EA011438B1 - Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт - Google Patents

Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт Download PDF

Info

Publication number
EA011438B1
EA011438B1 EA200501012A EA200501012A EA011438B1 EA 011438 B1 EA011438 B1 EA 011438B1 EA 200501012 A EA200501012 A EA 200501012A EA 200501012 A EA200501012 A EA 200501012A EA 011438 B1 EA011438 B1 EA 011438B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
asparaginase
vector
polynucleotide
sequence
acrylamide
Prior art date
Application number
EA200501012A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501012A1 (ru
Inventor
Питер Ян Арнольдус Мария Пломп
Де Лекс Бур
Ван Рутгер Ян Ройен
Рульф Бернхард Мейма
Original Assignee
ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32050091&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA011438(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В.
Publication of EA200501012A1 publication Critical patent/EA200501012A1/ru
Publication of EA011438B1 publication Critical patent/EA011438B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01001—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • A23L19/10—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof of tuberous or like starch containing root crops
    • A23L19/12—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof of tuberous or like starch containing root crops of potatoes
    • A23L19/18—Roasted or fried products, e.g. snacks or chips
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/06—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/28—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/104—Fermentation of farinaceous cereal or cereal material; Addition of enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/104—Fermentation of farinaceous cereal or cereal material; Addition of enzymes or microorganisms
    • A23L7/107—Addition or treatment with enzymes not combined with fermentation with microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01002—Glutaminase (3.5.1.2)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологическим объектам, используемым в пищевой промышленности для предотвращения образования акриламида в пищевых продуктах. Решение этой проблемы предлагается путем введения в пищевой продукт нового фермента - выделенной из Aspergillus niger аспарагиназы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или аспарагиназы, последовательность которой гомологична указанной по меньшей мере на 80%. Способ получения пищевого продукта включает по меньшей мере одну стадию нагревания, предусматривающий добавление указанной аспарагиназы к полуфабрикату указанного пищевого продукта, причем аспарагиназу добавляют до указанной стадии нагревания в количестве, эффективном для снижения содержания аминокислот, присутствующих в указанном полуфабрикате пищевого продукта и вовлеченных в образование акриламида в течение указанной стадии нагревания.

