,在步骤e)中,在4至8之间的pH下测定比活性。在步骤e)的另一实施方式中,在测定变体的pH最优值和/或至少一种pH下的比活性之前,可测量特定温度下变体在pH7下的天冬酰胺酶活性与pH5下的天冬酰胺酶活性的比例,所述比例高于亲本天冬酰胺酶多肽的变体可被选择出来。
在本发明的工艺的另一实施方式中,在步骤f)中,选择在至少一种pH下(优选在4至8之间的pH下)较之亲本多肽具有增加的比活性,和/或较之亲本多肽具有增加的pH最优值的变体。优选地,变体在至少一种pH下(优选在4至8之间的pH下)较之亲本多肽具有增加的比活性,并且,较之亲本多肽具有增加的pH最优值。在本发明的工艺的另一实施方式中,在步骤f)中,选择在至少一种pH下(优选在4至8之间的pH下)较之亲本多肽具有增加的比活性的变体。
在另一实施方式中,本发明涉及含有本发明包括的核酸的细胞,例如经转化的宿主细胞或重组宿主细胞。“经转化的细胞”或“重组细胞”是通过重组DNA技术,向其中(或其祖代中)引入了本发明的核酸的细胞。原核细胞和真核细胞都被包括在内,例如,细菌、真菌、酵母等,尤其优选的是来自丝状真菌的细胞,特别是Aspergillus niger。
可以对宿主细胞加以选择,选出能调节插入序列表达的宿主细胞或能以特异性的、令人期待的方式对基因产物进行修饰或加工的宿主细胞。对蛋白产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可以促进被编码的蛋白的最优机能。
多种宿主细胞都具有特征性的及特异性的机制,用于对蛋白及基因产物的翻译后加工和修饰。可以选择分子生物学和/或微生物学领域的技术人员熟悉的合适的细胞系或宿主系统,以确保对所表达的外源蛋白的修饰和加工是令人期望的及正确的。为达成此目标,可以使用具有胞内加工机制的真核宿主细胞,所述机制用于对初级转录本的正确加工、对基因产物的糖基化和磷酸化。此类宿主细胞是本领域中公知的。
宿主细胞还包括但不限于:哺乳动物细胞系,例如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。
如果需要的话,可通过经稳定转染的细胞系来生产本发明的变体。适于对哺乳动物细胞进行稳定转染的大量载体都是公众可获得的,构建此类细胞系的方法也为公众所已知,例如在(前述的)Ausubel et al.中。
本发明还公开了包含根据本发明的天冬酰胺酶的组合物。所述组合物任选可包含其它成分,例如,其它酶。根据本发明的天冬酰胺酶变体或包含所述天冬酰胺酶的组合物可用于生产食物产品。在本发明的一种实施方式中,根据本发明的天冬酰胺酶变体或包含所述天冬酰胺酶的组合物可用于降低基于含天冬酰胺的原材料的经热加工的食物产品中形成的丙烯酰胺的量。它们可例如用于下述生产食物产品的工艺中,所述工艺涉及至少一个加热步骤,包括在所述生产工艺中将一种或多种天冬酰胺酶加入所述食物产品的中间产物形式中,由此在所述加热步骤之前将酶以能有效降低所述食物产品的所述中间产物形式中存在的天冬酰胺酶的水平的量加入。此类工艺被公开于WO04/030468中,所述工艺及其所有优选级通过引用并入本文。WO04/026043中还描述了其中可使用根据本发明的天冬酰胺酶的合适工艺。WO04/026043中公开的方法及其所有优选级通过引用并入本文。
食物产品的中间产物形式在本文中被定义为生产工艺期间在获得食物产品的最终形式之前出现的任何形式。中间产物形式可包含使用的各原材料和/或其混合物和/或与添加剂和/或加工助剂的混合物或其经随后加工的形式。例如,对于食物产品面包来说,中间产物形式包含,例如,小麦、小麦面粉、其与其它面包成分(例如水、盐、酵母和面包改进组合物)的最初混合物、混合面团、经捏练的面团、经发酵的面团和经部分烘焙的面团。例如,对于若干种基于马铃薯的产品而言,脱水马铃薯片或颗粒是中间产物,对玉米脆片而言,玉米糊是中间产物。
食物产品可以从至少一种植物来源(例如马铃薯、烟草、咖啡、可可、水稻、谷物,例如小麦、裸麦、玉来、大麦、燕麦粒(groats)、荞麦和燕麦)的原材料制得。小麦在此处和下文中包括Triticum属的所有已知种,例如,aestivum、durum和/或spelta。从超过一种原材料或中间产物制得的食物产品也包括在本发明的范围内,例如包括小麦(面粉和/或淀粉)和马铃薯二者的食物产品。
