BRPI0317298B1 - Methods for the preparation of polynucleotyde, vector and asparaginase, processed host cells, use of asparaginase and foodstuff process for production of food product, vetor heterólogo, methods for preparation of polynucleotyde, vector and asparaginase, processed host cells, use of asparaginase and food product - Google Patents

Abstract

"processo para produção de alimentos". processo para a produção de um produto alimentício envolvendo pelo menos uma etapa de aquecimento, compreendendo adicionar uma ou mais enzimas a uma forma intermediária do referido produto alimentício no referido processo de produção por meio do qual a enzima é adicionada antes da referida etapa de aquecimento em uma quantidade que seja eficaz na redução do nível de aminoácidos que está presente na referida forma intermediária do referido produto alimentício cujos aminoácidos estão envolvidos na formação da acrilamida durante a referida etapa de aquecimento. a invenção também se refere aos produtos alimentícios obtidos do processo da invenção.

Description

"PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE PRODUTO ALIMENTÍCIO, VETOR HETERÓLOGO, MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO, VETOR E ASPARAGINASE, CÉLULAS HOSPEDEIRAS TRANSFORMADAS, USO DE ASPARAGINASE E PRODUTO ALIMENTÍCIO" [001] A presente invenção se refere a um processo para a produção de um produto alimentício envolvendo pelo menos uma etapa de aquecimento e produtos alimentícios obtidos deste. Além disso, a presente invenção se refere a uma nova enzima adequada para o processo de acordo com a invenção e a sequências de polinucleotídeo recentemente identificadas compreendendo os genes que codificam a nova enzima.

[002] A acrilamida foi produzida comercialmente por um tempo prolongado para uma variedade de aplicações técnicas e, portanto, seu fundamento toxicológico é bem avaliado. A acrilamida é empregada para a produção de poliacrilamida, e o último composto é aplicado na produção de água potável, estabilização de solo, tratamento de água de refugo industrial, na remoção de óleo e aplicações em laboratório.

[003] A acrilamida é considerada como um provável carci-nogênico para animais e humanos. Em 1991 o Comitê Científico em Alimentos teve a acrilamida monomérica investigada em contato com materiais alimentícios e em sua avaliação foi concluído que a acrilamida é um carcinogênico genotóxico. Bergmark e outros, (Chem. Res. Toxicol. 10, 78-84 (1997)) demonstraram que a acrilamida é também um componente na fumaça do tabaco, e esta foi a primeira ligação entre a formação de acrilamida e o aquecimento do material biológico. Recentemente, a ocorrência de acrilamida em vários alimentos e alimentos preparados em forno foi publicada (Tareke e outros, Chem. Res. Toxicol., 13, 517-522. (2000)) e isto resultou em preocupação mundial. Outra pesquisa revelou que quantidades consideráveis de acrilamida são detectáveis em diversos alimentos comuns assados, fritos e preparados no forno e foi demonstrado que a ocorrência de acrilamida em alimentos foi o resultado do processo de assadura.

[004] O limite oficial na UK para contaminação de acrilamida nos produtos alimentícios é fixado em 10 ppb (10 mi-crogramas por quilograma) e os valores apresentados acima excederam abundantemente este valor para muitos produtos, especialmente cereais, produtos de pão e batatas fritas.

[005] A relação entre a dose administrada de acrilamida e a incidência de tumor foi observada em testes com animais, nos quais os ratos foram alimentados com acrilamida através de água potável e cujo destino foi acompanhado durante dois anos (Friedman, H.L. e outros), Fundam. Appl. Pharmacol. 85:154-168. M. (1986) e Johnson e outros. Toxicol. Appl. Pharmacol. 85:154-168 (1986)). O estudo da oncogenicidade e toxicidade crônica na acrilamida foi incorporado na água potável de ratos Fischer 344.

[006] Quando esses dados foram combinados com os resultados coletados em Tareke e outros, no qual a acrilamida ligada a hemoglobina (N-(2-carbamoiletil)valina), foi estudado como uma função de uma dieta contendo acrilaminda para ratos, foi calculado que a captação diária da acrilamida é 1,6 ug de acrilamida/ kg, correspondendo a um risco de câncer de 7*10-3 para humanos em exposição de longo prazo.

[007] Uma via para a formação de acrilamida a partir aminoácidos e açúcares redutores como um resultado da reação de Maillard, tem sido proposta por Mottram e outros, Nature 418:448 (2002). De acordo com esta hipótese, a acrilamida pode ser formada durante a reação de Maillard. Durante o cozimento e torrefação, a reação de Maillard é principalmente responsável pela cor, odor e paladar. A reação associada com o Maillard é a degradação Strecker de aminoácidos e uma via para acrilamida foi proposta. A formação de acrilamida tornou-se detectável quando a temperatura excedeu a 120oC, e a maior taxa de formação foi observada em cerca de 170oC. Quando a asparagina e glicose estavam presentes, os niveis maiores de acrilamida puderam ser observados, ao mesmo tempo em que a glutamina e o ácido aspártico somente resultaram e quantidades traços. O fato da acrilamida ser formada principalmente a partir de asparagina e glicose, pode explicar os niveis elevados de acrilamida em produtos a base de planta torrados ou cozidos no forno como tal. Várias matérias-primas vegetais são conhecidas por conterem niveis substanciais de asparagina. Nas batatas, a asparagina é o aminoá-cido livre dominante (940 mg/ kg, correspondendo com 40% do teor de aminoácido total) e na farinha de trigo a asparagina está presente em um nivel de cerca de 167 mg de asparagina/ kg de farinha, correspondendo com 14% dos agrupamentos de aminoácidos livres totais (Belltz e Grosch em Food Chemistry - Springer Nova York, 1999).

[008] Portanto, no interesse da saúde pública, há uma necessidade urgente de produtos alimentícios que tenham ní- veis substancialmente reduzidos de acrilamida ou, preferivelmente, que eles sejam evitados. No primeiro caso, as atividades de pesquisa foram iniciadas a fim de elucidar o mecanismo da formação de acrilamida em produtos alimentícios. Até agora, os resultados disto não têm ainda induzido a uma solução satisfatória do problema. Segundamente, as companhias de alimento estão investigando as possibilidades de evitar a formação de acrilamida reduzindo-se a temperatura dos processos de torrefação e cozimento no forno. Certamente, essas adaptações inerentemente resultarão em produtos alimentícios com propriedades de paladar alteradas (menos produtos de Maillard) e essas adaptações aumentarão o risco de uma contaminação microbiana acentuada tal como por Salmonella.

[009] A presente invenção fornece um processo para a produção de um produto alimentício envolvendo pelo menos uma etapa de aquecimento, compreendendo adicionar uma ou mais enzimas a uma forma intermediária do referido produto alimentício no referido processo de produção por meio do qual a enzima é adicionada antes da referida etapa de aquecimento em uma quantidade que seja eficaz na redução do nível de aminoácidos que estão presentes nas referidas formas intermediárias do referido produto alimentício cujos aminoácidos estão envolvidos na formação de acrilamida durante a referida etapa de aquecimento.

[0010] Uma forma intermediária do produto alimentício é definida aqui como qualquer forma que ocorra durante o processo de produção antes da obtenção da forma final do produ- to alimentício. A forma intermediária pode compreender os materiais brutos individuais empregados e/ou a mistura destes e/ou misturas com aditivos e/ou auxiliares de processamento, ou subsequentemente a forma processada deste. Por exemplo, para o pão de produto alimentício, as formas intermediárias compreendem, por exemplo, trigo, farinha de trigo, a mistura inicial deste com outros ingredientes do pão tal como, por exemplo, água, sal, levedura e composições para aperfeiçoamento do pão,a massa misturada, a massa cortada, a massa deixada descansar e a massa parcialmente assada.

[0011] 0 produto alimentício pode ser feito de pelo menos uma matéria-prima que seja de origem vegetal, por exemplo, batata, tabaco, café, coco, arroz, cereal, por exemplo, trigo, centeio, milho, cevada, groat, trigo-sarraceno e aveia. O trigo é aqui e posteriormente pretendido abranger todas as espécies conhecidas do gênero Triticum, por exemplo, aestivum, durum e/ou spelta. Além disso, os produtos alimentícios feitos de mais do que uma matéria-prima, estão incluídos no escopo desta invenção, por exemplo os produtos alimentícios compreendendo igualmente trigo (farinha) e batata .

[0012] Os exemplos de produtos alimentícios nos quais o processo de acordo com a invenção pode ser adequado são, qualquer produto com base em farinha - por exemplo, pão, pastel, bolo, biscoito, roscas, bolo doce holandês, cookies, pão de mel, bolo de gengibre e pão frito - e qualquer produto com base em batata - por exemplo, batata frita, fritas, batata chips, croquetes.

[0013] Os materiais brutos como citados acima são conhecidos por conter quantidades substanciais de aminoácido que estão envolvidas na formação de acrilamida durante a etapa de aquecimento do processo de produção. Alternativamente, esses aminoácidos podem se originar de outras fontes senão dos materiais brutos, por exemplo, de hidrolisados de proteína, tal como extratos de levedura, hidrolisado de soja, hi-drolisado de caseína e outros, que são empregados como um aditivo no processo de produção de alimentos. Um processo de produção preferido é a assadura do pão e outros produtos assados de farinha de trigo e/ou farinhas de outras origens de cereais. Outro processo de produção preferido é a fritu-ra profunda de batatas chips de fatias de batatas.

[0014] As etapas de aquecimento preferidas são aquelas nas quais pelo menos uma parte do produto alimentício intermediário, por exemplo, a superfície do produto alimentício, é exposta a temperaturas nas quais a formação da acrilamida é promovida, por exemplo, temperaturas até HOoC ou mais elevadas, 120oC ou mais elevadas. A etapa de aquecimento no processo de acordo com a invenção pode ser realizada em fornos, por exemplo, em uma temperatura entre 180-220oC, tal como para a assadura de pão e outros produtos de padaria, ou em óleo tal como fritura de batatas chips, por exemplo, em 160-190oC.

