BRPI0810480B1 - Variantes da enzima asparaginase, sequência de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, método de produção de asparaginase e método de produção de variante - Google Patents

Abstract

VARIANTES DA ENZIMA ASPARAGINASE E USOS DAS MESMAS A presente invenção relaciona-se a variantes de polipeptídeos de asparaginase recém identificadas de Id. de Seq. N° : 3 e as seqüências de polinucleotídeos que codificam novas variantes de asparaginase. Além disso, a invenção relaciona-se ao uso dessas novas variantes de asparaginase em processos industriais.

Description

Campo da invenção

A invenção relaciona-se a variantes de polipeptídeo de asparaginase e a seqüências de polinucleotídeos que compreendem genes que codificam essas variantes de asparaginase. A invenção apresenta um método para identificação de variantes de asparaginase adequadas. A invenção também se relaciona a métodos de uso dessas proteínas variantes em processos industriais. Também são incluídas na invenção células transformadas com um polinucleotídeo de acordo com a invenção adequado para a produção dessas proteínas e células, em que a proteína de acordo com a invenção é geneticamente modificada para melhorar ou reduzir sua atividade e/ou nível de expressão. A invenção também se relaciona a métodos de uso das variantes de asparaginase em processos industriais.

Fundamento da invenção

Recentemente, a ocorrência de acrilamida em inúmeros produtos alimentares aquecidos foi publicada (Tareke e cols. Chem. Res. Toxicol. 13, 517-522 (2000)). Uma vez que a acrilamida é considerada como provavelmente carcinogênica para animais e humanos, esse achado resultou em preocupação pelo mundo afora. Pesquisa adicional revelou que quantidades consideráveis de acrilamida são detectáveis em vários alimentos comuns preparados assados, fritos e cozidos, e foi demonstrado que a ocorrência de acrilamida nos alimentos foi o resultado do processo de aquecimento.

Uma via para a formação de acrilamida a partir de aminoácidos e açúcares de redução como um resultado da reação de Maillard foi proposta por Mottram e cols. Nature 419:448 (2002). De acordo com essa hipótese, acrilamida pode ser formada durante a reação de Maillard. Durante o processo de assar e tostar, a reação de Maillard é principalmente responsável pela cor, aroma e sabor. Uma reação associada à de Maillard é a degradação de Strecker de aminoácidos, e uma via para acrilamida foi proposta. A formação de acrilamida tornou-se detectável quando a temperatura excedeu 120°C, e a mais alta taxa de formação foi observada por volta de 170°C. Quando asparagina e glicose estavam presentes, os mais altos níveis de acrilamida puderam ser observados, enquanto glutamina e ácido aspártico resultaram apenas em quantidades de traço.

O limite oficial de migração na Comunidade Européia para acrilamida que migra em alimentos a partir de plásticos que fazem contato com o alimento é determinado a 10 ppb (10 microgramas por quilograma). Embora nenhum limite oficial seja já determinado para acrilamida que se forma durante o cozimento, o fato de que muitos produtos excedem esse valor, especialmente cereais, produtos de panificação e produtos com base em batata ou milho, causa preocupação.

Várias matérias primas derivadas de plantas são conhecidos por conter níveis substanciais de asparagina. Em batatas, a asparagina é o aminoácido livre dominante (940 mg/kg, que corresponde a 40% do conteúdo total de aminoácidos), e em farinha de trigo asparagina está presente em um nível de cerca de 167 mg/kg, que corresponde a 14% dos aminoácidos livres totais (Belitz and Grosch in Food Chemistry - Springer New York, 1999). O fato de que a acrilamida é formada principalmente de asparagina (combinada com açúcares de redução) pode explicar os altos níveis de acrilamida em produtos de plantas fritos, assados em forno ou torrados. Portanto, no interesse de saúde pública, há uma necessidade urgente por produtos alimentícios que tenham níveis substancialmente menores de acrilamida ou, preferivelmente, sejam desprovidos dela.

Várias soluções para diminuir o conteúdo de acrilamida têm sido propostas, seja por alteração de variáveis do processamento, por exemplo, temperatura ou duração da etapa de aquecimento, ou por prevenção por meio químico ou enzimático da formação de acrilamida ou por remoção da acrilamida formada.

Em vários pedidos de patente, o uso de asparaginase para diminuir o nível de asparagina e assim a quantidade de acrilamida formada foi revelado. Asparaginases adequadas para esse objetivo foram produzidas a partir de várias fontes fúngicas, como, por exemplo, Aspergillus niger em WO2004/030468 e Aspergillus oryzae em WO04/032648.

Embora todas as L-asparaginases catalisem a mesma conversão química, isso não significa que elas sejam adequadas para a mesma aplicação. Várias aplicações apontarão diferentes demandas sobre as condições sob as quais as enzimas devem operar. Parâmetros físicos e químicos que podem influenciar a taxa de uma conversão enzimática são a temperatura (que tem um efeito positivo sobre as taxas de reação química, mas pode ter um efeito negativo sobre a estabilidade da enzima), o conteúdo de umidade, o pH, a concentração de sal, a integridade estrutural da matriz do alimento, a presença de ativadores ou inibidores da enzima, a concentração do substrato e produtos etc.

Portanto, existe uma necessidade contínua por melhores asparaginases para várias aplicações que tenham melhores propriedades.

Objetivo da invenção

É um objetivo da invenção o fornecimento de novos polipeptídeos e polinucleotídeos de variantes de asparaginase que codificam tais variantes. Um objetivo adicional é o de fornecer cepas recombinantes que produzem tais variantes de asparaginase. Além disso, um método para identificação de variantes é parte da invenção, bem como métodos de confecção e uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com a invenção.

Sumário da invenção

A invenção fornece uma variante de polipeptídeo de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dos aminoácidos: 41, 53, 62, 63, 64, 66, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 88, 90, 91, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 142, 143, 145, 161, 162, 163, 164, 168, 169, 170, 195, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 228, 232, 233, 234, 235, 262, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 293, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 310, 314, 317, 318, 319, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 ou 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3.

A invenção também fornece: - uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica tal variante; - um constructo de ácidos nucleicos que compreende uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma variante da invenção operacionalmente ligada a uma ou mais seqüências de controle capazes de direcionar a expressão de uma asparaginase em um hospedeiro de expressão adequado; - um vetor de expressão recombinante que compreende um constructo de ácidos nucleicos; - uma célula hospedeira recombinante que compreende tal vetor de expressão; - um método para a produção de uma asparaginase que compreende o cultivo de tal célula hospedeira sob condições que conduzem à produção da asparaginase e recuperação da asparaginase; - um método de produção de uma variante de polipeptídeo de asparaginase, cujo método compreende: a) a seleção de um polipeptídeo de asparaginase parente; b) substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um de: 41, 53, 62, 63, 64, 66, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 88, 90, 91, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 142, 143, 145, 161, 162, 163, 164, 168, 169, 170, 195, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 228, 232, 233, 234, 235, 262, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 293, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 310, 314, 317, 318, 319, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 ou 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3. c) opcionalmente substituição de um ou mais aminoácidos adicionais como definido em b); d) preparação da variante que resulta das etapas a)- c); e) determinação da atividade específica e/ou o pH ótimo da variante; e f) seleção de uma variante que tem uma atividade específica aumentada e/ou pH ótimo em comparação ao polipeptídeo de asparaginase parente, assim produzindo uma variante de polipeptídeo de asparaginase. - uma composição que compreende uma variante da invenção ou uma variante obtida por um método da invenção; - uso de uma composição da invenção na produção de um produto alimentício; e - uso de uma composição da invenção para reduzir a quantidade de acrilamida formada em um produto alimentício termicamente processado com base em uma matéria prima que contém asparagina.

Descrição detalhada da invenção

Por toda a presente especificação e nas reivindicações que a acompanham, as palavras “compreende” e “inclui” e variações como “compreendem”, “que compreende”, “incluem” e “que incluem” devem ser interpretadas de modo inclusivo. Ou seja, essas palavras devem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, quando o contexto permitir.

A presente invenção relaciona-se a uma variante de polipeptídeo de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase. A variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dos aminoácidos: 41, 53, 62 , 63 , 64, 66, 70, 71, 73 , 74, 76, 77, 88, 90 , 91, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 142, 143, 145, 161, 162, 163, 164, 168, 169, 170, 195, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 228, 232, 233, 234, 235, 262, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 293, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 310, 314, 317, 318, 319, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 ou 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3.

Ou seja, quando a seqüência de asparaginase variante é alinhada com a seqüência da asparaginase de Id. de Seq. N°: 3, a variante compreenderá pelo menos uma substituição em uma posição (na variante) que corresponde a uma das posições apresentadas acima em Id. de Seq. N° : 3. Uma “substituição” nesse contexto indica que uma posição na variante que corresponde a uma das posições apresentadas acima em Id. de Seq. N°: 3 compreende um resíduo de aminoácido que não aparece naquela posição no polipeptídeo parente (cujo polipeptídeo parente pode ser Id. de Seq. N°: 3).

Aquelas posições em um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção que correspondem às posições apresentadas acima em Id. de Seq. N°: 3 podem ser identificadas por alinhamento da seqüência do polipeptídeo de variante com aquela de Id. de Seq. N°: 3 com o uso, por exemplo, do alinhamento GAP para a seqüência mais homóloga encontrada pelo programa GAP (veja abaixo para detalhes desse programa). As posições na variante que correspondem às posições em Id. de Seq. N°: 3 como mostrado acima podem assim ser identificadas e são referidas como aquelas posições definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3.

O polipeptídeo de asparaginase parente que pode ser usado na presente invenção pode ser qualquer asparaginase (EC 3.5.1.1). Um polipeptídeo de asparaginase adequado pode ser obtido a partir de várias fontes, como, por exemplo, a partir de uma planta, um animal ou um microorganismo. Por exemplo, uma asparaginase pode ser obtida a partir das espécies Escherichia, Erwinia, Streptomyces, Pseudomonas, Aspergillus e Bacillus. Um exemplo de uma cepa adequada de Escherichia é Escherichia coli. Um exemplo de uma cepa adequada de Erwinia é Erwinia chrysanthemi. Exemplos de cepas adequadas de Streptomyces são Streptomyces lividans e Streptomyces murinus. Exemplos de cepas adequadas de Aspergillus são Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans ou Aspergillus niger. Exemplos de cepas adequadas de Bacillus são Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thurigiensis.