根据本发明的工艺适用的食物产品的例子是任何基于面粉的产品,例如,面包、糕点、蛋糕、脆饼、百吉圈、荷兰蜂蜜蛋糕、曲奇、姜面包、姜饼和薄脆饼干,以及任何基于马铃薯的产品,例如,薯条、pommesfrites、薯片、炸丸子。
上文提到的原材料已知含有相当含量的天冬酰胺,其在生产工艺的加热步骤期间参与丙烯酰胺的形成。或者,天冬酰胺可来自并非所述原材料的其它来源,例如,来自蛋白水解产物,例如酵母提取物,大豆水解产物,酪蛋白水解产物等(在食物生产工艺中用作为添加剂)。一种优选的生产工艺是面包和来自小麦面粉和/或其它芥物来源的面粉的其它烘焙产品的烘焙。另一优选的生产工艺是从马铃薯切片油炸薯片。
优选的加热步骤是这样的,其中,中间产物食物产品的至少一部分,例如,食物产品的表面,暴露给促进丙烯酰胺形成的温度,例如,110℃或更高,120℃或更高的温度。根据本发明的工艺中的加热步骤可在烤箱中进行,例如,在180-220℃间的温度下进行,例如,用于烘焙面包和其它烘焙产品,或者在油中进行,例如炸薯片,例如在160-190℃下进行。
在另一个方面,本发明提供了可通过前文所述的本发明的工艺或通过使用前文所述的用于生产食物产品的新颖的天冬酰胺来获得的食物产品。这些食物产品特征在于较之可通过下述生产工艺获得的食物产品而言具有显著降低的丙烯酰胺水平,所述生产工艺不包括以能有效降低参与所述加热步骤期间丙烯酰胺形成的氨基酸水平的量加入一种或多种酶。根据本发明的工艺可用于使生产的食物产品的丙烯酰胺含量较之用传统工艺获得的食物产品而言减少优选超过50%,更优选超过20%,进一步更优选10%,最优选超过5%。
根据本发明的天冬酰胺酶变体的另一应用是用于动物和人的肿瘤治疗中。肿瘤细胞的代谢需要L-天冬酰胺,其可被天冬酰胺酶快速降解。根据本发明的天冬酰胺酶还可用作为佐剂用于治疗一些人白血病。在实验动物和人中施用天冬酰胺酶使得某些淋巴瘤和白血病消退。因此,在一种实施方式中,本发明涉及用作为药物的根据本发明的天冬酰胺酶或组合物,例如,用于动物和人的肿瘤治疗中,例如,用于对淋巴瘤或白血病的治疗中。
可在微生物中方便地生产根据本发明的天冬酰胺酶变体。在上述工艺中,有利地,使用通过重组DNA技术获得的天冬酰胺酶。此类重组酶具有大量优点,例如,以低成本、高产率生产,并且不含污染性试剂,例如细菌或病毒,并且还不含细菌毒素或污染性的其它酶活性。
下文中通过下述非限制性实施例来阐述本发明。
实施例
材料和方法
天冬酰胺酶检验,以测量pH=4至pH=9范围内的pH依赖性
使用L-天冬酰胺作为底物来测量天冬酰胺酶活性。根据Berthelot反应来测量通过酶作用释放的氨的量。从Sigma获得现成可用的试剂苯酚硝普(phenolnitroprusside)和碱性漂白粉(alkaline hypoclorite)。在50mM柠檬酸和50mM焦磷酸钠的具有想要的pH的缓冲液的混合物中,将100μl酶样品与2000μl100mM L-天冬酰胺混合起来。在37℃孵育30分钟之后,通过加入400μl25%三氯乙酸来终止反应,之后加入2500μl水。孵育期间,除非另有说明,温度固定为37℃。
本领域技术人员将理解,应按以下要求来选择酶的剂量:使得在上述条件下孵育之后获得显著高于背景的信号但获得的信号仍在与加入的酶的量成比例的范围内。优选地,反应是零级的(zero order)。
终止反应后,将4μl孵育混合物加入156μl水中。随后,加入34μl苯酚/硝普溶液(Sigma P6994)和34μl碱性漂白粉溶液(SigmaA1727)。37℃孵育676秒后,在600nm测量消光。通过包括进恰当的空白,针对背景信号来校正读数。用具有(TCA)失活的酶的样品作为空白。检验在自动分析仪,例如Konelab Arena30(Thermo Scientific)上进行。使用通过用600nm处测量的吸光度对标准系列的已知硫酸铵浓度作图制造的校正线,来测定活性。活性以单位表示,其中,一个单位被定义为在定义的检验条件下每分钟从L-天冬酰胺释放1微摩尔氨所需的酶的量。
天冬酰胺酶检验,以测量pH4至pH8范围内的pH依赖性
按照与上文所述用于测量pH=4至pH=9范围内的活性pH依赖性一样的方式来进行本方法,不同之于在于将100μl酶样品与2000μl100mM L-天冬酰胺在具有想要的pH的50mM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中混合。
天冬酰胺酶人工检验,以测量pH=5和pH=7时的活性