Description

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологическим объектам, используемым в пищевой промышленности для предотвращения образования акриламида в пищевых продуктах. Конкретно, настоящее изобретение относится к новому ферменту, способу его получения, к новой полинуклеотидной последовательности, содержащей ген, кодирующий новый фермент, способу наработки полинуклеотида, вектору, клетке-хозяину, способу производства пищевого продукта с новым ферментом и соответствующим пищевым продуктам.
Коммерческое производство акриламида для различных технических применений существует уже в течение длительного времени, поэтому его токсическое воздействие хорошо изучено. Акриламид используется для получения полиакриламида, который используется при получении питьевой воды, для стабилизации почвы, для обработки промышленных сточных вод, для добычи нефти и используется в лаборатории.
Считается, что акриламид является канцерогеном для человека и животных. В 1991 году Научный Комитет по пищевым продуктам исследовал мономерный акриламид в контактных пищевых материалах и в его оценке был сделан вывод, что акриламид является генотоксичным канцерогеном. Вегдшагк е! а1. (Сйет. Кек. Τοχίεοί., 10, 78-84 (1997)) показал, что акриламид также является компонентом табачного дыма и это была первая связь между образованием акриламида и нагреванием биологических материалов. Недавно было опубликовано, что акриламид встречается в ряде пищевых и выпечных продуктов (Тагеке е! а1. Сйет. Кек. Τοχίοοί. 13, 517-522 (2000)), что вызвало всеобщее беспокойство. Дальнейшие исследования показали, что значительное количество акриламида обнаруживается в различных выпечных, жареных и приготовленных в духовке обычных продуктах, и было показано, что акриламид в продуктах появился в результате процесса выпекания.
Официальное ограничение в Соединенном Королевстве на примеси акриламида в пищевых продуктах составляет 10 ррЬ (10 млрд. долей или 10 мкг на 1 кг), но указанные значения значительно превысили эту величину у множества продуктов, особенно зерновых закусок, выпечных продуктов и картофельных чипсов.
Зависимость между введенной дозой акриламида и частотой возникновения опухолей изучалась в тестах на животных, в которых крысы пили воду, содержащую акриламид, и погибали в течение двух лет (Епейтап, Н.Ь. е! а1., Бипйат. Арр1. Ρйа^тасο1. 85:154-168, М. (1986) и ΙοΗηκοη е! а1. Τοχίεοί. Арр1. Ρίκιπικιοοί. 85:154-168 (1986)). Хроническая токсичность и онкогенность изучалась на 344 крысах Фишера, в питьевую воду которым был введен акриламид.
Когда эти данные были объединены с результатами, собранными Такеге е! а1., в которых акриламид, связанный с гемоглобином (Ы-(2-карбамоилэтил)валин) был изучен как функция от акриламидсодержащего питания крыс, было рассчитано, что дневное потребление акриламида, составляющее 1,6 мкг акриламида/кг, соответствует риску возникновения рака 7х10-3 для людей в течение длительного времени воздействия.
Путь образования акриламида из аминокислот и восстанавливающих сахаров в результате реакции Майяра был предложен Μοй^ат е! а1. Ха!иге 419-448 (2002). В соответствии с этой гипотезой акриламид может образоваться в ходе реакции Майяра. В ходе выпекания и поджаривания реакция Майяра главным образом ответственна за цвет, запах и вкус. Был предложен путь образования акриламида в ходе реакции Штреккера деградации аминокислот, ассоциированной с реакцией Майяра. Образование акриламида становилось обнаружимым, когда температура превышает 120°С, а наибольшая скорость образования наблюдалась около 170°С. Наибольший уровень акриламида можно было наблюдать в присутствии аспарагина и глюкозы, тогда как глутаминовая и аспарагиновая кислота приводили только к следовым количествам. Тот факт, что акриламид образуется главным образом из аспарагина и глюкозы, может объяснить высокое содержание акриламида в приготовленных в духовке или поджаренных растительных продуктах. Известно, что некоторые сырые растительные материалы содержат значительный уровень аспарагина. В картофеле аспарагин является доминирующей свободной аминокислотой (940 мг/кг соответствует 40% от общего количества аминокислот) и в пшеничной муке содержание аспарагина на уровне около 167 мг аспарагина/кг муки соответствует 14% от общего содержания свободных аминокислот (ВейЛ и Сгокей ίη Ροοй Сйетщйу - Брппдег Ыете ΥοιΤ. 1999).
Поэтому в интересах общественного здоровья существует насущная потребность в пищевых продуктах, которые имеют значительно более низкое содержание акриламида или, что предпочтительнее, не содержат его совсем. В первом случае исследования были начаты с целью определения механизма образования акриламида в пищевых продуктах. Эти результаты пока еще не привели к удовлетворительному решению этой проблемы. Во-вторых, пищевые компании исследуют возможность избежать образования акриламида посредством снижения температуры в печи и в процессе обжаривания. Конечно, эти адаптации неизбежно приведут к пищевым продуктам с измененными вкусовыми свойствами (меньше продуктов реакции Майяра), и эти адаптации повысят риск микробного загрязнения, например сальмонеллой.
Настоящее изобретение предлагает решение этой проблемы путем введения в пищевой продукт нового фермента - выделенной из АкрегдШик шдег аспарагиназы, имеющей аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ N0:3, или аспарагиназы, последовательность которой гомологична указанной по
- 1 011438 меньшей мере на 80%.
Следующими объектами изобретения являются выделенные полинуклеотиды, кодирующие указанную аспарагиназу.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий указанную аспарагиназу, может иметь последовательность БЕЦ ΙΌ N0:1 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. Выделенный полинуклеотид получают из нитчатых грибов, в частности из АкрегдШик шдег.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий указанную аспарагиназу, может иметь последовательность БЕЦ ΙΌ N0:2 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий указанную аспарагиназу, может иметь последовательность БЕЦ ΙΌ N0:3 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%.
Выделенный полинуклеотид может кодировать по меньшей мере один функциональный домен указанной аспарагиназы.
Следующим объектом изобретения является вектор, содержащий любой из указанных полинуклеотидов. В этом векторе указанный полинуклеотид может быть оперативно соединен с регуляторными последовательностями, пригодными для экспрессии указанного полинуклеотида в подходящей клеткехозяине. В этом векторе, в частности, подходящая клетка-хозяин может быть нитчатым грибом, а именно АкрегдШик шдег.
Одним из объектов является аспарагиназа, полученная путем экспрессии вышеперечисленных полинуклеотидов и вектора в подходящей клетке-хозяине, например АкрегдШик шдег.
Другим из объектов является рекомбинантная аспарагиназа, содержащая функциональный домен вышеупомянутой аспарагиназы.
Способ получения заявленной аспарагиназы предусматривает стадии трансформации подходящей клетки-хозяина выделенным полинуклеотидом или вектором; культивирования указанной клетки в условиях, позволяющих экспрессию указанных полинуклеотидов; и, возможно, очистки кодируемых полипептидов из указанной клетки или культуральной среды.
Способ наработки вышеупомянутого полинуклеотида или вектора предусматривает стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом или указанным вектором, и выделения указанного полинуклеотида или указанного вектора из указанной клетки-хозяина.
Следующими объектами являются рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вышеупомянутый полинуклеотид или вектор, и рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид, представляющий собой указанную аспарагиназу.
Следующими объектами являются способ производства пищевого продукта и пищевой продукт, полученный по этому способу.
Способ производства пищевого продукта включает по меньшей мере одну стадию нагревания, предусматривающий добавление указанной аспарагиназы к полуфабрикату указанного пищевого продукта, причем аспарагиназу добавляют до указанной стадии нагревания в количестве, эффективном для снижения содержания аминокислот, присутствующих в указанном полуфабрикате пищевого продукта и вовлеченных в образование акриламида в течение указанной стадии нагревания. Пищевой продукт получают по меньшей мере из одного сырьевого растительного материала. Таким сырьевым растительным материалом является зерновая мука, предпочтительно пшеничная мука, альтернативно картофель.
«Промежуточная форма» пищевого продукта означает здесь любую форму, встречающуюся в процессе производства до получения конечной формы пищевого продукта. Промежуточная форма или полуфабрикат может включать отдельное используемое сырье, и/или их смесь, и/или смеси с добавками, и/или вспомогательные добавки, или их впоследствии обработанную форму. Например, для приготовления хлеба промежуточные формы включают, например, пшеницу, пшеничную муку, их первоначальную смесь с другими хлебными ингредиентами, такими как, например, вода, соль, дрожжи и добавки, улучшающие хлеб, смесь для теста, замешанное тесто, заквашенное тесто и частично выпеченное тесто.
Пищевой продукт может быть выполнен по меньшей мере из одного сырого растительного материала, например картофеля, табака, какао, риса; из зерновых, например пшеницы, ржи, кукурузы, маиса, ячменя, овсяной крупы, гречихи и овса. «Пшеница» здесь и ниже охватывает все известные сорта ТгШеиш депик, например аекйуиш, бигиш и/или креИа. Пищевые продукты более чем из одного сырьевого материала также включены в объем этого изобретения, например пищевые продукты, содержащие как пшеницу (муку), так и картофель.
Примерами пищевых продуктов, для которых пригоден способ по изобретению, являются любые мучные продукты, например хлеб, кондитерские изделия, торты, крендели, бублики; голландские медовые пирожки, булочки, имбирные пряники и хрустящие хлебцы, а также любые продукты на основе картофеля, например французский картофель, «пом-фрит», картофельные чипсы, крокеты.
Сырьевые материалы, описанные выше, содержат значительные количества аминокислот, вовлеченных в образование акриламида во время стадии нагревания в процессе получения продукта. Альтернативно, эти аминокислоты могут происходить из других источников, чем исходное сырье, например из белковых гидролизатов, таких как дрожжевой экстракт, соевые гидролизаты, казеиновые гидролизаты и т.п., которые используют в качестве добавок в процессе получения пищи. Предпочтительным производ
- 2 011438 ственным процессом является выпекание хлеба и других хлебобулочных изделий из пшеничной муки и/или из муки, полученной из других зерновых культур. Другим предпочтительным производственным способом является обжаривание во фритюре картофельных чипсов из ломтиков картофеля.
Предпочтительная стадия нагревания предусматривает, что по меньшей мере на часть промежуточного пищевого продукта, например на его поверхность, воздействует температура, которая способствует образованию акриламида, например, 110°С или выше, 120°С или выше.
Стадия нагревания в способе по изобретению может быть проведена в печи, например, при температуре 180-220°С для выпекания хлеба и других мучных продуктов или в масле для поджаривания картофельных чипсов, например, при 160-190°С.
Ферменты, используемые в способе по изобретению, предпочтительно являются ферментами, которые модифицируют боковые цепи аминокислот, участвующих в образовании акриламида во время термообработки в процессе производства, при этом продукты деградации указанных соединений не приводят или, по крайней мере, в меньшей степени приводят к образованию акриламида по сравнению с исходными формами аминокислот. Предпочтительно фермент модифицирует боковую цепь по меньшей мере одной из аминокислот: аспарагина, глутамина, цистеина, метионина, пролина, серина, фенилаланина, тирозина и/или триптофана. Фермент может быть добавлен в виде препарата фермента или может продуцироваться на месте микроорганизмами, способными продуцировать указанный фермент. Предпочтительно ферментативный препарат выделяют из микроорганизмов и получают в процессе ферментации. Микроорганизмом могут быть бактерии, грибы или дрожжи. В предпочтительном варианте изобретения способ предусматривает добавление аспарагиназы (ЕС 3.5.1.1) или глутаминазы (ЕС 3.5.1.2).
Аспарагиназа может быть получена из различных источников, таких как, например, растения, животные или микроорганизмы, например ЕксйебсЫа, Επνίπία. 81гер1отусек, Ркеиботопак, АкрегдШик и ВассШик. Примером подходящего вида ЕксйебсЫа является ЕксйепсШа сой. Примером подходящего вида Еттша является Епуйиа сйтукапШетт Примером подходящего вида 81тер1отусек является 81тер1отусек 1ЕШапк или 81тер1отусек титшик. Примерами подходящих видов АкретдШик являются АкретдШик огу/ае, АкретдШик шбШапк или АкретдШик шдег. Примерами подходящих видов ВасШик являются Васй1ик а1ка1орЫ1ик, ВасШик ату1о11диекас1епк, ВасШик όϊΌνίκ, ВасШик сбсШапк, ВасШик соади1апк, ВасШик 1аи1ик, ВасШик 1еп1ик, ВасШик Нсйешкогтщ, ВасШик теда1етшт, ВасШик к1еагоШеторЫ1ик, ВасШик киЫШк или ВасШик ШиппЦепкщ. Примеры подходящих способов получения аспарагиназы из штаммов ВасШик, 81тер1отусек, Ексйеба или Ркеиботопак описаны в \У0 03/083043. Однако в \У0 03/083043 не показано использование аспарагиназы для уменьшения количества акриламида в пище, как описано в настоящем изобретении. Предпочтительно использовать пищевые организмы, например АкретдШик шдет или Васй1ик киЫШк.
Согласно второму объекту изобретение предлагает новые полинуклеотидные последовательности, содержащие гены, которые кодируют новую аспарагиназу, которая, например, может быть получена из АкретдШик шдет. Новая аспарагиназа может быть использована в способе производства пищевых продуктов по изобретению, например, для получения выпечного продукта из теста.
Полинуклеотиды.
Изобретение также обеспечивает новые полинуклеотиды, кодирующие новые аспарагиназные ферменты. Настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие аспарагиназу, предварительно названную А8РА01, имеющую аминокислотную последовательность согласно 8ЕО ΙΌ N0:3 или ее функциональные эквиваленты. Последовательность гена, кодирующего А8РА01, была определена путем секвенирования геномного клона, полученного из АкретдШик шдет. Изобретение обеспечивает полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий А8РА01 аспарагиназу, а также полную последовательность ее кДНК и кодирующую ее последовательность. Соответственно, изобретение касается выделенного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2 или ее функциональные эквиваленты.
В частности, изобретение касается выделенного полинуклеотида, спообного гибридизироваться в строгих условиях, предпочтительно в очень строгих условиях с полинуклеотидом согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2. Предпочтительно такие полинуклеотиды могут быть получены из нитчатого гриба, в частности из АкретдШик шдет. Конкретнее, изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2.
Изобретение также касается выделенного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен полипептида согласно 8Е0 ΙΌ N0:3 или его функциональный эквивалент.
Как использовано здесь, термин «ген» и «рекомбинантный ген» означает молекулы нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которая включает открытую рамку считывания, кодирующую белок, например аспарагиназу А.шдет. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Кроме того, ген означает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, как она определена здесь.
- 3 011438
Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, например молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:1 или δΕΟ ΙΌ N0:2 или ее функциональный эквивалент, может быть выделена с использованием стандартной технологии молекулярной биологии и представленной здесь информации о последовательности. Например, используя всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты δΕΟ ΙΌ N0:1 или нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ N0:2 в качестве зонда для гибридизации, молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут быть выделены с использованием стандартной технологии гибридизации и клонирования (например, как описано в δαιηόΐΌοΚ. 1., ΕτΐΐδΕ, Ε.Ε. и ΜαηίαΙίδ. Т. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб еб., Со1б δρτίη^ НатЬот ЬаЬога1огу, Со1б δρτίη^ НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк, Со1б δρτίη^ НагЬог, ΗΥ, 1989).
Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая всю или часть последовательности δΕΟ ΙΌ N0:1 или δΕΟ ΙΌ N0:2, может быть выделена с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием синтетических праймеров, сконструированных на основе последовательностей, содержащихся в δΕΟ ΙΌ N0:1 или δΕΟ ΙΌ N0:2.
Нуклеиновая кислота по изобретению может быть амплифицирована с использованием кДНК, мРНК или, с другой стороны, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартной технологией ПЦР-амплификации. Амплифицированная нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована с помощью анализа ДНК-последовательности.
Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизирующиеся с нуклеотидной последовательностью по изобретению, могут быть получены с использованием стандартной технологии синтеза, например с использованием автоматического ДНК синтезатора.
В предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:2. Последовательность δΕΟ ΙΌ N0:2 соответствует кодирующей области ΑδΡΑ01 кДНК А.шдет. Эта кДНК содержит последовательность, кодирующую ΑδΡΑ01 полипептида А.шдет согласно δΕΟ ΙΌ N0:3.
В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ N0:1 или δΕΟ ΙΌ N0:2 или функциональным эквивалентам этих нуклеотидных последовательностей.
Молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная другой нуклеотидной последовательности, - это молекула, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности для ее гибридизации с этой другой нуклеотидной последовательностью, образуя таким образом стабильный дуплекс.
Один объект изобретения касается выделенных молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по изобретению или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также молекулы нуклеиновой кислоты, достаточные для использования в качестве гибридизационных проб для нахождения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептиды по изобретению, и фрагменты таких молекул нуклеиновой кислоты, пригодные для использования в качестве праймеров для ПЦР-амплификации или мутации молекул нуклеиновой кислоты.