Um exemplo de métodos adequados para obtenção de asparaginase a partir de cepas de Bacillus, Streptomyces, Escherichia ou Pseudomonas é descrito em WO 03/083043. Um exemplo de métodos adequados para obtenção de asparaginase a partir de Aspergillus é descrito em WO 2004/030468 e WO 04/032468.

Um polipeptídeo de asparaginase parente preferido adequado para uso na invenção é o polipeptídeo que tem a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com Id. de Seq. N°: 3, por exemplo, pelo menos 85% de identidade com Id. de Seq. N°: 3, como pelo menos 85% de identidade com Id. de Seq. N°: 3, como pelo menos 90% de identidade com Id. de Seq. N°: 3, por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com Id. de Seq. N°: 3.

Os resíduos de aminoácido em uma variante da invenção que são substituídos com comparação com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3 são aqueles que correspondem às posições: 41, 53, 62 , 63 , 64, 66, 70, 71, 73 , 74, 76, 77, 88, 90 , 91, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 142, 143, 145, 161, 162, 163, 164, 168, 169, 170, 195, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 228, 232, 233, 234, 235, 262, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 293, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 310, 314, 317, 318, 319, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 ou 371 como definido em relação à seqüência de Id. de Seq. N°: 3.

Uma variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das referidas posições, por exemplo, em duas, três, quatro, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70 ou em todas as referidas posições.

Um subconjunto preferido de posições para substituição é definido por aquela nas posições: 41, 53, 62, 63 , 64, 66, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 88, 90 , 91, 101, 102, 103, 104, 106 , 107, 108, 109, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 142, 143, 145 , 161, 162, 163, 164, 168, 169, 170, 195, 211, 214, 215, 216 , 218, 220, 228, 232, 233, 262, 267, 293, 295, 297, 298, 299 , 300, 301, 303, 304, 310, 314, 317, 319, 321, 324, 330, 332 , 333, 334 ou 371 . como definido em relação à seqüência de Id. de Seq. N°: 3.

Uma variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das referidas posições, por exemplo, em duas, três, quatro, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45 ou em todas as referidas posições.

Um subconjunto mais preferido de posições para substituição é definido por aquela nas posições: 41, 53, 63, 64, 66, 73, 74, 76, 77, 88, 90, 91, 101, 106, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 145, 161, 170, 195, 211, 218, 228, 232, 233, 262, 267, 293, 295, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 310, 314, 317, 321, 324, 330, 332, 333 ou 371, como definido em relação à seqüência de Id. de Seq. N°: 3.

Um subconjunto ainda mais preferido de posições para substituição é definido por aquela nas posições: 53, 63, 64, 66, 73, 74, 76, 77, 88, 101, 140, 170, 293, como definido em relação à seqüência de Id. de Seq. N° : 3.

Uma variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das referidas posições, por exemplo, em duas, três, quatro, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou em todas as referidas posições.

Uma variante da invenção compreende uma ou mais substituições como acima definido. Uma “substituição” nesse contexto indica que uma posição na variante que corresponde a uma das posições apresentadas acima em Id. de Seq. N°: 3 compreende um resíduo de aminoácido que não aparece naquela posição no polipeptídeo parente (o parente pode ser Id. de Seq. N°: 3). Substituições preferidas são apresentadas na tabela a seguir (com as posições sendo definidas em relação à seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3).

Uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende um ou mais de: Ile na posição 41, Tyr na posição 53, Gly ou Val ou Ser na posição 63, Pro na posição 64, Pro na posição 66, Lys na posição 73, Ala na posição 74, Thr na posição 76, Ile na posição 77, Tyr ou Pro na posição 88, Val na posição 90, Glu na posição 91, Val na posição 101, Pro na posição 106, Gly na posição 111, Asn na posição 119, His na posição 122, Ala na posição 123, Ser na posição 132, Asn na posição 140, Ser na posição 145, Leu na posição 161, Thr na posição 170, Asp na posição 195, Ser na posição 211, Val na posição 218, His na posição 228, Val na posição 232, Val na posição 233, Cys ou His na posição 262, Tyr na posição 267, Ser ou Val na posição 293, Ser na posição 295, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ile na posição 300, Pro na posição 301, Ser na posição 303, Thr na posição 304, Val na posição 310, Asp na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Ser na posição 330, Ala na posição 332, Glu na posição 333, ou Met na posição 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3.

Em uma modalidade preferida, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende um ou mais de: Tyr na posição 53, Gly ou Val na posição 63, Pro na posição 64, Pro na posição 66, Lys na posição 73, Ala na posição 74, Thr na posição 76, Ile na posição 77, Tyr ou Pro na posição 88, Val na posição 101, Asn na posição 140, Thr na posição 170, Ser ou Val na posição 293, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3.

Em uma modalidade preferida, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 63, preferivelmente que compreende a Gly ou Val na posição 63, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 63, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições D63G e G132S (temporariamente chamado ASN01), o polipeptídeo que compreende as substituições D63G, D111G e R122H (temporariamente chamado ASN02), e o polipeptídeo que compreende as substituições D63V e T300I (temporariamente chamado ASN03).

Em outra modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 64, preferivelmente que compreende uma Pro na posição 64, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 64, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições S64P e I310V (temporariamente chamado ASN04).

Ainda em outra modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 66, preferivelmente que compreende a Pro na posição 66, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 66, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições T41I, S66P e V371M (temporariamente chamado ASN05).

Ainda em outra modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 73, 74, 293, preferivelmente que compreende um ou mais de Lys na posição 73, Ala na posição 74, Ser ou Val na posição 293 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 73, 74 ou 293, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições G195D e A293V (temporariamente chamado ASN14), o polipeptídeo que compreende as substituições T73K, S74A e A293S (temporariamente chamado ASN15), ou o polipeptídeo que compreende as substituições T73K, S74A, E106P, A293S, G297S, T299S, Q319A, M321T e V324G (temporariamente chamado ASN16).

Em uma modalidade adicional, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 76 ou 101, preferivelmente que compreende um ou mais de Thr na posição 76, ou Val na posição 101, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 76 ou 101, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N° : 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições A76T e A101V (temporariamente chamado ASN06).

Ainda em outra modalidade adicional, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 77, preferivelmente que compreende Ile na posição 77 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 77, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições V77I, V123A e E314D (temporariamente chamado ASN07).

Em uma modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 88, preferivelmente que compreende Tyr ou Pro na posição 88 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 88, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende a substituição S88Y (temporariamente chamado ASN08) ou o polipeptídeo que compreende as substituições S88P, I161L e R262C (temporariamente chamado ASN09).

Em outra modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 140, preferivelmente que compreende a Asn na posição 140 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 140, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende a substituição D140N (temporariamente chamado ASN10).

Em uma modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 170, preferivelmente que compreende Thr na posição 170 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 170, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições D91E, A170T e R262H (temporariamente chamado ASN11).

Em mais uma modalidade, uma variante de acordo com a invenção pode ter uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 53, preferivelmente que compreende Tyr na posição 53 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, e em que o polipeptídeo parente da referida variante corresponde preferivelmente a Id. de Seq. N°: 3.

Exemplos de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 53, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3., e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, são o polipeptídeo que compreende as substituições F53Y e K119N (temporariamente chamado ASN13).

Um exemplo adicional de uma variante de um polipeptídeo parente que tem atividade de asparaginase, em que a variante tem uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3, compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dos aminoácidos: 41, 53, 63, 64, 66, 73, 74, 76, 77, 88, 90, 91, 101, 106, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 145, 161, 170, 195, 211, 218, 228, 232, 233, 262, 267, 293, 295, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 310, 314, 317, 321, 324, 330, 332, 333 ou 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3. e em que o polipeptídeo parente corresponde a Id. de Seq. N°: 3, é o polipeptídeo que compreende as substituições L90V, K119N, Y228H e R262C (temporariamente chamado ASN12).

Uma variante da invenção também pode compreender modificações adicionais em comparação ao parente nas posições diferentes daquelas acima especificadas, por exemplo, uma ou mais substituições adicionais, adições ou deleções. Uma variante da invenção pode compreender uma combinação de diferentes tipos de modificações desse tipo. Uma variante pode compreender uma, duas, três, quatro, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30 ou mais de tais modificações (que podem ser todas do mesmo tipo ou podem ser de tipos diferentes de modificação). Tipicamente, as modificações adicionais podem ser substituições.

Uma variante de acordo com a invenção pode ter pelo menos 80% de identidade com o polipeptídeo de asparaginase parente, por exemplo, pelo menos 85% de identidade com o polipeptídeo parente, como 90% de identidade com o polipeptídeo parente, pelo menos 95% de identidade com o polipeptídeo parente, pelo menos 98% de identidade com o polipeptídeo parente, ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo parente.

Uma variante da invenção reterá tipicamente a atividade de asparaginase (EC 3.5.1.1). Ou seja, uma variante da invenção será tipicamente capaz de catalisar a hidrólise de asparagina a ácido aspártico. Uma variante da invenção é, portanto, uma que seja tipicamente capaz de modificar as cadeias laterais de asparaginase que estão envolvidas na formação de acrilamida durante a produção de um produto alimentício que envolve pelo menos uma etapa de aquecimento.

Preferivelmente, uma variante da invenção exibirá tipicamente melhores propriedades em comparação com o polipeptídeo de asparaginase parente do qual ela é derivada. Tal melhor propriedade será tipicamente uma que seja relevante se a variante for usada como apresentado abaixo, por exemplo, em um método para a preparação de um alimento.

Tais propriedades incluem, sem limitação, atividade específica aumentada (de modo que seja possível usar uma menor quantidade da variante em um método para a preparação de um alimento quando comparada à quantidade de asparaginase parente necessária), um pH ótimo aumentado ou diminuído, mais particularmente um pH ótimo mais adequado para uso em um método para a preparação de um alimento (quando comparado à asparaginase parente) e termo- estabilidade aumentada.

Em uma modalidade, uma proteína da variante de acordo com a invenção pode ter um pH ótimo que é maior que aquele do polipeptídeo parente ou menor que o do polipeptídeo parente. Preferivelmente, o pH ótimo da proteína da variante é maior que aquele do polipeptídeo parente. Preferivelmente, o polipeptídeo parente é aquele de acordo com Id. de Seq. N°: 3. Por exemplo, a asparaginase de tipo selvagem de A. niger (como revelado em Id. de Seq. N°: 3) tem um pH ótimo de pH 4 a pH 5. Uma proteína da variante da invenção pode ser mais alcalifílica que tal enzima de tipo selvagem, ou seja, pode, por exemplo, ter um pH ótimo de pH 5 a pH 8, preferivelmente de pH 6 a pH 7. Opcionalmente, uma proteína da variante da invenção pode ser mais acidofílica que a asparaginase de tipo selvagem.