检验在例如微滴定板(MTP’s)或试管中进行。为鉴定具有迁移的pH-活性范围的天冬酰胺酶,在pH=5和pH=7时测量活性。将10μl酶样品与100mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)或100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的190μl100mM L-天冬酰胺混合。在室温下孵育1小时后,通过加入100μl12.5%三氯乙酸来终止反应。以室温下1小时孵育后能获得显著高于背景的信号的方式来选择酶剂量。终止反应后,将95μl水加入到8μl孵育混合物中。随后,加入70μl苯酚/硝普溶液(Sigma P6994)和70μl碱性漂白粉溶液(Sigma A1727)。室温下孵育60分钟后,在620nm测量消光。通过包括进恰当的空白(例如,失活的样品和/或来自空宿主菌株的发酵样品的上清液),针对背景信号来校正读数。空菌株表示没有经过转化以含有天冬酰胺酶基因的宿主菌株。使用通过用620nm处测量的吸光度对标准系列的已知硫酸铵浓度作图制造的校正线,来测定活性。活性以单位表示,其中,一个单位被定义为在定义的检验条件下每分钟从L-天冬酰胺释放1微摩尔氨所需的酶的量。
所有检验中,天冬酰胺酶样品的活性都以单位/ml表示。
实施例1 根据本发明的天冬酰胺酶的发酵、分离和纯化
通过构建含有编码本发明天冬酰胺酶的DNA序列的表达质粒,用该质粒转化Aspergillus niger菌株以及按照WO2004/030468所述培养Aspergillus niger菌株,来获得本发明的天冬酰胺酶。
培养含有正确表达质粒的Aspergillus niger之后,通过在4℃以5000xg对发酵液离心30分钟,来制备不含细胞的上清液。如果需要的话,再将上清液进一步分别滤过Miracloth过滤器(Calbiochem cat#475855)和GF/A Whatmann Glass微纤维过滤器以除去任何固体。为除去任何真菌材料,可用4N KOH将上清液调节至pH=5,并在抽吸(suction)下,经2μm(底-顶)过滤器过滤灭菌。将上清液贮藏于4℃,直到使用,或者如果需要的话,冷冻于-20℃。
在杂质超过60%w/w的情况下,通过阴离子离子交换色谱,从不含细胞的上清液开始对天冬酰胺酶加以纯化,或者经由PD-10柱(AmershamBiosciences)进行ccUF脱盐。将经脱盐的材料应用到在20mM组氨酸缓冲液(pH5.96)中平衡过的Mono-Q或Q-Sepharose柱上。充分洗涤之后,使用0至1MNaCl的梯度,从柱上洗脱天冬酰胺酶。
通过分析性尺寸排除色谱(HP-SEC:高效尺寸排除色谱,TSKgel3000SW-XL,柱300*7.8mm;MW范围10-300kDa,100mM磷酸盐缓冲液pH7和pH5.96),来检查含有天冬酰胺酶活性的上清液级分或经纯化的天冬酰胺酶级分的纯度(以mg蛋白/ml测定)。所有流速都是1ml/分钟(在Q-Sepharose上的样品注射除外,其为5ml/分钟)。对洗脱的蛋白的检测在280nm处进行。使用10240M-1.cm-1的摩尔消光常数(A2801cm,1mg/ml=0.28,其中,A2801cm,lmg/ml是使用1cm的光路长,在1mg/ml的纯蛋白浓度下,280nm处的消光),从280nm的消光(A280)来计算洗脱的Aspergillus niger天冬酰胺酶的浓度。对A280的测量在Uvikon XL Secomamf分光光度计(Beun de Ronde,Abcoude,TheNetherlands)中进行。对于对应于ASN15和ASN16的天冬酰胺酶而言,使用与Aspergillus niger野生型天冬酰胺酶相同的消光系数。在280nm处杂质吸收的情况下,通过将测得的天冬酰胺酶样品的A280与天冬酰胺酶峰下面积和280nm处吸收峰的总面积之比乘起来,基于HP-SEC色谱,来校正天冬酰胺酶浓度。当天冬酰胺酶的峰不能与其它峰清楚分开的情况下,用峰高度代替峰面积。