[0015] As enzimas empregadas no processo da invenção são preferivelmente enzimas que modificam as cadeias laterais de aminoácidos que estão envolvidas na formação de acrilamida durante a etapa de aquecimento do processo de produção e por meio do qual os produtos de degradação dos referidos aminoá-cidos não são, ou pelo menos em uma menor extensão, dão origem à formação de acrilamida em comparação com a forma não degradada do aminoácido. Preferivelmente a enzima está modificando a cadeia lateral de pelo menos um dos aminoácidos asparagina, glutamina, cisteina, metionina, prolina, serina, fenilalanina, tirosina e/ou triptofano. A enzima pode ser adicionada como uma preparação de enzima ou produzida in situ por um microorganismo capaz de produzir a referida enzima. Preferivelmente a preparação de enzima é derivada de um microorganismo e obtida por processos de fermentação conhecidos na técnica. 0 micro-organismo pode ser uma bactéria, um fungo ou uma levedura. Em uma modalidade preferida da invenção, o processo compreende a adição de asparaginase (EC 3.5.1.1) ou glutaminase (EC 3.5.1.2).

[0016JA asparaginase pode ser obtida de várias fontes, tal como, por exemplo, de plantas, animais e microorganismos, tal como, por exemplo, espécies de Escherichia, Erwi-nia, Streptomyces, Pseudomonas, Aspergillus e Baccilus. Um exemplo de uma cepa de Escherichia adequada é Escherichia coli. Um exemplo de uma cepa de Erwinia adequada é Erwinia Chryssanthemi. Os exemplos de cepas de Streptomyces adequadas são Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus. Os exemplos de cepas de Aspergillus adequadas são Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans ou Aspergillus niger. Os exemplos de cepas de Bacillus adequadas são Bacillus al-kalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Ba- cillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megateruim, Bacillus stearothemophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis. Um exemplo de métodos adequados para a produção de asparaginase de cepas de Baccilus, Streptomyces, Escherichia ou Pseudomonas é descrito em WO 03/083043. WO 03/083043, entretanto não divulga o uso de asparaginase para diminuir a quantidade de acrilamida nos alimentos como descrito na presente invenção.

[ 0017]Preferivelmente, uso é feito de organismos de grau alimentício, por exemplo, Aspergillus niger ou Bacillus subtilis.

[0018] Em um segundo aspecto, a invenção fornece sequências de polinucleotídeo recentemente identificadas compreendendo genes que codificam uma nova asparaginase que, por exemplo, pode ser produzida de Aspergillus niger. A nova asparaginase pode ser empregada no processo para a produção de alimentos da presente invenção, por exemplo, na produção de um produto assado de uma massa.

Polinucleotídeos [0019] A invenção também fornecer novos polinucelotídeos codificando novas enzimas asparaginase. A presente invenção fornece polinucleotídeos codificando uma asparaginase, experimentalmente chamada ASPA01, tendo uma sequência de aminoá-cido de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou equivalentes funcionais desta. A sequência do gene codificando ASPA01 foi determinada por sequenciamento de um clone genômico obtido de Aspergillus niger. A invenção fornece sequências de polinucleotídeo compreendendo o gene codificando a asparaginase ASPA01 bem como sua sequência de codificação e sua sequência de cDNA completa. Consequentemente, a invenção se refere a um polinucleotideo isolado compreendendo a sequência de nu-cleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou equivalentes funcionais destas.

[0020] Mais particularmente, a invenção se refere a um polinucleotideo isolado hibridizável sob condições estrin-gentes, preferivelmente sob condições altamente estringen-tes, para um polinucleotideo de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Vantajosamente, tais polinucleotideos podem ser obtidos de fungo filamentoso, em particular de Aspergillus niger. Mais especificamente, a invenção se refere a um polinucleotideo isolado tendo uma sequência de nucleotí-deo de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0021] A invenção também se refere a um polinucleotideo isolado codificando pelo menos um dominio funcional de um polipeptideo de acordo com SEQ ID NO: 3 ou equivalentes funcionais desta.

[0022] Como empregado aqui, os termos "gene" e "gene re-combinante" se refere a moléculas de ácido nucléico que podem ser isoladas de DNA cromossômico, que inclui um quadro aberto de leitura codificando uma proteína, por exemplo, uma asparaginase de A. niger. Um gene pode incluir sequências de codificação, sequências de não codificantes, íntrons e sequências reguladoras. Entretanto, um gene se refere a uma molécula de ácido nucléico isolada como definido aqui.

[0023] Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, tal como uma molécula de acido nucléico tendo a sequên- cia de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional desta, pode ser isolada empregando técnicas de biologia molecular padrão e a informação da sequência fornecida aqui. Por exemplo, empregando toda ou uma porção da sequência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 como uma sonda de hibridização, as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção podem ser isoladas empregando técnicas de clonagem e hibridização padrão (por exemplo, como descrito em Sambro-ok, J., Fritsh, E.F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HArbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[0024] Entretanto, uma molécula de ácido nucléico abrangendo toda ou uma porção da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2, pode ser isolada pela reação em cadeia de polimerase (PCR) empregando iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos projetados com base na informação da sequência contida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0025] Um ácido nucléico da invenção pode ser amplificado empregando cDNA, mRNA ou alternativamente, DNA genômico, como um molde e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com as técnicas de amplificação de PCR padrão. O ácido nucléico desse modo amplificado pode ser clonado em um vetor apropriado e caracterizado por análise de sequência de DNA.

[0026] Além disso, os oligonucleotídeos correspondentes ou hibridizáveis nas sequências de nucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados por técnicas de síntese padrão, por exemplo, empregando um sintetizador de DNA automatizado .

[0027] Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2. A sequência de SEQ ID NO:2 corresponde à região de codificação do DNAc de ASPA01 de A.niger. Este DNAc compreende a sequências codificando o peptídeo de ASPA01 de A.niger de acordo com a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção compreende uma molécula de ácido nucléico que é complementar a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional dessas sequências de nucleotídeo.

[0028] Uma molécula de ácido nucléico que é complementar a outra sequência de nucleotídeo é uma que seja suficientemente complementar à outra sequência de nucleotídeo tal que possa hibridizar na outra sequência de nucleotídeo por meio da qual forma um dúplex estável.

[0029] Um aspecto da invenção pertence às moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam um polipeptídeo da invenção ou um equivalente funcional deste tal como um domínio ou fragmento biologicamente ativo, bem como moléculas de ácido nucléico suficientes para uso como sondas de hibridi-zação para identificar as moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção e fragmentos de tais moléculas de ácido nucléico adequadas para uso como iniciado-res de PCR para a amplificação ou mutação de moléculas de ácido nucléico.

[0030] Um "polinucleotídeo isolado" ou "ácido nucléico isolado" é um DNA ou RNA que não é imediatamente contíguo com ambas das sequências de codificação com as quais ele é imediatamente contíguo (um na terminação 5' e um na terminação 3') no genoma de ocorrência natural do organismo do qual é derivado. Desse modo, em uma modalidade, um ácido nucléico isolado inclui alguns ou todos das sequências de não co-dificantes 5' (por exemplo, promotor) que são imediatamente contíguas à sequência de codificação. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um vírus ou plasmídeo autonomamente repli-cante, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um fragmento de cDNA ou de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Ele também inclui um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido codificando um polipeptídeo adicional que é substancialmente livre de material celular, material viral, ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante) , ou precursores químicos ou outros produtos químicos (quando quimicamente sintetizados). Entretanto, um "fragmento de ácido nucléico isolado" é um fragmento de ácido nucléico que não é de ocorrência natural como um fragmento e não seria encontrado no estado natural.

[0031] Como empregado aqui, os termos "polinucleotídeo" ou "molécula de ácido nucléico" são pretendidos incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNAc ou DNA genômico) e molécu- Ias de RNA (por exemplo, RNAm) e análogos do DNA e RNA gerados empregando análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucléico pode ser DNA de fita simples ou fita dupla, porém preferivelmente é DNA de fita dupla. 0 ácido nucléico pode ser sintetizado empregando análogos de oligonucleótideos ou derivados (por exemplo, nucleotideos de inosina ou fosforo-tiotato). Tais oligonucleotideos podem ser empregados, por exemplo, para preparar os ácidos nucléicos que tenham capacidades de pareamento de bases alteradas ou resistência aumentada a nuclease.

[0032] Outra modalidade da invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que é anti-sentido a uma molécula de ácido nucléico de ASPA01, por exemplo, a fita de codifi-cante de uma molécula de ácido nucléico de ASPA01. Também incluídos no escopo da invenção estão as fitas complementares das moléculas de ácido nucléico descritas aqui.

Erros no Sequenciamento [0033] A informação da sequência quando fornecida aqui não deve ser tão rigorosamente construída uma vez que requer a inclusão de bases erroneamente identificadas. As sequências específicas divulgadas aqui podem ser facilmente empregadas para isolar o gene completo de fungos filamentosos, em particular, A. niger, que sucessivamente pode facilmente ser submetido à outra análise de sequência por meio do que identificando os erros do sequenciamento.

[0034] A menos que de outro modo indicado, todas as sequências de nucleotídeo determinadas por sequenciamento de uma molécula de DNA aqui foram determinadas empregando um sequenciador de DNA automatizado e todas as sequências de aminoácido de polipeptideos codificadas por moléculas de DNA determinadas aqui foram preditas por tradução de uma sequência de DNA como determinado acima. Portanto, como é conhecido na técnica para qualquer sequência de DNA determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência de nu-cleotídeo determinada aqui pode conter alguns erros. As sequências de nucleotideo determinadas por automação são tipicamente pelo menos cerca de 90% idênticas, mais tipicamente pelo menos 95% a pelo menos cerca de 99,9% idênticas à sequência de nucleotideo real da molécula de DNA sequenciada. A sequência real pode ser mais precisamente determinada por outras abordagens incluindo métodos de sequenciamento de DNA manual bem conhecidos na técnica. Como é também conhecido na técnica, uma deleção ou inserção única em uma determinada sequência de nucleotideo, comparado com a sequência real causará uma mudança de quadro na tradução da sequência de nucleotideo tal que a sequência de aminoácido predita codificada por uma determinada sequência de nucleotideo será completamente diferente da sequência de aminoácido realmente codificada pela molécula de DNA sequenciada, iniciando-se no ponto de uma tal inserção ou deleção.