Preferivelmente, uma proteína de asparaginase variante de acordo com a invenção pode ter um pH, que é maior que o pH ótimo, e em que 50% da atividade de asparaginase é ainda presente (aqui indicado como pH alcalino), que é maior que aquele da asparaginase parente. Quando a asparaginase parente é aquela de acordo com Id. de Seq. N°: 3, a proteína da variante pode ter um pH alcalino em que 50% da atividade é observada, que é pelo menos 6,9, preferivelmente, pelo menos 7,0, pelo menos 7,5, preferivelmente pelo menos 8.

Uma variante que exibe uma propriedade que é melhorada em relação à asparaginase parente é uma que demonstra uma redução ou aumento mensurável na propriedade relevante, tipicamente de modo que a variante seja mais adequada para usar como apresentado abaixo, por exemplo, em um método para a produção de um alimento.

Preferivelmente, uma proteína da variante de acordo com a invenção pode ter uma atividade específica que é maior que aquela do polipeptídeo parente medida no mesmo pH. Com atividade específica de uma proteína da variante, entende-se a atividade de asparaginase da proteína da variante medida em unidades/mg de proteína pura. Preferivelmente, a atividade específica da proteína da variante de acordo com a invenção é maior em pelo menos um pH, preferivelmente um pH entre 4 e 8, que aquela do polipeptídeo parente medida no mesmo pH.

Em outra modalidade da invenção, a asparaginase variante é mais termofílica que o polipeptídeo de asparaginase parente. A propriedade pode ser assim diminuída em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99%. Alternativamente, a propriedade pode ser aumentada em pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500% ou pelo menos 1.000%. O aumento ou diminuição da percentagem nesse contexto representa um aumento ou diminuição da percentagem em comparação ao polipeptídeo de asparaginase parente. É bem conhecido pela pessoa habilitada como tais mudanças na percentagem podem ser medidas - ela é uma comparação da atividade da asparaginase parente e da asparaginase variante.

As variantes aqui descritas são coletivamente compreendidas nos termos “um polipeptídeo de acordo com a invenção” ou “uma variante de acordo com a invenção”. Os termos “peptídeo” e “oligopeptídeo” são considerados sinônimos (como é comumente reconhecido), e cada termo pode ser usado de modo intercambiável como o contexto necessitar para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos ligados por ligações de peptidil. A palavra “polipeptídeo” é aqui usada para cadeias que contêm mais de sete resíduos de aminoácido. Todas as fórmulas de oligopeptídeo e polipeptídeo ou seqüências nesta especificação são escritas da esquerda para a direita e na direção do terminal amino para o terminal carboxi. O código de aminoácidos de uma letra aqui usado é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, e cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por polipeptídeo “isolado” ou proteína “isolada”, entende-se um polipeptídeo ou proteína removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas recombinantemente produzidos expressos em células hospedeiras são considerados isolados para os objetivos da invenção, assim como polipeptídeos recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada como, por exemplo, o método de purificação de etapa única revelado em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Uma variante de polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser recuperada e purificada a partir de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos na técnica. Mais preferivelmente, cromatografia líquida de alta performance (“HPLC”) é empregada para purificação.

Os polipeptídeos da presente invenção incluem produtos de procedimento sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células de bactéria, levedura, planta superior, inseto e mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem também incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos como um resultado de processos mediados por hospedeiro.

A invenção também apresenta fragmentos biologicamente ativos das variantes de polipeptídeo de acordo com a invenção. Tais fragmentos são considerados como englobados no termo “uma variante da invenção”.

Fragmentos biologicamente ativos de uma variante de polipeptídeo da invenção incluem polipeptídeos que compreendem seqüências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas da seqüência de aminoácidos de uma proteína da variante da invenção que inclui menos aminoácidos que a proteína de comprimento total, mas que exibe pelo menos uma atividade biológica da proteína de comprimento total correspondente. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de uma proteína da variante da invenção. Um fragmento biologicamente ativo da proteína da invenção pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividade biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da invenção.

Tipicamente, um fragmento da proteína da invenção compreenderá uma ou mais das substituições aqui definidas. A invenção também apresenta fragmentos de ácido nucleico que codificam os fragmentos biologicamente ativos acima (cujos fragmentos biologicamente ativos são eles próprios variantes da invenção).

Como apresentado acima, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos da variante da invenção. A invenção também se relaciona a um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um domínio funcional de uma variante de polipeptídeo da invenção. Tipicamente, tal domínio compreenderá uma ou mais das substituições aqui descritas.

Em uma modalidade da invenção, a seqüência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma seqüência de aminoácidos que tem um ou mais truncamentos, e/ou pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção de um aminoácido quando comparado à asparaginase parente. Tal polipeptídeo, no entanto, compreenderá tipicamente uma ou mais das substituições aqui descritas.

Como aqui usado, os termos “gene” e “gene recombinante” referem-se a moléculas de ácido nucleico que incluem uma estrutura de leitura aberta que codifica uma variante, como aqui descrito. Um gene pode incluir seqüências codificadoras, seqüências não codificadoras, íntrons e seqüências reguladoras. Ou seja, um “gene”, como aqui usado, pode referir-se a uma molécula de ácido nucleico isolada, como aqui definido. Portanto, o termo “gene”, no contexto do presente pedido, não se refere apenas a seqüências de ocorrência natural.

Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser gerada com o uso de técnicas padrão de biologia molecular bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, em combinação com a informação de seqüência aqui fornecida.

Por exemplo, com o uso de técnicas sintéticas padrão, a molécula de ácido nucleico necessária pode ser sintetizada novamente. Tal processo sintético será tipicamente um processo automatizado.

Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser gerada pelo uso de mutagênese direcionada a sítio de uma molécula de ácido nucleico existente, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de tipo selvagem. A mutagênese direcionada a sítio pode ser realizada com o uso de inúmeras técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Em um método, aqui mencionado apenas por via de exemplo, PCR é realizada em um modelo de plasmídeo com o uso de “iniciadores” de oligonucleotídeo que codificam a substituição desejada. Uma vez que os iniciadores são as extremidades de filamento recém sintetizados, se houver uma descombinação durante um primeiro ciclo na ligação do filamento de DNA de modelo, depois daquele primeiro ciclo, o filamento com base em iniciador (contendo a mutação) deve estar em concentração igual ao modelo original. Depois de ciclos sucessivos, ele cresceria exponencialmente, e depois de 25, deve superar o número original, filamento não mutado na região de 8 milhões:1, resultando em uma solução quase homogênea de fragmentos amplificados mutados. O DNA de modelo pode ser então eliminado por digestão enzimática com, por exemplo, o uso de uma enzima de restrição que cliva apenas DNA metilado, como Dpn1. O modelo, que é derivado de uma preparação de plasmídeo de lise alcalina e, portanto, é metilado, é destruído nessa etapa, mas o plasmídeo mutado é preservado porque ele foi gerado in vitro e é não metilado como um resultado.

Em tal método, mais de uma mutação (que codifica uma substituição, como aqui descrito) pode ser introduzida em uma molécula de ácido nucleico em uma reação de PCR única, por exemplo, com o uso de um ou mais oligonucleotídeos, cada um compreendendo uma ou mais descombinações. Alternativamente, mais de uma mutação pode ser introduzida em uma molécula de ácido nucleico ao realizar mais de uma reação de PCR, cada reação introduzindo uma ou mais mutações, de modo que ácidos nucleicos alterados são introduzidos no ácido nucleico em um modo seqüencial, iterativo.

Um ácido nucleico da invenção pode ser gerado com o uso de cDNA, mRNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo, e iniciadores de oligonucleotídeo descombinados adequados de acordo com a técnica de mutagênese direcionada a sítio acima descrita. Uma molécula de ácido nucleico derivada desse modo pode ser clonada em um vetor adequado e caracterizada por análise de seqüência de DNA.

Uma seqüência de ácido nucleico da invenção pode compreender uma ou mais deleções, ou seja, gaps, em comparação à asparaginase parente. Tais deleções/gaps podem ser também geradas com o uso de mutagênese direcionada a sítio que usa oligonucleotídeos adequados. Técnicas para a geração de tais deleções são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Além disso, oligonucleotídeos que correspondem a ou são hibridizáveis a seqüências de nucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados por técnicas sintéticas padrão, por exemplo, com o uso de um sintetizador de DNA automatizado.

Além disso, moléculas de ácido nucleico complementares são incluídas na presente invenção. Uma molécula de ácido nucleico que é complementar a outra seqüência de nucleotídeos é uma que é suficientemente complementar à outra seqüência de nucleotídeos de modo que ela possa hibridizar à outra seqüência de nucleotídeos, assim formando uma dupla estável.

Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma variante da invenção, ou um fragmento biologicamente ativo ou domínio desta, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como marcadores de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo da invenção e fragmentos de tais moléculas de ácido nucleico adequadas para uso como iniciadores de PCR para a amplificação ou mutação de moléculas de ácido nucleico, como para a preparação de moléculas de ácido nucleico da invenção.

Um “polinucleotídeo isolado” ou “ácido nucleico isolado” é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguo com ambas as seqüências codificadoras com as quais ele é imediatamente contíguo (uma na extremidade 5’ e uma na extremidade 3’) no genoma de ocorrência natural do organismo do qual ele é derivado. Assim, em uma modalidade, um ácido nucleico isolado inclui algumas ou todas as seqüências não codificadoras 5’ (por exemplo, promotora) que são imediatamente contíguas à seqüência codificadora. O termo inclui, portanto, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo autonomicamente replicante ou vírus, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras seqüências. Ele também inclui um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica um polipeptídeo adicional que é substancialmente livre de material celular, material viral, ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante), ou precursores químicos ou outros agentes químicos (quando quimicamente sintetizados). Além disso, um “fragmento de ácido nucleico isolado” é um fragmento de ácido nucleico que não ocorre naturalmente como um fragmento e não deve ser encontrado em estado natural.

Como aqui usado, os termos “polinucleotídeo” ou “molécula de ácido nucleico” ou “ácido nucleico” devem incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados com o uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo, mas é preferivelmente DNA de filamento duplo. O ácido nucleico pode ser sintetizado com o uso de análogos de oligonucleotídeo ou derivados (por exemplo, nucleotídeos de inosina ou fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar ácido nucleicos que têm capacidades de pareamento de base alteradas ou resistência aumentada a nucleases.