对于对应于ASN01至ASN14的天冬酰胺酶而言,使用Novex4-12%Bis-Tris12孔凝胶(Invitrogen,NP0322BOX),通过PAA-SDS凝胶电泳,来测定天冬酰胺酶含量(以mg蛋白/ml测定)。将1μl培养物上清液与1μl10x样品还原剂(Invitrogen,NP0004)、2.5μl4x NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen,NP0007)和5.5μl milliQ水在70℃下孵育10分钟。将得到的经还原的样品上样到凝胶上。用Plus2预染色的标准物(Invitrogen,LC5925)作为尺寸标记物。此外,0.5μg BSA(Sigma A9418)作为蛋白含量的校正剂也被上样。在MES SDS凝胶电泳缓冲液(Invitrogen,NP0002)(含有抗氧化剂(Invitrogen,NP0005))中以200V对凝胶进行35分钟的电泳。电泳后,在固定溶液(7%HAc(v/v)和10%乙醇(v/v))中对凝胶进行2x30分钟的固定,用SYPRO Ruby蛋白凝胶染料(Invitrogen S12000)染色过夜,在固定溶液中去染色2x30分钟。随后,用去矿物质水洗凝胶,并用Typhoon9200扫描仪(GE Healthcare)扫描。使用Image QuantTLv2003.02软件计算峰体积,基于BSA蛋白条带计算蛋白浓度。
实施例2 根据本发明的天冬酰胺酶的性能
针对具有改变的pH活性范围的突变体,来筛选A.niger天冬酰胺酶突变体(其中,亲本多肽是根据SEQ ID NO:3的多肽)的随机文库。为找到在更碱性的pH下具有改进的活性的突变体,在pH=5和pH=7时测定天冬酰胺酶突变体的活性。随后,测定pH=7时的活性和pH=5时的活性之间的比例。该比例示于表1中。较高的比例表示pH-活性范围朝向pH=7迁移。
表1:第三列:对于所选定的突变体而言,pH=7时的活性和pH=5时的活性之间的比例。野生型(WT)是A.niger天冬酰胺酶(WO2004/030468)。
第四列:突变体仍展示出其最大催化活性的50%时的pH所代表的pH活性范围的碱性分支的pH迁移。pH活性范围是在37℃时用不含细胞的上清液来测定的。使用磷酸盐/柠檬酸缓冲系统,在pH=4至pH=8的范围内测量活性。
对具有比野生型A.niger天冬酰胺酶高的比例的突变体进行进一步测试,以确定pH-活性范围向碱性pH迁移的程度。对于这些突变体而言,测量完整的pH-活性范围,其显示,特别地,pH-活性范围的碱性分支迁移至更高的pH。pH-活性范围的碱性分支中显示出突变体在其pH最优值时的最大活性的50%时的pH被采用为pH活性范围的碱性分支较之野生型的迁移(表1)。迁移至更高的pH表示在更碱性的条件下有更高的活性。此类突变体对于需要更碱性的条件的应用来说特别有好处。
当针对pH=7时的活性和pH=5时的活性之间的比例较低的突变体进行选择时,观察到pH-活性范围的碱性分支迁移至较低的pH(表2)。
表2:对于所选定的突变体而言,pH=7时的活性和pH=5时的活性之间的比例。野生型(WT)是A.niger天冬酰胺酶(WO2004/030468)。pH活性范围是在37℃时用不含细胞的上清液来测定的。使用磷酸盐/柠檬酸缓冲系统,在pH=4至pH=8的范围内测量活性。
pH-活性依赖性和pH最优值
在50mM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中,针对pH=4至pH=8的pH范围,使用不含细胞的上清液,来测定天冬酰胺酶活性的pH依赖性。针对突变体观察到最高活性时的pH被称为所述所述变体的pH最优值。在表3和4中,针对突变体观察到的最大活性被设定为100%,所述突变体在其它pH值下的活性作为针对所述突变体观察到的最大活性的百分比来显示。表3中,pH活性范围是使用磷酸盐/柠檬酸缓冲系统针对pH=4至pH=8的pH范围测定的。在表4中,pH活性范围是使用焦磷酸盐/柠檬酸缓冲系统针对pH=4至pH=9的pH范围测定的。
表3:较之野生型(wt)A.niger天冬酰胺酶(WO2004/030468)而言,突变体的天冬酰胺酶活性的pH依赖性。针对每种天冬酰胺酶观察到的最高活性被设定为100%。活性是在磷酸盐/柠檬酸缓冲系统中于37℃使用不含细胞的上清液测定的。
表4:较之野生型(wt)A.niger天冬酰胺酶(WO2004/030468)而言,突变体的天冬酰胺酶活性的pH依赖性。针对每种天冬酰胺酶观察到的最高活性被设定为100%。活性是使用焦磷酸盐/柠檬酸缓冲系统于37℃使用不含细胞的上清液测定的。