[0035] A pessoa versada na técnica é capaz de identificar tais bases erroneamente identificadas e sabe como corrigir tais erros.

Iniciadores, Sondas e Fragmentos de Ácido Nucléico [0036] Uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção pode compreender somente uma porção ou um fragmento da sequência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2, por exemplo, um fragmento que pode ser empregado como um sonda ou iniciador ou um fragmento codificando uma porção de uma proteína de ASPA01. A sequência de nucle-otídeo determinada da clonagem do cDNA e gene de ASPA01 permite a geração de sondas e iniciadores designados para o uso na identificação e/ou clonagem de outros membros da família de ASPA01, bem como homólogos de ASPA01 de outras espécies. A sonda/ iniciador tipicamente compreende oligonucleotídeos substancialmente purificados que tipicamente compreendem uma região de sequência de nucleotídeo que hibridiza preferivelmente sob condições altamente estringentes a pelo menos cerca de 12 ou 15, preferivelmente cerca de 18 ou 20, preferivelmente cerca de 22 ou 25, mais preferivelmente cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2 ou de um equivalente funcional deste.

[0037]As sondas com base nas sequências de nucleotídeo ASPA01 podem ser empregadas para detectar as transcrições ou sequências de ASPA01 genômicas codificando as proteínas iguais ou homólogas, por exemplo, em outros organismos. Nas modalidades preferidas, a sonda ainda compreende um grupo de rótulo ligado a ela, por exemplo, o grupo de rótulo pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Tais sondas podem também ser empregadas como parte de um kit de teste de diagnóstico para a identificação de células que expressam uma proteína de ASPA01.

Identidade e Homologia [0038] Os termos "homologia" ou "percentual de identidade" são empregados alternadamente aqui. Para o propósito desta invenção, é definido aqui que a fim de determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácido ou de duas sequências de ácido nucléico, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideal (por exemplo, os intervalos podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácido ou de ácido nucléico para alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucléico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de nucleotídeo ou posições de aminoácidos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas dividido pelas sequências (isto é, % de identidade = número de posições idênticas/ número total de posições (isto é, posições sobrepostas) x 100) . Preferivelmente, as duas sequências estão no mesmo comprimento.

[0039] A pessoa versada estará ciente do fato que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para determinar a homologia entre duas sequências. Por exemplo, uma comparação de sequências e determinação do percentual de identidade entre duas sequências pode ser concluída empregando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoá-cido é determinado empregando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol, (48): 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com) empregando ou uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A pessoa versada avaliará que todos esses parâmetros diferentes produzirão resultados levemente diferentes porém que o percentual total de identidade de duas sequências não é significantemente alterado quando empregando algoritmos diferentes.

[0040] Em ainda outra modalidade, o percentual de identidade entre duas sequências de nucleotídeo é determinado empregando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), empregando ou uma matriz NWS-gapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em outra modalidade, o percentual de identidade de duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido é determinado empregando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) (disponível em http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) empregando uma tabela de resíduo de peso PAM12 0, uma penalidade de tamanho de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4.

[0041] As sequências de ácido nucléico e proteína da presente invenção podem ainda ser empregadas como uma "sequência de indagação" para realizar uma pesquisa contra as bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas empregando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403 - 10. As pesquisas de nucleotídeo de BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, score-100, comprimento de palavra= 12 para obter sequências de nucleotídeo homólogas as moléculas de ácido nucléico de ASPA01 da invenção. As pesquisas de proteína de BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, score= 50, comprimento de palavra= 3 para obter sequências de aminoácido homólogas as moléculas da proteína de ASPA01 da invenção. Para obter as linhagens em intervalos para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser empregados. Observe http://www.ncbl.nlm.nih.gov.

Hibridização [0042]Como empregado aqui, o termo "hibridização" é pretendido descrever as condições para hibridização e lavagem sob as quais as sequências de nucleotídeo pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% a 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% homólogas a cada outra tipicamente permanecem hibridizadas a cada outra.

[0043] Um exemplo não limitante preferido de tais condições de hibridização são a hibridização em 6 X de cloreto de sódio/ citrato de sódio (SSC) em cerca de 45oC, seguido por uma ou mais lavagens em 1 X de SSC, 0,1% de SDS em 50oC, preferivelmente em 55oC, preferivelmente em 60oC e ainda mais preferivelmente em 65oC.

[0044] As condições altamente estringentes incluem, por exemplo, hibridização em 68oC em 5 x de SSC/ 5 x de solução de Denhardt/ 1,0% de SDS e lavagem em 0,2 x de SSC/ 0,1% de SDS em temperatura ambiente. Alternativamente, a lavagem pode ser realizada em 42oC.

[0045] O técnico versado saberá quais condições aplicar para condições de hibridização estringentes e altamente estringentes . Orientação adicional com respeito a tais condições está facilmente disponível na técnica, por exemplo, em Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel e outros (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

[0046] Certamente, um polinucleotídeo que hibridiza somente para uma sequência poli A (tal como o trato poli(A) de terminação 3' de mRNAs), ou para um estiramento complementar de T (ou U) residir, não seria incluído em um polinucleotídeo da invenção empregado para especificamente hibridizar para uma porção de um ácido nucléico da invenção, uma vez que um tal polinucleotídeo hibridizaria para qualquer molécula de ácido nucléico contendo um estiramento poli (A) ou o complemento deste (por exemplo, praticamente qualquer clone de cDNA de fita dupla).

Obtenção de DNA de Comprimento Total de Outros Organismos [0047] Em uma abordagem típica, as bibliotecas de DNAc construídas de outros organismos, por exemplo, fungos fila-mentosos, em particular das espécies Aspergillus, podem ser avaliadas.

[0048] Por exemplo, as cepas de Aspergillus podem ser avaliadas por polinucleotídeos de ASPA01 homólogos por análise Northern blot. Sob detecção de transcrições homólogas aos polinucleotídeos de acordo com a invenção, as bibliotecas de DNAc podem ser construídas de RNA isolado da cepa apropriada, utilizando técnicas padrão bem conhecidas por aqueles de experiência na técnica. Alternativamente, uma biblioteca de DNA genômico total pode ser avaliada empregando uma sonda hibridizável para um polinucleotídeo de ASPA01 de acordo com a invenção.

[0049] As sequências de gene homólogo podem ser isoladas, por exemplo, realizando-se PCR empregando dois agrupamentos de iniciadores de polinucleotídeos degenerados designados com base nas sequências de nucleotídeo como ensinado aqui.

[0050] O modelo para a reação pode ser o DNAc obtido por transcrição reversa de mRNA preparado de cepas conhecidas ou suspeitas por expressar um polinucleotídeo de acordo com a invenção. O produto de PCR pode ser subclonado e sequencia-do para garantir que as sequências amplificadas representem as sequências de uma nova sequência de ácido nucléico de ASPA01, ou um equivalente funcional deste.

[0051] O fragmento de PCR pode então ser empregado para isolar um clone de DNAc de comprimento total por uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, o fragmento amplificado pode ser marcado e empregado para avaliar uma biblioteca de cDNA de cosmideo ou bacteriófago. Alternativamente, o fragmento marcado pode ser empregado para avaliar uma biblioteca genômica.

[0052] A tecnologia de PCR também pode ser empregada para isolar as sequências de DNAc de comprimento total de outros organismos. Por exemplo, o RNA pode ser isolado, seguindo o procedimento padrão, de uma fonte de tecido ou celular apropriada. Uma reação de transcrição reversa pode ser realizada no RNA empregando um iniciador de oligonucleo-tídeo especifico para a maioria da terminação 5' do fragmento amplificado para o inicio da primeira síntese de fita.

[0053] O híbrido de RNA/ DNA resultante pode então ser "caudado" (por exemplo, com guaninas) empregando uma reação de transferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido com RNase H, e uma segunda síntese de fita pode então ser iniciada (por exemplo, com um iniciador poli-C). Desse modo, as sequências de DNAc a montante do fragmento amplificado podem facilmente ser isoladas. Para uma revisão das estratégias de clonagem úteis, observe, por exemplo, Sambrook e outros, supra; e Ausubel e outros, supra.

[0054] Se ou não um fragmento de DNA homólogo codifica uma proteína de ASPA01 funcional, pode facilmente ser testado por métodos conhecidos na técnica.

Vetores [0055]Outro aspecto da invenção pertence a vetores, preferivelmente vetores de expressão, contendo um ácido nu-cléico codificando uma proteína de ASPA01 ou um equivalente funcional deste. Como empregado aqui, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ele tenha sido ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular no qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor vi-ral, onde os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira sob introdução na célula hospedeira, e por meio da qual são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Entretanto, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes para que eles sejam operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombi-nante estão frequentemente na forma de plasmídeo. Os termos "plasmídeo" e "vetor" podem ser empregados alternadamente aqui se bem que o plasmídeo é a forma mais comumente empregada de vetor. Entretanto, a invenção é pretendida incluir tais outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus associados com o adenovírus), que são úteis para funções equivalentes.

[0056]Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem empregadas para a expressão, que está operativamente ligada a sequência de ácido nucléico a ser expressada. Em um vetor de expressão recombinante, "operativamente ligado" é pretendido significar que a sequência de nucleotídeo de interesse está ligada à sequência (s) reguladora(s) de um modo que considere a expressão da sequência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/ tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "sequência reguladora" é pretendido incluir os promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinal de poliadenilação). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . As sequências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão da sequência de nucleotídeo somente em uma certa célula hospedeira (por exemplo, sequência reguladora específica de tecido). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o propósito do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteína desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras por meio das quais produzem proteínas ou peptídeos, codificados por ácidos nucléicos como descrito aqui (por exemplo, proteínas de ASPA01, formas mutantes de proteínas de ASPA01, fragmentos, variantes ou equivalentes funcionais destas, etc).