«Выделенный полинуклеотид» или «выделенная нуклеиновая кислота» - это ДНК или РНК, которая не граничит непосредственно с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она может быть непосредственно смежной (одна на 5' конце и одна на 3' конце) в природном геноме организма, из которого она была выделена. Таким образом, в одном варианте выделенная нуклеиновая кислота включает все или некоторые 5'-некодирующие (например, промоторные) последовательности, которые непосредственно граничат с кодирующей последовательностью. Поэтому термин включает, например, встроенную в вектор рекомбинантную ДНК в автономно реплицирующейся плазмиде или вирусе, или в геномную ДНК прокариотов или эукариотов, или которые существуют как отдельные молекулы (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный с помощью ПЦР или после обработки рестрикционными эндонуклеазами), независимо от других последовательностей. Этот термин также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который в значительной степени свободен от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (когда его получают с использованием технологии рекомбинатной ДНК) или химических предшественников или других реагентов (когда его синтезируют химически). Кроме того, «выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты» - это фрагмент нуклеиновой кислоты, который не встречается в естественных условиях в качестве фрагмента и не может быть обнаружен в естественном состоянии.
Термины «полинуклеотид» или «молекула нуклеиновой кислоты» означают здесь, что они включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, созданные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием нуклеотидных аналогов или производных (например, инозина или фосфорно-тиолатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют основания с измененными свойствами образования пар или повышенной устойчивостью к нуклеазам.
- 4 011438
Другой вариант изобретения обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой к молекуле нуклеиновой кислоты А8РЛ01. например к кодирующей цепи молекулы нуклеиновой кислоты А8РА01. В объем изобретения также включены комплементарные цепочки молекул нуклеиновых кислот. указанных здесь.
Ошибки секвенирования.
Информацию о последовательностях. приведенную здесь. не следует понимать в узком смысле изза возможного наличия ошибочно определенных оснований. Конкретные последовательности. раскрытые здесь. могут быть легко использованы для выделения полного гена из нитчатого гриба. в особенности из А.шдет. который может быть подвергнут дальнейшему анализу последовательности. с определением при этом ошибок секвенирования.
Если не указано другое. то все нуклеотидные последовательности. определенные путем секвенирования ДНК. получены с использованием автоматического ДНК-секвенатора и все аминокислотные последовательности полипептидов. кодируемые ДНК молекулами. определенными здесь. предсказаны путем транслирования последовательности ДНК. определенной. как указано выше. Как известно. в любой последовательности ДНК. определенной с помощью автоматического ДНК-секвенатора. может содержаться некоторое количество ошибок. Нуклеотидные последовательности. определенные с помощью автомата. обычно являются по меньшей мере примерно на 90%. чаще от по меньшей мере около 95% до по меньшей мере около 99.9% идентичными действительной нуклеотидной последовательности секвенируемой молекулы ДНК. Исходная последовательность может быть более точно определена с использованием других методов. включая хорошо известное в данной области ручное секвенирование. Как также известно. единственная вставка (инсерт) или делеция в определенной нуклеотидной последовательности по сравнению с исходной последовательностью приведет к сдвигу рамки считывания нуклеотидной последовательности таким образом. что предсказанная аминокислотная последовательность. кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью. будет совершенно отличаться от аминокислотной последовательности. в действительности кодируемой секвенируемой молекулой ДНК. начиная от инсерта или делеции.
Специалист способен выявить такие ошибочно определенные основания и знает. как исправить такие ошибки.
Фрагменты нуклеиновых кислот. зонды и праймеры.
Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты. показанной в 8ЕО ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2. например фрагмент. который может быть использован в качестве зонда или праймера. или фрагмент. кодирующий часть белка А8РА01. Нуклеотидная последовательность. определенная из клонированного гена А8РА01 и кДНК. позволяет создать зонды и праймеры для использования при определении или/и клонировании других членов семейства А8РА01. а также гомологов А8РА01 из других видов. Зонд/праймер обычно содержит. по существу. очищенный олигонуклеотид. обычно содержащий область нуклеотидной последовательности. которая хорошо гибридизируется в строгих условиях к по меньшей мере около 12 или 15. предпочтительно около 18 или 20. предпочтительно около 22 или 25. еще предпочтительнее около 30. 35. 40. 45. 50. 55. 60. 65 или 75 или более последовательным нуклеотидам нуклеотидной последовательности. показанной в 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2 или их функциональных эквивалентов.
Зонды. основанные на нуклеотидных последовательностях А8РА01. могут быть использованы для определения транскриптов или геномных последовательностей А8РА01. кодирующих те же или гомологичные белки. например. в других организмах. В предпочтительном варианте эти зонды содержат меченые группы. прикрепленные к ним. например меченая группа может быть меченым изотопом. флуоресцентным соединением. ферментом или ферментативным кофактором. Такие зонды могут быть использованы в качестве составной части диагностического набора для идентификации клеток. которые экспрессируют белок А8РА01.
Идентичность и гомология.
Термин «гомология» или «процент идентичности» используется здесь взаимозаменяемо. Для целей этого изобретения здесь считается. что для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей эти последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например. в первую нуклеотидную или аминокислотную последовательность могут быть введены пробелы для оптимального выравнивания второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занята таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом. как и соответствующая позиция во второй последовательности. тогда в этой позиции молекулы идентичны. Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных позиций в обеих последовательностях (например. % идентичности = количество идентичных позиций/общее количество позиций (например. перекрывающихся позиций) х 100). Предпочтительно последовательности имеют одинаковую длину.
Специалисту известно несколько различных компьютерных программ. способных определить степень гомологии между двумя последовательностями. Например. сравнение последовательностей и опре
- 5 011438 деление степени идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математических алгоритмов. В предпочтительном варианте процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма №еб1етаи и Аипксй (1. Мо1. Вю1. (48):444-453 (1970)), включенного в программу САР в программном пакете ССС (доступен на 1Шр:/Л\л\лу.дс8.сот). использующий матрицу В1оккот 62 или матрицу РАМ250, и с размером пробела 16, 14. 12. 10. 8. 6 или 4 и размером отрезка 1. 2. 3. 4. 5 или 6. Специалист поймет. что все эти различные параметры приведут к слегка различным результатам. но общий процент идентичности двух последовательностей не будет значительно отличаться при использовании различных алгоритмов.
В еще одном варианте процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы САР в программном пакете ССС (доступен на 1Шр://\у\у\у.8сд.сот). с использованием матрицы ЫА8дарбпа.СМР и с размером пробела 40. 50. 60. 70 или 80 и размером отрезка 1. 2. 3. 4. 5 или 6. В другом варианте процент идентичности двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма Е. Меуегк и А. Мй1ет. САЬВЮ8. 4:11-17 (1989). включенного в программу АЫСЫ (версия 2.0) (доступна на 1Шр://уеда.щН.спгк.Гг/Ып/а1щп-диекк.сщ) с использованием весовой таблицы остатков РАМ120. штрафная длина пробела 12 и штрафной пробел 4.
Последовательности белков и нуклеиновых кислот по изобретению также могут использоваться в качестве «запрашиваемой последовательности» при поиске по открытым базам данных. например для поиска других членов семейства или сходных последовательностей. Такие поиски могут быть осуществлены с использованием программ ИВЬА8Т и ХВЬА8Т (версия 2.0) А1!кс1и1 е! а1. (1990) 1. Мо1. Вю1. 215:403-10. Поиск по нуклеотидам ВЬА8Т может быть осуществлен программой ΝΒΡ-Λ8Τ. коэффициент = 100. длина слова = 12 для получения нуклеотидных последовательностей. гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты А8РА01 по изобретению. Белковый поиск ВЬА8Т может быть осуществлен с программой ХВЬА8Т. коэффициент = 50. длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей. гомологичных белковым молекулам А8РА01 по изобретению. Для выравнивания молекул с использованием пробелов с целью сравнения может быть использован Сарреб ВЬА8Т. как описано в А1!кс1и1 е! а1. (1997). ШсШс Ас1бк Век. 25 (17):3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например. ХВЬА8Т и №ЬА8Т). См. 1Шр:/\у\у\у.псЫ.п1т.пП1.доу.
Гибридизация.
Как здесь используется. термин «гибридизация» подразумевает описание условий гибридизации и промывки. при которых нуклеотидные последовательности. имеющие по меньшей мере около 50%. по меньшей мере около 40%. по меньшей мере около 70%. более предпочтительно по меньшей мере около 80%. еще более предпочтительно по меньшей мере около от 85 до 90%. более предпочтительно по меньшей мере 95% гомологии по отношению друг к другу. обычно остаются гибридизированными друг к другу.
Предпочтительным. но не ограничивающим примером такой гибридизации является гибридизация в 6х хлориде натрия/цитрате натрия (88С) при около 45°С с последующей промывкой один или более раз в 1х 88С. 0.1% 8Ό8 при 50°С. предпочтительно при 55°С. предпочтительно при 60°С. еще предпочтительнее при 65°С.
«Очень строгие условия» включают. например. гибридизацию при 68°С в 5х 88С/5х растворе Денхардта/1.0% 8Ό8 и промывку в 0.2х 88С/0.1% 8Ό8 при комнатной температуре. Альтернативно. промывка может быть проведена при 42°С.
Специалисту также известно. какие условия нужно использовать для гибридизации в жестких и очень жестких условиях. Дополнительные указания в отношении таких условий легко доступны. например. из 8атЬтоок е! а1.. 1989. Мо1еси1аг С1ошид. А ЬаЬога!огу Мапиа1. Со1б 8рппд НатЬот Ргекк. Ν.Υ. и АикиЬе1 е! а1. (ебк.). 1995. Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду. (бойп АПеу&8опк. Ν.Υ.).
Конечно. полинуклеотиды. которые гибридизуются только к поли-А последовательности (такой как 3'-концевая поли-(А) последовательность мРНК) или к комплементарным отрезкам Т (или и) остатков. не могут быть включены в полинуклеотиды по изобретению. используемые для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению. поскольку такие полинуклеотиды могут гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты. содержащей поли-(А) хвост или его комплемент (например. практически любой двухцепочечный клон кДНК).
Выделение ДНК полной длины из других организмов.
При обычном подходе может быть проведен скрининг библиотек кДНК других организмов. например нитчатого гриба. в частности. рода АкретдШик.
Например. с помощью Нозерн-блоттинга можно провести поиск гомологов полинуклеотида А8РА01 в штамме АкретдШик. При обнаружении транскриптов. гомологичных полинуклеотидам по изобретению. библиотеки кДНК могут быть созданы из РНК. выделенной из подходящего штамма. используя стандартные технологии. известные специалисту. Альтернативно. можно провести скрининг всей геномной библиотеки ДНК с использованием зонда. способного гибридизироваться к полинуклеотиду
- 6 011438
А8РА01 по изобретению.
Гомологичные генные последовательности могут быть выделены, например, с использованием ПЦР и двух пулов праймеров вырожденных олигонуклеотидов, последовательность которых основана на нуклеотидных последовательностях, приведенных здесь.
Шаблоном для реакции может служить кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, которые, как известно или предположительно, экспрессируют полинуклеотиды по изобретению. ПЦР-фрагмент может затем быть клонирован и секвенирован для подтверждения, что амплифицированная последовательность представляет собой новую нуклеотидную последовательность А8РА01 или его функциональный эквивалент.
ПЦР-фрагмент может затем использоваться для выделения клона полных последовательностей кДНК с использованием различных известных методов. Например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофагов или космид. Альтернативно, меченый фрагмент может использоваться для скрининга геномной библиотеки.
Технология ПЦР может использоваться для выделения полной последовательности кДНК из других организмов. Например, РНК может быть выделена с использованием стандартных процедур, из подходящего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть осуществлена на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного к большей части 5' конца амплифицированного фрагмента для начала синтеза первой цепи.
Образовавшийся в результате гибрид РНК/ДНК может быть достроен (например, гуанинами) с использованием стандартной концевой трансферазной реакции, гибрид может быть расщеплен с использованием РНазы Н, а затем может быть инициирован синтез второй цепи (например, поли-С праймером). Таким образом, кДНК последовательности, расположенные перед амплифицированным фрагментом, могут быть легко получены. Для обзора полезных стратегий клонирования, см. выше, например, 8атЬтоок е! а1. и АизиЬе1 е! а1.
Кодирует ли гомологичный фрагмент ДНК или нет функциональный белок А8РА01, может быть легко установлено известными в данной области методами.
Векторы.
Еще один объект изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессионным векторам, содержащим нуклеотидную кислоту, кодирующую белок А8РА01 или его функциональный эквивалент. Как использовано здесь, термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она была присоединена. Одним типом «вектора» является «плазмида», которая означает кольцевую замкнутую двухцепочечную ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, когда добавочная ДНК лигирована в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клеток-хозяев после введения в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с клеточным геномом. Кроме того, некоторые векторы способны экспрессировать гены, к которым они лигированы. Такие векторы называются здесь «экспрессионными векторами». Наиболее часто в технологии рекомбинантной ДНК экспрессионные векторы используют в виде плазмид. Термины «плазмида» и «вектор» могут быть использованы здесь взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее используемой формой вектора. Однако подразумевается, что изобретение включает другие формы экспрессионных векторов, такие как вирусные векторы (например, реплицирующиеся измененные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые служат для тех же целей.
Рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению содержат нуклеиновую кислоту изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, это означает, что рекомбинантный экспрессионный вектор включает одну или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе клетки-хозяина, используемой для экспрессии, которые оперативно присоединяются к экспрессируемой последовательности нуклеиновой кислоты. В рекомбинантном экспрессионном векторе «оперативное присоединение» означает, что требуемая нуклеотидная последовательность присоединяется к регуляторным(ому) элементам(у) таким образом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в ίη νίίτο системе транскрипции/трансляции, или в клеткехозяине, когда вектор вводят в клетку-хозяина). Термин «регуляторная последовательность» охватывает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Сепе Ехртеззюп Тес1шо1оду: МеШобз ίη Епхуто1оду 185, Асабет1с Ргезз, 8ап О1едо, СА (1990). Регуляторные последовательности включают те, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и те, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалисту будет понятно, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и
- 7 011438
т.д. Экспрессионные векторы по изобретению могут вводиться в клетки-хозяева для получения белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, как описано здесь (например, белка А8РА01, мутантных форм белка А8РА01, фрагментов, вариантов или их функциональных эквивалентов и т.д.).
Рекомбинантный экспрессионный вектор по изобретению может быть сконструирован для экспрессии белков А8РА01 в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белок А8РА01 может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как Ε.οοίί, клетках насекомых (с использованием экспрессионных векторов на основе бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева подробно описаны в Сосббск Сспс Εχρκκκίοη Тесйио1о§у: Мебюбк ίη Επζνιηοίοβν 185, Асабетю Ргекк, 8ап О|едо. СА (1990). С другой стороны, рекомбинантный экспрессионный вектор может быть подвергнут транскрипции и трансляции ίη νίΐτο, например, с использованием Т7 промотора и Т7 полимеразы.
Экспрессионные векторы, полезные в настоящем изобретении, включают хромосомальные, эписомальные или вирусные векторы, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы вакцинии, аденовирусы, вирусы птичьей оспы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные из их комбинаций, такие как космиды и фагемиды, полученные из комбинации генетических элементов плазмид и бактериофагов.
ДНК-инсерт должен быть оперативно соединен с подходящим промотором, таким как промотор РЬ фага лямда, 1ас, ΐτρ, 1ас промоторы Ε^ο1ί, ранние и поздние промоторы 8У40 и некоторое количество ретровирусных ЬТК. промоторов. Другие подходящие промоторы известны специалисту. Особенно предпочтительны промоторы, которые позволяют обеспечить высокий уровень экспрессии аспарагиназы в нитчатых грибах. Такие промоторы известны. Экспрессионные конструкции могут содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелого транскрипта, экспрессируемого этой конструкцией, будет включать инициатор трансляции АИС в начале и терминирующий кодон в конце транслируемого полипептида.
Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычной технологии трансформации и трансфекции. Предполагается, что используемые здесь термины «трансформация» и «трансфекция» относятся к различным методам введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая кальций-фосфатное и кальций-хлоридное совместное осаждение, трансфекция с помощью ДЭАЭ-декстрана, трансдукция, инфицирование, липофекция, катионно-липидная трансфекция или электропорация. Подходящие методы для трансформирования или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в ΞαιηόΐΌοΕ е1 а1. (Μο^ιιΟι· Ο1οηίη§: А ΡηόοπιΙοιν Мапиа1, 2'1 еб. СЫб 8ρτίη§ Ηπγ6ογ ^аЬο^аΐο^у, ^16 8ρτίη§ Ηπγ6ογ ΡπόοπιΙοιν Ргекк, ^16 8ρπη§ ΜηΛοη ΝΥ, 1989), Οπνίκ е1 а1., Вакю Мебюбк ίη ΜοΒαιΟΓ Βίο1οβ\· (1986) и в других лабораторных руководствах.
Известно, что при стабильной трансфекции клеток млекопитающих в зависимости от экспрессионного вектора и метода трансфекции, чужеродная ДНК может встроиться в геном только небольшого количества клеток. Чтобы определить и выделить эти встроенные элементы, ген, кодирующий селективный маркер (например, устойчивость к антибиотикам), обычно вводят в клетку-хозяина наряду с интересующим геном. Предпочтительными селекционными маркерами являются те, которые кодируют устойчивость к лекарствам, такие как С418, гидромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селективные маркеры, может быть введена в клетку-хозяина в том же векторе, который кодирует белок А8РА01, или может быть введена в отдельном векторе. Клетки, устойчиво трансфецированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть отобраны по устойчивости к лекарствам (например, клетки, в которые встроен ген селективного маркера, выживут, тогда как другие клетки погибнут).
Экспрессию белков в прокариотах зачастую осуществляют в клетках Е.той с помощью векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, контролирующие экспрессию белков.
Как уже сказано, предпочтительно, чтобы экспрессионные векторы содержали селективные маркеры. Для культуры эукариотических клеток такими маркерами являются дегидрофолат редуктаза или устойчивость к неомицину и тетрациклиновая или ампицилиновая устойчивость для Е.отй и других бактерий. Характерными примерами подходящих хозяев являются бактериальные клетки, такие как Е^й, ЗЧерФтусек и 8а1тοηе11а Κρίιίιηιιπιιιη; клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Ώτο^ρ^ίΗ 82 и 8ροбορΐе^а 8£9; клетки животных, таких как СНО, СО8 и меланома Бовеса; и клетки растений. Подходящая культуральная среда и условия культивирования для вышеупомянутых клеток-хозяев известны.
Предпочтительными векторами для использования в бактериях являются ρΟΕ70, ρΟΕ60 и РОЕ-9, доступные от О1адещ ρΒ8 векторы, Рйадекс^^ρΐ векторы, В1иексг1|э1 векторы, ρNΗ8А, ρNΗ16А, ρNΗ18А, ρNΗ46А, доступные от 81га1аде1те; и ρΐ^с99а, ρΚΚ223-3, ρΚΚ233-3, ρΌΚ.540, ρΡΙΤ5 доступные от Рйатташа. Предпочтительными эукариотическими векторами являются Р^к-ΝΕΟ, ρ8V2САТ, ρΟΟ44, ρΖΤ1 и ρ80, доступные от 81га(аде1те; и ρ8ΥΚ3, ρΒРV, ρΜ8Ο и ρ8νΕ, доступные от Рйаттааа. Другие подходящие векторы могут быть легко оценены специалистом.
- 8 011438
Среди известных бактериальных промоторов для использования в настоящем изобретении подходят 1ас1 и 1ас2 промоторы Е.соИ, Т3 и Т7 промоторы, др! промотор, лямбда промоторы РК, РЬ и ίτρ промотор, промотор тимидинкиназы Н8У, ранние и поздние промоторы 8У40, ЬТК промоторы ретровирусов, такие как промоторы вируса саркомы Рауса («К8У»), и металлотионеиновые промоторы, такие как металлотионеиновый промотор-Ι мыши.
Транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды по изобретению в высших эукариотах, может быть усилена за счет вставки энхансерных последовательностей в вектор. Энхансеры являются цисдействующими элементами ДНК, действующими в пределах от 10 до 300 Ьр (пар оснований) для усиления транскрипционной активности промотора данного типа клетки-хозяина. Примеры энхансеров включают 8У40 энхансер, который расположен в поздней области инициации репликации между 100 и 270 Ьр (пар оснований), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы из поздней области инициатора репликации, энхансеры аденовирусов.
Для секреции транслируемых белков в люмен эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное окружение подходящий секреторный сигнал может быть вставлен в экспрессируемый полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерогенными.
Полипептиды могут быть экспрессированы в модифицированной форме и могут включать не только секреторный сигнал, но и также добавочные функциональные гетерологичные области. Такие как, например, область добавочных аминокислот, особенно заряженных аминокислот, может быть добавлена к Ν-концу полипептида для увеличения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующих манипуляций и хранения. Также фрагменты пептидов могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки.
Полипептиды по изобретению.
Изобретение предлагает выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8ЕО ΙΌ N0:3, аминокислотную последовательность, полученную экспрессией полинуклеотида 8Е0 ΙΌ N0:3 в подходящем хозяине, а также аминокислотную последовательность, полученную экспрессией полинуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 в подходящем хозяине. Также пептиды или полипептиды, содержащие функциональные эквиваленты вышеприведенных полипептидов, включены в настоящее изобретение. Вышеприведенные полипептиды охвачены выражением «полипептиды по изобретению».
Термины «пептид» и «олигопептид» считаются синонимами (что общепризнано) и каждый из них может использоваться взаимозаменяемо, в зависимости от контекста, для указания цепи по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидной связью. Слово «полипептид» используется здесь для цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все формулы олигопептидов, или полипептидов, или последовательности написаны здесь справа налево в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Однобуквенное обозначение аминокислот, используемое здесь, широко известно и может быть найдено в 8ашЬтоок, е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 2пб еб. Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ, 1989).
Подразумевается, что «выделенный» полипептид или белок является полипептидом или белком, выделенным из природного источника. Например, рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются выделенными для целей изобретения как природные или рекомбинантные полипептиды, по существу, очищенные с использованием любой подходящей технологии, такой как, например, одностадийный метод очистки, описанный 8ιηί11ι и 1ойпкоп, Сепе, 67:31-40 (1988).
Аспарагиназа А8РА01 по изобретению может быть получена и очищена из культуры рекомбинантных клеток хорошо известными методами, включающими осаждением сульфатом аммония или этанолом, кислая экстракция, анионно- или катионнообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, гидрофобная хроматография, хроматография на гидроксиапатите и хроматография с использованием лектина. Наиболее предпочтительной для выделения является высокоэффективная жидкостная хроматография («ВЭЖХ»).
Полипептиды по изобретению включают естественно очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантной технологией из прокариотических или эукариотических хозяев, включающих, например, бактерии, дрожжи, высшие растения, насекомые и клетки млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого для получения рекомбинантных продуктов, полипептиды по изобретению могут быть либо гликозилированы, либо нет. Помимо этого, в некоторых случаях в результате процессов в клетке-хозяине полипептиды по изобретению могут включать инициирующий модифицированный остаток метионина.
Фрагменты белков.
Изобретение также касается биологически активных фрагментов полипептидов по изобретению.
Биологически активные фрагменты полипептида по изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или полученные из аминокислотной последовательности белка А8РА01 (например, аминокислотная последовательность 8Е0 ΙΌ N0:3),
- 9 011438 которые включают меньше аминокислот, чем белок полной длины, и обладают по меньшей мере одной биологической активностью соответствующего белка полной длины. В основном биологически активные фрагменты содержат домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка А8РА01.
Биологически активный фрагмент белка по изобретению может быть полипептидом, который содержит, например, 10, 25, 50, 100 или больше аминокислот. Кроме того, другие биологически активные части, в которых удалены другие области белка, могут быть получены с помощью рекомбинантной техники и оценены на наличие одной или нескольких биологических активностей исходной формы полипептида по изобретению.
Изобретение также включает фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные выше активные фрагменты белка А8РА01.
Функциональные эквиваленты.
Термин «функциональные эквиваленты» и «функциональные варианты» используются здесь взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК А8РА01 являются выделенными фрагментами ДНК, которые кодируют полипептиды, которые проявляют специфическую активность аспарагиназы А8РА01 А.шдет, как описано здесь. Функциональные эквиваленты полипептида А8РА01 по изобретению являются полипептидами, которые обладают по меньшей мере одной функцией аспарагиназы А.шдет, как описано здесь. Функциональные эквиваленты также включают биологически активные фрагменты.
Эквиваленты функциональных белков или полипептидов могут содержать только консервативные замены одной или более аминокислот 8ЕО ΙΌ N0:3 или замены, вставки или делеции несущественных аминокислот. Следовательно, несущественными аминокислотами являются остатки, которые могут быть изменены в 8Е0 ΙΌ N0:3 без значительного изменения биологической активности. Например, остатки аминокислот, которые консервативны среди белков А8РА01 настоящего изобретения, по-видимому, не подвержены изменениям. Более того, аминокислоты, консервативные среди белков А8РА01 в соответствии с настоящим изобретением и других аспарагиназ, вероятно, не подвержены изменениям.
Подразумевается, что термин «консервативная замена» обозначает замену, в которой остаток аминокислоты заменен остатком аминокислоты, обладающим сходной боковой цепью. Эти семейства известны и включают аминокислоты с основной боковой цепью (например, лизин, аргинин и гистидин), кислой боковой цепью (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженной полярной боковой цепью (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярной боковой цепью (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленной боковой цепью (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматической боковой цепью (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Функциональные эквиваленты нуклеиновой кислоты могут обычно содержать молчащие мутации или мутации, которые не влияют на биологическую активность кодируемых полипептидов. Таким образом, изобретение предоставляет молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки А8РА01, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, не существенные для целевой биологической активности. Такие А8РА01-белки по своей аминокислотной последовательности отличаются от 8Е0 ΙΌ N0:3, однако все еще сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, в которой белок содержит в значительной степени гомологичную аминокислотную последовательность с, по меньшей мере около, 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологией с аминокислотной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0:3.
Например, указания относительно выполнения фенотипически незаметной аминокислотной замены есть в Во\\зе. 1.И. е! а1., 8с1еисе 247:1306-1310 (1990), в котором автор указывает, что существует два подхода для изучения толерантности аминокислотных последовательностей к изменению. Первый метод основан на процессе эволюции, при котором мутации либо сохраняются, либо удаляются в процессе естественного отбора. Второй подход использует генную инженерию для введения аминокислотных изменений в нужную позицию клонированного гена и селекции или поиска для нахождения последовательностей, которые сохраняют функциональность. Как утверждают авторы, эти исследования показали, что белки удивительно толерантны к аминокислотным заменам. Авторы, кроме того, указывают, какие изменения в определенной позиции белка, вероятно, будут допустимы. Например, большинство углубленных аминокислотных остатков требует неполярных боковых цепей, тогда как лишь немногие признаки боковых цепей на поверхности являются консервативными. Другие такие фенотипически незаметные мутации описаны выше в Во\\зе е! а1. и в ссылках, цитируемых в этой публикации.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая А8РА01-белок, гомологичный белку согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, может быть получена с помощью введения одной или нескольких нуклеотидных замен, вставок или делеций в кодирующую нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2, так что одна или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводятся в кодирующий полипептид. Такие мутации могут быть введены с использованием стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез и мутагенез с использованием ПЦР.
Термин «функциональные эквиваленты» включает также ортологи белка А8РА01 А.шдет. Ортологами белка А.шдет А8РА01 являются белки, которые могут быть выделены из других штаммов или ви
- 10 011438 дов и обладающие сходной или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут быть легко определены по аминокислотной последовательности, в значительной степени гомологичной 5ЕО ΙΌ N0:3.
Как определено здесь, термин «значительная гомология» относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов по отношению ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности таким образом, что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности обладают общим доменом. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, обладают около 40%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, еще более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности или более, как определено здесь как достаточная идентичность.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие других членов семейства Л8РЛ01, которые обладают нуклеотидной последовательностью, отличающейся от 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2, также входят в объем изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Л8РЛ01 из различных видов, которые имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2, также входят в объем изобретения.
Молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологичные ДНК Л8РЛ01 по изобретению, могут быть выделены на основании их гомологии к нуклеиновой кислоте Л8РЛ01, описанной здесь, с использованием кДНК, описанных здесь, или ее подходящего фрагмента в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартной технологией гибридизации, предпочтительно в очень жестких гибридизационных условиях.
В дополнение к встречающимся в природе аллельным вариантам последовательности Л8РЛ01, как известно специалисту, изменения могут быть введены в нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2 путем мутации, обеспечивая изменения в аминокислотной последовательности белка Л8РЛ01 без существенного изменения функции белка Л8РЛ01.
Еще один объект изобретения касается улучшенного белка Л8РЛ01. Улучшенными белками Л8РЛ01 являются такие белки, в которых по меньшей мере одна биологическая активность улучшена. Такие белки могут быть получены с помощью статистических (неупорядоченных) мутаций на протяжении всей или только части кодирующей последовательности Л8РЛ01, например с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты можно рекомбинантно экспрессировать и проверить на биологическую активность. Например, есть стандартные процедуры для измерения ферментативной активности аспарагиназы и, таким образом, улучшенные белки могут быть легко обнаружены.
В предпочтительном варианте белок Л8РЛ01 обладает аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:3. В другом варианте Л8РЛ01 полипептид в значительной степени гомологичен аминокислотной последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:3 и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, но отличается по аминокислотной последовательности вследствие природных вариаций или мутагенеза, как описано выше.
В дополнительном предпочтительном варианте белок Л8РЛ01, обладающий аминокислотной последовательностью, кодируемой выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты, способным гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:2, предпочтительно в жестких гибридизационных условиях.
Таким образом, белком Л8РЛ01 является белок, который содержит аминокислотную последовательность, гомологичную аминокислотной последовательности, указанной в 8Е0 ΙΌ N0:3, примерно на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида 8Е0 ΙΌ N0:3.
Функциональные эквиваленты белка по изобретению могут также быть обнаружены, например, с помощью скрининга комбинаторных библиотек мутантов, например усеченных мутантов, белка по изобретению на наличие аспарагиназной активности. В одном варианте разнообразная библиотека вариантов получается с использованием комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот. Различная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов с последовательностью генов. Полученный таким образом вырожденный набор потенциальных белковых последовательностей экспрессируется в виде отдельных полипептидов. Существуют различные методы, которые могут быть использованы для получения библиотеки возможных вариантов полипептидов по изобретению из вырожденных нуклеотидных последовательностей. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны (см., например, №1гапд (1983), Те!гаПеПгои 39:3; Пакша е! а1. (1984), Лили. Веу. ВюсПеш. 53:323; Пакита е! а1. (1984), 8с1еисе 198:1056; Ле е! а1. (1983), №с1ею Лс1П Век. 11:477).
Кроме того, библиотека фрагментов кодирующих последовательностей полипептида по изобретению может быть использована для получения разнообразной популяции полипептидов для последующего поиска вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующих последовательностей может быть получена обработкой двухцепочечных ПЦР-фрагментов интересующих кодирующих последовательностей нуклеазой в условиях, при которых за 1 мин происходит образование только одного ника примерно