Outra modalidade da invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que é anti-senso a uma molécula de ácido nucleico da invenção. Os termos “identidade” ou “percentual de identidade” são usados de modo intercambiável nesta especificação. Para o objetivo desta invenção, é aqui definido que, para determinar o percentual de identidade de duas seqüências de ácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas para objetivos de comparação (por exemplo, gaps podem ser introduzidos na seqüência de um primeiro aminoácido ou ácidos nucleicos para alinhamento ótimo com uma segunda seqüência de aminoácidos ou ácidos nucleicos). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeo em posições correspondentes de aminoácido ou nucleotídeo são então comparados. Quando a posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição. O percentual de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas seqüências (ou seja, % identidade = número de posições idênticas/número total de posições (ou seja, posições que se sobrepõem) x 100). Preferivelmente, as duas seqüências têm o mesmo comprimento.

Uma comparação de seqüência pode ser realizada pelos comprimentos inteiros das duas seqüências sendo comparadas ou no fragmento das duas seqüências. Tipicamente, a comparação será realizada no comprimento total das duas seqüências sendo comparadas. No entanto, a identidade de seqüência pode ser realizada em uma região, por exemplo, de vinte, cinqüenta, cem ou mais resíduos contíguos de aminoácido.

A pessoa habilitada estará ciente do fato de que vários diferentes programas de computador são disponíveis para determinar a identidade entre duas seqüências. Por exemplo, uma comparação de seqüências e determinação do percentual de identidade entre duas seqüências pode ser realizada com o uso de um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, o percentual de identidade entre duas seqüências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos é determinado com o uso do algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), que foi incorporado no programa GAP no pacote de programas Accelrys GCG (disponível em http://www.accelrys.com/produtos/gcg/), com o uso de uma matriz Blossom 62 ou matriz PAM250, e um peso de gap (gap weight) de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento (length weight) de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A pessoa habilitada perceberá que esses diferentes parâmetros produzirão resultados levemente diferentes, mas que a percentagem de identidade geral das duas seqüências não é significativamente alterada quando do uso de diferentes algoritmos.

As seqüências de proteína ou seqüências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser também usadas como uma “seqüência query” para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou seqüências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas com o uso dos programas BLASTN e BLASTP (versão 2.0) de Altschul, e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de proteína em BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTP, pontuação = 50, wordlength = 3 para obter seqüências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos espaçados (gapped) para objetivos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e cols., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Quando da utilização de programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTP e BLASTN) podem ser usados. Veja a página inicial do “National Center for Biotechnology Information em www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro aspecto da invenção pertence a vetores, preferivelmente vetores de expressão, que contêm um ácido nucleico que codifica uma asparaginase variante da invenção.

Como aqui usado, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissomais) são integrados no genoma da célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e assim são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui referidos como “vetores de expressão”. Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de forma intercambiável nesta especificação uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção deve incluir tais outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno- associados), que servem a funções equivalentes.

Os vetores recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que é operacionalmente ligada à seqüência de ácido nucleico a ser expressa. Em um vetor de expressão recombinante, “operacionalmente ligado” deve significar que a seqüência de nucleotídeos de interesse é ligada à seqüência(s) reguladora(s) em uma maneira que permita a expressão da seqüência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo “seqüências reguladoras” deve incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinal de poliadenilação). Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Seqüências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva ou indutível de uma seqüência de nucleotídeos em vários tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expressão da seqüência de nucleotídeos apenas em uma certa célula hospedeira (por exemplo, seqüências reguladoras específicas para tecido). Deve ser percebido por aqueles habilitados na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão desejado da proteína etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptídeos, codificados por ácido nucleicos como aqui descritos (por exemplo, a variante de asparaginase de Id. de Seq. N°: 3 ou uma variante desta, por exemplo, um equivalente funcional ou fragmento, ou uma proteína de fusão que compreende uma ou mais dessas variantes).

Os vetores de expressão recombinante da invenção podem ser desenhados para expressão de proteínas variantes da invenção em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, uma proteína da variante da invenção pode ser expressa em células de bactéria como E. coli, células de inseto (com o uso de vetores de expressão de baculovírus), células de levedura ou células de mamífero. Células hospedeiras adequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, Gene Expression Technology: Métodos in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, com o uso das seqüências reguladoras de promotor T7 e polimerase T7.

Vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossômicos, epissomais e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, epissomo de levedura, elementos cromossômicos de levedura, vírus como baculovírus, papova vírus, vaccínia vírus, adenovírus, pox vírus falsos, vírus da pseudo-raiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações destes, como aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago, como cosmídeo e fagemídeos.

A inserção de DNA pode ser operacionalmente ligada a um promotor adequado, como o promotor PL de fago lambda, o lac de E. coli, promotores trp e tac, os promotores de SV40 precoces e tardios, e promotores de LTRs retrovirais. Outros promotores adequados serão conhecidos pela pessoa habilitada. Em uma modalidade específica, são preferidos promotores que sejam capazes de direcionar um alto nível de expressão de asparaginase em fungos filamentosos. Tais promotores são conhecidos na técnica. As construções de expressão podem conter sítios para iniciação de transcrição, terminação, e, na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomo para tradução. A porção codificadora dos transcritos maduros expressos pelas construções incluirá um AUG de iniciação de tradução no início e um códon de terminação adequadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas e eucarióticas adequadas por meio de técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Como aqui usado, os termos “transformação” e “transfecção” devem se referir a uma variedade de técnicas reconhecidas para introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecção catiônica mediada por lipídeo ou eletroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, e cols (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis e cols., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais de laboratório.

Para transfecção estável de células de mamífero, é sabido que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. Para identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metotrexate. Ácido nucleico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido na célula hospedeira no mesmo vetor que aquele que codifica uma proteína da variante da invenção ou pode ser introduzido em um vetor separado. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármaco (por exemplo, células que incorporaram o gene de marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrerão).

A expressão de proteínas em procariotas é freqüentemente realizada em E. coli com vetores que contêm promotores constitutivos ou indutíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Vetores de fusão adicionam inúmeros aminoácidos a uma proteína aqui codificada, por exemplo, ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente a três objetivos: 1) para aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante por ação como um ligante em purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, é introduzido um sítio de clivagem proteolítica na junção da porção de fusão e a proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão subseqüente à purificação da proteína de fusão.

Como indicado, os vetores de expressão preferivelmente contêm marcadores selecionáveis. Tais marcadores selecionáveis incluem resistência à dihidrofolato redutase ou neomicina para cultura de células eucarióticas e resistência à tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiro adequados incluem células de bactéria, como E. coli, Streptomyces Salmonella typhimurium e certas espécies de Bacillus; células fúngicas como espécies de Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. oryzae e A. nidulans, levedura como Kluyveromyces, por exemplo, K. lactis e/ou Pichia, por exemplo, P. pastoris; células de inseto como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animal como CHO, COS e melanoma de Bowes; e células de plantas. Meios de cultura e condições adequados para as células hospedeiras acima descritas são conhecidos na técnica.

Vetores preferidos para uso em bactérias são, por exemplo, revelados em WO-A1-2004/074468, que são aqui englobados por referência. Outros vetores adequados serão facilmente aparentes para o profissional habilitado. Promotores bacterianos conhecidos adequado para uso na presente invenção incluem os promotores revelados em WO-A1- 2004/074468, que são aqui incorporados por referência.

A transcrição do DNA que codifica uma variante da presente invenção por eucariotas superiores pode ser aumentada por inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. Intensificadores são elementos de ação cis de DNA, comumente de cerca de 10 a 300 bp que agem para aumentar a atividade transcricional de um promotor em um dado tipo de célula hospedeira. Exemplos de intensificadores incluem o intensificador SV40, que está localizado no lado remoto da origem de replicação em bp 100 a 270, o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado remoto da origem de replicação e intensificadores de adenovírus.

Para a secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplásmico ou no ambiente extracelular, um sinal de secreção adequado pode ser incorporado no polipeptídeo expresso. Os sinais podem ser endógenos ao polipeptídeo ou eles podem ser sinais heterólogos.

Uma variante da invenção oide ser expressa em tal forma que ela possa incluir regiões funcionais heterólogas adicionais, por exemplo, sinais de secreção. Uma variante da invenção também pode compreender, por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, adicionados ao N-terminal do polipeptídeo, por exemplo, para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante subseqüente manuseio e estocagem. Além disso, as porções do peptídeo podem ser adicionadas a uma variante da invenção para facilitar a purificação, por exemplo, pela adição de resíduo de histidina ou um tag T7.

As variantes da invenção, como proteínas da presente invenção ou equivalentes funcionais dessas, por exemplo, porções biologicamente ativas e fragmentos dessas, podem ser operacionalmente ligadas a um polipeptídeo não variante (por exemplo, seqüências de aminoácidos heterólogas) para formar proteínas de fusão. Um “polipeptídeo não variante” nesse contexto refere-se a um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácidos que corresponde à proteína que não é substancialmente homóloga a uma variante asparaginase da invenção.

Na proteína de fusão, a variante da invenção pode corresponder a uma seqüência de comprimento total ou um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade preferida, uma proteína de fusão da invenção compreende pelo menos duas porções biologicamente ativas. Na proteína de fusão, o termo “operacionalmente ligado” deve indicar que o polipeptídeo variante e o polipeptídeo não variante são fundido em estrutura um ao outro. O polipeptídeo não variante pode ser fundido ao N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo variante.

Por exemplo, em uma modalidade, a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a seqüência/s variante/a é/são fundida/s ao C-terminal das seqüências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de uma variante recombinante de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a proteína de fusão é uma variante da invenção que contém uma seqüência de sinal heteróloga em seu N-terminal. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamífero e levedura), a expressão e/ou secreção de uma variante da invenção pode ser aumentada através do uso de uma seqüência de sinal heteróloga.

Em outro exemplo, a seqüência secretora gp67 da proteína de envelope de baculovírus pode ser usada como uma seqüência de sinal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e cols., eds., John Wiley & Sons, 1992). Outros exemplos de seqüências de sinal heterólogas eucarióticas incluem as seqüências secretoras de melitina e fosfatase alcalina de placenta humana (Stratagene; La Jolla, California). Ainda em outro exemplo, seqüências de sinal heterólogas procarióticas úteis incluem o sinal secretor phoA (Sambrook e cols., supra) e o sinal secretor A de proteína (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey).