[0057] Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser designados para a expressão das proteínas de ASPA01 em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, as proteínas de ASPA01 podem ser expressadas em células bacterianas tal como E. coli, células de insetos (empregando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura ou células de mamíferos. As células hospedeiras adequadas são discutidas ainda em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, empregando sequências reguladoras promotoras T7 e polimerase T7 .

[0058] Os vetores de expressão úteis na presente invenção incluem, vetores cromossômicos, epissômicos e derivados de vírus, vetores derivados de plasmídeo bacteriano, bacte-riófago, epissoma de levedura, elementos cromossômicos de levedura, vírus tal como baculovírus, vírus de papova, vírus da vaccínia, adenovírus, vírus do epitelioma contagioso, vírus da pseudo-raiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações destes, tal como aqueles derivados de elementos genéticos de bacteriófagos e plasmídeo, tal como cosmídeos e fagomídeos.

[0059] 0 inserto de DNA deve ser operativamente ligado a um promotor apropriado, tal como o promotor PL de fago lamb-da, os promotores tac, trp e lac de E. coli, os promotores tardios e precoces de SV40 e promotores de LTRs retrovirais, para mencionar alguns. Outros promotores adequados serão conhecidos por pessoas versadas na técnica. Em uma modalidade específica, os promotores são preferidos os quais sejam capazes de dirigir um nível elevado de expressão de asparaginases em fungos filamentoso. Tais promotores são conhecidos na técnica. As construções de expressão podem conter sítios para a iniciação, terminação da transcrição, e, na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossoma para tradução. A porção de codificação das transcrições maduras expressadas pelas construções incluirá um AUG de iniciação de tradução no início e um códon de terminação apropriadamente posicionado no final do polipeptídeo a ser traduzido.

[0060] O DNA do vetor pode ser introduzido nas células procarióticas e eucarióticas através de técnicas de transformação e transfecção convencionais. Como empregado aqui, os termos "transformação" e "transfecção" são pretendidos referir-se a uma variedade de técnicas reconhecidas na técnica para introduzir o ácido nucléico estrangeiro (por exemplo, DNA) na célula hospedeira, incluindo co-precipitação com cloreto de cálcio ou fosfato de cálcio, transdução, infecção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção mediada por lipideo catiônico ou eletroporação. Os métodos adequados para a transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis, e outros Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais de laboratório .

[0061]Para transfecção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção empregada, somente uma pequena fração de células pode integrar o DNA estrangeiro em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência às drogas, tal como G418, higromicina e metotrexato. O ácido nucléico codificando um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no mesmo vetor como aquele codificando uma proteína de ASPA01 ou pode ser introduzido em um vetor separado. As células estavelmente transfec-tadas com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas por seleção com droga (por exemplo, as células que têm incorporado o gene marcador selecionável sobreviverão, ao mesmo tempo em que as outras células morrerão).

[0062] A expressão das proteínas em procariotos é frequentemente realizada em E. coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de proteínas.

[0063] Como indicado, os vetores de expressão preferivelmente conterão marcadores selecionáveis. Tais marcadores incluem diidrofolato redutase ou resistência a neomicina para cultura de células eucarióticas e resistência à tetraci-clina ou ampicilina para cultura de E. coli e outras bactérias . Os exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem células bacterianas, tal como E. coli, Estrepto-mices e Salmonella typhimurium; células fúngicas, tal como levedura; células de insetos tal como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais tal como CHO, COS e melanoma de Bowes; e células de plantas. As condições e meios de cultura apropriados para as células hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica.

[0064] Entre os vetores preferidos para uso nas bactérias estão pQE70, pQE60 e PQE-9, disponíveis por Qiagen; vetores pBS, vetores Phagescript, vetores Bluescript, pNH8A, pNHl6A, pNHl8A, pNH46A, disponível por Stratagene; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, disponível por Pharmacia. Entre os vetores eucarióticos preferidos estão PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZTl e pSG disponível de Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponível por Pharmacia. Outros vetores adequados serão facilmente evidentes aos técnicos versados.

[0065] Entre os promotores bacterianos conhecidos para uso na presente invenção incluem os promotores lacl e lacZ de E. coli, os promotores T3 e T7, o promotor gpt, os promotores PL, PR lambda e o promotor trp, o promotor de timidina cinase de HSV, os promotores SV40 precoces e tardios, os promotores de LTRs retrovirais, tal como aqueles do virus de sarcoma Rous ("RSV"), e promotores de metalotioneina, tal como o promotor de metalotioneina-1 de camundongo.

[0066] A transcrição do DNA codificando os polipeptideos da presente invenção por eucariotos mais elevados pode ser aumentada inserindo-se uma sequência intensificadora no vetor. Os realçadores são elementos cis-atuantes de DNA, frequentemente de cerca de 10 a 300 bp que atuam para aumentar a atividade transcricional de um promotor em um determinado tipo de célula. Os exemplos de realçadores incluem o real-çador SV40, que está localizado no último lado da origem de replicação em bp 100 a 270, o realçador promotor prematuro de citomegalovirus, o realçador de polioma no último lado da origem de replicação, e realçadores de adenovirus.

[0067] Para secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplásmico ou no ambiente extracelular, o sinal de secreção apropriado pode ser incorporado no polipeptídeo expressado. Os sinais podem ser endógenos para o polipeptídeo ou eles podem ser sinais hete-rólogos.

[0068] O polipeptídeo pode ser expressado de uma forma modificada e pode incluir não somente os sinais de secreção porém também as regiões funcionais heterólogas adicionais. Desse modo, por exemplo, uma região de aminoácidos adicio- nais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada o N-terminal do polipeptideo para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante o armazenamento e manipulação subsequente. Além disso, as porções de peptideo podem ser adicionadas ao polipeptideo para facilitar a purificação.

Polipeptideos de Acordo com a Invenção [0069] A invenção fornece um polipeptideo isolado tendo as sequências de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 3, uma sequência de aminoácido obtenível expressando-se o poli-nucleotídeo da SEQ ID NO: 1. Em um hospedeiro apropriado, bem como uma sequência de aminoácido obtenível expressando-se as sequências de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 em um hospedeiro apropriado. Além disso, um peptideo ou polipep-tídeo compreendendo um equivalente funcional do polipeptideo acima é compreendido na presente invenção. Os polipeptideos acima estão coletivamente compreendidos no termo "polipeptí-deo de acordo com a invenção".

[0070] 0 termo "peptideo" e "oligopeptídeo" são considerados sinônimos (como é comumente reconhecido) e cada termo pode ser empregado alternadamente quando o contexto requerer para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplados por ligações de peptidila. A palavra "polipeptideo" é empregada aqui para as cadeias contendo mais do que sete resíduos de aminoácido. Todas as sequências ou fórmulas de polipeptideo e oligopeptídeo aqui são escritas da esquerda para direita e na direção do amino terminal para carbóxi terminal. O código de uma letra de aminoácido empregado aqui é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[0071] Por proteínas ou polipeptídeo "isolado" é pretendido um polipeptídeo ou proteína, removido de seu ambiente nativo. Por exemplo, os polipeptídeos recombinantemente produzidos e proteínas expressadas em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção uma vez que são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada tal como, por exemplo, o método de purificação de etapa única divulgado em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

[0072] A asparaginase ASPA01 de acordo com a invenção pode ser recuperada e purificada de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração com ácido, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Mais preferivelmente, a croma-tografia líquida de alto desempenho ("HPLC") é empregada para purificação.

[0073] Os polipeptídeos da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células bacterianas, de levedura, de planta superior, de inseto e de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombi-nante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser gli-cosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem também incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos como um resultado dos processos mediados por hospedeiro.

Fragmentos de Proteína [0074] A invenção também caracteriza fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos de acordo com a invenção.

[0075] Os fragmentos biologicamente ativos de um poli-peptídeo da invenção incluem polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácido suficientemente idênticas ou derivados da sequência de aminoácido da proteína de ASPA01 (por exemplo, a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:3), que inclui menos aminoácidos do que a proteína de comprimento total, e exibe pelo menos uma atividade biológica da proteína de comprimento total correspondente. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade da proteína de ASPA01.

[0076] Um fragmento biologicamente ativo de uma proteína da invenção pode ser um polipeptídeo que apresenta, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Entretanto, outras porções biologicamente ativas, nas quais outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto a uma ou mais das atividades biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da invenção.

[0077] A invenção também caracteriza os fragmentos de ácido nucléico que codificam os fragmentos biologicamente ativos acima da proteína de ASPA01.

Equivalentes Funcionais [0078] Os termos "equivalentes funcionais" e "variantes funcionais" são empregados alternadamente aqui. Os equivalentes funcionais de DNA de ASPA01 são fragmentos de DNA isolados que codificam um polipeptídeo que exibe uma função particular da asparaginase de A. niger ASPA01, como definido aqui. Um equivalente funcional de um polipeptídeo de ASPA01 de acordo com a invenção é um polipeptídeo que exibe pelo menos uma função de uma asparaginase de A. niger como definido aqui. Os equivalentes funcionais portanto também abrangem fragmentos biologicamente ativos.

[0079] Os equivalentes funcionais de polipeptídeo ou proteína podem conter substituições somente conservativas de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou substituições, inserções ou deleções de aminoácido não essenciais. Consequentemente, um aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado na SEQ ID NO:3 sem substancialmente alterar a função biológica. Por exemplo, os resíduos de aminoácido que são conservados entre as proteínas de ASPA01 da presente invenção, são preditos por serem particularmente intratáveis para alteração. Além disso, os aminoácidos conservados entre as proteínas de ASPA01 de acordo com a presente invenção e outras asparaginases não são prováveis de serem tratáveis para alteração.