- 11 011438 на одну молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией ДНК для образования двухцепочечных ДНК, которые могут включать смысловые/антисмысловые пары из различных никированных продуктов, удалением одноцепочечных частей в образовавшихся дуплексах обработкой нуклезой 81 и встраиванием образовавшихся фрагментов библиотеки в экспрессионный вектор. Таким образом может быть получена экспрессионная библиотека, кодирующая Ν-концевые и внутренние фрагменты различных размеров интересующего белка.
Известно несколько методов скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных с помощью точечных мутаций усечения и для поиска генных продуктов, обладающих выбранными свойствами в библиотеке кДНК. Наиболее широко используемые технологии, которые подходят для проведения большого количества анализов, для скрининга больших генных библиотек, обычно включают клонирование генных библиотек в реплицирующиеся экспрессионные векторы, трансформирование подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых определение желаемой активности облегчает выделение векторов, кодирующих гены, продукт которых был обнаружен. Рекурсивный множественный мутагенез - метод, увеличивающий частоту функциональных мутантов в библиотеке, может быть использован вместе со скринингом для идентификации вариантов белка по изобретению (Аткш и Уоитуаи (1992), Ргос. N311. Лсаб. 8с1. И8Л, 89:7811-7815; Эе1дгауе е! а1. (1993), Рго1еш Епдшеетшд, 6 (3):327-331).
Помимо последовательности гена А8РА01, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0:1, специалисту понятно, что полиморфизм последовательности ДНК, который может приводить к изменениям аминокислотной последовательности белка А8РА01, может существовать в данной популяции. Такой генетический полиморфизм может существовать в клетках из различных популяций, или внутри одной популяции из-за естественных аллельных вариантов. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты.
Фрагменты полинуклеотида по изобретению могут также содержать полинуклеотиды, которые не кодируют функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут использоваться в качестве зондов или праймеров для ПЦР-реакции.
Нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут использоваться в качестве гибридизационных зондов или в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использование молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, которые не кодируют полипептиды, обладающие активностью А8РА01, включает, среди прочего, (1) выделение генов, кодирующих белок А8РА01 или его аллельные варианты, из библиотеки кДНК, например, из другого организма, чем А.шдет; (2) гибридизацию на месте (например, ΡΙ8Η) с веретенами метафазной хромосомы для нахождения точного местоположения гена А8РА01 на хромосоме, как описано в Уетша е! а1., Нитап Сйтотокотек: а Мапиа1 о£ Вакю Тесйшдиек, Регдатоп Ргекк, №\ν Уогк (1988); (3) Нозерн-блоттинг для определения экспрессии мРНК А8РА01 в отдельной ткани и/или клетке и (4) зонды и праймеры, которые могут быть использованы в качестве диагностических инструментов для анализа присутствия нуклеиновых кислот, гибридизируемых к зонду А8РА01 в данном биологическом образце (например, ткани).
Изобретение также охватывает способ получения функциональных эквивалентов гена А8РА01 или кДНК. Этот способ предусматривает получение меченых зондов, которые включают выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или только часть последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:3 или ее вариант; скрининг меченым зондом библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты в условиях, позволяющих гибридизацию зонда к фрагменту нуклеиновой кислоты библиотеки с образованием нуклеотидного дуплекса, и получение последовательности полноразмерного гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченом дуплексе для получения генов, относящихся к гену А8РА01.
В одном варианте нуклеиновая кислота А8РА01 по изобретению гомологична последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в 8ЕЦ ΙΌ N0:1, 8ЕЦ ΙΌ N0:2 или их комплементам по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более.
В другом предпочтительном варианте полипептид А8РА01 по изобретению по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, приведенной в 8ЕЦ ΙΌ N0:3.
Клетки-хозяева.
В другом варианте изобретение характеризует клетки, например трансформированные клеткихозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, охватываемую изобретением. «Трансформированная клетка» или «рекомбинантная клетка» является клеткой, в которую (или в предшественник которой) была введена, с использованием технологии рекомбинантной ДНК, нуклеиновая кислота по изобретению. Эта клетка охватывает как прокариоты, так и эукариоты, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., но особенно предпочтительны клетки нитчатых грибов, в частности АкретдШик шдет.
Может быть выбрана клетка-хозяин, которая модулирует экспрессию вставленной последовательности или модифицирует и обрабатывает генный продукт специфичным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (процессинг) (например, усечение) белкового
- 12 011438 продукта могут способствовать оптимальному функционированию белка.
Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфическими механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и генетических продуктов. Подходящие клеточные линии или клеточные системы известны специалисту в молекулярной биологии и/или микробиологии и могут быть выбраны для получения желаемой и корректной модификации и процессинга экспрессируемых чужеродных белков. С этой целью могут использоваться эукариотические клетки-хозяева, которые содержат клеточный инструментарий для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генетического продукта. Такие клетки хорошо известны.
Клетки-хозяева также включают, но без ограничения этим, клеточные линии млекопитающих, такие как СНО, ΥΕΚ.Ο, ВНК, НеЬа, СО8, МОСК, 293, 3Т3, ν138 клеточная линия хориоидального сплетения.
Если требуется, полипептиды по изобретению могут быть получены с использованием стабильно трансфецированных клеточных линий. Векторы, подходящие для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, доступны, а методы получения таких клеточных линий также известны, например, из Ли8иЬе1 е1 а1. (см. выше).
Еще один объект изобретения касается пищевых продуктов, полученных способом по изобретению, как описано выше, или с использованием новой аспарагиназы, как описано выше, для производства пищевых продуктов. Эти пищевые продукты характеризуются значительно пониженным содержанием акриламида по сравнению с пищевыми продуктами, полученными с помощью способов, которые не предусматривают добавления одного или больше ферментов в количестве, эффективном для значительного снижения содержания аминокислот, вовлеченных в образование акриламида во время указанной стадии нагревания. Способ по изобретению может быть использован для получения пищевых продуктов, содержащих меньше акриламида, предпочтительно более чем на 50%, предпочтительнее более чем на 20%, еще предпочтительнее более чем на 10% и наиболее предпочтительно более чем на 5% по сравнению с пищевыми продуктами, полученными с использованием традиционного способа.
Материалы и методы.
Измерение акриламида.
Предварительная обработка образцов.
600 мг высушенного и гомогенизированного образца экстрагируют 5 мл воды ιηίΐΐίρ. 1 мкг внутреннего стандарта 13С3 акриламида в растворе (С1Ь) добавляют к экстракту. После 10 мин центрифугирования (6000 об/мин) 3 мл верхнего слоя переносят в колонку Ех1те1ии1-3ВТ (Мегск). Акриламид элюируют из колонки 15 мл этилацетата. Этилацетат упаривают под слабым потоком азота приблизительно до 0,5 мл.
Условия хроматографирования.
Раствор этилацетата анализируют с использованием газовой хроматографии. Разделение осуществляют на колонке СР-^ах 57 (Уапаи) (длина 25 м, внутренний диаметр 0,32 мм, пленка 1,2 мкм). В качестве газа-носителя используют гелий с постоянным потоком 5,4 мл/мин. Инжекцию пробы 3 мкл осуществляют без расщепления. Температуру в камере поддерживают 50°С в течение 1 мин, затем температуру повышают со скоростью 30°С/мин до 220°С. После поддержания температуры 220°С в течение 12 мин камеру охлаждают и стабилизируют до следующей инжекции. Детектирование осуществляют поточной масс-спектрометрией химической ионизации с регистрацией положительных ионов, используя метан в качестве ионизирующего газа. Характерные ионы м/з 72 (акриламид) и м/з 75 (13С3 акриламид) отслеживают для количественного определения.
Использованное оборудование.
ГХ НР6890 (11е\\1е1 Раскатб)
МСД (селективный детектор масс) НР5973 (Не\\'1е1 Раскатб)
Измерение аспарагиназной активности.
Аспарагиназную активность измеряли в соответствии с 8ЫгГтш е1 а1. (81нгГг1п, 8., Ратгой, С.Ь., ЬиЬогаку, 8.\ν. (1974), 1оита1 оГ Вю1одка1 СйешИйу 249, 1445-1340). В основу определения ферментативной активности было положено измерение ИН3, высвобождаемого аспарагиназной активностью.
Для измерения выделившегося ИН3 использовали следующий список реактивов.
Раствор А 0,1 М лимонная кислота + 0,2 М Иа2НРО4 2Н2О рН 5,5
Раствор В 0,189 М Ь-аспарагин (81дша)
Раствор С 0,006 М (ИН4)28О4 (Мегск)
Раствор Ό 25% (ν/ν) трихлоруксусная кислота (Мегск)
Раствор Е Цветной реагент на аммоний (А1бпс11)
Для измерения аспарагиназной активности растворы должны быть свежими.
В табл. 1 суммированы растворы, используемые для калибровочной кривой (ТК = точка калибровки).
- 13 011438
Таблица 1
Список калибровочных растворов
Растворы в соответствии с табл. 1 немедленно инвертировали и инкубировали при 37°С инвертированными. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 0,1 мл раствора Ό. Для эталонного ферментативного анализа затем добавляли 0,1 мл раствора фермента. Раствор немедленно перемешивали и центрифугировали для удаления любого осадка. 0,2 мл надосадочной жидкости отбирали в пробирку, содержащую 4,3 мл деионизированной воды и 0,5 мл раствора Е. Эту смесь немедленно перемешивали и после 1 мин измеряли при А 436 нм для калибровки образцов, эталонов и тестов.
Калибровочную кривую строили следующим образом:
ДА436 нм точка калибровки = А436 точка калибровки - А436 точка калибровки 1. Стандартную кривую строили из зависимости ДА436 нм стандарта от концентрации аммония (ΝΗ3).
Ферментативную активность рассчитывали следующим образом:
ДА436 нм ферментативного теста = А436 нм тест - А436 нм эталонного теста.
Определение мкмоль высвобождаемого ΝΗ3 с использованием стандартной кривой:
„. , мкмоль высвобождаемого ΝΗ-, х К
Единиц! мл ---------------------------е---ГХЛХЕ где У8 = объем реакционного раствора (по графику + 0,1 мл раствора Ό), 2,2 мл;
V = объем реакционного раствора, используемого во второй реакции для определения ΝΗ3, 0,2 мл;
11 = время инкубации, 30 мин;
Уе = объем образца фермента, используемого для тестирования, 0,1 мл.
Удельная ферментативная активность = (единиц/мл фермента)/(мг белка/мл фермента).
Одна единица аспарагиназной активности определялась как 1 мкмоль ΝΗ3, высвобождаемого из Ь-аспарагина за 1 мин при рН 5,5 при 37°С, если не указано иное. рН хлебного теста составляет около 5,5, поэтому это рН является предпочтительным для измерения. Однако для других субстратов с различными уровнями рН предпочтительно использовать эти уровни рН для определения аспарагиназной активности.
Количество в миллионных долях (ррт) указано из расчета на количество муки, если не указано иное.
Материалы.
Аспарагиназа была получена из ЕксйепсЫа сой (81дта, удельная активность 285 ед./мг), Επνίηία сНгукапИепН (81дта, удельная активность 100 ед./мг), ВасШик киЫШк или АкретдШик шдет (см. примеры условий ферментации).
Среда С8Ь содержала (в количестве на 1 л):
100 г Согп 81еер 8о1Ык (РоциеПе).
г NаΗ2ΡО4хΗ2О,
0,5 г Мд8О4х7Н2О, г глюкозыхН2О и
0,25 г ВакШоп (противопенный агент).
Компоненты растворяли в деминерализованной воде и доводили рН до 5,8 с помощью №1ОН или Н28О4; в 100 мл колбы с экраном и поплавком для пены разливали 20 мл ферментативного бульона и стерилизовали при 120°С 20 мин, затем после охлаждения до комнатной температуры в каждую колбу было добавлено 200 мкл раствора, содержащего 5000 ΐυ/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина.
- 14 011438
Среда С8М содержала (в количестве на 1 л):
150 г мальтозыхН2О, г 8оу1опе (пептон), г ЫаН2РО4хН2О, г Мд8О4х7Н2О,
0,08 г Т\гееп 80,
0,02 г Вакййоп (противопенный агент), г МЕ8, г Ь-аргинина.
Компоненты растворяли в деминерализованной воде и доводили рН до 6,2 с помощью ЫаОН или Н28О4; в 500 мл колбы с экраном и поплавком для пены разливали по 100 мл ферментативного бульона и стерилизовали при 120°С в течение 20 мин, затем после охлаждения до комнатной температуры в каждую колбу было добавлено 200 мкл раствора, содержащего 5000 ΐυ/мл пенициллина и 5000 ΐυ/мл стрептомицина.
Пример 1. Ферментация АкрегдШик шдег.
Аспарагиназа, кодируемая приведенной здесь нуклеотидной последовательностью, была получена путем конструирования экспрессионной плазмиды, содержащей последовательность ДНК, трансформированием этой плазмидой штамма А.шдег и выращиванием штамма АкрегдШик шдег в следующих условиях.
Свежими спорами (108-107) штамма А.шдег инокулировали 20 мл среды С8Ь (100 мл колба с экраном) и рост в течение 20-24 ч при 34°С и 170 об/мин. После инокуляции 5-10 мл С8Ь предкультуры в 100 мл среды С8М (500 мл колба с экраном) штаммы ферментировали при 34°С и 170 об/мин в течение 3-5 дней.
С помощью центрифугирования в 50 мл пробирках Стешет (30 мин, 5000 об/мин, 4°С) получали свободную от клеток надосадочную жидкость и все последующие шаги проводили во льду. Надосадочную жидкость предварительно фильтровали на фильтре СР/А \У11а1тап С1а§8 т1сгойЬег ййег (0 150 мм) для удаления крупных частиц, рН доводили до 5 с помощью 4 N КОН (если требуется) и стерилизовали фильтрат 0,2 мкм (на верху колбы) фильтром под вакуумом для удаления частиц гриба. Надосадочную жидкость хранили при 4°С (или -20°С).
Измерение содержания аспарагиназы АкрегдШик шдег и аспарагиназной активности в ультрафильтрате.
Стадия 1. Получение ультрафильтратов.
Культуральную надосадочную жидкость, полученную как описано в примере 1, ультрафильтровали для повышения концентрации фермента и для удаления низкомолекулярных примесей, которые могут помешать определению ферментативной активности и тестированию при выпекании. Ультрафильтрация 300 мл надосадочной жидкости проводилась в системе Мййроге ЬаЬ8са1е ТРР, содержащей фильтр с порогом отсечения 10 кДа по молекулярной массе.
В зависимости от цвета и объема образцы промывали 3-5 раз 10-30 мл холодной деминерализованной водой и в дальнейшем называли «ультрафильтратами».
Стадия 2. Определение концентрации аспарагиназы с помощью А280 и НР8ЕС.
Концентрацию аспарагиназы АкрегдШик гиде г в ультрафильтратах вычисляли по экстинкции при 280 нм (А280), характерной для аспарагиназы, и вычисленного молярного коэффициента экстинкции аспарагиназы. Измерение при А280 осуществляли с помощью спектрофотометра иу1кот ХЬ 8есотат (Веип йе Ропйе. АЬсоийе, Тке №1кег1апЙ8).
Коэффициент молярной экстинкции фермента может быть вычислен по количеству остатков тирозина, триптофана и цистеина на молекулу фермента (8.С. С111 и Р.Н. Уоп Н1рре1, Апа1. Вюсйет. 182, 319-236 (1989)). Молярные коэффициенты экстинкции этих аминокислот составляют 1280, 5690 и 120 М-1-см-1 соответственно. Количество остатков тирозина, триптофана и цистеина в аспарагиназе АкрегдШик шдег по изобретению может быть вычислено из белковой последовательности данной в 8Е0 ГО NО:3. Вычисленный коэффициент экстинкции аспарагиназы АкрегдШик шдег по изобретению представлен в табл. 2.
Таблица 2
Коэффициент экстинкции аспарагиназы АкрегдШик шдег
Фермент δΕΟΙΟ ΝΟ # аминокислоты Вычисленный М. в. (Да) Вычисленный коэффициент экстинкции при 280 нм
Тгр Туг Сув М''.см‘1 (1 мг/мл)‘‘хм'1
Аспарагиназа 3 0 9 2 39584 11760 0,3
Экстинкция ультрафильтрата при 280 нм (А280), свойственная аспарагиназе, зависит от чистоты ферментативного образца. Эту чистоту определяли с использованием ВЭЭХ (высокоэффективная экс- 15 011438 клюзионная хроматография) на колонке ТБК Б^-ХЬ (300x7,8 мм; разброс М.в. 10-300 кДа). Буфер для элюирования содержал 25 мМ фосфата натрия рН 6,0, скорость потока 1 мл/мин. На колонку наносилось 5-100 мкл образца. Поглощение измерялось при 280 нм.
А280 в ультрафильтрате, соответствующую аспарагиназе по изобретению, вычисляли из отношения площадей пиков, соответствующих аспарагиназе на хроматограмме, и общей площади пиков, поглощающих при 280 нм. Концентрацию аспарагиназы в ультрафильтрате вычисляли умножением А280 ультрафильтрата на отношение, описанное выше и деленное на 0,3 (вычисленный коэффициент экстинкции) для каждой аспарагиназы. Раствор содержал 40 мг белка/мл.
Стадия 3. Определение аспарагиназной активности.
Активность аспарагиназы АкрегдШик шдег в растворе составила 40000 и/мл при рН 5,5. Поэтому, учитывая, что концентрация белка в растворе была 40 мг/мл, удельная активность составила 1000 ед./мг белка.
Пример 2. рН-оптимум аспарагиназы АкрегдШик шдег.
В этом примере активность измеряли при различных значениях рН. Для поддержания постоянного рН и минимизирования влияния буфера измерение активности аспарагиназы осуществляли в различных буферах при одном значении рН.
Для измерения активности аспарагиназы в интервале рН 5-9 использовали три различных буфера:
1) лимонная кислота/фосфатный буфер (рН 5,0-6,2);
2) фосфатный буфер (рН 8,5-7,6) и
3) трис-буфер (рН 7,2-8,9).
Содержание аспарагина составляло 17,2 мМ. В табл. 3 показана зависимость активности аспарагиназы из А.шдег от рН.
Таблица 3
Активность аспарагиназы АкрегдШик шдег при различных рН, измеренная в подходящем буфере.
Конечные концентрации в ферментативном анализе цитратного, фосфатного и трис(гидроксиметил)аминометанового буферах составили 0,05, 0,1 и 0,025 М соответственно
Уровенъ рН Активность аспарагиназы (выраженная в и/мл)
Лимонная кислота/фосфатный буфер Фосфатный буфер Трис-буфер
5,0 45700 - -
5,2 38000 - -
5,4 40600 - -
5,6 30500 - -
5,3 26800 24200 -
6,0 31900 23000 -
6,2 23900 21800 -
6,8 - 14400 -
7,2 - 8600 11300
7,6 - 8700
8,0 - 6400
8,4 - - 4200
8,9 - - 2600
Как видно из этих данных, аспарагиназа АкрегдШик шдег очень хорошо подходит для использования в выпекании, поскольку фермент проявляет относительно высокую ферментативную активность при рН теста около 5,5.
Пример 3. Значения Км и Утах аспарагиназ ЕксйепсЫа сой и АкрегдШик шдег.
Определения Км и Утах проводили при рН 5,5 и 37°С, измеряя аспарагиназную активность аспарагиназ ЕксйепсЫа сой и АкрегдШик шдег, соотвественно. В табл. 4 суммированы результаты этих исследований.
- 16 011438
Таблица 4
Км и Утах аспарагиназ ЕксйепсЫа οο1ί и АкрегдШик шдег
Источник аспарагиназы νΜΧ (и/мг) Км (мМ)
Е. соИ 300+/-30 1,4+/-0,6
А. п4д-ег 1100+/-40 2,4+/-0,3