除了pH-活性范围的碱性分支的迁移之外,pH最优值也朝向更高的pH迁移。含有突变D63G的两个突变体显示pH最优值迁移到pH=7。D63G突变体含有另外的突变。但是,这些另外的突变在每种D63G突变体中有所不同,而pH-活性范围却近乎相同。因此,D63G看起来导致了观察到的pH-活性范围的迁移。突变体D140N、含有A170T的突变体和含有突变S66P的突变体的pH最优值迁移至pH=6。
剩下的突变体较之野生型而言在pH=5展示出更清楚的pH最优值。表3和4清楚地显示了pH-活性范围的碱性分支朝向更高的pH的迁移,这导致更宽的pH-活性范围,并且特别增加了pH=6至pH=8的范围内的相对活性,同时,在pH=4至pH=6的酸性范围内也保持了相当的活性。
作为pH函数的比活性
在37℃下,50mM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中,使用不含细胞的上清液,于pH=4、pH=5、pH=6、pH=7、pH=8时测定天冬酰胺酶变体的比活性。
表5:在指出的pH值下,使用天冬酰胺作为底物,变体相对于野生型(wt)A.niger天冬酰胺酶(WO2004/030468)的比活性(通过将样品的活性(以单位/ml表示)除以样品中存在的mg/ml大冬酰胺酶来测量的)。对于每个pH而言,野生型比活性被设定为100%,突变体的活性相对于野生型大冬酰胺酶来计算。当突变体的活性低于100%时,活性在表中略去。活性在37℃测定。通过进行“材料和方法”中描述的PAA-SDS凝胶电泳实验和凝胶扫描来测定不含细胞的上清液中天冬酰胺酶蛋白的含量。对于T73K+S74A+A293S和T73K+S74A+A293S+E106P+G297S+T299S+Q319A+M321T+V324G而言,大冬酰胺酶蛋白含量源于A280测量,其中应用了基于HP-SEC色谱针对任何杂质进行的校正。
表5显示,突变体的比活性在pH=6、pH=7和pH=8时较之野生型大冬酰胺酶大有提高。特别地,突变体T73K+S74A+A293S、T41I+S66P+V371M、S88P+I161L+R262C和F53Y+K119N特别有用,因为它们在pH=4至pH=8的整个pH范围上都显示更高的活性。突变体T73K+S74A+A293S+E106P+G297S+T299S+Q319A+M321T+V324G在酸性pH区域pH=4至pH=6更有活性。
温度最优值
为验证活性对温度的依赖性,在不同温度下进行测量。在一种检验中,10分钟后终止反应,在第二检验中,30分钟后终止反应。30分钟检验中的酶剂量是10分钟检验中剂量的1/3。如果酶在所应用的条件下稳定的话,观察到的活性应当相似。发生失活的情况下,预计在较长的检验时间后活性会有所减少。结果示于表6中。
表6:活性的温度依赖性。检验在pH=5时于50mM磷酸盐/柠檬酸缓冲液中进行。30分钟检验中的酶剂量是10分钟检验中剂量的1/3。10分钟孵育时间时的最高活性被发定为100%。
表6显示,变体的稳定性与野生型Aspergillus niger天冬酰胺酶非常相似。甚至在70℃,30分钟孵育后的活性相对于10分钟的情况都没有降低,这表明突变体至少能在70℃稳定30分钟。我们出人意料地观察到,突变体的温度最优值迁移到较高的温度。对于野生型而言,温度最优值为50℃(考虑到测试的温度)。对于突变体S16A+D63G+G132S、D63G+D111G+R122H和T41I+S66P+V371M而言,其迁移到70℃。此类性质在需要天冬酰胺酶在升高的温度下工作的应用中特别有用。
Claims (26)
1.具有天冬酰胺酶活性的亲本多肽的变体,其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于氨基酸41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371中任何的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,其中,所述亲本多肽与SEQ IDNO:3具有至少80%的同源性。
2.权利要求1的变体,其中所述亲本多肽具有SEQ ID NO:3所示的序列。
3.权利要求1或2的变体,其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于氨基酸41、53、63、64、66、73、74、76、77、88、90、91、101、106、111、119、122、123、132、140、145、161、170、195、211、218、228、232、233、262、267、293、295、297、299、300、301、303、304、310、314、317、321、324、330、332、333或371中任何的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
4.权利要求1-3中任意一项所述的变体,其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含第41位的Ile、第53位的Tyr、第63位的Gly或Val或Ser、第64位的Pro、第66位的Pro、第73位的Lys、第74位的Ala、第76位的Thr、第77位的Ile、第88位的Tyr或Pro、第90位的Val、第91位的Glu、第101位的Val、第106位的Pro、第111位的Gly、第119位的Asn、第122位的His、第123位的Ala、第132位的Ser、第140位的Asn、第145位的Ser、第161位的Leu、第170位的Thr、第195位的Asp、第211位的Ser、第218位的Val、第228位的His、第232位的Val、第233位的Val、第262位的Cys或His、第267位的Tyr、第293位的Ser或Val、第295位的Ser、第297位的Ser、第299位的Ser、第300位的Ile、第301位的Pro、第303位的Ser、第304位的Thr、第310位的Val、第314位的Asp、第317位的Ile、第321位的Thr、第324位的Gly、第330位的Ser、第332位的Ala、第333位的Glu或第371位的Met中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
5.权利要求1-4中任意一项所述的变体,其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含对应于氨基酸53、63、64、66、73、74、76、77、88、101、140、170、293中任何的氨基酸残基的至少一种取代,所述位置参照SEQ IDNO:3来定义。
6.权利要求1-5中任意一项所述的变体,其中,所述变体具有下述氨基酸序列,在与SEQ ID NO:3所示的序列进行比对时,所述氨基酸序列包含第53位的Tyr、第63位的Gly或Val、第64位的Pro、第66位的Pro、第73位的Lys、第74位的Ala、第76位的Thr、第77位的Ile、第88位的Tyr或Pro、第101位的Val、第140位的Asn、第170位的Thr、第293位的Ser或Val中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
7.权利要求1-6中任意一项所述的变体,其与所述亲本天冬酰胺酶多肽具有至少80%的同源性。
8.权利要求1-7中任意一项所述的变体,在相同pH下测量时,其具有比所述亲本多肽更高的比活性。
9.权利要求1-8中任意一项所述的变体,其中,所述变体具有比所述亲本多肽更高的pH最优值。
10.权利要求1-9中任意一项所述的变体,其还包含对并非权利要求1所定义的那些氨基酸残基的一个或多个取代。
11.权利要求10的变体,其包含1至5个另外的取代,所述另外的取代并非权利要求1所定义的那些。
12.核酸序列,其编码权利要求1-11中任意一项所述的变体。
13.核酸构建体,其包含权利要求12所述的核酸序列,所述核酸序列与能指导天冬酰胺酶在合适的表达宿主中表达的一种或多种控制序列可操作地连接。
14.重组表达载体,其包含权利要求13所述的核酸构建体。
15.重组宿主细胞,其包含权利要求14所述的表达载体。
16.生产天冬酰胺酶的方法,所述方法包括在有益于生产所述天冬酰胺酶的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞,以及回收所述天冬酰胺酶。
17.生产天冬酰胺酶多肽变体的方法,所述方法包括:
a)选择亲本天冬酰胺酶多肽;
b)取代对应于41、53、62、63、64、66、70、71、73、74、76、77、88、90、91、101、102、103、104、106、107、108、109、111、119、122、123、132、140、142、143、145、161、162、163、164、168、169、170、195、211、213、214、215、216、217、218、219、220、228、232、233、234、235、262、267、268、269、270、271、272、273、293、295、297、298、299、300、301、302、303、304、310、314、317、318、319、321、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、334、335或371中任何位置的至少一个氨基酸残基,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且其中,所述亲本多肽与SEQ ID NO:3具有至少80%的同源性;
c)任选地,对b)中定义的一个或多个另外的氨基酸进行取代;
d)制备从步骤a)-c)产生的变体;
e)测定所述变体的pH最优值和/或在至少一个pH下的比活性;
以及
f)选择较之所述亲本天冬酰胺酶多肽而言在至少一个pH下具有增加的比活性和/或较之所述亲本天冬酰胺酶多肽而言具有增加的pH最优值的变体,由此产生天冬酰胺酶多肽变体。
18.权利要求17的方法,其中,所述亲本天冬酰胺酶多肽具有SEQ IDNO:3所示的序列。
19.权利要求17或18中任意一项所述的方法,其中,在步骤b)中,对应于41、53、63、64、66、73、74、76、77、88、90、91、101、106、111、119、122、123、132、140、145、161、170、195、211、218、228、232、233、262、267、293、295、297、299、300、301、303、304、310、314、317、321、324、330、332、333或371中任何位置的至少一个氨基酸残基被取代,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义,并且其中,所述亲本多肽与SEQ ID NO:3具有至少80%的同源性。
20.权利要求19的方法,其中,在步骤b)中,被取代的氨基酸残基对应于第41位的Ile、第53位的Tyr、第63位的Gly或Val或Ser、第64位的Pro、第66位的Pro、第73位的Lys、第74位的Ala、第76位的Thr、第77位的Ile、第88位的Tyr或Pro、第90位的Val、第91位的Glu、第101位的Val、第106位的Pro、第111位的Gly、第119位的Asn、第122位的His、第123位的Ala、第132位的Ser、第140位的Asn、第145位的Ser、第161位的Leu、第170位的Thr、第195位的Asp、第211位的Ser、第218位的Val、第228位的His、第232位的Val、第233位的Val、第262位的Cys或His、第267位的Tyr、第293位的Ser或Val、第295位的Ser、第297位的Ser、第299位的Ser、第300位的Ile、第301位的Pro、第303位的Ser、第304位的Thr、第310位的Val、第314位的Asp、第317位的Ile、第321位的Thr、第324位的Gly、第330位的Ser、第332位的Ala、第333位的Glu或第371位的Met中的一个或多个,所述位置参照SEQ ID NO:3来定义。
21.组合物,其包含根据权利要求1至11中任意一项所述的变体或能根据权利要求16至20中任意一项所述的方法获得的变体。
22.权利要求1至11中任意一项所述的天冬酰胺酶或权利要求21的组合物在生产食物产品中的用途。
23.根据权利要求1至11中任意一项所述的天冬酰胺酶或权利要求21的组合物用于降低基于含有天冬酰胺的原材料的经热加工食物产品中形成的丙烯酰胺的量的用途。
24.生产食物产品的工艺,其中涉及至少一个加热步骤,所述工艺包括在所述生产工艺中,向所述食物产品的中间产物形式中加入根据权利要求1至11中任意一项所述的天冬酰胺酶或权利要求21的组合物,由此,在所述加热步骤之前,以能有效降低所述食物产品的所述中间产物形式中存在的天冬酰胺酶的水平的量加入酶。
25.可通过权利要求24的工艺或通过权利要求22或23的用途获得的食物产品。
26.用作为治疗肿瘤的药物的、根据权利要求1至11中任意一项所述的天冬酰胺酶或权利要求21的组合物。
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