[0080] O termo "substituição conservativa" é pretendido significar aquela substituição na qual o residuo de aminoá-cido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Essas famílias são conhecidas na técnica e incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glici-na, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisterna) , cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metioni-na, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, triptofano, fenilalanina, histidina).

[0081]Os equivalentes de ácido nucléico funcionais podem tipicamente conter mutações silenciosas ou mutações que não alteram a função biológica do polipeptídeo codificado. Consequentemente, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico codificando as proteínas de ASPA01 que contém as alterações nos resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica particular. Tais proteínas de ASPA01 diferem nas sequências de aminoácido de SEQ ID NO:3, no entanto, mantém pelo menos uma atividade biológica. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucléico isolada compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína, onde a proteína compreende uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga de pelo menos cerca de 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólo- gas às sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:3.

[0082] Por exemplo, orientações com respeito a como preparar substituições de aminoácido fenotipicamente silenciosas são fornecidas em Bowie, J.U. e outros, Science 247:1306-1310 (1990) onde os autores indicam que existem duas abordagens principais para estudar a tolerância de uma sequência de aminoácido quanto à alteração. O primeiro método conta com o processo de evolução, no qual as mutações são aceitas ou rejeitadas por seleção natural. A segunda abordagem usa engenharia genética para introduzir as alterações de aminoácido nas posições especificas de um gene clo-nado e seleções e avaliações para identificar as sequências que mantêm a funcionalidade. Como os autores declaram, esses estudos têm revelado que as proteínas são surpreendentemente tolerantes a substituições de aminoácidos. Os autores ainda indicam que as alterações são prováveis de serem permissivas em uma certa posição da proteína. Por exemplo, os resíduos de aminoácido mais absorvidos requerem cadeias laterais não polares, ao mesmo tempo em que poucas características de cadeias laterais de superfície são geralmente conservadas. Outras tais substituições fenotipicamente silenciosas são descritas em Bowie e outros, supra, e as referências citadas aqui.

[0083] Uma molécula de ácido nucléico isolada codificando uma proteína de ASPA01 homóloga à proteína de acordo com a SEQ ID NO: 3, pode ser criada introduzindo-se uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções nas sequências de nucleotídeo de codificação de acordo com a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 tal que uma ou mais substituições de aminoácido, deleções ou inserções sejam introduzidas na proteína codificada. Tais mutações podem ser introduzidas por técnicas padrões, tal como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR.

[0084] 0 termo "equivalentes funcionais" também abrange ortólogos da proteína de ASPA01 de A. niger. Os ortólogos da proteína de ASPA01 de A. niger são proteínas que podem ser isoldadas de outras cepas ou espécies e possuem uma atividade biológica similar ou idêntica. Tais ortólogos podem facilmente ser identificados quando compreendendo uma sequência de aminoácido que é substancialmente homóloga a SEQ ID NO: 3.

[0085] Como definido aqui, o termo "substancialmente homólogo" se refere a uma primeira sequência de aminoácido ou nucleotídeo que contém uma quantidade mínima ou suficiente de nucleotídeos ou aminoácidos equivalentes (por exemplo, com cadeia lateral similar) ou idênticos para uma segunda sequência de aminoácido ou nucleotídeo tal que a primeira e segunda sequência de aminoácido ou nucleotídeo tenham um domínio comum. Por exemplo, as sequências de nucleotídeo ou aminoácido que contêm um domínio comum tendo cerca de 40%, preferivelmente 65%, mais preferivelmente 70%, ainda mais preferivelmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou mais são definidas aqui como suficientemente idênticas.

[0086] Além disso, os ácidos nucléicos codificando outros membros da família de ASPA01, que desse modo têm uma sequência de nucleotideo que difere da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO: 2, estão no escopo da invenção. Entretanto, os ácidos nucléicos codificando as proteínas de ASPA01 de espécies diferentes que desse modo têm uma sequência de nucleotideo que difere da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2 estão no escopo da invenção .

[0087] As moléculas de ácido nucléico correspondendo a variantes (por exemplo, variantes alélicos naturais) e homólogos do DNA de ASPA01 da invenção podem ser isoladas com base em sua homologia aos ácidos nucléicos de ASPA01 divulgados aqui empregando os DNAcs divulgados aqui ou um fragmento adequado deste, como uma sonda de hibridização de acordo com as técnicas de hibridização padrão preferivelmente sob condições de hibridização altamente estringentes.

[0088] Além dos variantes alélicos de ocorrência natural da sequência de ASPA01, a pessoa versada reconhecerá que as alterações podem ser introduzidas por mutação nas sequências de nucleotideo de SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO: 2 por meio da qual induzindo a alterações na sequência de aminoácido da proteína de ASPA01 sem substancialmente alterar a função da proteína de ASPA01.

[0089] Em outro aspecto da invenção, as proteínas de ASPA01 aperfeiçoadas são fornecidas. As proteínas de ASPA01 são proteínas onde pelo menos uma atividade biológica é aperfeiçoada. Tais proteínas podem ser obtidas aleatoriamente introduzindo mutações ao longo de toda ou parte da sequência de codificação de ASPA01, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser expressados recombinantemente e avaliados quanto a atividade biológica. Por exemplo, a técnica prover a subsistência de ensaios padrão para a medição da atividade enzimática da asparaginase e desse modo, as proteínas aperfeiçoadas podem ser facilmente selecionadas.

[0090] Em uma modalidade preferida, a proteína de ASPA01 tem uma sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de ASPA01 é substancialmente homólogo à sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 3 e mantém pelo menos uma atividade biológica de um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 3, se bem que difere na sequência de aminoácido devido a mutagênese ou variação natural como descrito acima.

[0091] Em uma outra modalidade preferida, a proteína de ASPA01 tem uma sequência de aminoácido codificada por um fragmento de ácido nucléico isolado capaz de hibridizar para um ácido nucléico de acordo com a SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2, preferivelmente sob condições de hibridização altamente estringentes.

[0092] Consequentemente, a proteína de ASPA01 é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga à sequência de aminoácido, mostrada na SEQ ID NO:3, e mantém pelo menos uma atividade funcional do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3.

[0093] Os equivalentes funcionais de uma proteína de acordo com a invenção podem ser também identificados, por exemplo, avaliando-se as bibliotecas combinatórias de mutan- tes, por exemplo, mutantes de truncamento, da proteína da invenção quanto à atividade de asparaginase. Em uma modalidade, uma biblioteca variegada de variantes é gerada por mu-tagênese combinatória no nível do ácido nucléico. Uma biblioteca variegada de variantes pode ser produzida, por exemplo, enzimaticamente ligando-se uma mistura de oligonu-cleotídeos sintéticos nas sequências de gene tal que um grupo degenerado de sequências de proteína potencial seja ex-pressível como polipeptídeos individuais. Existe uma variedade de métodos que podem ser empregados para produzir as bibliotecas de variantes potenciais dos polipeptídeos da invenção de uma sequência de oligonucleotídeo degenerado. Os métodos para sintetizar os oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (observe, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura e outros (1984) Annu. Ver. Bio-chem. 53:323; Itakura e outros (1984) Science 198:1056; e outros (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

[0094]Além disso, as bibliotecas de fragmentos da sequência de codificação de um polipeptídeo da invenção podem ser empregadas para gerar uma população variegada de polipeptídeos para a avaliação de uma seleção subsequente de variantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos de sequência de codificação pode ser gerada tratando-se um fragmento de PCR de fita dupla da sequência de codificação de interesse com uma nuclease sob condições onde o corte ocorra somente aproximadamente uma vez por molécula, desnaturando o DNA de fita dupla, renaturando o DNA para formar o DNA de fita dupla que pode incluir pares de sentido/ anti-sentido de produtos cortados diferentes, removendo as porções de fita simples de dúplex reformado por tratamento com nuclease Sl, e ligando a biblioteca de fragmento resultante em um vetor de expressão. Por este método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada a qual codifique os fragmentos internos e N-terminais de vários tamanhos da proteína de interesse .

[0095] Várias técnicas são conhecidas na técnica para a avaliação dos produtos de gene das bibliotecas combinatórias feitas por mutações de ponto de truncamento, e para a avaliação das bibliotecas de DNAc para os produtos de gene tendo uma propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente empregadas, que são tratáveis para análise de alta performance, para avaliar as grandes bibliotecas de gene tipicamente incluem a clonagem da biblioteca de gene nos vetores de expressão replicáveis, transformação das células apropriadas com a biblioteca de vetores resultante, e expressão dos genes combinatórios sob condições nas quais a detecção de uma atividade desejada facilite o isolamento do vetor codificando o gene cujo produto foi detectado. A mutagênese de conjunto recorrente (REM), uma técnica que melhora a frequência dos mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser empregada em combinação com os ensaios de avaliação para identificar os variantes de uma proteína da invenção (Arkin e Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7811-7815; Delgrave e outros, (1993) Protein EngineeRING 6(3): 327331) .

[0096] Além da sequência de gene de ASPA01 mostrada na SEQ ID N0:1, será evidente para a pessoa versada na técnica que os polimorfismos da sequência de DNA que podem induzir a alterações na sequência de aminoácido da proteína de ASPA01 podem existir dentro de uma determinada população. Tais po-limorfismos genéticos podem existir em células de populações diferentes ou em uma população devido à variação alélica natural. Os variantes alélicos podem também incluir equivalentes funcionais.

[0097] Os fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com a invenção podem também compreender polinucleotídeos não co-dificantes ou polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeos podem funcionar como sondas ou iniciadores para uma reação de PCR.