Аспарагиназа А.шдег значительно более активна, по сравнению с аспарагиназой Е.той.
Пример 4. Получение хлеба «Ва(агй» и влияние аспарагиназы ЕгМша, ЕксйепсЫа οο1ί и АкрегдШик шдег на содержание акриламида в корке и мякише.
Тесто приготавливали из 2000 г муки (100%), 1040 мл воды (57%), 44 г свежих дрожжей Конинга, 40 г соли (5%), 136 г аскорбиновой кислоты (68 ррт) и указанных количеств аспарагиназы из ЕгМша (81дта) или АкрегдШик шдег по изобретению. Ингредиенты перемешивали до образования теста с помощью спирального миксера Эюкпа 8Р 12 (2 мин при скорости 1, затем смешивание проводили при скорости 2, пока затраты энергии не достигали 85 Вт). После этого для поднятия полученное тесто было оставлено на 15 мин при 32°С. Затем из 350 г кусочков теста руками были вылеплены круглые булочки и оставлены на 15 мин при 32°С. После этого кусочки теста были скруглены и отформованы с последующей последней выдержкой в течение 75 мин. После выдержки по длине верхней поверхности кусочков теста был сделаны разрезы глубиной 1 см. Образцы теста для определения уровня акриламида брали перед выпеканием. Кусочки теста выпекали в духовке при температуре 240°С 30 мин.
Затем были взяты образцы корки (наружные 2 мм), в которых было определено содержание акриламида, как описано выше. Корка была взята с верхней стороны хлеба «Ва!агй» и была выбрана та часть корки, которая обладала средним коричневым цветом, не слишком темным и не слишком белым. Для определения акриламида среднее из двух образцов одной буханки и двух буханок для одних и тех же условий показаны в табл. 5-7.
Таблица 5 Влияние некоторых типов аспарагиназы на образование акриламида в хлебе
Источник аспарагиназы Аспарагиназа (ррт миллионные доли) Акриламид (ррЬ - миллиардные доли) в корке
Буханка 1 - 0 74
Буханка 2 Еалиалаа 1,75 51
Буханка 3 Е. соИ 1,00 60
Буханка 4 А. П1дег 0,20 60
Из приведенной выше таблицы можно сделать вывод, что использование нескольких различных типов аспарагиназ, включая новую А8РА01, уменьшает количество образующего акриламида в корке.
Таблица 6
Влияние количества аспарагиназы Ег\уйиа на образование акриламида
Аспарагиназа (ррт) Акриламид в корке (ррЬ)
Тесто 0 <30
Буханка 1 0 74
Буханка 5 0,0875 66
Буханка 6 0,25 59
Буханка 2 1,75 51
Из приведенной выше таблицы видно, что увеличение количества аспарагиназы уменьшает количество образовавшегося акриламида в корке.
Пример 5. Влияние аспарагиназы на содержание акриламида в хлебе «Ва(агй» с добавленным аспарагином.
Тесто, буханки и образцы приготавливали по примеру 4, поэтому Ь-аспарагин был добавлен в муку на той же стадии, когда была добавлена аспарагиназа, в количествах, которые указаны в табл. 7. В полученных образцах определяли акриламид, результаты определения приведены ниже.
- 17 011438
Таблица 7
Влияние добавленного аспарагина на уровень акриламида в корке
Добавленный Ь-аспарагин (ррт) Источник аспарагиназы Аспарагиназа (ррт) Акриламид в корке (ррЬ)
Буханка 1 0 - 0 74
Буханка 7 600 - 0 1265
Буханка 3 600 Ег«1п1а 0,2 482
Буханка 9 600 А. пхдег 2 159
Буханка 10 600 А. п!дег 5 105
Буханка 11 600 А. пбдег 10 80
Буханка 12 1500 - 0 5095
Буханка 13 1500 Етш1п1а 0,5 3790
Из табл. 7 видно, что добавление аспарагина в хлеб значительно повышает содержание акриламида в корке хлеба. Однако использование аспарагиназы позволяет понизить содержание акриламида.
Пример 6. Влияние различных параметров на уровень акриламида в корке.
Тесто было получено из 2000 г непросеянной муки (100%) (Ьшбе® - МепеЬа, Но11апб) или нормальной пшеничной муки (Ко11Ьг1® - МепеЬа, Но11апб), 1140 мл воды (57%), 47 г свежих дрожжей Кошпд8§181®, 40 г соли (1,75%), 136 мг аскорбиновой кислоты (34 ррт) и указанных количеств Ь-аспарагина (δίβΐηη) и аспарагиназы ΑδΡΑ01, полученной из АкрегдШик шдег. Ингредиенты перемешивали до образования теста с помощью спирального миксера Июкпа δΡ 12 (2 мин при скорости 1, затем смешивание проводили при скорости 2, пока затраты энергии не достигали 85 Вт). После этого для поднятия полученное тесто оставляли на 15 мин при 32°С. Затем из 350 г кусочков теста руками были вылеплены круглые булочки и оставлены на 15 мин при 32°С. После этого кусочки теста были скруглены и отформованы с последующей последней выдержкой в течение 75 мин. После выдержки по длине верхней поверхности кусочков теста были сделаны разрезы глубиной 1 см. Кусочки теста выпекали в печи.
Использовали три способа выпекания:
1) 30 мин при 240°С;
2) 20 мин при 300°С;
3) 20 мин при 320°С.
После выпекания брали образцы хлебной корки, как указано в примере 4. Результаты акриламидного анализа образцов приведены ниже. Количество акриламида в тесте было измерено перед самым выпеканием. Каждое значение является средним из двух измерений одной буханки для каждого условия.
Таблица 8 Влияние способа выпекания на количество акриламида, образовавшегося в корке хлеба на основе нормальной муки, ни аспарагин, ни аспарагиназа не были добавлены
Номер буханки Процесс выпекания Акриламид в корке (ррЬ)
1 1 74
14 2 85
15 3 175
Из табл. 8 можно сделать вывод, что образование акриламида зависит от применяемого способа выпекания. В горячем и коротком способе выпекания образование акриламида в корке значительно выше, чем при пониженной температуре. В результате процесса выпекания 3 образуется очень темная буханка, поэтому дальнейшие эксперименты в этих условиях выпекания не проводились.
- 18 011438
Таблица 9
Влияние типа муки на уровень акриламида в корке хлеба для способа выпекания 1. ни аспарагиназы. ни аспарагина добавлено не было
Номер буханки Тип муки Акриламид в корке (ррЬ)
1 Нормальная 74
16 Непросеянная мука 227
Из табл. 9 видно. что тип муки влияет на содержание образующегося акриламида.
Таблица 10
Влияние сахара на содержание акриламида в корке хлеба. полученного из нормальной муки. и влияние увеличенного количества акриламида на эффективность аспарагиназы А.шдег
Номер буханки Способ выпекания Добавленная сахароза (г/кг муки) Добавленный аспарагин (ррт) Аспарагиназа АфегрНия т§ег (ррт) Акриламид в корке (ррЬ)
1 1 0 0 0 74
17 1 250 0 0 220
18 1 250 0 5 110
19 1 250 600 0 847
20 1 250 600 5 97
14 2 0 0 0 85
21 2 250 0 0 161
22 2 250 0 5 120
23 2 250 600 0 1001
24 2 250 600 5 132
Присутствие сахарозы стимулировало образование акриламида. В случае добавления аспарагина этот эффект был еще больше. Когда аспарагиназу АкрегдШик шдег добавляли к тесту. обогащенному сахаром. содержание акриламида в корке хлеба было значительно снижено. Удивительным оказался тот факт. что для буханок. содержащих значительные количества акриламида. наблюдалось и гораздо более значительное уменьшение содержания акриламида. в то время как количество использованной аспарагиназы из АкрегдШик шдег было тем же.
Пример 7. Получение Голландского медового пирога.
Голландский медовый пирог получали в две стадии. На первой стадии предварительное жидкое тесто приготавливали следующим образом: 4 кг Коекхое!® (А11ап1а Эе11ипег5 В.У.. 6гошпдеп-Но11апй) и 500 г смеси для Голландского медового пирога добавляли к 2 л воды и нагревали до температуры 116°С. Добавляли 5 кг ржаной муки и смешивали. пока тесто не становилось однородным. Затем тесто охлаждали и хранили при комнатной температуре 1-2 дня.
На 2750 г этого предварительного теста добавляли следующие ингредиенты: 500 г Коекхое!®. 27.5 г просеянных приправ для Голландского медового пирога. 22 г просеянного Пекарского порошка Кагат®. 16.5 г Пекарского порошка Уи1каап® (все А(1ап(а Эе1ктег5). Кроме того. добавляли различные количества аспарагиназы АкрегдШик шдег. ферментативная активность которых составляла 40000 и/мл (ферментативную активность измеряли в соответствии с примером 1 при рН 5.5).
Эту смесь перемешивали при 104 об/мин в течение 6 мин в миксере Эюкпа 8Ό 12 (Эюкпа. Э|егк5 & 8бЬпе. 05паЬгиск-Сегтапу). Взвешивали 3250 г теста. смачивали снаружи и укладывали в формочки на поднос. Затем тесто инкубировали при 30°С 105 мин. После этого тесто выпекали при 180°С 60 мин. Образцы наружного слоя и внутреннего содержимого («корки») Голландского медового пирога анализировали на присутствие акриламида.
После выпекания брали образцы из корки (наружные 2 мм) и из мякиша (из середины булочки) и анализировали на акриламид. как описано выше. Для образца корку брали с верхней стороны булочки. выбирая такую часть корки. которая имела средний цвет.
- 19 011438
Таблица 11
Содержание акриламида и влияние различных доз АзрегдШиз шдег в корке и мякише Голландского медового пирога
Добавленная аспарагиназа (мг) Акриламид в образце (ррЬ) Уменьшение акриламида (%) *
Корка Мякиш Корка Мякиш
Исходный 1077 3411
40 75 172 93 95
100 85 158 92 95
200 74 156 93 95
*Уменьшение содержания акриламида вычисляли по следующей формуле:
Уменьшение акриламида=((Содержание акриламида в пироге, обработанном аспарагиназой)/Содержание акриламида в контрольном образце)х 100%
Как показано в этом примере, добавление аспарагиназы АзрегдШиз шдег уменьшает содержание акриламида до 5% по сравнению с необработанным Голландским медовым пирогом. Кроме того, в необработанном Голландском медовом пироге было неожиданно обнаружено высокое содержание акриламида в мякише. Во всех экспериментах с хлебом количество акриламида в мякише было ниже предела обнаружения (<30 ррЬ) даже в случае добавления аспарагина или сахара.
- 20 011438
Перечень последовательностей <110> Ώ5Μ ΙΡ АззеЪз Β.ν.
<120> Аспарагиназа, полученная из АкрегдШик шдег, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт <130> 21401ИО <160> 3 <170> Патентная версия 3.1 <210> 1 <211> 3223 <212> ДНК <213> Азрегд111из шдег <400> 1
Сддддддаас •ЬдааСаааса ддсбссдада ааЬССддддд асаасдада'С Ьс£ЬдаддаЪ Ьддддс-ЁаЬ са^сс^а^са адас£адрас аддаддадаУ СГссдаа1:ас аЪдааТЪдда сда(:Ьс7ссЪ ссассааСда ссассс£дсс дЬдсдассда саассдссас Ьдссаесса£ аддаЬаСсас аддасссдас ссУтсг^сс»: дсссаСссас сСдссЬссас сддссгасЬа Ъдддс£ассЪ саассдд^аа Ъд£СГ£с1:(:а адддаагЪдт: даЬдадааЬа ГсдаддаГдЬ дддаадйдсс Ъааасссдса ссдаааЪсдс а-аЬааЪааТ са1садсааа аадаЁсаЬда ддСдсЬЬЬдс а'Саа'СадЪдд адсСадддсс дддас^дТсС ддаЬс£дсаа еедсЬсддЬа дасдссаадс ддЬадГаГСа аЪсаддсдсд ддсдассаад С-СГсдаСаас сСсЬссЬдса дддсЬдассс СссЬадсс^д ааддс££д£с Сдаадссса£ адассдддСЪ ддаГасесаЬ
СрдсаСсЬ да Ьсс£дс£Ьд£ дЪСЪЪда^ад сдаа£д£Рда аадасдаааь 1дсс£са£сд сдеддаадад дЪССссассс ЪадЪсйаСса адсаадссЬс асссдссдсс ададаадсса дСс^дсссЬд аассЕЬсдХс даасдЬдасс НадЬ'Ьаассд дассддс±ас дсЪдда£д1д сСсТдасаТс саЬддссддЬ ддасдссас£ ддссаЬсЬса дСсддсдсдс Ьд1:дассаад ЪддсдадаЪд ддЪддссЪХЬ ГдаддасаГд ддЬдадГдГд да£Сдесддд саЬсаассд!: аскд'Ьсадас даадЪсссдс ЬдасдСдгЬГ: дассдда^аЪ дда1:ассдад а^саТдЬсгС дСсСдаадда дйаГаГГЬда Гддс1ТддГ;д сссдссаСТа ΐαΐΐίαϊίϋσ ЪЪсЪддассд сЬдассаа-ес аддсадсТад аааСддаасд ассс1:ддаГ1 дсаддаСЪдд сд^саСкасТ ГсадсТсддс сСддГададд ссТддесаас £д£сдд!аа£ СсдсасддЪс ссд1сЬас1:д дадса1:са1:а ас1асдсаТс садЬадссаа аЬссадсСса аСЪдсЬдЬса са^дддаЬаа Ьсасссссда асаада'Ьадс £дЪсдас£сс сасадаааса Гддсаадсас дсададасса дссадЬсЬсд СУсассаасд аГСССсдсаа саасЪсасад асссссддад дссаа£дТ£д с1дай'Ь1сса дсСдТса+са десаас1д£д дс7дасдддс да£сдсдд£д ассааЪдсса аСс+ссааса даса£сасса сасаасдаса ае^СссТ1да дсЪдд-ЬдсЬд ИддадаСсс дГдадсадсд агхсЪдгЪдд дс£с£дддса £а£даГса1:д ТТ^ТдсссТ.с а1сь£с1ддс £ссдадаЬса ад£сса£Ъда дсаЪаСсдРЬ ТСсСсасааС сс£сдЬса1:с Ъаадас^деъ СадГаадсРд ССсдссТдса аадСдсдадд даЪсдсЬаЬд аЬссСсссад садасасСсс д^дддагдсс сдда1да^Са саТсасЪс^д сдТссссааа дсадаассдс Сд-ЬаСаГсСд сГадЕЬасТа дссдТсСГдс 7Х:аасЬад1.а £дссаа££да Ьддд£да1аа ЪайсасссГс Ьа^сддТддд с£а!:ддассс а£д1;ддадаа аТаСсаСс^с а+дддд^а+а ЬсдсаСссдГ сс£сддсс£с ссаа!ддсс1: сдддгаддЬд деддГассаЧ: садТсдддд!: ссддсдЬсса ЬдГссаадаа сссасддсас дсаадссааЪ сс£Тсаа£с£ ссаЪддСдд'С асасХаЬдда ссссТ СЬсГГ. асд+дас£да сссЬс£асаа ГсСсГсГс1а даддсдЬсас сСдТсдСдса асассдссас даСЕдссдсе сддаХдсдГа аЬада^Сдса аддсдтг.сд1: ссссЬсд^аЬ ааЬ+дасасд Ъад'Ьсс^Ьд'С ддассаа^ад ЬсСЬаСсадс асаС^сссас Ъ^даааддса дСсССасССЪ Т£ассассса ЬссасИаас а£Ссдсддаа ссСсдСс^сЪ саСсСМ^Гдс Ьдаа'ЬсдЪЬд Ъаа^ааГсаа дЬСа^^дасС даа^сЪдссс аЪссаасасд саасдасьаа сЬасЬасЬас ГдасаСддад даЬдсЬад^а саЬсгддада сЕадаГдсГй дддСддассС ссаадсссТС £да£!:ссс£1: асссЪдаЪаа сассХдсааС аааЪдс+даа сЕГсаИсаЬд ЬссдсЬдсЪс саасМзсасс дассдадЪа!: сдсдддсСсс сс^дСсссЕс ддЬддссаас дсГдаассдс сдасасссЬс 4дЬса^сдСд дсесдаадсс саСдаасдаУ сасс££саад сСЪсСасссд да+сссссд! сдсса^сЬсс СаааасССдд аасс£сс!±с дадТаСдсдс ссасаГсдсс а£сссаддда ддГдСсдаГа а^адааадЬд адааааадСд ссадддЬд'ЬЪ адссададЬс ££д1д6сддд аСддЪадЪ'Ьс аса££1:Ъссс даааадасса ааЪдЪааадс дддСдйадас ддсдаддсас аЬдаЬдсдсд ссссдсдддЪ дсаадсддда £ГаШЛ:дсаа дЬдааад+сС адсасссЬаЬ адГ СдГд-ССГ Лдса^саЪд Ьс£ад£адаа. СдГ
ГасГЪдссда аЬаТаТТСЬд с^асСсСадЬ СсСссасдад сдадааддаЪ £сссддсЪд! ЪаЪсааЪсаЬ с±адссасад дассаСд^дд сасддИСдда ассаддсаад ссЬс£саадс ЬасЬсдсдда садаЬдааса ассСсаддРа даСТссадсЬ а^сдаЪдсдд д^дддаадсд д££дЬаЬд£д даддадасТд дд£дсса£дс дТдасддЬдд сдсаЬ'Ьдсс1 дссарддада сссдЪсаадс дТддасаг'Ес адСддЪдссс аа£ддасдс£ ааТдаддс^а асадЬсааТд адсддаГасс аадаа^а^са даасса££д£ асГддаГаса СакссСасСд ддаса'Едсад ЬдаЬаса+сс сааСГдддГГ ааССассдас тдСсдсдсСТ СссадасаЪс дЪда^ЪддЬс ддаддПаСИа дссасГдсТд сдда£асЪаа 1:сС1;сасддс сссЬдааддд 1даа£с^аТ аСЬЬдадсаа сдГаадда'Сд дддадасадс дадЪсаддаа ддаддддсад
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3223
- 21 011438 <210> 2 <211 > 1137 <212> ДНК <213 > АзрегдШиз пгдег <22ϋ>
<221> СОЗ <222> ¢1)..(1137) <400> 2
а 19 ссь сес а ад сед аее сес с кд Ьсе дсс сЬд дсс аде скс дсс кед 45
Мек Рго Ьеи Ьуд Рго Не Ьеи Ьеи Зег А1а Ьеи А1а Зег Ьеи А1а Зег
1 5 10 15
дсс Сек сед съд скс еас есд едд асе асе аас даа асе ЬЬе дке ккс 96
А1а Зег Рго Ьеи Ьеи Туг Зег Агд ТЬг ТНг Азп С1и ТНг РЬе Уа1 РЬе
20 25 30
асе ааЬ дсс ааС ддс скс аас ккс асе сад аЪд аас асе асе с кд ссд 144
ТЫ АЗП А1а Азп Й1у Ьеи Азп РНе ТЬг С1п Мег Азп ТНг ТЫ ьеи РГО
35 40 45
аас дед асе аЪС еес дса асд дде ддЬ асе аес дед ддс Ьсс дак ксс 192
Азп Уа1 ТНг Не РНе А1а ТНг <31у С1у ТЬг 11е А1а С1у Зег Азр Зег
50 55 60
аде еса асе дсс асд асе ддс еас асе есс дд» дса дке 999 дке скд 240
Зег Зег ТНг А1а ТНг ТНг <31у Туг ТНг Зег С1у А1а Уа1 01у Уа1 Ьеи
65 70 75 80
есс скс аес даС дед дед сса есс а1д сед даЬ дед дсс аае дкк дсс 285
Зег Ьеи Не Азр А1а Уа1 Рго Зег МеГ Ьеи Азр Уа1 А1а Азп Уа1 А1а
п е пл лп
03 7ν
99С дес сад дед дсс аас дед дда аде дад да£ аес асе есе дас акс 336
С1у Уа1 С1п Уа1 А1а Азп Уа1 С1у Зег С1и Авр 11е ТНг Зег Азр Не
100 105 но
сед аее есс аед есс аад аад сед аас сдс дПС деа еде дад дас ссд 384
Ьеи 11е Вех Мее Зег Ьуз Ьуз Ьеи АЗП Агд 7а1 Уа1 Суз О1и Азр Рго
115 120 125
асе а ед дсс ддк дек дке аЪс асе сас ддс асе дас аес скс дад дад 432
ТНг Мек А1а <31у А1а Уа1 11е ТНг Н13 С1у ТЬг Азр ТНг Ьеи С1и С1и
130 135 140
асе дсс еес еес сед дас дсс асе д£с аас ЪдТ: ддс аад сса акк дке 480
ТЬг А1а РНе РНе Ьеи Аар А1а ТНг Уа1 АЗП Суз 61у Ьуз Рго Не Уа1
145 150 155 160
аес дед ддс дсс акд сдс сса есс асд дсс аЬс еса дсс дас ддд ссс 525
Не νβΐ С1у А1а Мее Агд Рго Зег ТНг А1а 11е Зег А1а Азр <31у Рго
165 170 175
еес аак сед скс даа дсс дед асд дед дсе дсс есс асд кед дед сдс 576
РНе Азп Ьеи Ьеи С1и А1а Уа1 ТНг Уа1 А1а А1а Зег ТНг Зег А1а Агд
180 185 190
даН сде дде дсс аед дед дес аед аас дас сдс асе дсс кед дсс еас 624
Азр Агд <31у А1а Мее Уа1 Уа1 Мек Азп Азр Агд Не А1а Зег А1а Туг
195 200 205
сак дед асе а ад асе аае дсс аас асЪ аЬд дас асе есс аад дсс аед 672
Туг Уа1 ТНг Ьуз ТНг Азп А1а Аап ТЬг МеЬ Азр ТНг РНе Ьуз А1а Мек
- 22 011438
210 215 220
дад аХ 9 ддс гас сее ддс дад а ед аес Ссс аас асе ссе еее ЬСс есс 720
О1и МеЪ <31у Туг Ъеи С1у О1и мее Не Зег Авп ТЬг Рго РЬе РЬе РЬе
225 230 235 240
Сас ссд ссс дес аад сса асе дде аад дед дсс еее дас асе асе аас 768
Туг Рго Рго Уа1 Ьув Рго ТЬг <31у Ьув Уа1 А1а РЬе Авр Не ТЬг Авп
245 250 255
дбд асЪ дад абс ссс еде дед дас аее сед ЪЪЪ есе Сае дад дас асд 816
Уа1 ТЬг 01 и Не Рго Агд Уа1 Авр Не Ьей РЬе Зег Туг <31и Авр МеС
260 265 270
сас аас дас асе еее Сас аае дсс аес Ссс аде ддс дсс сад дда асе В64
ΗίΒ Азп Аар ТЬг Ьей Туг Ави А1а Не Бег Зег 01у А1а О1п 01у Не
275 280 2Θ5
дед ас С дсс ддд дсе дде дсе дда ддс дес аса асе Ссс ссс аас дад 912
νβΐ Не А1а О1у А1а С1у А1а 01 у 01 у Уа1 ТЬг ТЬг Зег РЬе Авп С1и
290 295 300
дсС аес дад да с дес аес аас еде еед дад асе ССС дСс дед сад адк 960
А1а Не С1и Авр Уа1 Не Азп Агд Ьей 01и Не Рго Уа1 ν«1 01п Зег
305 310 315 320
а ед сдс аса дес аас ддд даа дед сса скд Сса дас дед аде аде дас 1008
Мее Агд ТЬг νβΐ Ави О1у (31и 7а1 Рго Ьей Зег Авр 7а1 Зег Зег Авр
325 330 335
асе дсс асе сас аес дсс аде дда еас сСа аас ссд сад аад Ссс сдс 1056
ТЫ А1а ТЬг Ηίβ Не А1а Зег О1у Туг Ъеи Азп Рго О1п Ьуз Зег Агд
340 345 350
аее сЪд еед дда еед сед ска есс сад дда аад ааС аСс асе даа аСс 1104
Не Ьей Ьей <31у Ьей Ьей Ьей Зег С1п О1у Ьув Азп 11е ТЬг <31и Не
355 360 365
дсе дас дед еее дсе сед ддс асд дае дед сад 1137
А1а Авр νβΐ РЬе А1а Ьей О1у ТЬг Авр А1а
370 375 <210> 3 <211> 378 <212> РКТ <213> АврегдШив п!дег
с400> 3
МеС Рго Ьей Ьув Рго Не Ьей Ьей Зег А1а Ьей А1а Зег Ьей А1а Зег
1 5 ίο 15
А1а Зег Рго Ьей Ьей Туг Зег Агд ТЬг ТЬг Азп О1и ТЬг РЬе Уа1 РЬе
20 25 30
ТЬг Азп А1а Авп <31у Ьей Азп РЬе ТЬг О1п МеС Авп ТЬг ТЬг Ьей Рго
35 40 45
Авп Уа1 ТЬг Не РЬе А1а ТЬг С1у 01у ТЬг Не А1а О1у Зег Азр Зег
50 55 60
Зег Зег ТЬг А1а ТЬг ТЫ С1у Туг ТЫ Зег О1у А1а νβΐ <31у Уа1 Ьей
65 70 75 80
Зег Ьей Не Азр А1а νβΐ Рго Зег МеС Ьей Авр Уа1 А1а Азп Уа1 А1а
85 90 95
- 23 011438
61у УаЬ СЬп УаЬ АЬа Азп УаЬ СЬу Зег СЬи Азр Не ТЬх Зех НО Азр Ые
100 105
Ьеи Не Зег Мес Зег Ьуз Ьуз Ьеи Азп Агд УаЬ УаЬ Суз СЬи Азр Рхо
115 120 125
ТЬг МеС АЬа СЬу АЬа УаЬ 1Ье ТЬг НЬз СЬу ТЫ Азр ТЬх Ьеи СЬи СЬи
ί30 135 140
ТЬг АЬа РЬе РЬе Ьеи Азр АЬа ТЬг УаЬ Азп Суз СЬу Ьуз Рго ЬЬе УаЬ
145 150 155 160
Не Уа1 СЬу АЬа МеС Агд Рхо Зег ТЬх АЬа Не Зег АЬа Азр СЬу Рго
165 170 175
РЬе Азп Ьеи Ьеи СЬи АЬа УаЬ ТЫ УаЬ АЬа АЬа Зег ТЬх Зег АЬа Ахд
180 185 190
Азр Агд СЬу АЬа МеС УаЬ УаЬ МеС Азп Азр Агд 11е АЬа Зег АЬа Туг
195 200 205
Туг УаЬ ТЫ Ьуз ТЬг Азп АЬа Азп ТЫ МеС Азр ТЬг РЬе Ьуз АЬа МеС
210 215 220
СЬи Мег СЬу Тух Ьеи СЬу С1и Мес 11е Зех Азп ТЫ Рго РЬе РЬе РЬе
225 230 235 240
Туг Рго Рго УаЬ Ьуз Рхо ТЬг СЬу Ьуз УаЬ АЬа РЬе Азр Не ТЬг АЗП
245 250 255
УаЬ ТЬг СЬи Не Рхо Ахд УаЬ Азр Не Ьеи РЬе Зех Тух СЬи Азр МеС
260 265 270
Н13 Азп Азр ТЬг Ьеи Туг Азп АЬа Не Зех Зег С1 у АЬа СЬп СЬу Не
275 280 285
УаЬ Не АЬа СЬу АЬа СЬу АЬа СЬу СЬу УаЬ ТЬг ТЬг Зех РЬе Азп СЬи
290 295 300
А1а Не СЬи Азр УаЬ Не Азп Агд Ьеи СЬи Не Рхо УаЬ УаЬ СЬп Зег
305 310 315 320
МеС Агд ТЬг УаЬ Азп СЬу СЬи УаЬ Рхо Ьеи Зех Азр УаЬ Зег Зег Азр
325 330 335
ТЬх АЬа ТЬг НЬз Не АЬа Зег С1у Тух Ьеи Азп Рхо СЬп Ьуз Зег Агд
340 345 350
11е Ьеи Ьеи СЬу Ьеи Ьеи Ьеи Зег СЬп СЬу Ьуз Азп 11е ТЬг СЬи 1Ье
355 360 365
АЬа Азр УаЬ РЬе АЬа Ьеи С1у ТЬг Азр АЬа
370 375