Uma seqüência de sinal pode ser usada para facilitar a secreção e isolação de uma variante da invenção. Seqüências de sinal são tipicamente caracterizadas por um núcleo de aminoácidos hidrofóbicos, que são geralmente clivados a partir da proteína madura durante a secreção em um ou mais eventos de clivagem. Tais peptídeos se sinal contêm sítios de processamento que permitem a clivagem da seqüência de sinal a partir das proteínas maduras uma vez que elas passam através da via secretora. A seqüência de sinal pode direcionar a secreção da variante, como de um hospedeiro eucariótico em que o vetor de expressão é transformado, e a seqüência de sinal pode ser então subseqüentemente ou concomitantemente clivada. A variante da invenção pode ser então facilmente purificada a partir de meio extracelular por métodos conhecidos. Alternativamente, a seqüência de sinal pode ser ligada à variante de interesse com o uso da seqüência, o que facilita a purificação, como com um domínio de GST. Portanto, por exemplo, a seqüência que codifica a variante da invenção pode ser fundida a uma seqüência de marcador, como a seqüência que codifica um peptídeo, que facilita a purificação da variante fundida da invenção. Em certas modalidades preferidas desse aspecto da invenção, a seqüência de marcador um peptídeo de hexa- histidina, como o tag fornecido em um vetor pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, vários dos quais são comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa- histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. O tag HA é outro peptídeo útil para a purificação que corresponde a um epitopo derivado de proteína de hemaglutinina de influenza, que foi descrito por Wilson e cols., Cell 37:767 (1984), por exemplo.

Uma proteína de fusão da invenção pode ser produzida por técnicas padrão de DNA recombinante. Por exemplo, fragmentos de DNA que codificam para as diferentes seqüências de polipeptídeos são ligados juntos em estrutura de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, pelo emprego de terminal blunt-ended ou stagger-ended para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminais adequados, preenchimento de extremidades coesivas como adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejadas, e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais que incluem sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de gene pode ser realizada com o uso de iniciadores âncora, que produzem protuberâncias complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subseqüentemente anelados e reamplificados para gerar uma seqüência de genes quimérica (veja, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel e cols. John Wiley & Sons: 1992). Além disso, são comercialmente disponíveis vários vetores de expressão que já codificam uma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucleico que codifica variante pode ser clonados em tal vetor de expressão de modo que a porção de fusão é ligada em estrutura à referida variante.

Os termos “equivalentes funcionais” e “variantes funcionais” são usados de modo intercambiável nessa. Equivalentes funcionais de acordo com a invenção são fragmentos de DNA isolados que codificam um polipeptídeo que exibe uma função particular de uma variante como aqui definido. Equivalentes funcionais, portanto, também englobam fragmentos biologicamente ativos e são englobados no termo “a variante” da invenção.

Preferivelmente, um equivalente funcional da invenção compreende uma ou mais das substituições aqui descritas. No entanto, um equivalente funcional pode compreender uma ou mais modificações além das substituições acima descritas.

Equivalentes funcionais de ácido nucleico podem conter tipicamente mutações silenciosas ou mutações que não alteram a função biológica do polipeptídeo codificado. Portanto, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de asparaginase variante que contém mudanças nos resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica particular. Tais proteínas variantes diferem na seqüência de aminoácidos da seqüência parente de asparaginase da qual elas são derivadas ainda retendo pelo menos uma atividade biológica dessa, preferivelmente elas retêm pelo menos a atividade de asparaginase. Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico isolada compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína, em que a proteína compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogos à seqüência de aminoácidos parente (por exemplo, aquela mostrada em Id. de Seq. N°: 3).

Como aqui definido, o termo “substancialmente homólogo” refere-se a um primeiro aminoácido ou seqüência de nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com cadeia lateral similar) a um segundo aminoácido ou seqüência de nucleotídeos de modo que o primeiro e o segundo aminoácido ou seqüências de nucleotídeos tenham um domínio comum. Por exemplo, aminoácido ou seqüências de nucleotídeos que contêm um domínio comum que tem cerca de 60%, preferivelmente 65%, mais preferivelmente 70%, ainda mais preferivelmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou mais são aqui definidos como suficientemente idênticos.

A pessoa habilitada reconhecerá que podem ser introduzidas mudanças por mutação nas seqüências de nucleotídeos de acordo com a invenção assim levando a mudanças na seqüência de aminoácidos da proteína resultante sem alterar substancialmente a função de tal proteína.

Portanto, a variante de asparaginase da invenção é preferivelmente uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga à seqüência de aminoácidos parente, por exemplo, que é mostrada em Id. de Seq. N°: 3, e também retém tipicamente pelo menos uma atividade funcional do polipeptídeo parente.

Variantes da invenção, por exemplo, equivalentes funcionais da proteína de acordo com a invenção, também podem ser identificados, por exemplo, por rastreamento de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, mutantes de truncagem, da proteína da invenção para atividade de asparaginase. Em uma modalidade, uma biblioteca variada de variantes é gerada por mutagênese combinatória no nível de ácido nucleico. Uma biblioteca variada de variantes pode ser produzida por, por exemplo, ligação enzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em seqüências de gene de modo que um conjunto degenerado de seqüências de proteínas potenciais é expressível como polipeptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para apresentação de fago). Há vários métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes 'potenciais dos polipeptídeos da invenção a partir de uma seqüência de oligonucleotídeos degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura e cols. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura e cols. (1984) Science 198:1056; Ike e cols. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

Além disso, bibliotecas de fragmentos da seqüência que codifica um polipeptídeo da invenção podem ser usadas para gerar uma população variada de polipeptídeos para rastreamento de uma seleção subseqüente de variantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos de seqüência codificadora pode ser gerada por tratamento de um fragmento de PCR de filamento duplo da seqüência codificadora de interesse com uma nuclease sob condições em que ocorre fissura apenas por volta de uma por molécula, desnaturação do DNA de filamento duplo, renaturação do DNA para formar um DNA de filamento duplo que pode incluir pares senso/anti-senso de diferentes produtos com fissura, remoção de porções de filamento único de duplexes reformadas por tratamento com S1 nuclease, e ligação da biblioteca de fragmento resultante em um vetor de expressão. Por este método, pode ser derivada uma bibliteca de expressão que codifica fragmentos N-terminais e internos de vários tamanhos da proteína de interesse.

Várias técnicas são conhecidas na prática para rastreamento de produtos de gene de bibliotecas combinatórias feitas por mutações em ponto de truncagem, e para rastreamento de bibliotecas de cDNA para produtos de gene que têm uma propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente usadas, que são passíveis de análise de alto rendimento para rastreamento de grandes bibliotecas de gene tipicamente incluem clonagem da biblioteca de gene em vetores de expressão replicáveis, transformação de células adequadas com a biblioteca resultante de vetores, e expressão dos genes combinatórios sob condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita a a isolação do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese em conjunto recorrente (REM), uma técnica que melhora a freqüência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de rastreamento para identificar variantes da proteína da invenção (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave e cols. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com a invenção também podem compreender polinucleotídeos que não codificam polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeos podem funcionar como marcadores ou iniciadores para uma reação de PCR.

Ácidos nucleicos de acordo com a invenção independente de ser eles codificam polipeptídeos funcionais ou não funcionais podem ser usados como marcadores de hibridização ou iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR). Os usos das moléculas de ácido nucleico da presente invenção que não codificam um polipeptídeo que tem atividade de asparaginase incluem, entre outros, (1) hibridização in situ (por exemplo, FISH) a extensões cromossômicas de metáfase para fornecer uma localização cromossômica precisa de um gene que codifica asparaginase como descrito em Verma e cols., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (2) análise de Northern blot para detectar expressão de mRNA de asparaginase em tecidos específicos e/ou células; e (3) marcadores e iniciadores que podem ser usados como uma ferramenta diagnóstica para análise da presença de um ácido nucleico hibridizável a tal marcador ou iniciador em uma amostra biológica dada (por exemplo, tecido).

Variantes de uma dada enzima asparaginase parente podem ser obtidas pelos seguintes procedimentos padrão: - Mutagênese (propensa a erro, doped oligo, spiked oligo) - Rastreamento primário - Identificação de uma melhor variante (por exemplo, em relação à atividade específica) - Manutenção (por exemplo, em cultura de glicerol, placas LB-Amp, Mini-Prep) - esgotamento (Streaking out) em outros ensaios de rastreamento de placa secundário - Sequenciamento de DNA - Transformação in, por exemplo, Aspergillus - Cultivo, por exemplo, em escala de 100 ml, purificação, DSC.

Em uma modalidade a invenção relaciona-se a um método de produção de uma asparaginase variante de polipeptídeo de acordo com a invenção, cujo método compreende: a) a seleção de um polipeptídeo de asparaginase parente; b) substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dos: 41, 53, 62 , 63 , 64, 66, 70, 71, 73 , 74, 76, 77, 88, 90 , 91, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 142, 143, 145, 161, 162, 163, 164, 168, 169, 170, 195, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 228, 232, 233, 234, 235, 262, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 293, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 310, 314, 317, 318, 319, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 ou 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3; c) opcionalmente substituição de um ou mais aminoácidos adicionais como definido em b); d) preparação da variante que resulta das etapas a)-c); e) determinação da atividade específica em pelo menos um pH e/ou o pH ótimo da variante; e f) seleção de uma variante que tem uma atividade específica aumentada em pelo menos um pH em comparação ao polipeptídeo de asparaginase parente e/ou pH ótimo aumentado em comparação ao polipeptídeo de asparaginase parente, assim produzindo uma variante de polipeptídeo de asparaginase.

Em uma modalidade preferida no método de produção de uma asparaginase variante de polipeptídeo de acordo com a invenção, o polipeptídeo de asparaginase parente tem a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: 3.

Mais preferivelmente na etapa b) do método de acordo com a invenção pelo menos um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um dos 41, 53, 63, 64, 66, 73, 74, 76, 77, 88, 90, 91, 101, 106, 111, 119, 122, 123, 132, 140, 145, 161, 170, 195, 211, 218, 228, 232, 233, 262, 267, 293, 295, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 310, 314, 317, 321, 324, 330, 332 ou 333 , 371 , é substituído, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3 e em que o polipeptídeo parente tem pelo menos 80% de identidade com Id. de Seq. N°: 3.

Ainda mais preferivelmente na etapa b) do método de acordo com a invenção o resíduo de aminoácido substituído corresponde a um ou mais de Ile na posição 41, Tyr na posição 53, Gly ou Val ou Ser na posição 63, Pro na posição 64, Pro na posição 66, Lys na posição 73, Ala na posição 74, Thr na posição 76, Ile na posição 77, Tyr ou Pro na posição 88, Val na posição 90, Glu na posição 91, Val na posição 101, Pro na posição 106, Gly na posição 111, Asn na posição 119, His na posição 122, Ala na posição 123, Ser na posição 132, Asn na posição 140, Ser na posição 145, Leu na posição 161, Thr na posição 170, Asp na posição 195, Ser na posição 211, Val na posição 218, His na posição 228, Val na posição 232, Val na posição 233, Cys ou His na posição 262,

Tyr na posição 267, Ser ou Val na posição 293, Ser na posição 295, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ile na posição 300, Pro na posição 301, Ser na posição 303, Thr na posição 304, Val na posição 310, Asp na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Ser na posição 330, Ala na posição 332 ,Glu na posição 333 ou Met na posição 371 as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3.

Em uma modalidade do processo da invenção na etapa e) a atividade específica é determinada em um pH entre 4 e 8. Em outra modalidade da etapa e), antes da determinação da atividade específica em pelo menos um pH e/ou o pH ótimo da variante, a proporção, em uma temperatura específica, entre a atividade de asparaginase em pH 7 e a atividade de asparaginase em pH 5 da variante pode ser medida e uma variante pode ser selecionada em que a referida proporção é maior que aquela do polipeptídeo de asparaginase parente.

Em outra modalidade do processo da invenção na etapa f) é selecionada uma variante que tem uma atividade específica aumentada em pelo menos um pH, preferivelmente em um pH entre 4 e 8, em comparação ao polipeptídeo parente e/ou que tem um pH ótimo aumentado em comparação ao polipeptídeo parente. Preferivelmente a variante tem uma atividade específica aumentada em pelo menos um pH, preferivelmente em um pH entre 4 e 8, em comparação ao polipeptídeo parente e um pH ótimo aumentado em comparação ao polipeptídeo parente. Em outra modalidade do processo da invenção na etapa f) é selecionada uma variante que tem uma atividade específica aumentada em pelo menos um pH, preferivelmente em um pH entre 4 e 8, em comparação ao polipeptídeo parente.

Em outra modalidade, a invenção apresenta células, por exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes que contêm um ácido nucleico englobado pela invenção. Uma “célula transformada” ou “célula recombinante” é uma célula em que (ou em um ancestral da qual) foi introduzido, por meio de técnicas de DNA recombinante, um ácido nucleico de acordo com a invenção. Tanto células eucarióticas quanto procarióticas são incluídas, por exemplo, bactéria, fungos, levedura e outras, especialmente preferidas são as células de fungos filamentosos, em particular Aspergillus niger.

Pode ser escolhida uma célula hospedeira que modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa o produto codificado pela seqüência de ácidos nucleicos incorporada em um modo específico, desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem facilitar o funcionamento ótimo da proteína codificada.

Várias célula hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para processamento pós tradução e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhagens de células ou sistemas de hospedeiro adequados familiares pa4ra aqueles habilitados na técnica de biologia molecular e/ou microbiologia podem ser escolhidos para assegurar a modificação desejada e correta e processamento da proteína estranha expressa. Para essse fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica.

As células hospedeiras também incluem, sem limitação, linhagens de células de mamífero como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e linhagens de células de plexo coróide.

Se desejado, uma linhagem de células estavelmente transfectada pode produzir uma variante de acordo com a invenção. Inúmeros vetores adequados para transfecção estável de células de mamífero são disponíveis ao público, métodos para a construção de tais linhagens de células são também publicamente conhecidos, por exemplo, em Ausubel e cols. (supra).

A presente invenção também revela uma composição que compreende as variantes de asparaginase de acordo com a invenção. A composição pode compreender opcionalmente outros ingredientes como, por exemplo, outras enzimas. As variantes de asparaginase de acordo com a invenção ou composições que compreendem as referidas asparaginases podem ser usadas na produção de um produto alimentício. Em uma modalidade da invenção as variantes de asparaginase ou composições de acordo com a invenção podem ser usadas para reduzir a quantidade de acrilamida formada em um produto alimentício termicamente processado com base em uma matéria prima que contém asparagina. Elas podem, por exemplo, ser usadas em um processo para a produção de um produto alimentício que envolve pelo menos uma etapa de aquecimento, que compreende a adição de uma ou mais enzimas de asparaginase a uma forma intermediária do referido produto alimentício no referido processo de produção segundo o qual a enzima é adicionada antes da referida etapa de aquecimento em uma quantidade que é efeicaz na redução do nível de asparaginase que está presente na referida forma intermediária do referido produto alimentício. Tal processo é revelado e WO04/030468 cujo processo e todas as suas preferências são aqui incorporados por referência. Também em WO04/026043 são descritos processos adequados em que a asparaginase de acordo com a invenção pode ser usada. Os processos revelados em WO04/026043 e todas as preferências reveladas em são aqui incorporados por referência.

Uma forma intermediária do produto alimentício é aqui definida como qualquer forma que ocorra durante um processo de produção antes da obtenção da forma final do produto alimentício. A forma intermediária pode compreender as matérias primas individuais e/ou mistura desses e/ou misturas com aditivos e/ou auxiliares de processamento, ou forma subseqüentemente processada desses. Por exemplo, para o produto alimentício pão, as formas intermediárias compreendem, por exemplo, trigo, farinha de trigo, a mistura inicial desses com outros ingredientes do pão como, por exemplo, água, sal, levedura e composições para melhoria do pão, a massa misturada, a massa trabalhada, a massa levedada e a massa parcialmente assada. Por exemplo, para vários produtos com base em batata, flocos ou grânulos de batata desidratados são produtos intermediários, e massa de milho é um produto intermediário para tortilla chips.

O produto alimentício pode ser feito de pelo menos uma matéria prima que é de origem em planta, por exemplo, batata, tabaco, café, cacau, arroz, cereal, por exemplo, trigo, milho, centeio, milho, cevada, groats, fagópiro e aveia. O trigo deve englobar aqui e a seguir todas as espécies conhecidas do gênero Triticum, por exemplo, aestivum, durum e/ou spelta. Além disso, produtos alimentícios feitos a partir de mais de uma matéria prima ou intermediário são incluídos no escopo dessa invenção, por exemplo, produtos alimentícios que compreendem tanto trigo (farinha e/ou amido) quanto batata. Exemplos de produtos alimentícios em que o processo de acordo com a invenção pode ser adequado são quaisquer produtos com base em farinha, por exemplo, pão, produtos de confeitaria, bolos, pretzels, bagels, bolo “Dutch honey”, biscoitos, pão de gengibre, bolo de gengibre e pão crocante, e quaisquer produtos com base em batata, por exemplo, batatas fritas, pommes frites, batatas chips, croquetes.

As matérias primas como acima citados são conhecidos por conte quantidades substanciais de asparagina que está envolvida na formação de acrilamida durante uma etapa de aquecimento do processo de produção. Alternativamente, a asparagina pode ser originar de outras fontes diferentes das matérias primas , por exemplo, de hidrolisados de proteína, como extratos de levedura, hidrolisado de soja, hidrolisado de caseína e outros, que são usados como um aditivo no processo de produção do alimento. Um processo de produção preferido é o cozimento do pão e outros produtos assados a partir de farinha de trigo e/ou farinhas de outras origens cereais. Outro processo de produção preferido é a fritura das batatas chips a partir de fatias de batata.

As etapas de aquecimento preferidas são aquelas em que pelo menos uma parte do produto alimentício intermediário, por exemplo, a superfície do produto alimentício, é exposta a temperaturas em que a formação de acrilamida é promovida, por exemplo, 110°C ou mais , 120°C ou mais de temperaturas. A etapa de aquecimento no processo de acordo com a invenção pode ser realizada em fornos, por exemplo, em uma temperatura entre 180-220°C, como para assar o pão e outros produtos assados, ou em óleo como a fritura de batatas chips, por exemplo, a 160-190°C.

Em outro aspecto, a invenção fornece produtos alimentícios que podem ser obtidos pelo processo da invenção como aqui descrito anteriormente ou pelo uso da nova asparaginase como aqui descrito anteriormente para produzir produtos alimentícios. Esses produtos alimentícios são caracterizados por reduzir significativamente os níveis de acrilamida em comparação com os produtos alimentícios obtidos por processos de produção que não compreendem a adição de uma ou mais enzimas em uma quantidade que é eficaz na redução do nível de aminoácidos que estão envolvidos na formação de acrilamida durante a referida etapa de aquecimento. O processo de acordo com a invenção pode ser usado para obter uma diminuição do conteúdo da acrilamida do produto alimentício produzido preferivelmente em mais de 50%, mais preferivelmente mais de 20%, ainda mais preferivelmente 10% e mais preferivelmente mais de 5% comparado a um produto alimentício obtido com o processo convencional.

Uma aplicação adicional para as variantes de asparaginase de acordo com a invenção é o emprego na terapia de tumores. O metabolismo das células tumorais requer L-asparagina, que pode ser rapidamente degradada por asparaginases. A asparaginase de acordo com a invenção também pode ser usada como um adjunto no tratamento de algumas leucemias humanas. A administração de asparaginase em animais experimentais e humanos leva à regressão de certos linfomas e leucemias. Portanto, em uma modalidade a invenção relaciona-se a asparaginases ou uma composição de acordo com a invenção para uso como medicamento, por exemplo, no tratamento de tumores, por exemplo, no tratamento de linfomas ou leucemias em animais ou humanos.

As variantes de asparaginase de acordo com a invenção podem ser convenientemente produzidas em microorganismos. Nos processos acima, é vantajoso usar asparaginases que sejam obtidas por técnicas de DNA recombinante. Tais enzimas recombinantes têm inúmeras vantagens, como a produção em um menor custo, alto rendimento, livre de agentes contaminantes como bactérias ou vírus, mas também livre de toxinas bacterianas ou que contaminam outras atividades da enzima. A invenção é aqui ilustrada pelos exemplos não limitante a seguir.

EXEMPLOS Materiais e Métodos

Ensaio de asparaginase para medir a dependência ao pH na faixa de pH=4 a pH=9 A atividade de asparaginase foi medida com o uso de L- asparagina como substrato. A quantidade de amônia que foi liberada pela ação da enzima foi medida de acordo com a reação de Berthelot. Reagentes prontos para o uso fenolnitroprusside e hipoclorito alcalino foram obtidos a partir de Sigma. 100 μl de amostra de enzima foram misturados com 2.000 μl 100 mM L-asparagina em uma mistura de 50 mM ácido cítrico e 50 mM tampão de pirofosfato de sódio do pH desejado. Depois de incubação a 37°C por 30 minutos a reação foi interrompida pela adição de 400 μl 25% ácido tricloroacético, depois do que 2.500 μl de água foram adicionados. Durante a incubação a temperatura foi fixada a 37°C a menos que indicado de outro modo.

Deve ser compreendido pela pessoa habilitada na técnica que a dosagem da enzima foi escolhida em uma tal maneira que depois da incubação sob as condições acima foi obtido um sinal significativamente acima do valor de fundo mas ainda dentro de uma escala em que os sinais obtidos são proporcionais à quantidade de enzima adicionada. Preferivelmente a reação foi de ordem zero.

Depois de interromper a reação, 4 μl da mistura de incubação foram adicionados a 156 μl de água. Subsequentemente 34 μl de solução de fenol/nitroprusside (Sigma P6994) e 34 μl solução alcalina de hipoclorito (Sigma A1727) foram adicionados. Depois de 676 segundos de incubação a 37°C, a extinção foi medida a 600 nm. As leituras foram corrigidas para o sinal de base por inclusão dos vazios apropriados. Uma amostra com enzima inativada (TCA) foi usada como um vazio. Os ensaios foram feitos em um autoanalyzer, por exemplo, um Konelab Arena 30 (Thermo Scientific). A atividade foi determinada com o uso de uma linha de calibragem feita por traçado da absorvência medida a 600 nm versus as concentrações conhecidas de sulfato de amônio de uma série padrão. A atividade foi expressa em unidades, em que uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um micromol de amônia de L-asparagina por minuto sob condições definidas de ensaio.

Ensaio de asparaginase para medir a dependência de pH na faixa de pH=4 a pH=8 O método foi executado do mesmo modo que o método acima descrito para medição da dependência ao pH e da atividade para a faixa de pH=4 a pH=9, com a diferença de que 100 μl de amostra de enzima foram misturados com 2.000 μl 100 mM L-asparagina em 50 mM de tampão fosfato/ácido cítrico do pH desejado.

Ensaio manual de asparaginase para medir a atividade em pH=5 e pH=7 O ensaio foi realizado, por exemplo, em placas de microtítulo (MTP’s) ou tubos. Para identificar asparaginases com um perfil de atividade de pH deslocado, a atividade foi medida em pH=5 e pH=7. 10 μl de amostra da enzima foram misturados com 190 μl 100 mM L-asparagina em 100 mM tampão de ácido cítrico pH 5,0 ou 100 mM tampão de fosfato pH 7,0. Depois de incubação em temperatura ambiente por 1 hora a reação foi interrompida pela adição de 100 μl 12,5% ácido tricloroacético. A dosagem da enzima foi escolhida em uma tal maneira que depois de 1 hora de incubação em temperatura ambiente, foi foi obtido um sinal significativamente acima do valor de fundo. Depois de interromper a reação, 95 μl de água foram adicionados a 8 μl da mistura de incubação. Subseqüentemente, 70 μl de solução de fenol/ nitroprusside (Sigma P6994) e 70 μl solução alcalina de hipoclorito (Sigma A1727) foram adicionados. Depois de 60 minutos de incubação em temperatura ambiente, a extinção foi medida a 620 nm. As leituras foram corrigidas para o sinal de base por inclusão dos vazios apropriados, por exemplo, amostra e/ou sobrenadante ainativado de amostras de fermentação de cepas hospedeiras vazias. Cepa vazia indica uma cepa de hospedeiro que não foi transformada para conter o gene de asparaginase. A atividade foi determinada com o uso de uma linha de calibragem feita por traçado da absorvência medida a 620 nm versus as concentrações conhecidas de sulfato de amônio de uma série padrão. A atividade foi expressa em unidades, em que uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um micromol de amônia de L-asparagina por minuto sob condições definidas de ensaio. Em todos os ensaios a atividade das amostras de asparaginase foram expressas em unidade/ml.

Exemplo 1 Fermentação, isolação e purificação de asparaginases de acordo com a invenção

As asparaginases da invenção foram obtidas pela construção de plasmídeos de expressão que contêm uma seqüência de DNA que codifica a asparaginase da invenção, transformação de uma cepa de Aspergillus niger com o plasmídeo e crescimento das cepas de Aspergillus niger como descrito em WO2004/030468.

Depois de crescimento de Aspergillus niger que contém os plasmídeos de expressão adequados, sobrenadantes livres de células foram preparados por centrifugação do caldo de fermentação a 5.000 x g por 30 minutos a 4°C. Se necessário os sobrenadantes foram filtrados também sobre um filtro de Miracloth (Calbiochem cat# 475855) e um filtro de microfibra de vidro GF/A Whatmann (150mm 0) , respectivamente, para remover quaisquer sólidos. Para remover qualquer material fúngico os sobrenadantes podem ser ajustados ao pH=5 com 4N KOH e filtrados de modo estéril sobre um filtro de 2 μm (do topo ao fundo) com sucção. Os sobrenadantes foram estocados até o uso a 4°C ou congelados a -20°C se necessário.

No caso em que as impurezas eram mais de 60% p/p asparaginase foi purificada por cromatografia de troca aniônica iônica iniciando a partir dos sobrenadantes livres de células ou ccUF dessalgado por meio de uma coluna PD-10 (Amersham Biosciences). O material dessalgado foi aplicado a uma coluna Mono-Q ou Q-Sepharose equilibrada em 20mM tampão de histidina pH 5,96. Depois de lavagem extensiva as asparaginases foram eluídas da coluna com o uso de um gradiente de 0 a 1M NaCl.

A pureza das frações do sobrenadante que contêm a atividade de asparaginase ou das frações de asparaginase purificada (determinada em mg proteína/ml) foi checada por cromatografia de exclusão por tamanho analítica (HP-SEC: Cromatografia de exclusão por tamanho de alta performance, TSKgel 3000SW-XL, coluna 300*7,8 mm; faixa de peso molecular 10-300 kDa, 100mM tampão de fosfato pH 7 e pH 5,96). Todos os fluxos foram a 1 ml/min (exceto por injeção de amostra na coluna Q-Sepharose, que foi a 5 ml/min). A detecção das proteínas eluídas foi feita a 280 nm. A concentração da asparaginase de tipo selvagem de Aspergillus niger eluída foi calculada a partir da extinção a 280 nm (A280) com o uiso de um coeficiente de extinção molar de 10.240 M-1.cm-1 (A2801cm,1mg/ml= 0,28, em que

A2801cm,1mg/ml é a extinção a 280 nm medida com um comprimento de 1 cm e na concentração de proteína pura de 1mg/ml). A medição de A280 foi realizada em um espectrofotômetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, The Netherlands). Para asparaginases que correspondem a ASN15 abd ASN 16 o mesmo coeficiente de extinção que aquele da asparaginase de tipo selvagem de Aspergillus niger foi usado. No caso de impurezas que absorvem a 280nm a concentração da asparaginase foi corrigida com base no cromatograma HP-SEC por multiplicação de A280 medido da amostra de asparaginase pela proporção da área sob o pico de asparaginase e a área total dos picos que absorvem a 280 nm. Quando os picos de asparaginase não foram claramente separados de outros picos as alturas dos picos em vez das áreas dos picos foram tomadas.

Para asparaginases que correspondem a ASN 01 a ASN14 o conteúdo de asparaginase (determinado em mg proteína/ml) pode ser determinado por eletroforese de gel PAA-SDS com o uso de géis de cavidade NuPAGE® Novex 4-12 % Bis-Tris 12 (Invitrogen, NP0322BOX). 1 μl de sobrenadante de cultura foi incubado com 1 μl 10 x Agente de redução de amostra NuPAGE® (Invitrogen, NP0004), 2,5 μl 4 x tampão de amostra NuPAGE LDS (Invitrogen, NP0007) e 5,5 μl água milliQ por 10 minutos a 70°C. A amostra reduzida resultante foi carregada no gel. O padrao pré-corado SeeBlue® Plus2 (Invitrogen, LC5925) foi usado como marcador de tamanho. Além disso, 0,5 μg de BSA (Sigma A9418) foi carregado como calibrador para a quantidade de proteína. Os géis foram passados em tampão de passagem NuPAGE® MES SDS (Invitrogen, NP0002), contendo Antioxidante NuPAGE® (Invitrogen, NP0005) por 35 minutos a 200 V. Após eletroforese, os géis foram fixados por 2 x 30 minutos em solução Fix (7 % HAc (v/v) e 10% etanol (v/v)), corados de um dia para o outro com corante de gel de proteína SYPRO Ruby (Invitrogen S12000) e descorados em solução Fix por 2 x 30 minutos. Subsequentemente, os géis foram lavados com água desmineralizada e submetidos ao scanner Typhoon 9200 (GE Healthcare). O volume do pico foi calculado com o uso de programa Image Quant TLv2003.02 e as concentrações da proteína foram calculadas com base na banda de proteína BSA.

Exemplo 2 Performance de uma asparaginase variantes de acordo com a invenção

Uma biblioteca aleatória de mutantes de asparaginase de A.niger (em que polipeptídeo parente era aquele de acordo com Id. de Seq. N°: 3) foi rastreada para mutantes com um perfil modificado de atividade de pH. Para encontrar mutantes com melhor atividade em pH mais alcalino, a atividade dos mutantes de asparaginase foi determinada em pH=5 e pH=7. Subseqüentemente a proporção entre a atividade em pH=7 e a atividade em pH=5 foi determinada. Essa proporção é mostrada na tabela 1. Uma maior proporção indica uma mudnca do perfil de atividade de pH para o pH=7.

Tabela 1: Terceira coluna: Proporção entre atividade em pH=7 e atividade em pH=5 para mutantes selecionados. Tipo selvagem (WT) é asparaginase de A.niger (WO2004/030468). Quarta coluna: A mudança do pH do limbo alcalino do perfil de atividade de pH representada pelo pH em que o mutante ainda exibe 50% de sua atividade catalítica máxima. Os perfis de atividade de pH foram determinados a 37°C com o uso de sobrenadantes livres de células. A atividade foi medida na faixa de pH=4 a pH=8, com o uso de um sistema de tampão de fosfato/ácido cítrico.

Mutantes com uma maior proporção que a de asparaginase de tipo selvagem de A. niger foram também testados para estabelecer em qual extensão o perfil de atividade de pH foi trocado para o pH alcalino. Para esses mutantes um perfil complete de atividade de pH foi medido e foi mostrado que em particular o limbo alcalino do perfil de atividade de pH mudou para um pH maior. O pH em que o limbo alcalino do perfil de atividade de pH mostra 50% da atividade máxima de um mutante em seu pH ótimo é tomado como um indicador para uma troca do limbo alcalino do perfil de atividade de pH comparado ao tipo selvagem (tabela 1). Uma mudança para um pH maior indica uma maior atividade sob condições mais alcalinas. Tais mutantes são benéficos em particular em aplicações que requerem condição mais alcalina.

Quando da seleção por mutantes com uma menor proporção entre atividade em pH=7 e atividade em pH=5 é observado que o limbo alcalino do perfil de atividade de pH troca para um pH menor (tabela 2).

Tabela 2: Proporção entre atividade em pH=7 e atividade em pH=5 para mutantes selecionados. Tipo selvagem (WT) é asparaginase de A. niger (WO2004/030468). Os perfis de atividade de pH foram determinados a 37°C com o uso de 5 sobrenadantes livres de células. A atividade foi medida na faixa de pH=4 a pH=8, com o uso de um sistema de tampão de fosfato/ácido cítrico.

A dependência da atividade de pH e o pH ótimo

A dependência da atividade de asparaginase para os mutantes foi determinada em 50mM tampão fosfato/citrato na faixa de pH de pH=4 ao pH=8 com o uso de sobrenadantes livres de células. O pH em que a mais alta atividade foi observada para um mutante é chamado o pH ótimo para o referido mutante. Nas tabelas 3 e 4 a atividade máxima observada para um mutante é ajustada a 100% e as atividades do referido mutante em outros valores de pH são mostradas como percentagem da atividade máxima observada para o referido mutante. Na tabela 3 o perfil de atividade de pH foi determinado para a faixa de pH de pH=4 a pH=8 com o uso de sistema de tampão de fosfato/ácido cítrico. Na tabela 4 o perfil de atividade de pH foi determinado para a faixa de pH de pH=4 a pH=9 com o uso de sistema de tampão de fosfato/ácido cítrico.

Tabela 3: A dependência de pH da atividade de asparaginase para os mutantes comparada à asparaginase de A.niger de tipo selvagem (wt) (WO2004/030468). A mais alta atividade que foi observada para cada asparaginase foi ajustada a 100%. A atividade foi determinada com o uso de sobrenadante livre de células a 37°C no sistema de tampão de fosfato/ácido cítrico.

Tabela 4: A dependência de pH da atividade de asparaginase para os mutantes comparada à asparaginase de A.niger de tipo selvagem (wt) (WO2004/030468). A mais alta atividade que foi observada para cada asparaginase foi ajustada a 100%. A atividade foi determinada com o uso de sobrenadante livre de células a 37°C usando sistema de tampão de 10 pirofosfato/ácido cítrico.

Sem considerar uma mudança do limbo alcalino do perfil de atividade de pH há também uma mudança do pH ótimo em direção a um pH maior. Ambos mutantes que contêm a mutação D63G mostram uma mudança do pH ótimo para pH=7. Os mutantes 15 D63G contêm mutações adicionais. Entretanto, essas mutações

adicionais são diferentes em cada mutante D63G, embora os perfis de atividade de pH sejam quase idênticos. Portanto, D63G parece causar a mudança observada do perfil de atividade de pH. O pH ótimo do mutante D140N, o mutante que contém A170T, e do mutante que contém a mutação S66P é modificado para pH=6.

Os mutantes restantes exibem um pH ótimo mais explícito em pH=5 comparados ao tipo selvagem. As tabelas 3 e 4 mostram claramente a mudança do limbo alcalino do perfil de atividade de pH na direção de um maior pH resultando em um perfil de atividade de pH mais amplo com uma atividade relativa particular aumentada para a faixa de pH=6 a pH=8, embora ao mesmo tempo uma atividade substancial seja também mantida a=na região ácida pH=4 a pH=6.

Atividade específica como uma função de pH A atividade específica das variantes de asparaginase foi determinada em pH=4, pH=5, pH=6, pH=7, pH=8 a 37°C em 50mM tampão fosfato/citrato com o uso de sobrenadantes livres de células.

Tabela 5: A atividade específica (medida por divisão da atividade de uma amostra (em unidades/ml) por mg/ml de asparaginase presente na amostra) das variantes em relação à asparaginase de A.niger de tipo selvagem (WO2004/030468) nos valores indicados de pH com o uso de asparagina como um substrato. Para cada pH a atividade específica de tipo selvagem foi ajustada a 100% e a atividade dos mutantes calculada em relação à asparaginase de tipo selvagem. Quando a atividade dos mutantes estava abaixo de 100%, a atividade foi omitida da tabela. A atividade foi determinada em 37°C. a quantidade de proteína asparaginase nos sobrenadantes livres de células foi determinada por realização de experimentos de PAA-SDS eletroforese em gel e rastreamento dos géis como é descrito em materiais e métodos. Para T73K+S74A+A293S e T73K+S74A+A293S+E106P+G297S+T299S+Q319A+ M321T+ V324G a concentração da proteína asparaginase foi derivada de uma medida de A280 que aplica uma correção para quaisquer impurezas com base em HP-SEC cromatografia.

A tabela 5 mostra que a atividade específica dos mutantes em pH=6, pH=7 e pH=8 foi substancialmente melhorada comparada à asparaginase de tipo selvagem. Em particular mutantes T73K+S74A+A293S, T41I+S66P+V371M, S88P+I161L+R262C e F53Y+K119N são muito úteis porque eles mostram uma maior atividade por toda a faixa de pH de pH=4 a pH=8. O mutante T73K+S74A+A293S+E106P+G297S+T299S+Q319A+M321T+V324G é mais ativo na região de pH ácido pH=4 a pH=6.

Temperatura ótima

Para verificar a dependência da atividade sobre a temperatura, a atividade foi medida em diferentes temperaturas. Em um ensaio a reação da enzima foi interrompida depois de 10 minutos, em um segundo ensaio a reação foi interrompida depois de 30 minutos. A dosagem da enzima no ensaio de 30 minutos foi um teço da dosagem no ensaio de 10 minutos. Se as enzimas são estáveis sob as condições aplicadas a atividade observada deve ser similar. No caso de ocorrer inativação espera-se que a atividade diminua depois de tempo de ensaio mais longo. Os resultados são mostrados na tabela 6. 50°C 60°C 70°C

Tabela 6: dependência da atividade sobre a temperatura. O ensaio foi realizado em pH=5 em 50mM tampão fosfato/ácido cítrico. A dosagem da enzima no ensaio de 30 minutos foi um teço da dosagem no ensaio de 10 minutos. A mais alta atividade em 10 minutos de tempo de incubação foi ajustada a 100%.

A Tabela 6 indica que a estabilidade das variantes é muito similar à asparaginase de Aspergillus niger de tipo selvagem. Os mutantes não mostram redução na atividade depois de 30 minutos de incubação comparado a 10 minutos mesmo a 70°C, o que indica que os mutantes são estáveis pelo menos por 30 minutos a 70°C. De modo surpreendente, é observado que a temperatura ótima dos mutantes é trocada para uma temperatura maior. Para o tipo selvagem a temperatura ótima é a 50°C considerando as temperaturas que são testadas. Para os mutantes S16A+D63G+G132S, D63G+D111G+R122H e T41I+S66P+V371M ela trocou para 70°C. Tais propriedades são úteis em particular em aplicacões que necessitem de asparaginases que funcionem em temperaturas elevadas.

Claims (7)

1. Variante de um polipeptídeo que tem atividade de asparaginase, caracterizada pelo fato de que a variante possui uma sequência de aminoácidos que, quando alinhada com a sequência apresentada na Id. de Seq. N°: 3, compreende: (D63G+G132S), (D63V+T300I), (D63G+D111G+R122H), (S64P+I310V), (V77I+V123A+E314D), (D140N), (T41I+S66P+V371M), (A76T+A101V), (S88Y), (S88P+I161L+R262C), (D91E+A170T+R262H), (L90V+K119N+Y228H+R262C), (F53Y+K119N), (G195D+A293V), (T73K+S74A+A293S), ou (T73K+S74A+A293S+E106P+G297S+T299S+Q319A+M321T+V324G), as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3, em que o polipeptídeo parente tem a sequência estabelecida na Id. de Seq. N°: 3.

2. Sequência de ácido nucleico caracterizada por codificar a variante como definida na reivindicação 1.

3. Constructo de ácido nucleico caracterizado por compreender a sequência de ácido nucleico, como definida na reivindicação 2, operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão de uma asparaginase em um hospedeiro de expressão adequado.

4. Vetor de expressão recombinante caracterizado por compreender o constructo de ácido nucleico, como definido na reivindicação 3.

5. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender o vetor de expressão, como definido na reivindicação 4, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula fúngica.

6. Método de produção de uma variante asparaginase caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo da célula hospedeira, como definida na reivindicação 5, em um meio CSM compreendendo, por litro, 150 g de maltose*H2O, 60 g de Sytone (peptona), 1 g de NaH2PO4*H2O, 15 g MgSO4*7H2O, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon (antiespumante), 20 g MES, 1 g L-arginina em pH 6,2 a 34°C e 170 rpm durante 3 a 5 dias e recuperação da asparaginase por centrifugação.

7. Método de produção de uma variante de polipeptídeo de asparaginase, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a seleção de um polipeptídeo de asparaginase tendo a sequência apresentada na Id. de Seq. N°: 3; b) a substituição de aminoácido (D63G+G132S), (D63V+T300I), (D63G+D111G+R122H), (S64P+I310V), (V77I+V123A+E314D), (D140N), (T41I+S66P+V371M), (A76T+A101V), (S88Y), (S88P+I161L+R262C), (D91E+A170T+R262H), (L90V+K119N+Y228H+R262C), (F53Y+K119N), (G195D+A293V), (T73K+S74A+A293S), ou (T73K+S74A+A293S+E106P+G297S+T299S+Q319A+M321T+V324G) as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 3; c) preparação da variante que resulta das etapas a)- b); d) determinação da atividade específica em pelo menos um pH e/ou o pH ótimo da variante; e e) seleção de uma variante que tem uma atividade específica aumentada em pelo menos um pH em comparação ao polipeptídeo de asparaginase tendo a sequência apresentada na Id. de Seq. N°: 3 e/ou um pH ótimo aumentado em comparação ao polipeptídeo de asparaginase parente, assim produzindo uma variante de polipeptídeo de asparaginase.