[0098] Os ácidos nucléicos de acordo com invenção independente se eles codificam os polipeptídeos funcionais ou não funcionais, podem ser empregados como sondas de hibridi-zação ou iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR) . Os usos das moléculas de ácido nucléico da presente invenção que não codificam um polipeptídeo tendo uma atividade de ASPA01 incluem, entre outras coisas, (1) isolar o gene codificando a proteína de ASPA01, ou variantes alélicos desta de uma biblioteca de DNAc, por exemplo, de outros organismos que não Ά. niger, (2) hibridização in situ (por exemplo, FISH) para propagação cromossômica de metáfase para fornecer a localização cromossômica precisa do gene de ASPA01 como descrito em Verma e outros, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nova York (1988) ; (3) análise de Northern blot para a detecção da ex- pressão de RNAm de ASPA01 em células e/ou tecidos específicos e (4) sondas e iniciadores que possam ser empregados como um instrumento para diagnóstico para analisar a presença de um ácido nucléico hibridizável para a sonda de ASPA01 em uma determinada amostra biológica (por exemplo, tecido).

[0099] Também abrangido pela invenção é um método de obtenção de um equivalente funcional de um DNAc ou gene de ASPA01. Um tal método requer a obtenção de uma sonda marcada que inclui um ácido nucléico isolado que codifica toda ou uma porção da sequência de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou uma variante desta; avaliação de uma biblioteca de fragmento de ácido nucléico com a sonda marcada sob condições que permitam a hibridização da sonda em fragmentos de ácido nucléico na biblioteca, por meio da qual formando dúplex de ácido nucléico, e preparando uma sequência de gene de comprimento total dos fragmentos de ácido nucléico em qualquer dúplex marcado para obter um gene relacionado com o gene de ASPA01.

[00100] Em uma modalidade, um ácido nucléico de ASPA01 da invenção é pelo menos 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogo a uma sequência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 ou o complemento desta.

[00101] Em outra modalidade preferida um polipeptídeo de ASPA01 da invenção é pelo menos 40%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogo a uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:3. Células Hospedeiras [00102] Em outra modalidade, a invenção caracteriza células, por exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes que contêm um ácido nucléico abrangido pela invenção. Uma "célula transformada" ou "célula recombinante" é uma célula na qual (ou em um antepassado da qual) tenha sido introduzido, através de técnicas de DNA recombinante, um ácido nucléico de acordo com a invenção. Ambas células procarióticas e eucarióticas são incluídas, por exemplo, bactérias, fungos, levedura e outros, especialmente preferidas sendo as células do fungo filamento-so, em particular Aspergillus niger.

[00103] Uma célula hospedeira pode ser escolhida a qual module a expressão das sequências inseridas, ou modifique e processe o produto de gene de um modo desejado, específico. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, divagem) dos produtos de proteína podem facilitar o funcionamento ideal da proteína.

[00104] Várias células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-traducional e modificação das proteínas e produtos de gene. Os sistemas de hospedeiros ou linhagens de célula apropriadas familiares àqueles de experiência na técnica de microbiologia e/ou biologia molecular podem ser escolhidos para garantir a modificação correta e desejada e processamento da proteína estrangeira expressada. Para esta finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para o processamento apropriado da, glicosilação, fosforilação e transcrição primária do produto de gene, podem ser empregadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica .

[00105] As células hospedeiras também incluem, porém não estão limitadas a, linhagens de células de mamíferos tal como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e linhagens de células do plexo coróide.

[00106] Se desejado, os polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser produzidos por uma linhagem de célula es-tavelmente transfectada. Vários vetores adequados para transfecção estável das células de mamíferos estão disponíveis ao público, métodos para a construção de tais linhagens de células são também publicamente conhecidas, por exemplo, em Ausubel e outros (supra).

[00107] Em outro aspecto, a invenção fornece produtos alimentícios obteníveis pelo processo da invenção como descrito anteriormente ou pelo uso da nova asparaginase como descrito anteriormente para produzir os produtos alimentícios. Esses produtos alimentícios são caracterizados por significantemente reduzir os níveis de acrilamida em comparação com os produtos alimentícios obteníveis por processo de produção que não compreendem a adição de uma ou mais enzimas em uma quantidade que seja eficaz na redução do nível de aminoácidos que estão envolvidos na formação de acrilamida durante a referida etapa de aquecimento. O processo de acordo com a invenção pode ser empregado para obter uma redução do teor de acrilamida do produto alimentício produzido, preferivelmente, mais do que 50%, mais preferivelmente, mais do que 20%, ainda mais preferivelmente, 10% e mais preferivelmente mais do que 5% comparado com um produto alimentício obtido com o processo convencional.

Materiais & Métodos Medição de Acrilamida Pré-Tratamento da Amostra [00108] 600 mg da amostra seca e homogeneizada são extraídos empregando 5 ml de água milliQ. 1 pg de acrilamida 13C8 padrão interna na solução (CIL) é adicionado ao extrato. Após 10 minutos de centrifugação (6000 rpm), 3 ml da camada superior são levados em uma coluna Extreluut-3BT (Merck). Empregando 15 ml de etilacetato, a acrilamida é eluída da coluna. O etilacetato é evaporado sob um vapor suave de nitrogênio para abaixo de aproximadamente 0,5 ml. Condições Cromatográficas [00109JA solução e etilacetato é analisada empregando cromatografia de gás. A separação é obtida empregando uma coluna CP-Wax 57 (Varian) (comprimento de 25 m, diâmetro interno de 0,32 mm, película de 1,2 pm) e hélio como o gás portador com um fluxo constante de 5,4 ml/ minuto. A injeção menos dividida de 3 pl é realizada. A temperatura do forno é mantida em 50oC durante 1 minuto, tempo após o qual a temperatura é aumentada com 30oC/ minuto em direção à 220oC. Após 12 minutos de temperatura constante de 220oC o forno é resfriado e estabilizado antes da próxima injeção. A detecção é realizada empregando espectrometria de massa de ionização química on-line no modo de íon positivo, empregando metano como gás de ionização. Os íons característicos m/ζ 72 (acrilamida) e m/z 75 (13C8 acrilamida) são monitorados por quantificação.

Equipamento Empregado GC:HP6890 (Hewlwt Packard) MSD (detector seletivo HP5973 (Hewiet Packard) de massa) Medições da Atividade de Asparaginase [00110] A atividade de asparaginase foi medida de acordo com Shirfrin e outros (Shirfrin, S., Parrot., C.L. e Lu-borsky, S.W. (1974), Journal of Biological Chemistry 249, 1445-1340) . O fundamento deste ensaio de enzima é a determinação do NH6 liberado como um resultado da atividade de asparaginase.

[00111] A fim de medir ο NH3 liberado, a seguinte relação de pipetas foi como segue: Solução A: 0,1 M de ácido citrico + 0,2 M de Na2HP04.2 H20 pH 5,5 Solução B: 0,189 M de L-asparagina (Sigma) Solução C: 0,006 M (NH4)2S04 (Merck) Solução D: 25% (volume/ volume) de ácido tricloro-acético (Merck) Solução E: Reagente de Cor de Amônia (Aldrich) [00112] Para as medições da atividade de asparaginase, as soluções têm que ser preparadas recentemente.

[00113] Na tabela 1 as soluções empregadas para a curva de calibração (CP= ponto de calibração) são sumarizadas.

Tabela 1. Relação de Solução de Calibração [00114] As soluções de acordo com a tabela 1 foram ime- diatamente invertidas e incubadas em 37oC por inversão. Após 30 minutos a reação foi terminada pela adição de 0,1 ml de solução D, Para o teste da enzima de referência, 0, 1 ml de solução de enzima foi adicionado posteriormente. As so- luções foram imediatamente misturadas e centrifugadas para remover qualquer precipitado. 0,2 ml dos sobrenadantes foi pipetado para tubos contendo 4,3 ml de água deionizada e 0,5 ml de solução E. Essas misturas foram imediatamente misturadas e após 1 minuto A436 nm foi medido para as amostras, referências e testes de calibração.

[00115] A curva de calibração foi feita como segue: /..A4 36 nm de ponto de calibração = A436 nm de ponto de calibração-A436 nm de ponto de calibração 1 [00116] Uma curva padrão é preparada representando-se o ΔΑ436 nm do padrão versus a concentração de Amônia (NH3).

[00117] A atividade da enzima foi calculada como segue: δΑ436 nm de teste de enzima = A436 nm de teste - A436 nm de referência de teste [00118] Determinar os pmóis de NH3 liberado empregando a curva padrão: onde, Vq = Solução de reação de volume (na relação + 0,1 ml de solução D); 2,2 ml Vi = Volume da solução de reação empregada para a segunda reação para determinar ο NH3; 0,2 ml ti = tempo de incubação em minutos; 30 Ve = amostra da enzima em volume a ser testada; 0,1 [00119] Uma unidade de atividade de asparaginase é definida 1 pmol de NH5 que é liberado de L-asparagina por minuto em pH 5,5 em 37°C, a menos que de outro modo declarado. A massa tem um pH de cerca de 5,5, portanto este pH é preferido na medição. Entretanto, para outros substratos com valores de pH diferentes, este pH diferente é preferivelmente empregado na determinação da atividade de asparaginase.

[00120] As quantidades em ppm são com base na quantidade de farinha, a menos que de outro modo declarado.

Materiais [00121] A asparaginase foi obtida de Escherichia coli (Sigma, tendo uma atividade especifica de 28 unidades/ mg), Ewinia chrysantherni (Sigma, tendo uma atividade especifica de 100 unidades/ mg), Bacillus subtillis ou Aspergillus niger (observe os exemplos para os detalhes da fermentação).

[00122] O meio CSL consistiu de (em quantidade por litro) ; 100 g de Sólidos Corn Steep (Roquette), lg de NaH2P04*H20, 0,5 g de MgS04*7H20, 10 g de glicose*H20 e 0,25 g de Basildon (anti-espuma). Os ingredientes foram dissolvidos em demi-água e o pH foi ajustado para pH 5,8 com NaOH ou H2SO4; frascos de 100 ml com bafle e bola de espuma foram carregados com 20 ml de caldo de fermentação e esterilizados durante 20 minutos em 120°C tempo após o qual 200 μΐ de uma solução contendo 5000 1U/ ml de penicilina e 5 mg/ml de Streptomicina foi adicionada a cada frasco após o resfriamento em temperatura ambiente.