Claims (22)

1. Выделенная из АкрегдШик шдег аспарагиназа, имеющая аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО NО:3, или аспарагиназа, последовательность которой гомологична указанной по меньшей мере на 80%.
2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1, имеющий последовательность 8ЕЦ ГО NО:1 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%.
3. Выделенный полинуклеотид по п.2, полученный из нитчатых грибов.
4. Выделенный полинуклеотид по п.3, полученный из АкрегдШик шдег.
5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1.
6. Выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен аспарагиназы по п.1.
7. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1, имеющий последовательность 8ЕЦ ГО NО:2, или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%.
8. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.2-7.
9. Вектор по п.8, в котором указанный полинуклеотид оперативно соединен с регуляторными последовательностями, пригодными для экспрессии указанного полинуклеотида в подходящей клеткехозяине.
10. Вектор по п.9, в котором подходящая клетка-хозяин является нитчатым грибом.
11. Вектор по п.10, в котором указанная подходящая клетка-хозяин является АкрегдШик шдег.
12. Аспарагиназа, полученная путем экспрессии полинуклеотида по любому из пп.2-7 и вектора по любому из пп.8-11 в подходящей клетке-хозяине, например АкрегдШик шдег.
- 24 011438
13. Рекомбинантная аспарагиназа. содержащая функциональный домен аспарагиназы по п.1.
14. Способ получения аспарагиназы по любому из пп.1. 12 или 13. предусматривающий стадии трансформации подходящей клетки-хозяина выделенным полинуклеотидом по любому из пп.2-7 или вектором по любому из пп.9-10. культивирования указанной клетки в условиях. позволяющих экспрессию указанных полинуклеотидов и. возможно. очистки кодируемых полипептидов из указанной клетки или культуральной среды.
15. Способ наработки полинуклеотида по любому из пп.2-7 или вектора по любому из пп.8-11. предусматривающий стадии культивирования клетки-хозяина. трансформированной указанным полинуклеотидом или указанным вектором и выделения указанного полинуклеотида или указанного вектора из указанной клетки-хозяина.
16. Рекомбинантная клетка-хозяин. содержащая полинуклеотид по любому из пп.2-7 или вектор по любому из пп.8-11.
17. Рекомбинантная клетка-хозяин. экспрессирующая полипептид по любому из пп.1. 12 или 13.
18. Способ производства пищевого продукта. включающий по меньшей мере одну стадию нагревания. предусматривающий добавление аспарагиназы по любому из пп.1. 12 или 13 к полуфабрикату указанного пищевого продукта. причем аспарагиназу добавляют до указанной стадии нагревания в количестве. эффективном для снижения содержания аминокислот. присутствующих в указанном полуфабрикате пищевого продукта и вовлеченных в образование акриламида в течение указанной стадии нагревания.
19. Способ по п.18. в котором пищевой продукт получают по меньшей мере из одного сырьевого растительного материала.
20. Способ по п.19. в котором сырьевым растительным материалом является зерновая мука. предпочтительно пшеничная мука.
21. Способ по п.19. в котором сырьевым растительным материалом является картофель.
22. Пищевой продукт. полученный способом по любому из пп.18-21.
EA200501012A 2002-12-19 2003-12-18 Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт EA011438B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02102819 2002-12-19
PCT/EP2003/014553 WO2004030468A2 (en) 2002-12-19 2003-12-18 Novel food production process