[00123] O meio CSM consistiu de (em quantidade por litro) : 150 g de maltose*H20, 60 g de Soytone (pepton) , 1 g de NaH2P04*H20, 15 g de MgSC>4*7H20, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon (anti-espuma), 20 g de MÊS, 1 g de L-arginina. Os ingredientes foram dissolvidos em demi-água e o pH foi ajustado para pH 6,2 com NaOH ou H2SO4; frascos de 500 ml com bafle e bola de espuma foram carregados com 100 ml de caldo de fermentação e esterilizados durante 20 minutos em 120°C tempo após o qual 1 ml de uma solução contendo 5000 1U/ ml de penicilina e 5 mg/ ml de Streptomicina foi adicionada a cada frasco após o resfriamento em temperatura ambiente. EXEMPLO 1 Fermentação de Aspergillus niger [00124] A asparaginase codificada pela sequência de nu-cleotídeo como fornecida aqui foi obtida construindo-se plasmideos de expressão contendo a sequência de DNA, transformando uma cepa de A. niger com este plasmideo e desenvolvendo as cepas de Aspergillus niger do seguinte modo.

[00125] Esporos frescos (108-107) de cepas de A. niger foram inoculados em 20 m de meio CSL (frasco de 100 ml, ba-fle) e desenvolvidos durante 20-24 horas em 34°C e 170 rpm. Após a inoculação de 5-10 ml de pré-cultura de CSL em 100 ml de meio CSM (frasco de 500 ml, bafle) as cepas foram fermentadas em 34°C e 170 rpm durante 3-5 dias.

[00126] Os sobrenadantes livres de célula foram obtidos por centrifugação em tubos Grenier de 50 ml (30 minutos, 5000 rpm, 4°C) , e todas as etapas subsequentes foram realizadas no gelo. Os sobrenadantes foram pré-filtrados em um filtro de microfibra GF/A Whatman Glass (150 mm 0) para remover as partículas grandes, ajustado para pH 5 com 4 N de KOH (se necessário) e filtrado estéril sobre um filtro de 0,2 pm (topo da garrafa) com sucção para remover o material fúngico. Os sobrenadantes foram armazenados em 4°C (ou -20°C).

Medição do teor de asparaginase de Aspergillus niger no ultra-filtrado e atividade de asparaginase Etapa 1- Preparação dos ultra-filtrados [00127] Os sobrenadantes das culturas como obtido no Exemplo 1, foram ultra-filtrados para obter uma concentração de enzima superior e para remover a contaminações moleculares baixas que possam interferir com as determinações da atividade enzimática e os testes de cozimento. As ultra-filtrações de 300 ml de sobrenadante foram realizadas em um sistema Millipore Labscale TFF equipado com um filtro com um corte de 10 kDa.

[00128] Dependendo de sua cor e volume, as amostras foram lavadas 3-5 vezes com 10-30 ml de água desmineralizada fria. Os volumes finais das soluções de enzima foram 10-30 ml e são ainda referidos como "ultra-filtrados".

Etapa 2- Determinação da concentração de Asparaginase por A280 e HPSEC

[00129JA concentração da asparaginase de Aspergillus niger no ultra-filtrado foi calculada da extinção em 280 nm (A280) atribuível a asparaginase e ao coeficiente de extinção molecular calculado da asparaginase. A medição do A280 foi realizada em um espectrofotômetro Uvikon XL Scomam (Beun de Ronde, Abcoude, The Netherlands).

[00130]O coeficiente de extinção molar de uma enzima pode ser calculado do número de resíduos de tirosina, trip-tofano e cisteína por molécula de enzima (S.C. Gill e P.H. Von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1989)). Os coeficientes de extinção molar desses aminoácidos são 1280, 5690 e 12 0 M'1. cm-1 respectivamente. O número de resíduos de tirosina, triptofano e cisteína na asparaginase de Aspergillus niger da invenção pode ser deduzido das sequências de prote- ína corno determinado na SEQ ID NO: 3. 0 coeficiente de ex- tinção calculado das asparaginase de Aspergiiius níger da invenção está na tabela 2.

Tabela 2. Coeficiente de extinção de Asparaginase de A, níger [00131] A extinção do ultra-filtrado em 280 nm (A280) que é atribuível a asparaginase depende da pureza da amostra da enzima. Esta pureza foi determinada empregando HPSEC (Cromatografia de Exclusão de Tamanho de Alto Desempenho) com uma coluna TSK SW-XL (300*7, 8 mm; faixa de MW 10-300 kDa) . O tampão de eluçâo consistiu de 25 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,0 e foi empregado em um fluxo de 1 ml/ minuto. As amostras de 5-100 μΐ foram injetadas. A absorção em 280 nm foi medida.

[00132] O A28G no ultra-filtrado atribuível à asparaginase da invenção foi obtido da relação da superfície pico do pico de asparaginase respectivo no cromatograma e a superfície total dos picos absorvendo em 280 nm. A concentração de asparaginase no ultra-filtrado foi então calculada multipli- cando-se ο A280 do ultra-filtrado pela razão descrita acima e dividido por 0,3 (o coeficiente de extinção calculado) para cada asparaginase. A solução conteve 40 mg de proteína/ ml.

Etapa 3 - Determinação da Atividade de Asparaginase [00133JA solução de asparaginase de Aspergillus niger mostrou uma atividade de 40000 U/ml em pH 5,5. Portanto uma atividade específica de 1000 unidades/ mg de proteína pôde ser calculada levando o teor de proteína de 40 mg/ml em conta . EXEMPLO 2 pH-Ideal de Asparaginase de Aspergillus niger [00134] Neste exemplo a atividade foi medida em vários valores de pH. Para manter o valor de pH constante e corrigir para o efeito de tampão, várias medições da atividade de asparaginase foram realizadas nos mesmos valores de pH em diferentes tampões.

[00135] Três tampões diferentes foram empregados para medir a atividade de asparaginase na faixa de pH de 5-9: 1. tampão de ácido cítrico/ fosfato (pH 5-6,2); 2. tampão de fosfato (pH 8,5-7,6); e 3. tampão tris (pH 7,2-8,9).

[00136] A concentração de substrato foi 17,2 mM de asparaginase. Na tabela 3 a atividade de asparaginase versus pH é apresentada quanto a asparaginase obtida de A. niger.

Tabela 3. Atividade de asparaginase de Aspergillus niger era vários valores de pH medidos era tampões adequados.

As concentrações finais no ensaio de enzima para os tampões de ácido cítrico, fosfato e Tris(hidroximetil)erainoraetano sâo respectivamente 0,05, 0,1 e 0,025 M

[00137]Como é mostrado a partir dos dados, esta asparaginase de Aspergillus niger é muito adequada para aplicações em cozimento, por que a enzima mostra atividade de enzima relativamente elevada no valor de pH da massa que é cerca de 5,5. EXEMPLO 3 Valores de Kw e V^, para a asparaginase de Escherichia coli e Aspergi1lus niger [00138] A determinação de KM e Vmax foi realizada em pH 5,5 em 3?oC, medindo-se a atividade de asparaginase de asparaginases de Escherichis coli ou Aspergiillus niger respectivamente. Na tabela 4, os resultados dessas medições sâo sumarizados.

Tabela 4. K„, e VnõX da asparaginase de Escherichia coli ou Aspergi1lus niger [00139] A asparaginase de A. niger mostra uma atividade Significantemente maior do que a asparaginase de E. coli. EXEMPLO 4 Preparação de pão tipo batard e o efeito de asparaginase de Erwinia, Escherichia coli e Aspergi 1 lus niger sobre o nivel de acrilantida na casca e miolo do pão.

[00140] Uma massa foi preparada de 2000 g de farinha (100%) , 104 0 ml de água (57%) , 44 g de levedura de Konings fresca, 40 g de sal (5%), 136 mg de ácido ascórbico (68 ppm) e as quantidades indicadas de asparaginase de Erwinia (Sig- ma) ou asparaginase de Aspergillus niger de acordo com a invenção. Os ingredientes foram misturados a uma massa por um misturador espiral Diosna SP 12 (2 minutos em velocidade 1, seguido com um tempo de mistura na velocidade 2 até um consumo de energia total ser alcançado de 86 kw). Após isto, a massa completa foi endurecida durante 15 minutos em 32°C. Subsequentemente, os pedaços da massa de 350 g foram enrolados manualmente e endurecida durante 15 minutos em 32°C. Em seguida, os pedaços de massa foram enrolados e moldados, seguido por um endurecimento final de 75 minutos. Após o endurecimento, os cortes foram feitos no comprimento da superfície superior dos pedaços de massa com uma profundidade de 1 cm. Uma amostra da massa foi tomada exatamente antes do cozimento para determinar o teor de acrilamida. Os pedaços da massa foram assados em um forno em 240°C durante 30 minutos. Em seguida, as amostras foram tomadas da casca (a mais externa de 2mm) e analisadas quanto a acrilamida como descrito acima. A casca foi tomada do lado superior do pão de batard, e aquela parte da casca foi selecionada a qual mostrou uma cor marrom média, não muito escura e não muito branca. Para a determinação de acrilamida a média de 2 medições de um pão e dois pães para cada condição é apresentada na tabela 5, 6 e 7 abaixo.

Tabela 5. Efeito de vários tipos de asparaginase na formação de acrilamida no pâo.

[00141] A partir da tabela acima pode ser concluído que o uso de vários tipos de asparaginases, incluindo a ASPA01 nova tem um efeito de redução na quantidade de acrilamida formada na casca.

Tabela 6. Efeito da quantidade de asparaginase de Erwinia na formação de acrilamida [00142] A partir da tabela acima pode ser concluído que o aumento da quantidade de asparaginase diminui a quantidade de acrilamida formada na casca. EXEMPLO 5 Efeito da asparaginase no nível de acrilamida nos pães de batard com asparaqina adicionada [00143] A massa, os pães e as amostras foram preparados do mesmo modo como para o exemplo 4, por meio do qual a L-asparagina (Sigma) foi adicionada à massa na mesma etapa quando a asparaginase foi adicionada, nas quantidades como determinadas na tabela 7» A acrilamida foi determinada nas amostras resultantes, cujos resultados podem ser encontrados abaixo.

Tabela 7. 0 efeito da adição extra de asparaqina sobre a formação de acrilamida na casca, [00144] A partir da tabela 7 pode ser concluído que a adição da asparagina de aminoácido ao pão significantemente aumenta o teor de acrilamida da casca do pão. Isto pode entretanto ser reduzido novamente com o uso de asparaginase. EXEMPLO 6 Efeito dos vários parâmetros no nível de acrilami-da na casca [00145] Uma massa foi preparada de 2000 g de farinha de trigo integral (100%) (Lindo®- Meneba, Holland) ou de farinha de trigo normal (Kollbri® - Meneba, Holland), 1140 ml de água (57%) , 47 g de Koningsgist fresco , 40 g de sal (1,75%), 136 mg de ácido ascórbico (34 ppm) e as quantidades indicadas de L-asparagina (Sigma) e asparaginase ASPA01 obtida de Aspergillus niger. Os ingredientes foram misturados a uma massa por um misturador espiral Diosna SP 12 (2 minu- tos na velocidade 1, seguido com um tempo de mistura na velocidade 2 até um consumo de energia total ser alcançado de 86 wh) . Após isto, a massa completa foi endurecida durante 15 minutos em 32°C. Subsequentemente, os pedaços da massa de 350 g foram enrolados manualmente e endurecidos durante 15 minutos em 32°C. Em seguida, os pedaços de massa foram enrolados e moldados, seguido por um endurecimento final de 90 minutos. Após o endurecimento, os cortes foram feitos no comprimento da superfície superior da massa com uma profundidade de 1 cm. Os pedaços da massa foram assados em um forno.

[00146] Três processos de cozimento foram empregados 1. 30 minutos em 240°C

2. 20 minutos em 300°C

3. 20 minutos em 320°C

[00147] Após o cozimento, as amostras foram tomadas da casca do pão como indicado no exemplo 4. Os resultados da análise de acrilamída das amostras sào determinados abaixo. A quantidade de acrilamida na massa foi medida exatamente antes da assadura ocorrer. Cada figura é uma média de 2 medições de um pão e para cada condição.

Tabela 8. 0 efeito do processo de assadura sobre a quantidade de acrilamida formada na casca do pão com base na farinha normal, nenhuma asparagína ou asparaginase adicionada .

[00148]A partir da tabela 8 pode ser concluído que a formação de acrilamda é dependente do processo de assadura aplicado. Em um processo de cozimento curto e quente a formação da acrilamida é significantemente maior na casca do que quando é assado em uma temperatura mais baixa. O processo de assadura 3 resultou em pães muito escuros. Portanto, nenhuma experiência foi realizada sob esta condição de assadura.

Tabela 9. 0 efeito do tipo de farinha no nível de acrilamida na casca do pão, para o processo de cozimento 1, nenhuma asparagina nem asparaginase adicionada.

[00149]A partir da tabela 9 é claro que o tipo de farinha tem um efeito na quantidade de acrilamida formada.

Tabela 10. O efeito do açúcar no nivel de acrilamida na casca do pâo cora base na farinha normal e o efeito de uma quantidade aumentada de acrilamida sobre a eficácia da asparaginase de A. níger.

[00150] A presença de açúcar estimulou a formação de acrilamida. Se Além disso a asparagina foi adicionada, este efeito foi ainda maior. Quando a asparaginase de Aspergillus niger foi adicionada a este sistema de massa rica em açúcar, o nivel de acrilamida na casca do pão foi signifi-cantemente reduzido. Surpreendentemente, para os pães relativamente ricos em acrilamida, a redução da acrilamida é muito maior enquanto empregando a mesma quantidade de asparaginase produzida de Aspergillus niger. EXEMPLO 7 Preparação de bolo doce holandês [00151] A preparação do bolo doce holandês ocorreu em duas fases. Na primeira fase uma prê-massa mole foi feita como segue: 4 kg de Kokzoet- (Atlanta Dethmers B.V., Groningen - Holland) e 500 g de bolo doce holandês fragmentado foram adicionados a dois litros de água e aquecidos até uma temperatura de 116°C ser alcançada. 5 kg de farinha de arroz foram adicionados e isto foi misturado até a massa mole ficasse macia. Em seguida, a massa é resfriada e armazenada em temperatura ambiente durante 1-2 dias.

[00152] Para 2750 gramas desta pré-massa mole os seguintes ingredientes foram adicionados: 500 gramas de Koekzoet®, 27,5 g de tempero para cozimento de doce holandês peneirado, 22 g de pó Karairú BAking peneirado, 16,5 g de pó VUlkaan® Baking (todos de Atlanta Dethmers). Além disso, várias quantidades de asparaginase de Aspergillus niger foram adicionadas, com uma atividade de enzima de 40000 U/ ml (a atividade da enzima foi medida de acordo com o exemplo 1, em pH 5,5) .

[00153] Esta mistura foi misturada em 104 rpm durante 6 minutos em um misturador Diosan tipo SDS12 (Diosanm Dierks & Sõhne, Osnabruck-Alemanha). 3250 g de massa mole foram pesados e umedecidos no lado de fora e colocados em uma panela para bolo. Em seguida, a massa mole foi incubada em 30°C durante 15 minutos. Em seguida, a massa mole foi assada em 180°C durante 60 minutos. As amostras da camada externa e do sitio interno ("miolo") do bolo doce holandês foram analisadas quanto à presença de acrilamida.

[00154] Após o cozimento, as amostras foram retiradas da casca (a mais externa de 2 mm) e do miolo (do meio da massa) , e analisadas quanto a acrilamida como descrito acima. Para a amostra da casca, a casca foi tomada do lado superior da massa, selecionando-se aquela parte da caca que mostrou uma cor média.

Tabela 11. 0 teor de acrilamida e o efeito de várias dosagens de Aspergíiius niger na casca e miolo do bolo doce holandês. * A redução de acrilamida foi calculada pela fórmula abaixo: [00155]Como mostrado neste exemplo, a adição de asparaginase de Aspergillus niger reduziu o teor de acrilamida em 5% comparado com o bolo doce holandês que nào foram tratados. Além disso é surpreendente que no bolo doce holandês um nível elevado de acrilamida é constatado na casca. Em todas as experiências com pão, a quantidade de acrilamida na casca foi abaixo do limite de detecção da análise de acrilamida <<30 ppb), mesmo se a asparagina ou açúcar foram adicionados .

REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. Processo para a produção de um produto alimentício, CARACTERIZADO pelo fato de envolver pelo menos uma etapa de aquecimento, compreendendo adicionar uma ou mais enzimas asparaginase a uma forma intermediária do referido produto alimentício no referido processo de produção por meio do qual a enzima é adicionada antes da referida etapa de aquecimento em uma quantidade que seja eficaz na redução do nível de aminoácidos que estão presentes na referida forma intermediária do referido produto alimentício cujos aminoácidos estão envolvidos na formação de acrilamida durante a referida etapa de aquecimento, em que a enzima asparaginase é obtida a partir da espécie Aspergillus, em que o produto obtido pelo referido processo não é café.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentício é feito de pelo menos uma matéria-prima vegetal.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a matéria-prima vegetal é farinha de cereal, preferivelmente, farinha de trigo ou de batata.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é capaz de modificar a cadeia lateral de aminoácidos que estão envolvidos na formação de acrilamida durante a etapa de aquecimento do processo de produção e por meio do qual os produtos de degradação dos referidos aminoácidos não estão, ou pelo menos em uma menor extensão, dando origem à formação de acrilamida em comparação com a forma não modificada do aminoácido.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima está modificando a cadeia lateral de pelo menos um dos aminoácidos de asparagina, glutamina, cisterna, metionina, prolina, serina, fenilalanina, tirosina e/ou triptofano.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é adicionada como uma preparação de enzima ou produzida in situ por um micro-organismo capaz de produzir a referida enzima.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é obtida a partir de Aspergillus niger.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é um polipeptideo apresentando a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, uma sequência de aminoácidos obtenível pela expressão do polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1 em um hospedeiro apropriado, assim como uma sequência de aminoácidos obtenível pela expressão das sequências de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 2 em um hospedeiro apropriado.

9. Vetor heterólogo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou 2.

10. Vetor heterólogo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de polinucleotídeos é operativamente ligada com sequências reguladoras adequadas para expressão da referida sequência de polinucleotídeos em uma célula hospedeira adequada.

11. Vetor heterólogo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula hospedeira adequada é um fungo filamentoso.

12. Método para a preparação de um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO 1 ou 2 ou um vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de cultura de uma célula hospedeira transformada com o referido polinucleotídeo ou referido vetor, e isolar o referido polinucleotídeo ou o referido vetor da referida célula hospedeira.

13. Método para a preparação de uma asparaginase com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de transformar uma célula hospedeira adequada com um polinucleotídeo isolado de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou um vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, cultivar a referida célula sob condições que permitam a expressão do referido polinucleotídeo e, opcionalmente, purificar o polipeptídeo codificado da referida célula ou do meio de cultura.

14. Célula hospedeira transformada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou 2, ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 3, ou um vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que a célula hospedeira é selecionada de bactéria, fungo ou levedura, como a condição de que a célula hospedeira não é uma célula de Aspergillus.

15. Uso de uma asparaginase com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, CARACTERIZADO pelo fato de ser em um processo para a produção de um produto alimentício como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

16. Produto alimentício, CARACTERIZADO pelo fato de ser obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 15, em que o produto obtido pelo referido processo não é café.