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501012A1 EA200501012A1 (ru) 2005-12-29
EA011438B1 true EA011438B1 (ru) 2009-02-27

Family

ID=32050091

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501012A EA011438B1 (ru) 2002-12-19 2003-12-18 Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8105815B2 (ru)
EP (3) EP1571919B2 (ru)
JP (1) JP4723247B2 (ru)
CN (1) CN100569101C (ru)
AT (1) ATE440504T1 (ru)
AU (1) AU2003294908B2 (ru)
BR (3) BR0317298A (ru)
CA (2) CA2509891C (ru)
DE (1) DE60329018D1 (ru)
DK (1) DK1571919T4 (ru)
EA (1) EA011438B1 (ru)
ES (1) ES2331068T5 (ru)
PL (2) PL377490A1 (ru)
PT (1) PT1571919E (ru)
WO (1) WO2004030468A2 (ru)
ZA (1) ZA200504358B (ru)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7312062B2 (en) 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
US7811618B2 (en) 2002-09-19 2010-10-12 Frito-Lay North America, Inc. Method for reducing asparagine in food products
US20050064084A1 (en) * 2002-09-19 2005-03-24 Elder Vincent Allen Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US7393550B2 (en) 2003-02-21 2008-07-01 Frito-Lay North America, Inv. Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US7267834B2 (en) 2003-02-21 2007-09-11 Frito-Lay North America, Inc. Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US8110240B2 (en) 2003-02-21 2012-02-07 Frito-Lay North America, Inc. Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US7527815B2 (en) * 2003-06-25 2009-05-05 The Procter & Gamble Company Method for reducing acrylamide in corn-based foods, corn-based foods having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
US7189422B2 (en) * 2003-06-25 2007-03-13 The Procter And Gamble Company Method for reduction of acrylamide in cocoa products, cocoa products having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
CA2554910A1 (en) * 2004-02-26 2005-09-09 Dsm Ip Assets B.V. Novel food production process
US20050214411A1 (en) * 2004-03-29 2005-09-29 Lindsay Robert C Methods for suppressing acrylamide formation and restoring browned color and flavor
JP2008520213A (ja) * 2004-11-17 2008-06-19 ノボザイムス アクティーゼルスカブ アクリルアミドを低めるための方法
WO2006128843A1 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Dsm Ip Assets B.V. Novel process for enzymatic acrylamide reduction in food products
RU2458133C2 (ru) 2005-09-20 2012-08-10 Дж.Р. Симплот Компани Пищевые продукты с низким содержанием акриламида
PL1971219T5 (pl) * 2005-12-28 2020-10-19 Dsm Ip Assets B.V. Aromaty procesowe o niskiej zawartości akryloamidu
ES2685441T3 (es) * 2006-01-05 2018-10-09 Kellogg Europe Trading Limited Métodos para reducir la asparagina en un componente de masa alimentaria
US20100040729A1 (en) * 2006-03-21 2010-02-18 Michael Sahagian Compositions and methods for surface modification of root vegetable products
US7666652B2 (en) * 2007-03-09 2010-02-23 Novozymes A/S Asparaginases
JP2010524448A (ja) * 2007-04-20 2010-07-22 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 新規のアスパラギナーゼおよびその使用
CN101663395B (zh) * 2007-04-20 2012-09-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 新颖的天冬酰胺酶及其用途
EP2139997B1 (en) * 2007-04-20 2014-09-24 DSM IP Assets B.V. Asparaginase enzyme variants and uses thereof
DE102007027825A1 (de) * 2007-06-13 2008-12-18 C-Lecta Gmbh Amidohydrolasen zur Aufbereitung von Nahrungs- oder Genussmitteln
US8486684B2 (en) 2007-08-13 2013-07-16 Frito-Lay North America, Inc. Method for increasing asparaginase activity in a solution
US8284248B2 (en) 2009-08-25 2012-10-09 Frito-Lay North America, Inc. Method for real time detection of defects in a food product
US8158175B2 (en) 2008-08-28 2012-04-17 Frito-Lay North America, Inc. Method for real time measurement of acrylamide in a food product
US9095145B2 (en) 2008-09-05 2015-08-04 Frito-Lay North America, Inc. Method and system for the direct injection of asparaginase into a food process
EP2174556A1 (en) 2008-10-10 2010-04-14 Nestec S.A. Method for reducing acrylamide
US9215886B2 (en) * 2008-12-05 2015-12-22 Frito-Lay North America, Inc. Method for making a low-acrylamide content snack with desired organoleptical properties
US20110256267A1 (en) * 2008-12-16 2011-10-20 Novozymes A/S Stabilization of asparaginase
US8944072B2 (en) * 2009-06-02 2015-02-03 R.J. Reynolds Tobacco Company Thermal treatment process for tobacco materials
US20120263825A1 (en) * 2009-11-25 2012-10-18 Basf Se Process for producing baked goods
US20110129569A1 (en) 2009-11-26 2011-06-02 Dsm Ip Assets B.V. Method to produce fried vegetable products
MX338016B (es) * 2010-03-02 2016-03-30 Renaissance Bioscience Corp Mejoramiento funcional de microorganismos para minimizar la producción de acrilamida.
WO2011134916A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 Dsm Ip Assets B.V. Novel asparaginase enzyme
BR112012033701A2 (pt) 2010-06-29 2018-08-28 Dsm Ip Assets Bv polipeptídeo tendo atividade de degradação de carbohidrato e seus usos
WO2012000888A1 (en) 2010-06-29 2012-01-05 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptide having acetyl xylan esterase activity and uses thereof
HUE037256T2 (hu) 2010-06-29 2018-08-28 Dsm Ip Assets Bv Béta-glükozidáz aktivitású polipeptid alkalmazása
US9175050B2 (en) 2010-06-29 2015-11-03 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptide having swollenin activity and uses thereof
BR112012033404B1 (pt) 2010-06-29 2021-05-18 Dsm Ip Assets B.V. célula recombinante, método para a preparação de um polipeptídeo, composição, método para o tratamento de um substrato que compreende material de carboidrato e uso de um polipeptídeo
CN102971338A (zh) 2010-06-29 2013-03-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的多肽及其用途
BR112013012357A2 (pt) 2010-11-19 2016-10-11 Novozymes North America Inc processos de produzir um produto de fermentação, de produzir um açúcar, de produzir uma dextrina e de produzir sacarose, e, composição
US8790894B2 (en) 2011-01-31 2014-07-29 Dsm Ip Assets B.V. Mutant cellobiohydrolase
WO2012158320A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Baker Hughes Incorporated Method of using asparaginase as a polyacrylamide enzyme breaker
US9485953B2 (en) 2012-07-19 2016-11-08 R.J. Reynolds Tobacco Company Method for treating tobacco plants with enzymes
WO2014027062A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Novozymes A/S Thermostable asparaginase variants and polynucleotides encoding same
US20160128366A1 (en) 2013-06-24 2016-05-12 Novozymes A/S Method for Producing a Food Product
US20160138003A1 (en) 2013-06-24 2016-05-19 Novozymes A/S Method for Producing a Food Product
US20160135486A1 (en) 2013-06-24 2016-05-19 Novozymes A/S Method for Producing a Food Product
WO2016001894A1 (en) 2014-07-04 2016-01-07 West Systems Srl Method and composition to reduce the formation of acrylamide in fresh or pre-fried foods to be subjected to heat treatment
WO2017050653A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Dsm Ip Assets B.V. Asparaginase
WO2017050651A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Dsm Ip Assets B.V. Asparaginase
WO2017050652A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Dsm Ip Assets B.V. Asparaginase
CA2998263A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Dsm Ip Assets B.V. Asparaginase

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310670A (en) * 1990-08-02 1994-05-10 Public Health Laboratory Service Board Method for the purification of Erwinia L-asparaginase
WO2004026043A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 The Procter & Gamble Company Method for reducing acrylamide in foods,foods having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
WO2004032648A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-22 Novozymes A/S Method of preparing a heat-treated product

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002300862A (ja) * 2001-02-05 2002-10-15 Kikkoman Corp γ−アミノ酪酸含有天然食品素材の製造方法
EP1523679A4 (en) 2002-04-01 2007-06-20 Novozymes Inc METHODS FOR PRODUCING SECRETED POLYPEPTIDES WITH L-ASPARAGINASE ACTIVITY
US7037540B2 (en) * 2002-09-19 2006-05-02 Frito-Lay North America, Inc. Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US7393550B2 (en) 2003-02-21 2008-07-01 Frito-Lay North America, Inv. Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US7267834B2 (en) 2003-02-21 2007-09-11 Frito-Lay North America, Inc. Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods
US7220440B2 (en) 2002-10-25 2007-05-22 The Procter & Gamble Company Method for reduction of acrylamide in roasted coffee beans, roasted coffee beans having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
US7189422B2 (en) 2003-06-25 2007-03-13 The Procter And Gamble Company Method for reduction of acrylamide in cocoa products, cocoa products having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
US6989167B2 (en) 2003-06-25 2006-01-24 Procter + Gamble Co. Method for reducing acrylamide in foods comprising reducing the level of reducing sugars, foods having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
US7264838B2 (en) 2003-08-15 2007-09-04 General Mills, Inc. Method for reducing acrylamide levels in food products and food products produced thereby

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310670A (en) * 1990-08-02 1994-05-10 Public Health Laboratory Service Board Method for the purification of Erwinia L-asparaginase
WO2004026043A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 The Procter & Gamble Company Method for reducing acrylamide in foods,foods having reduced levels of acrylamide, and article of commerce
WO2004032648A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-22 Novozymes A/S Method of preparing a heat-treated product

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Mechanism(s) of Formation of Acrylamide in Food: Background" October 2002 (2002-10), XP002237515, Retrieved from the Internet: <URL: *
DATABASE EMBL 'Online! 27 January 1994 (1994-01-27), ATKINSOON ET AL.: "Production of L-asparaginase" Database accession no. A14577, XP002279377, The nucleic acid sequence is 60% identical to SEQ ID No 1 in an overlap of 655 nucleotides, the whole document *
FRIEDMAN M.: "Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide. A review" JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. WASHINGTON, US, vol. 51, no. 16, 3 July 2003 (2003-07-03), pages 4504-4526, XP002276620, ISSN: 0021-8561 *
MOTTRAM ET AL.: "Brief Communications, ACRYLAMIDE IS FORMED IN THE MAILLARD REACTION" NATURE, MACMILLAN JOURNALS LTD. LONDON, GB, vol. 419, 3 October 2002 (2002-10-03), pages 448-449, XP002235161, ISSN: 0028-0836, the whole document *
ZYZAK D. V. ET AL.: "Acrylamide formation mechanism in heated foods" JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. WASHINGTON, US, vol. 51, no. 16, 28 June 2003 (2003-06-28), pages 4782-4787, XP002276619, ISSN: 0021-8561 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA200501012A1 (ru) 2005-12-29
PT1571919E (pt) 2009-11-04
US20070042080A1 (en) 2007-02-22
US8338123B2 (en) 2012-12-25
CN1728950A (zh) 2006-02-01
PL377490A1 (pl) 2006-02-06
JP4723247B2 (ja) 2011-07-13
ZA200504358B (en) 2006-04-26
CN100569101C (zh) 2009-12-16
WO2004030468A3 (en) 2004-07-22
EP2156750A1 (en) 2010-02-24
ATE440504T1 (de) 2009-09-15
US8105815B2 (en) 2012-01-31
BR0317298A (pt) 2005-11-08
AU2003294908A1 (en) 2004-04-23
DK1571919T3 (da) 2009-11-30
CA2509891C (en) 2016-08-16
EP1571919B2 (en) 2015-04-15
EP1571919A2 (en) 2005-09-14
DE60329018D1 (de) 2009-10-08
CA2509891A1 (en) 2004-04-15
ES2331068T3 (es) 2009-12-21
JP2006510354A (ja) 2006-03-30
EP1704782A1 (en) 2006-09-27
CA2914911A1 (en) 2004-04-15
CA2914911C (en) 2019-07-30
BRPI0317298B1 (pt) 2017-06-13
PL395660A1 (pl) 2011-09-12
US20120141629A1 (en) 2012-06-07
ES2331068T5 (es) 2015-08-10
DK1571919T4 (en) 2015-07-20
EP1571919B1 (en) 2009-08-26
WO2004030468A2 (en) 2004-04-15
AU2003294908B2 (en) 2009-11-05
BR122016002751B1 (pt) 2017-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011438B1 (ru) Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт
JP6648191B2 (ja) 低レベルのホルデインを有するオオムギ
EP2137306B1 (en) Novel asparaginases and uses thereof
EA014853B1 (ru) Амидаза из aspergillus niger и применение амидазы для получения пищевого продукта с пониженным содержанием акриламида
EA018424B1 (ru) Варианты фермента аспарагиназы и их применение
JP7290591B2 (ja) 非常に低レベルのホルデインを有するオオムギ
AU2016289705B2 (en) Development of an asparagine-reducing yeast by adaptive evolution and uses thereof to reduce acrylamide formation
CN104894159A (zh) 低丙烯酰胺食品
WO2011134916A1 (en) Novel asparaginase enzyme
CN107920488B (zh) 谷蛋白减少的谷粒及其组合物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU