CN1692124A

CN1692124A - 与p53结合的T细胞受体分子以及其用途

Info

Publication number: CN1692124A
Application number: CNA028153030A
Authority: CN
Inventors: L·A·舍曼; K·F·卡德; J·A·韦丹兹; H·C·王; E·L·汤姆森
Original assignee: Scripps Research Institute; Altor Bioscience Corp
Current assignee: Scripps Research Institute; ImmunityBio Inc
Priority date: 2001-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2022-06-05
Also published as: AU2002316190B2; EP1546188A2; EP1546188B1; AU2002316190A1; CA2487779A1; EP1546188A4; CN1692124B; WO2004018619A2; AU2002316190B8; US7456263B2; DK1546188T3; AU2002316190A8; CA2487779C; DE60228504D1; WO2004018619A3; EP2009019A1; US20080269113A1; JP4447456B2; ATE405582T1; JP2005525128A

Abstract

本发明提供一种T细胞受体(TCR)分子，它可以与衍生自p53蛋白质的肽结合，特别是人类p53蛋白质。该TCR分子包含杂二聚分子以及单链分子，且该TCR分子特异性地结合至显现于上下文的HLA分子系统，特别是HLA－A2.1中的p53蛋白质的一个序列段，尤其是氨基酸264－273的位置。本发明还揭示了制造及使用这类TCR分子的方法。本发明具有广泛的用途，包括治疗用途以及检测表达p53蛋白质的细胞的用途。

Description

与p53结合的T细胞受体分子以及其用途

相关申请案

本申请基于35U.S.C.§120的要求，请求针对美国专利申请第09/774,681号的优先权，申请日为2001年2月1日，该申请针对美国专利申请第08/812,393号请求优先权，申请日为1997年3月5日，该申请针对美国专利申请第60/012,845号请求优先权，申请日为1996年3月5日。本申请还基于35U.S.C.§119(e)的要求，请求针对美国专利申请第60/296,324号的优先权，申请日为2001年6月5日。所有这些申请都以参考资料并入本文。

政府支持

本发明根据全国卫生研究所的第CA 25803号合约由政府支持完成。政府对本发明享有一定权利。

技术领域

本发明涉及能与特定p53蛋白质序列相结合的T细胞受体(TCR)分子，以及制造及使用这类分子的方法。本发明的TCR分子有各种用途，包括治疗以及诊断方面的用途。

背景技术

传统上治疗例如癌症等疾病的方法包含手术、放射线、化学治疗、抗生素或组合治疗。然而，上述治疗方法对于这些指标的大多数还没有证实具有有效性。发展预防和/或治疗这类人类疾病的替代疗法十分重要。近年来，利用抗体及T-淋巴细胞的免疫疗法和基因疗法已成为治疗人类疾病的新方法，并且是很有发展前景的方法。

这种治疗方法之一包括利用抗体使治疗或诊断试剂对特定目标进行瞄准。许多团体围绕利用抗体作为瞄准试剂这个课题形成了一些进展。这种进展包括对抗体融合蛋白质和抗体共轭分子的构造，将抗体连接到各种效应分子上，包括放射性分子、化学治疗剂、毒素、以及附加生物活性蛋白质。利用这类分子建立起来的治疗或诊断的设计是为了形成特定的效果，也就是连接了效应分子的抗体的目标效果。

正如抗体已经发展为疗法，免疫系统的另外一种主要效应物，T细胞受体(TCR)，拥有作为疗法发展平台的独特优势。抗体仅限于识别血液及细胞外空间内的病原体，或者是细胞表面上的蛋白质目标，而T细胞受体可识别细胞表面上表达出MHC分子的抗原(包含衍生自细胞内蛋白质的抗原)。依照T细胞的亚型，可识别显示的抗原并变为活化状态，T细胞受体及承载T细胞受体的T细胞可参与控制各种免疫反应。例如，T细胞参与体液免疫反应的调节，通过诱导B细胞分化成抗体产生细胞来实现。此外，活化的T细胞可引起细胞为媒介的免疫反应。因此，T细胞受体可识别抗体不能发现的其它目标。

T细胞反应通过抗原连接到T细胞受体(TCR)分子上进行调节。有一种类型的TCR是一种由外膜包裹的杂二聚体，它由类似于免疫珠蛋白的变异和恒定区域的α链及β链构成。该TCRα链包含以共价连接的Vα及Cα链，而该β链包含以共价连接到Cβ链上的Vβ链。该Vα及Vβ链形成一个口袋或裂口，这样就可以将超级抗原和抗原结合到主要组织兼容复合物系统中(MHC)(人类已知的是HLA复合物)。大体而言，参见Davis Ann.Rev.of Immunology 3：537(1985)；Fundamental Immunology 3rd Ed.，W.Paul Ed.Rsen Press LTD.NewYork(1993)。

人们相信TCR在免疫系统的发展和功能中起着重要的作用。例如，已报导该TCR可调停细胞死亡、增加B细胞繁殖、并影响各种紊乱症状的发展和严重性，这些紊乱症状包括：癌症、过敏、病毒感染以及自体免疫障碍。

已有报告指出人类p53是一种肿瘤抑制蛋白质，并且来自p53的肽表位具有特殊的I MHC类别的分子特征。进一步还有报告指出p53是广泛的有关肿瘤的毒害细胞的T-细胞(CTL)目标的候选成员。参见，例如，Theobald，M.et al.(1995)PNAS(USA)92：11993以及本文所引用的参考文献。

现已认可人类p53蛋白质的反常形式与各种癌症相关。其中一种看法就是异常或突变的p53蛋白质会湮没正常(野生型)p53蛋白质的保护特征。参见，例如Levine，A.J.et al.(1991)Nature(London)351：453。

已有文献描述了用于识别和具体连接衍生自人类p53蛋白质的肽的人类I类分子。其中一种分子就是HLA-A2.1。参见Theobald，M.etal。

故人们期望得到可以识别和连接衍生自人类p53蛋白质的肽的TCR分子。特别期望得到杂二聚体及单链TCR分子，可特异性地结合至人类p53蛋白质的氨基酸位置264至272间的序列段。

发明内容

本发明人已识别出可与衍生自人类p53蛋白质的肽相结合的T-细胞受体(TCR)分子。一方面，本发明人已分离出杂二聚体的TCR分子，它可以特异性地连接出现在HLA分子系统(尤其是HLA-A2.1)中，人类p53蛋白质的优选氨基酸位置264至272之间的序列段。另一方面，本发明人还制得了专门连接同一序列的单链TCR(sc-TCR)分子。本发明还揭示了制造及使用这种TCR分子的方法。本发明具有广泛的应用，包含治疗用途及检测具有p53蛋白质的细胞的用途。

根据本发明的TCR分子通常为杂二聚体或单链分子，它可结合人类p53分子的优选为氨基酸位置264至272间的序列。最佳的序列为Leu Leu Gly Arg Ash Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)的表位，其位置为人类p53分子的氨基酸位置264至272之间的范围。其它合适的p53序列如下述。

特定的TCR分子具有各种用途的特征。例如本文所揭示的杂二聚体TCR分子可用于检测表达p53蛋白质的细胞，尤其是在出现适当抗原的复合物系统中。对这种复合物的举例说明就是一种灵长类的I类主要组织兼容复合物(MHC)，它结合并出现在p53蛋白质的CTL免疫相关的局部。优选的MHC I类分子为如下揭示的人类HLA-A2.1复合物。

本发明包括各种杂二聚体的TCR分子，其所在的系统通常是预先确定的，以符合所需的用途。例如，于一具体实施例中，杂二聚体TCR分子表达为细胞表面分子位于转染或基因重组的细胞上。该细胞的实例如下述。此外，合适的杂二聚体TCR分子以更易于溶解的形式给出，例如，该杂二聚体包含下述一种或多种免疫球蛋白(Ig)序列。

本发明更特别的杂二聚体TCR分子是以α链及β链为特征，这些链彼此之间通常由一个或多个共价键连接。最好，这些共价键包含一或多个双硫键连接。更优选的，杂二聚体包含至少一个Vα链和至少一个Vβ链，这些链最好构造在有效位置，位于杂二聚体键合缝隙内或附近，序列段大约为人类p53分子的氨基酸位置264到272的范围，优选氨基酸位置264-272。短语“有效位置”的意思是指根据本发明(杂二聚体和单链形式)TCR V链与p53的特定序列结合，按照本文所揭示的标准分析法，包括优选的T细胞结合方式以及下述ELISA测试。

该杂二聚体TCR的特定V链包含以共价连接至C-α链的V-α链和以共价连接至C-β链的V-β链。在大多数具体实施例中，C-α链及C-β链各自独立地连接到适当的细胞跨膜结构区域，这个结构区域通常进一步地独立连接到适当的细胞质区域。例如，在需要一种可溶性杂二聚体分子的情况下，至少最好去除跨膜区域或最佳是去除整个跨膜区域，例如采用标准重组DNA的手段。

本发明的特征还有其它有用的TCR分子，包含本文所揭示的单链T细胞受体(sc-TCR)分子。一般，这些分子包含至少一个Vα链连接到至少一个Vβ链，通过至少一个肽序列。若需要，该sc-TCR可进一步包含至少一个Cα链的部分，并且可选至少一个Cβ链部分。在本发明更具体的实施例中，该sc-TCR将包含大约一个Vα链连接到大约一个Vβ链，通过至少一个肽连接序列。sc-TCR中任何V或C序列的排列通常并不重要，只要达到了目标连接结果。然而，通常最好Vα及Vβ链要足够，可以有效连接到人类p53序列段上，大约是按照标准连接测试确定的氨基酸264-272的位置。

本发明给出了重要的优点。

例如，杂二聚体及单链TCR首次提供了可辨识及结合到一种重要的p53表位序列上的TCR分子。本发明的分子通过结合至该序列提供了对于癌症或癌症前细胞中的p53肿瘤抑制蛋白的重要和可靠的识别。因此，在本发明之一个方面，该分子可用于诊断性的方面以检查并量化(若需要)细胞、组织和器官内p53的存在和数量。这类细胞包含培养细胞以及初级、二级及不死细胞系。检测p53蛋白质的能力对于癌症的体内和体外诊断十分有用。另一方面，本发明的TCR分子可用于检测和(选用)量化细胞中的p53，特别是可以在适当的MHC I类分子的系统(特别是HLA-A2.1复合物)中引起p53抗原的那些。

因此，一方面，本发明的特征是一种分离的T细胞的受体(TCR)杂二聚物，它包含Vα链及Vβ链。最好，该杂二聚体可结合下列“靶”氨基酸序列：Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)，最好特别是在HLA-A2.1 MHC分子的系统中，包括该序列的变异序列，其中至少有一个保守氨基酸的替代物。优选的结合通过任何一种标准TCR结合分析确定，其结合特性表达为结合的增加，这种结合的增加与发生在无关(对照)TCR上的结合具有显著的不同(此处“显著性”通过使用本领域中已知的常规统计方法决定，例如p≤0.05)。优选，该结合高于对照组至少约2倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、或至少约100倍。最优选的TCR结合分析以及不相关的TCR杂二聚体如下所述。

在一个更具体的实施例中，本发明的特征还包括一种分离的T细胞受体(TCR)杂二聚体，其包含一种α链及一种β链，其中该α链包括按照下列顺序通过共价键连接的：a)一种Vα链以及b)一种Cα链；且该β链包括按照下列顺序通过共价键连接的：c)一种Vβ链及一种Cβ序列。优选的，该杂二聚体可以在HLA-A2.1 MHC分子系统中结合前述的靶氨基酸序列SEQ ID NO.1，以及至少有一个保守氨基酸替代物的该靶序列的变异序列。

如上所讨论，本发明的发明特征还有sc-TCR分子，它包括可特异性地连接靶SEQ ID NO.1序列的V链。

在本发明的一个实施例中，这种sc-TCR包含至少一个Vα链通过共价键连接到至少一个Vβ链上，借由至少一个肽连接序列实现。优选，这类sc-TCR包含约1到5个这种V链，更优选为约1到2个这类V链。还优选，这类V链在HLA-A2.1 MHC分子系统中可以连接下列靶氨基酸序列：Leu Leu Gly Arg Ash Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)，包括至少有一个保守氨基酸替代物的该靶序列的变异序列。

优选的结合通过任何标准TCR结合分析确定，其结合特性表达为结合的增加，这种结合的增加与发生在不相关(对照)TCR上的结合有显著的不同(此处“显著性”通过使用本领域中已知的常规统计方法决定，例如p≤0.05)。优选的，该结合高于对照组至少约2倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、或至少约100倍。最优的sc-TCR结合分析以及不相关sc-TCR描述如下。

另一方面，本发明的特征还包含至少一对核酸片段(通常为DNA或RNA)，该片段中编码了一种或多种本文所提供的杂二聚体。

另一方面，本发明还包括DNA载体，包含至少一个编码了TCR杂二聚体的DNA片段。例如，第一DNA片段可编码该α链而第二DNA片段可编码该β链。于某些例子中，需要提供一种单一的DNA载体，它带有一些片段可以同时编码杂二聚体的α链和β链。

本文还展望了包含这里指出的DNA载体的细胞。

本发明的特征还包括一种核酸片段(DNA或RNA)，它编码了至少一个本文提供的sc-TCR分子，优选约1至5个，更优选为1到2个。本发明还包括含有核酸片段的DNA载体。

另一方面，本发明的特征还包含一种方法，可识别在HLA-A2.1MHC分子体系中表达p53蛋白的细胞和组织。在另一具体的实施例中，这种方法包括用转导细胞或基因重组细胞接触细胞和组织，这些转导细胞和基因重组细胞中包含本文所揭示的sc-TCR或TCR杂二聚体。或者，使该细胞或组织可以与可溶性sc-TCR或TCR杂二聚体接触，以替代(或结合使用)表达sc-TCR或TCR杂二聚体的转导细胞或基因重组细胞。

本发明的特征还包含一种方法，用于识别在HLA-A2.1 MHC分子体系中表达p53蛋白质的细胞和组织。在本发明的优选实施例中，该方法包括用本文提供的sc-TCR接触该细胞或组织。

本发明还包括杀死表达下列氨基酸靶序列的细胞的方法：Leu LeuGly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)，包括这个序列的变异序列，它具有至少一个保守氨基酸的替代物。更具体的方法包括用转导细胞和重组细胞接触该细胞，这种转导细胞和重组细胞表达本文所给出的sc-TCR或TCR杂二聚体分子。此外，优选的方法进一步包括用一定数量的sc-TCR或杂二聚体TCR接触该细胞，所采用的数量根据传统的分析方法来确定，通常足够用来伤害或杀死此细胞(例如，锥虫蓝排除法(trypan blue exclusion)，表达出细胞程序死亡的特征等)。

另一方面，本发明的特征还包括治疗癌症的方法，该方法包括对哺乳动物施用治疗上有效量的至少下列一种物质：a)具有本文所提供的TCR杂二聚体的转导细胞或基因重组细胞，或b)至少一种本发明的sc-TCR，优选为一种这类sc-TCR。优选，所述癌症的特征为p53蛋白质的正调节(upregulation)，其调整量根据下列讨论的免疫组织化学或流式细胞仪确定的量，正调整到至少约2倍，优选至少5至10倍，优选约100倍。

本发明的其它方面及具体实施例描述如下。

附图说明

图1是对pNAG2载体的图示说明。

图2是显示pSUN27载体的示意图(寄存编号为ATCC#209276)。

图3是显示载体中编码优选的双特异交杂分子pBISP/D011.10以及pBISP/149(称为pSUN28的寄存编号为ATCC#203186)的区域的示意图。

图4A、4B及4C显示该264单链TCR(264sc-TCR)(SEQ ID NO.2)的氨基酸及核酸序列。Va3＝TCR Vα3区域(氨基酸61-399)；连接子序列(氨基酸400-471)；Vb3＝TCR Vβ3区域(氨基酸472-813)；Cb＝TCR Cβ区域(氨基酸472-813)。

图5显示该264TCR的光学Cα区域(SEQ ID NO.3)。

具体实施方式

如上文所总结，本发明人现已分离出非常有用的T细胞受体(TCR)杂二聚体，它通常包含一个Vα链及一个Vβ链，也就是，一种双链复合物。更优选的杂二聚体通常在HLA-A2.1 MHC分子体系中，人类p53蛋白质序列的氨基酸序列约264到272间的区域结合，优选为该蛋白质的氨基酸位置264至272间，也就是，下列氨基酸靶序列：Leu LeuGly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)。正如前面总结的，良好的结合效果是由下述标准T细胞结合分析确定的。

已有报告指出许多自然形成的TCR杂二聚体之一般结构。例如参见Davis Ann Rev.of Immunology 3：537(1985)；FundamentalImmunology 3^rd Ed.，W.Paul Ed.Raven Press LTD.New York(1993)以及此文所引用的参考文献。

通常，T细胞是以提呈在其细胞表面上的T细胞受体来识别存在于细胞表面的抗原。TCR是双硫键连接的杂二聚体，主要是由α及β链糖蛋白构成。T细胞用来产生其各种受体分子的机制与用来产生在B细胞中起作用的各种抗体的机制相同。(Janeway and Travers；Immuno-biology 1997)。与免疫球蛋白基因相似，TCR基因是由在T细胞发展期间重新排列的片段所组成。TCR多肽是由可变的氨基端及固定的羧基端区域组成。同时，该羧基端区域的功能是作为透过细胞膜的锚接物，并且在受体被占据后参与细胞内的信号转导，而可变区域将负责识别抗原。该TCRα链仅含有由V及D片段编码的可变区域，而β链含有额外的结合(J)部分。在整个TCR的各种各样的组成成分中，这些片段的重新组合可以识别出现在不同MHC分子体系中的很多不同的抗原。

已有报告指出可识别特定抗原的特异性TCR。例如，尚未获准的美国专利申请案U.S.S.N.08/813,781和U.S.S.N.09/422,375，合并在本文中作参考；以及国际公开申请PCT/US98/04274和PCT/US99/24645，并且本文讨论的参考资料揭示了制备及使用特异性TCR的方法。此外，利用重组方法生产了特定特异性TCR如可溶性、单链TCR(sc-TCR)。生产和使用sc-TCR的方法揭示并描述于尚未获准的美国专利申请08/943,086，以及国际申请PCT/US98/20263中，它们作为参考资料合并在本文中。

本发明优选的TCR杂二聚体包含以至少一个双硫共价键互相连接的α链及β链。已经报道了链与链之间以非共价键连接的情况，例如，氢键连接。各链的长度约为150至350个氨基酸长度、优选为约200至约300个氨基酸长度、优选为约250至约290个氨基酸长度，本发明应用中大部分使用约280个氨基酸长度的链。本发明的杂二聚体TCR分子可视需要予以醣基化。

“HLA-A2.1 MHC分子”系指灵长类的MHC I类分子，优选为人类分子，其可由A2.1限制性产生或由A2.1限制性的具有TCR的肿瘤反应性胞毒T淋巴细胞(CTL)识别，该TCR对具有得自人类p53蛋白质的序列的肽具有特异性。优选的氨基酸序列系人类p53序列中的约氨基酸250至约氨基酸290，优选为该序列的约氨基酸264至约氨基酸272，于大部分应用中系使用该p53蛋白质序列的氨基酸264至氨基酸272区域。

本发明中优选的HLA-A2.1 MHC分子是完整的膜蛋白质，其包含具有三个细胞外结构域(α1、α2、及α3)的糖蛋白重链、跨膜结构域、以及细胞质结构域。该重链与可溶性次单元β2-微球蛋白间典型地系以非共价键连接。该重链的α1及α2结构域一起折叠形成特定p53序列的肽结合沟。该重链与β2-微球蛋白间的关联有助于稳定肽结合沟。该MHC分子可由自然产生或重组的I类重链(或其片段)的任何组合与自然产生或重组的β2-微球蛋白分子(或其生物活性片段)所构成。

与人类p53氨基酸及核酸序列有关的信息可自国家医药图书馆，38A，8N05，Rockville Pike，Bethesda，MD 20894的国家生物技术信息中心(NCBI)-基因序列数据库(Genbank)获得。Genbank亦可自网际网络 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov上获得。参见Benson，D.A.et al.(1997)Nucl.Acids.Res.25：1中对Genbank的说明。亦参见前述Theobald，M et al.(1995)(揭示本案采用的该p53氨基酸编号表)。

已有报告指出于恶性细胞中，肿瘤抑制蛋白质p53的表达有向上调节的情形。亦显示出所有肿瘤中，50％的肿瘤于其表面上增加p53的表达程度(Kolliston，M.D.，et al.，Science(1991)，253：49)。

关于制造及使用人类HLA-A2.1 MHC分子的信息，尤其是关于肿瘤细胞表达p53，以揭示于前述Theobald，M et al.(1995)的报告及其参考文献中。亦参见PCT/US97/03611及USSN 08/812,393，申请日为1997年3月5日，该申请案请求USSN 60/012,845，申请日为1996年3月5日的优势。PCT/US97/03611、USSN 08/812,393、以及USSN60/012,845申请案的内容在此引入以供参考。

检测HLA-A2.1 MHC分子与得自p53蛋白质序列的氨基酸序列间的结合的方法已揭示于，例如前述Theobald，M et al.(1995)的报告中。一般，该方法包括利用识别性竞争分析法以评估p53肽对HLA-A2.1分子的结合。亦参见，PCT/US97/03611、USSN 08/812,393、以及USSN60/012,845申请案。

本发明的特定杂二聚体TCR分子包含一Vα链，该链与第4A-C图所示的Va3链具有至少约90％的同一性，优选为约95％至100％的同一性。本发明的其它杂二聚体包含Vβ链，该链与第4A-C图(SEQ ID NO.2)所示的Vb3链具有至少约90％的同一性，优选为约95％至100％的同一性。

优选地，为了决定两个氨基酸序列间的同一性百分比，将这些序列排列以进行最适合的比对(例如，于第一及第二氨基酸之一或两者中插入间隔(gap)以进行最佳的比对，以及为了比对的目的，而忽视非相似性性序列)。「比对窗口」系指选自由25至600，通常约50至约200，更通常约100至约150个连续位置的数目中的任一片段，于该两序列经最佳排列后，将该片段的序列与连续位置的相同数目的参考序列进行比对。为了辨别序列具有如本文所揭示的适当的同一性％，该比对窗口可包括任何上述片段范围。

两序列间的同一性百分比系序列间共有的相似位置的数目、计算间隔的数目、以及为了进行两序列间最理想的排序而需插入的间隔的长度的函数。的后比对于相对应氨基酸位置上氨基酸残基。当第一序列中的某位置的氨基酸残基与对应于第二序列的位置时，则于该位置的分子系列为相似的(本文中所使用氨基酸的「同一性」等同于氨基酸的「相似性」)。

两序列间的同一性百分比可利用本领域中已知的数学算法决定(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988：Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。例如，两氨基酸序列间的同一性百分比可利用Needleman及Wunsch算法决定(J.Mol.Biol.(18)：444-453，1970)，其系GCG软件包(可自 http：//www.gcg.com取得)的GAP程序之一部份，或由Smith &Waterman的局部相似性算法(Adv.Appl.Math.2：482，1981)，Pearson& Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)与Altschul等人(Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997)的相似性搜寻的方法，这些计算机化的算法(Wisconsin Genetic Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及BLAST(得自Genetic Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.))，或手动排序以及用肉眼检视(参见，例如前述Ausubel等人)决定序列的同一性。

可调整间隔参数以符合使用者的需要。例如，当使用GCG软件包时，可采用NWSgapdna.CMP矩阵及40、50、60、70、或80之间隔比重(gap weight)与1、2、3、4、5、或6的长度比重(length weight)。使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵之间隔比重的例子为16、14、12、10、8、6、或4，而长度比重的例子为1、2、3、4、5、或6。两氨基酸序列间的同一性百分比可使用PAM120比重残基表、间隔长度的扣分为12及间隔扣分为4的条件，并利用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Myers与W.Miller的算法(CABIOS 4：11-17)加以决定。

因此，「100％同一性」系指V链的氨基酸与相对应的自然产生的TCR Vβ或Vα链或其具有相同结合特征的对偶变异物(例如，于结合特异性与亲和性方面无显著差异)系100％相似的。亦即，V链与相对应的自然产生的链(或其具有相同结合特征的对偶变异物)具有相同的长度与氨基酸序列。

本发明其它优选的杂二聚体分子包含分别与第5图[SEQ ID NO.3]以及第4A至C图[SEQ ID NO.2]所示的Cα及Cβ链的序列具有至少约90％同一性的Cα及Cβ链序列。优选地，该Cα及Cβ链序列与第5及第4A至C图所示的Cα及Cβ链序列间具有约95％至约100％的同一性。

sc-TCR的一般结构以及制造与使用该sc-TCR的方法已揭示于未获准的USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274中。USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274所揭示的内容在此引入以供参考。

其它，亦参见未获准的USSN 08/943,086以及PCT/US98/20263中有关制造及使用sc-TCR分子的内容。USSN 08/943,086以及PCT/US98/20263所揭示的内容在此引入以供参考。

如上述，本发明系以非常有用的单链T细胞受体(sc-TCR)蛋白质为特征，一般，该sc-TCR包含通过约1至5个肽连接子序列共价连接至约1至5个Vβ链的约1至5个Vα链。优选的sc-TCR包含通过约1个本文所提供的肽连接子序列而共价连接至约1个Vβ链的约1个Vα链。

其它优选的sc-TCR典型地可结合至在HLA-A2.1 MHC分子中具有得自人类p53蛋白质的序列的肽。优选的氨基酸序列通常系人类p53序列中约氨基酸250至约氨基酸290间，优选系以具有横跨p53蛋白质的氨基酸位置264至272序列的自约氨基酸264至约氨基酸272间为最佳应用。优良的结合系以下述的标准T细胞受体(TCR)ELISA分析法来决定。

本发明中特定的sc-TCR分子包含与下述第4A至C图[SEQ ID NO.2]所示的Va3链具有至少约90％同一性的Vα链，优选为约95％至约100％的同一性。其它优选的sc-TCR分子包含与第4A至C图[SEQ ID NO.2]所示的Vb3链具有至少约90％同一性的Vβ链，优选为约95％至约100％的同一性。

本发明其它优选的sc-TCR分子包含与第4A至C图所示的Cβ链具有至少约90％同一性的Cβ链，优选地，该Cβ链与第4A至C图所示的Cβ链具有约95％至约100％的同一性。

已于标准T细胞受体(TCR)ELISA分析法中发现，展现优良的sc-TCR结合并不总是需要Cα链。于这些具体实施例中，并不需要以Cα链作为sc-TCR分子的一部份。例如，参见下述第4A至5C图(揭示最佳的264sc-TCR的序列)。然而，sc-TCR分子可包含至少一个Cα链(例如于第5图所示者)或其功能片段，优选为约1至5个这些链，其中以1个这些Cα链为适当者。

本发明具体实施例中特定的sc-TCR分子包含Cα链或其功能片段，该链与第5图[SEQ ID NO.3]所示的Cα链具有至少约90％同一性。优选为与第5图[SEQ ID NO.3]所示的Cα链具有约95％至约100％的同一性。

本发明特定的sc-TCR分子包含共价连接的序列：1)第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Vα3链；2)肽连接子；以及3)第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Vβ3链。于一具体实施例中，该sc-TCR分子进一步包含如第4A至C图(SEQ ID NO.2)所提供的Cβ链，其优选系连接至Vβ3链的C端。

于前述特定的sc-TCR分子的具体实施例中，该sc-TCR进一步包含如第5图(SEQ ID NO.3)所提供的Cα链，该链优选系共价连接Vα链的C端及肽连接子的N端。

本文所揭示的典型的杂二聚体的Vα及Vβ链及单链TCR分子的长度一般系约200至400个氨基酸，优选为约300至350个氨基酸。决定氨基酸长度的方法为本领域中已知的技术，该方法包含聚丙烯酰胺凝胶电泳。

如所讨论，本发明优选的sc-TCR分子包含一或多的肽连接子序列，其优选位于Vα及Vβ链间。优选的连接子序列包括自约7至20个氨基酸，优选自约8至16个氨基酸。该连接子序列优选系具有灵活性的，因此不将衍生自该人类p53蛋白质(且表达于HLA-A2.1分子中)的序列限制为单一所需的构形。特定地，该肽连接子序列可设置于TCR可变链中以加强这些链间的结合灵活性。该连接子明显地包括具有小型侧链的氨基酸，例如甘胺酸、丙胺酸以及丝胺酸，使提供灵活性。约80或90百分比或以上的连接子序列包括甘胺酸、丙胺酸或丝胺酸残基，尤其系甘胺酸以及丝胺酸残基。至于杂二聚体TCR，该连接子序列系适当地连接至TCR分子的β链，虽然该连接子序列亦可附接至该TCR分子的α链。此外，该连接子序列可连接该TCR分子的α链及β链两者。

参见下列关于制造及使用sc-TCR分子的参考文献以补充本文所揭示的内容：Novotny，J.et al.PNAS(USA)88：8646(1991)；SooHoo，W.F.et al.PNAS(USA)89：4759(1992)；Wülfing，C.andPlückthun，A.，J.Mol.Biol.242：655(1994)；Kurucz，I.et al.PNAS(USA)90：3830(1993)；PCT WO 96/13593；Ward，E.S.et al.J.Mol.Biol.224：885(1992)；Schlueter，C.J.et al.J.Mol.Biol.256：859(1996)；Mariuzza，R.A.and Winter，G.，(1989)264：7310；Gascoigne，N.R.J.，et al.，PNAS(USA)(1987)，84：2936。

于本发明特定具体实施例中，适合的连接子序列系ASGGGGSGGG(亦即，Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)(SEQ ID NO.4)，重复4次或更多次，优选系连接至TCR的β结构域的第一个氨基酸。可使用不同的连接子序列，包含任何数量的灵活的连接子设计，这些设计的连接子已成功地用于结合抗体可变区，参见Whitlow，M.et al.，(1991)Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97-105。适当的连接子序列可轻易地凭经验加以辨别。另外，连接子序列的适当大小及序列亦可由已知计算机仿真技术基于该TCR分子的预定的大小及形状加以辨别。

因此，于一具体实施例中，本发明以特定的sc-TCR分子为特征，其中优选至少一个肽具有下列序列：Gly Gly Gly Gly Ser，重复4次或更多次(SEQ ID NO.5)。

亦参见案名为「T细胞受体融合物及共轭物及其使用方法」的相关申请中的申请案，申请日为2001年6月5日(USSN 09/874,907，发明人为Jon A.Weidanz，Kimberlyn F.Card，以及Hing C.Wong)以提供其它关于特定264TCR相关分子的信息；该相关申请中的申请案的内容在此引入以供参考。

某些套组(settings)可用于制造本发明的多价sc-TCR分子，例如，增加该sc-TCR的价数。简单的说，该多价TCR蛋白质是通过利用例如，标准生物素-抗生蛋白链菌素标记技术或通过共轭至适合的固体支撑物(例如乳胶珠)将二及四种蛋白质(可相同或不同)彼此间共价连接而制造该多价sc-TCR蛋白质。化学交联蛋白质(例如交联至树状聚合物)亦为适合的多价种类。例如，可通过包含带有化学反应性支链(例如Cys或His)的可编码出氨基酸残基的序列修饰该蛋白质。这些带有化学反应性支链的氨基酸可位于该经连接的蛋白质中的各种位置，优选位于TCR的抗原结合区域的末端。例如，可溶性融合蛋白质的C-β链片段的C端可共价连接至蛋白质纯化卷标或其它包含此种反应性氨基酸的其它蛋白质。适合的支链包含可将二或多种融合蛋白质化学地连接至适合的树状聚合物粒子而得到多价分子者。树状聚合物为合成的化学聚合物，其表面可具有一些不同官能基中的任一者(D.Tomalia，Aldrichimica Acta，26：91：101(1993))。根据本发明所使用的树状聚合物的实例包含，例如，E9亮光聚胺树状聚合物以及E9燃烧性聚胺树状聚合物，其可连接半胱胺酸残基。

本文所提供的人类p53序列对本发明的TCR分子的成功的提呈可通过各种特定分析法决定，包含T细胞结合分析法以及下述的TCRELISA。此外，若需要，可通过监测T细胞的活性检测及定量该成功的提呈，该T细胞活性监测包含T细胞增殖的诱发或抑制、或T细胞对特定位置或标记的免疫反应的起始作用或抑制作用。这些适合的分析法包含，但不限于，体外分析法，包含培养T细胞、增殖T细胞、以及使T细胞与MHC-肽抗原复合物接触，然后评估该细胞的生物反应。参见USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274申请案关于这些分析法的更多特定实例。

一方面，TCR分子的功能系由监测该TCR识别适当的MHC分子(例如HLA-2A)中的适当的p53肽的能力所决定，例如由监测该TCR与MHC:p53肽复合物的结合。这些复合物可提呈于细胞，于此情形中TCR的功能系由使经标记的TCR与提呈p53的细胞接触且测量与细胞结合的量，另一方面将该经标记的TCR与未提呈p53的细胞并测量与细胞结合的量，比较两者。经标记的细胞可通过使用本领域中常规的流式细胞仪加以检测。

另一方面，系使用非-细胞为主分析法，例如TCR酶连接免疫吸附分析法(Enzyme Linked Immunosorbant Assay，ELISA)。例如将该TCR直接结合至一支撑物，即可测量其与MHC:p53肽复合物的结合能力，或者将该MHC:p53结合至一支撑物，即可测量复合物与TCR的结合能力。适合的支撑物包含，但不限于微滴定盘的孔槽、细胞培养盘、膜、玻璃或聚合物基材等。除了直接将TCR结合至支撑物外，可于该支撑物外涂覆一种可识别TCR的抗体，该经结合的抗体会捕捉TCR因而间接将TCR结合至支撑物上。这些分析法的适当的对照组为熟于本领域者所知悉，其包含，但不限于MHC分子与不恰当的抗原结合、不会识别p53的TCR、缓冲液等。于TCR ELISA中，TCR分子或MHC分子或肽接可经标记。优选为结合至支撑物上的分子系未经标记的。本文所使用的「经标记」是指直接或间接标记。因此，「经标记的TCR分子」包括直接连接至TCR的标记或包括通过经标记的结合伙伴(bindingpartner)，例如抗体，直接或间接与TCR结合，该结合伙伴可识别TCR或识别与TCR结合的抗体。本文中所使用的「经连接」系指两个分子间稳定的连接，该连接可为共价或非共价连接。

监测TCR功能的分析法亦包含测量由TCR调节的信号转导。一方面，将可编码出TCR杂二聚体的核酸构建体引入细胞中，该细胞不会表达TCR或至少不会表达具有相同特异性的TCR。然后可检测该TCR-表达细胞与p53:MHC复合物结合时该细胞的转导适当信号的能力。例如，可测量该TCR-表达细胞产生IL-2的能力。亦可将sc-TCR转染进入细胞。此方法中，该sc-TCR优选系表达为一种与穿膜结构域多肽(例如，得自免疫球蛋白分子)融合的融合物，以及更优选为一种与适当细胞质信号结构域融合的融合物。一方面，该细胞质信号结构域系CD3ζ分子。MHC:p53复合物可以通过自然的或经人造工程抗原提呈细胞的方式提呈或可为分离的复合物。

亦可测定TCR调节细胞溶解(cytolytic)反应的能力。这些分析中，优选系将可编码TCR分子的核酸构建体引入细胞中，该细胞可表达适当的共-刺激分子。

于上述所有分析法中，「具功能的」TCR系指与未结合MHC:p53复合物的对照组TCR相较下，可显示使功能增加者(例如，增加结合、增加信号转导(例如产生IL-2)、增加细胞杀伤等)。显示「具功能的TCR」所增加的功能的量系根据所使用的分析法。例如，一方面，具功能的TCR所得的分析值比对照组TCR大约10％以上、约15％以上、约20％以上、约30％以上、约40％以上、约50％以上、约60％以上、约70％以上、约80％以上、约90％以上、或约100％以上。于其它分析中，具功能的TCR所得的分析值比对照组TCR大约2倍以上、约4倍以上、约8倍以上、约10倍以上、约20倍以上、约30倍以上、约40倍以上、约50倍以上、约60倍以上、约70倍以上、约80倍以上、约90倍以上、或约100倍以上。至于其它分析，具功能的TCR所得的分析值比对照组所得者在统计上具有p＜0.05的显著差异。熟于本领域者可常规地评估测量所使用的特定分析法的差异。

通常，本发明TCR的制备可由本文所揭示的程序以及经认可的重组DNA技术(包含，例如聚合酶连锁放大反应(PCR)、质体DNA的制备、以限制酶切割DNA、寡核苷酸的制备、DNA的接合、mRNA的分离、将DNA引入至一适合的细胞中、宿主的转形作用或转染作用、培养宿主)加以完成。此外，可使用离液剂(chaotropic agent)及已知的电泳、离心与层析法将该TCR分子分离及纯化。参见，Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.(1989))；以及Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York(1989)揭示相关的方法。

亦参见USSN 08/813,781以及PCT/US98/04274以及上述参考的相关申请中的申请案，案名为「T-细胞受体融合物与共轭物及其使用方法」申请日为2001年6月5日(USSN 09/874,907，发明人为Jon A.Weidanz，Kimberlyn F.Card以及Hing C.Wong.)以提供更多关于制造及使用本文所揭示的分子的特定背景信息。

如所讨论，本发明优选的分子显示有良好的结合，该结合系以本文所述的标准T细胞结合分析法或TCR ELISA所测定。「标准T细胞结合分析法」系指一种结合测试法，其可检测及定量适当的T细胞和与抗原复合的MHC分子间的结合。简单的说，优选的试验法包含提供可检测的经标记的MHC分子、于利于形成MHC-抗原：T细胞复合物的条件下，使该经标记的MHC分子(与抗原复合)与T细胞接触、以及利用标准检测法监测复合物的形成。若需要，可测定该复合物的形成。亦可使用上述其它的TCR功能分析法。

本文所提供优选的TCR分子(包含杂二聚体及单链分子)一般具有足够的大小可使该TCR特异性的结合至MHC分子。于具体实施例中，该MHC系与抗原复合亦称为肽-MHC分子，该TCR分子至少包含可形成MHC-肽结合口袋(binding pocket)的CDR结合圈。含有MHC-肽结合口袋的有用的α/βTCR分子优选至少系由α链可变结构域(根据α链的CDR的长度约为氨基酸1至约氨基酸110至约氨基酸130)以及该β链可变结构域(根据β链的CDR的长度约为氨基酸1至约氨基酸110至约氨基酸130)。

本发明中优选的TCR分子于本文前述的标准T细胞结合试验中展现显著的结合活性。优选地，该TCR分子与其同源MHC抗原分子复合物的特异性结合的程度显著地与结合至不适当的(对照组)TCR不同(此处「显著性」系利用本领域中已知的常规统计方法决定，例如具有p≤0.05)。优选地，该结合系对照值的至少约2倍、至少约倍10、至少约20倍、至少约50倍、或至少约100倍。适合的对照分子的实例包含，例如，USSN 08/813,781；USSN 09/422,375；PCT/US98/04274；PCT/US99/24645；以及其它本文所引用的参考资料中所提供的149 TCR分子。

非常有用的体外及体内T细胞结合分析法已揭示于公开的PCT申请案PCT/US95/09816、PCT/US96/04314及PCT/US97/01617，以及申请中的美国专利申请案08/382,454、08/596,387及08/943,086。若需要鉴定本发明TCR分子与显示于适当的MHC分子中的所揭示的p53氨基酸序列间的良好结合，可使用或轻易地采用所揭示的T细胞结合分析法。该公开的PCT申请案PCT/US95/09816、PCT/US96/04314及PCT/US97/01617，以及申请中的美国专利申请案08/382,454、08/596,387的内容在此引入以供参考。

该T细胞结合试验的优选实例已揭示于相关申请中的申请案，申请日为2001年5月16日，案名为「T-细胞受体交互作用的调节」(USSN09/859,012，发明人为Peter Rhode，Vaughan Wittman，Jon A.Weidanz，Martin Burkhardt，Kimberlyn F.Card，Rony Tal，Jorge Acevedo，and Hing C.Wong)，该相关申请中的申请案的内容在此引入以供参考(的后称为「于2001年5月16日申请的相关申请中的申请案」)。前述于2001年5月16日申请的相关申请中的申请案系USSN 60/206,920的接续案。USSN 60/206,920的内容在此引入以供参考。

尤其，于2001年5月16日申请的相关申请中的申请案的实施例15揭示标准T细胞结合试验的实例。典型地，该试验涉及产生可表达目的TCR(例如本发明的杂二聚体)的T细胞；然后将这些细胞以适当的I类MHC分子(特别系HLA-A2.1分子)染色。将T细胞染色的方法(包含已知的生物素/抗生物素蛋白链菌素技术)已揭示于2001年5月16日申请的相关申请中的申请案。如所揭示的，优选的检测形式为流式细胞分析法，但是其它检测策略可能更适合某些申请案。

「标准T细胞受体(TCR)ELISA」包括，但不限于所揭示的任一个适合的分析法，例如揭示于前述2001年5月16日申请的相关申请中的申请案者。优选的分析法涉及利用，例如以孔盘为主的ELISA，操作单链或杂二聚体TCR构建体。简单的说，该分析法涉及可检测地标记该单链或杂二聚体TCR，使经标记的TCR分子与适合的含肽的MHC分子(优选为本文所示的HLA-A2.1分子)接触，其中该接触系于足够形成TCR：MHC-肽复合体的条件下进行。优选的标记策略系揭示于2001年5月16日申请的相关申请中的申请案中，且包含生物素/抗生物素蛋白链菌素标记策略。参见，例如，于2001年5月16日申请的相关申请中的申请案的实施例15。

如所讨论，本发明优选的TCR分子典型地系与HLA-A2.1 MHC分子中，人类p53蛋白质序列的自约氨基酸264至约氨基酸272间的氨基酸序列结合，优选为该蛋白质的氨基酸位置264至272，亦即，，下列「标的」氨基酸序列：Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQID NO.1)。此外，标的氨基酸的衍生物亦可与本发明的TCR分子结合，标的氨基酸的衍生物系具有至少一个保留性氨基酸取代的氨基酸序列。于具体实施例中系于任何标的序列的残基上进行二或多个保留性氨基酸取代，根据需要，这些取代可为相邻的或非相邻的。

优选地，保留性取代系一种不会改变表达型的氨基酸取代作用，亦即，该取代不会显著地影响该TCR于标准分析法中的结合作用。将保留性氨基酸取代成另一氨基酸的实例系于优选的标的序列中氨基酸位置7(相当于人类p53蛋白质的氨基酸位置270)的酪胺酸取代为苯丙胺酸。相反地，将标的序列中的任一亮氨酸取代为精胺酸则系非-保性氨基酸取代的实例。优选的保留性氨基酸取代的实例已揭示于U.S.Pat.No.6,127,524(第15A-B图)；该篇专利案的内容在此引入以供参考。

本发明进一步提供编码本发明TCR分子(包含优选的杂二聚体与单链构建体)的核酸序列(DNA或RNA)且特别是DNA序列。这些DNA序列优选附带于适合染色体外复制的载体上，例如噬菌体、病毒、质体、噬粒(phagemid)、黏粒(cosmid)、YAC、或游离基因(episome)。于某些具体实施例中，该DNA载体可编码其它辅助蛋白质(helperprotein)，该等蛋白质的专一功能为促进本文所述的制备性方法以获得显著量的该蛋白质。该DNA序列可插入至适当的表达载体中，亦即，该载体包含该经插入的蛋白质编码序列于进行转录作用与转译作用所需的组件。各种宿主-载体系统可用于表达该蛋白质编码序列。包含以病毒感染的哺乳动物细胞系统(例如牛痘病毒、腺病毒等)或以表达载体转染的哺乳动物细胞系统；以病毒感染的昆虫细胞系统(例如杆状病毒)；微生物，例如含有酵母菌载体的酵母菌，或以噬菌体DNA、质体DNA或黏粒DNA转形的细菌。根据所利用的宿主-载体系统，可使用任何数目的适合进行转录作用与转译作用的组件。一般参见前述Sambrook等人以及前述Ausubel等人。

一般，本发明优选的DNA载体包括通过磷酸二酯键连接的核苷酸序列，由5’至3’的方向包括第一克隆位置，其是为了引入可编码出TCR链的核苷酸序列，该第一核苷酸序列操作性连接至编码效应物分子(effector molecule)的序列，亦即融合蛋白质或共轭物。

本文中所使用的「效应物分子」系指一氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽；糖类或多糖类；脂质或醣脂类、糖蛋白、脂蛋白质或可产生此处所讨论的所需作用的化学药剂。因此，适合的分子包含调节因子、酶、抗体或药物以及DNA、RNA、以及寡核苷酸。该生物活性分子或效应物分子可为自然产生的或由已知成分合成，例如通过重组或化学合成以及可包含异性成分。生物活性分子或效应物分子一般系介于约0.1至100KD或高达约1000KD，优选为介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30以及50KD之间，其大小是通过标准分子大小估算技术(例如离心或SDS-聚丙酰胺凝胶电泳)来评定。本发明目的的效果包含，例如，诱发细胞增殖或细胞死亡，激活免疫反应或为了诊断目的作为检测分子，该诊断是通过如下所揭示的分析来决定，包含含有一系列步骤的分析，如：培养细胞至细胞增殖，以及使该细胞与本发明的TCR融合复合物接触然后评估该TCR融合复合物系抑制该细胞还是使该细胞分化。

于多数例子中，各个由该DNA载体所编码出的融合蛋白质构成要素优选系以「暗盒」的型式提供。「暗盒」一词系指各个构成要素可轻易地通过标准重组方法由另一个构成要素取代。为了制造编码本文所提供的TCR分子的载体，编码该TCR分子的序列系利用适合的连接酶连接至载体序列。

若需要，于该基因构建体中亦可含有其它核苷酸序列。例如，激活子序列，其系控制编码该TCR分子的序列的表达，或者含有前导序列，其是将该TCR融合复合物指向细胞表面或培养基，该前导序列可包含于构建体中或存在于表达载体(含有经插入的构建体)中。于哺乳动物细胞表达中特佳为免疫球蛋白或CMV激活子。

应注意，本发明TCR分子的组成包含，但不限于可变链、穿膜结构域、固定链等，这些组成可以任何顺序加以组织而提呈其功能。

可使用许多策略来表达本文提供的TCR分子。例如，将可与HLA分子中的标的氨基酸序列SEQ ID NO：1结合的sc-TCR分子通过已知的方式(例如使用限制酶在载体上制造一切口，接着使该构建体与载体接合)合并至适合的载体。然后将含有该重组基因构建体的载体引入到适合的宿主中以表达该TCR融合肽。一般参见，Sambrook等人，如前述。根据与克隆方法相关的因素，可凭经验选择适合的载体。例如，该载体应为可兼容的，以及对宿主(目的使用的宿主)具有恰当的复制子。再者，该载体必需能容纳编码该TCR分子(欲表达的TCR分子)的DNA序列。适合的宿主细胞包含真核及原核细胞，优选为易转形的细胞及于培养基中展现快速生长能力的细胞。具体言的，优选的宿主细胞包含原核生物，例如大肠菌、枯草杆菌等以及真核生物，例如动物细胞及酵母菌种(例如啤酒酵母菌)。一般以哺乳动物细胞优选，尤其为J558、NOS、SP2-O或CHO。其它适合的宿主包含，例如昆虫细胞(例如Sf9)。培养条件系使用已知的条件。参见，Sambrook等人，如前述。然后选择可稳定转形及转染的细胞株。可通过已知程序决定用以表达TCR分子的细胞。例如，经连接至免疫球蛋白的TCR分子的表达可通过对该经连接的免疫球蛋白特异的ELISA以及/或通过免疫斑点法加以决定。

一般上述提及的宿主细胞可用于制备的目的使可编码目的的融合蛋白质的核酸增殖。因此，宿主细胞可包含原核或真核细胞，其中该融合蛋白质的生产系经特定的。因此，具体地宿主细胞包含酵母菌、蝇类、虫类、植物、蛙类、哺乳动物细胞以及可增殖编码该融合物的核酸的有机体。可使用的哺乳动物细胞株的非限制实例包含CHO dhfr-细胞(Urlaub and Chasm，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))，293 Cells(Graham等人，J.Gen.Virol，36：59(1977))或骨髓癌细胞，如SP2或NSO(Galfre and Milstein，Meth，Enzymol，73(B)：3(1981))。

可增殖编码目的的杂二聚体或单链TCR的核酸的宿主细胞亦包含非-哺乳动物真核细胞，包含昆虫(例如夜蛾，Sp.frugiperda)、酵母菌(例如啤酒酵母菌、裂殖酵母菌、毕赤酵母(P.pastoris)、克氏乳酸菌(K.lactis)、汉逊酵母菌(H.polymorpha)；典型地如Fleer，R.，Current Opinion in Biotechnology，3(5)：486496(1992)所整理者)、真菌以及植物细胞。亦包含某些原核生物，例如大肠菌及杆菌。

通过转染细胞的标准技术将编码目的的融合蛋白质的核酸引入宿主细胞中。该「转染」或「转染作用」一词系欲包含所有已知的将核酸引入宿主细胞的技术，包含磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡萄聚糖-调节的转染作用、脂质体感染、电穿孔、微注射、病毒转换以及/或整合。可于Sambrook等人，如前述，及其它实验教科书中发现适合用于转染宿主细胞的方法。

本发明进一步提供分离本文所揭示的任一TCR分子的生产过程。于该过程中，使宿主细胞(例如酵母菌、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)生长于具有生产规模的培养基中，刺激该可编码出目的的融合蛋白质的核苷酸序列的转录作用，其中该宿主细胞已经引入目的的可编码出该蛋白质的核酸，操作上该核酸系连接至调节序列。接着，自经收集的宿主细胞或培养基中分离出该TCR分子。可利用标准蛋白质纯化技术自该培养基或自该经收集的细胞分离出目的的蛋白质。尤其，该纯化技术可用于自各种培养容器(包含转动瓶、旋转培养瓶、组织培养盘、生物反应器、或发酵槽)大规模(即至少毫克的量)表达及纯化出目的的TCR蛋白质。

可通过已知的方法分离及纯化出经表达的本发明TCR分子。典型地，将培养基进行离心，然后通过亲合性或免疫亲合性层析法纯化该上清液，例如蛋白质-A或蛋白质-G亲合性层析法或免疫亲合性方法，包括利用结合该经表达的TCR分子的单株抗体。这些分子可通过适当组合已知的技术加以分离及纯化。这些方法包含，例如，利用溶解度的方法(例如盐类沉淀及溶剂沉淀法)、利用分子量的差异的方法(例如透析、超过滤法、凝胶过滤法以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、利用电荷的差异的方法(例如离子交换管柱层析法)、利用特异亲合性的方法(例如亲合性层析法)、利用疏水性的差异的方法(例如逆相高效能液相层析法)以及利用等电点的差异的方法(例如等电聚焦电泳)、金属亲合性管柱(例如Ni-NTA)。一般参见Sambrook等人及Ausubel等人，如前述所揭示的相关方法。

本发明的单链TCR分子优选为实质上纯的蛋白质。亦即，该分子已自天然伴随着该分子的细胞取代物中分离出，所以该融合蛋白质优选系以至少80％或90％至95％的同构型(w/w)存在。具有至少98％至99％的同构型(w/w)的融合蛋白质最适合用于许多医药、临床及研究的应用。在治疗应用方面，实质上经纯化的融合蛋白质实质上应不含污染物。该蛋白质经部分纯化或实质上纯时，该可溶性TCR分子(优选为单链形式)可用于治疗或如本文前述的内容进行活体外或活体内分析。可通过多种标准技术(例如层析法及交电泳)来决定该融合蛋白质实质上的纯度。

本发明经截断的TCR分子含有经充分地截断的TCR分子，以致于本发明的TCR分子于表达后可分泌至培养基中。因此，经截断的TCR分子(sc-TCR、TCR融合物或复合物)典型地不包含富有疏水性残基的区域(典型地为该TCR分子的穿膜及细胞质区域)。因此，例如，本发明优选的经截断的TCR分子中，该TCR分子的β链的自约残基199至237以及该α链的自约残基193至230优选系不包含于该经截断的TCR复合物中。

「可溶性」一词或类似的名称系指本发明的TCR分子(通常，但是不仅指单链构建体)于低G-力量离心(例如，于标准离心中小于约每分钟30,000转)下不易自水溶性缓冲液(例如细胞培养基)中沉降出来。再者，如果该分子于大于约5至37℃的温度下以及于低浓度或无阴离子或非-离子性接口活性剂存在下的接近自然的pH时仍保留于水溶液中，该分子系提呈可溶的状态。于这些条件下，可溶性蛋白质经常具有低沉降值，例如小于约10至50史维德柏里单位(svedberg unit)。

本文所提及的水溶液典型地具有缓冲化合物以建立pH，典型地pH值是落于约5至9的范围中，以及离子浓度范围系约2mM及500mM之间。有时会添加蛋白酶抑制剂或温和的非-离子性接口活性剂。此外，如果需要可添加载体蛋白质，例如于每毫升中添加几毫克的牛血清白蛋白(BSA)或人类血清白蛋白(HSA)。水性缓冲液的实例包含标准的磷酸缓冲盐水，Tris-缓冲盐水，或其它已知的缓冲液以及细胞培养基调配物。

本发明的TCR分子适合于活体外或各种细胞的活体内使用，该细胞系癌细胞、处于癌细胞前期、或肿瘤生成性细胞。与正常细胞(野生型)相较下，这些细胞优选可表达高程度的p53蛋白质，该等细胞并非已知为癌细胞、处于癌细胞前期、或肿瘤生成性细胞。

本发明分子尤其适合用于人类病人，该病人具有或怀疑具有与p53不正常表达(例如至少2倍的过度表达)有关的恶性疾病、病症或病情。例如，本发明分子或其衍生物特别适合用于于人类病人中治疗与p53不正常表达有关的肿瘤。依照本发明，可治疗的特定疾病的实例包含癌症，例如乳癌、前列腺癌等，其它本文所提及的特定疾病的病症。

本发明的分子可通过多种适合的途径给予，包含，口服给予、局部给予(包含经皮给予、经颊给予或经舌下给予)、经鼻给予以及非口服给予(包含腹膜内给予、皮下给予、静脉内给予、皮内给予或肌内注射)，一般以口服或非口服优选。应了解，优选的给予方法及剂量会随着例如，接受者的病情及年龄而改变。有效剂量可通过决定标准临床治疗终结点加以监测，例如肿瘤的抑制、降低癌症的表达-特定标记(包含p53)、降低细胞增殖、经改善或正常的活组织切片检查结果等。

本发明的分子可单独用于治疗或与其它药物(该药物已经识别对所指示欲治疗的病症具有药理活性)一起使用。药物的实例包含经识别的治疗法，例如手术、放射线、化学治疗及其它型式的免疫治疗(例如疫苗、治疗为主的抗体)。本发明的分子如需要可于这些治疗法的前、进行治疗法期间或进行治疗法的后给予。

本发明的一或多种分子可单独给予，其亦可以部分医药组成物(与已知的赋形剂混合)存在，即适合用于非口服、口服或其它目的的给予上的医药可接受性有机或无机载体物质，以及其与活性化合物不会造成有毒的反应以及对接受者亦不会造成毒性。通常，本发明的医药组成物包括一或多种本发明的TCR分子或编码这些TCR分子的DNA构建载体与一或多种可接受载体。思及为了与该配方中其它的成分兼容，该载体必需为「可接受的」以及对接受者亦不会造成毒性。适合的医药可接受载体包含，但不限于水、盐类溶液、醇、植物油、聚乙二醇、凝胶、乳糖、淀粉醣、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯及二甘油酯、派卓亚瑟(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯基

可与辅剂，例如，润滑剂、防腐剂、安定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲液、着色剂、矫味剂以及/或芳香物质等混合，其与本发明的活性分子不会造成有毒的反应。

关于非口服的施用，特别适合者为溶液、优选为油性或水性溶液以及悬浮液、乳液或植入物，包含栓剂。安瓿是方便的单位剂量。

关于肠道的施用，特别适合者为锭剂，经涂覆的药丸或具有滑石以及/或碳氢化合物载体结合剂等的胶囊，该载体优选为乳糖以及/或玉米淀粉以及/或马铃薯淀粉。可使用糖浆、万能药等，其中系使用甜味载剂。可调配持续释放的组成物，其中该活性成分系经不同的可分解性被覆所保护者，例如微胶囊化、多重被覆等。

本发明的治疗化合物亦可包含于微脂体中。该包入作用可根据已知的微脂体制备程序进行，例如，超音波处理及挤压作用。微脂体制备的适合的已知方法亦系揭示于，例如，A.D.Bangham等人，J.Mol.Biol.，23：238-252(1965)；F.Olson等人，Biochim.Biophys.Acta，557：9-23(1979)；F.Szoka等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，75：4194-4198(1978)；S.Kim等人，Biochim.Biophys.Acta，728：339-348(1983)；以及Mayer等人，Biochim.Biophys.Acta，858：161-168(1986)。

本发明亦提供于哺乳动物(例如人类)中引起免疫反应的方法，包含对哺乳动物(例如人类)注射疫苗以对抗与p53过度表达相关的标记病症(例如癌症)。

这些方法包括对哺乳动物给予有效量的DNA序列，该序列包括编码本发明的TCR分子的DNA载体。TCR分子表达载体的制备系如上所述以及说明于下列实施例中。已有报导指出质体DNA的给予方法、经给予者的细胞摄入该DNA的方法以及蛋白质的表达。参见Ulmer，J.B.等人，Science(1993)259：1745-1749。

可编码出本发明TCR分子的DNA载体适当地给予至包含人类的哺乳动物的优选方式是肌内注射。Ulmer等人已说明如何将cDNA给予至哺乳动物的骨骼肌，接着该肌肉细胞摄入经给予的表达载体以及表达由该DNA所编码的蛋白质的方式，且提出该实验方法[Ulmer，J.B.等人，Science 259：1745-1749]。于特定治疗的施用中，理想的剂量可通过已知方法决定。

除了用于治疗人类病症外，本发明的TCR分子以及本发明的可编码出此种TCR分子的DNA构建体于兽医方面的应用中亦具有显著的用途，例如，使用适合该动物物种的同源p53抗原以及MHC分子治疗家畜(例如牛、羊等)及宠物(例如狗及猫)的病症。

应理解，实际上本发明TCR分子或可编码出此种TCR分子的DNA构建体于特定治疗中优选的给予量系根据特定的活性化合物或所使用的化合物、特定的经调配的组成物、施用形式、给予的特定位置、病人的体重、大致上的健康情况、性别等、治疗时的特定指示等以及其它熟知本领域者(包含医师或兽医人员)所确认的因子而改变。特定给予方法的最理想的给予速度可由熟知本领域者利用已知的剂量决定试验，例如以关于前述的指导方针以及本文所揭示的分析法轻易地决定。

「多肽」系指任何聚合物，优选为由20种天然的必须氨基酸(不论其大小)的任一者所组成。虽然该「蛋白质」一词经常系用于提及相当大的蛋白质，而「肽」经常系用于提及小的多肽，于此领域中这些名词的使用经常会重叠。「多肽」一词，除非另有所指，通常系指蛋白质、多肽以及肽。依照本发明，通常有用的肽一般系介于约0.1至100KD或高达约1000KD，优选为介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30以及50KD之间，这些肽的大小是通过标准分子大小估算技术(例如离心或SDS-聚丙酰胺凝胶电泳)来评定。

如本文所使用，「细胞」一词欲包含任何原生细胞或不死化细胞株、任何含有这些细胞的组群、组织或器官。该细胞优选为哺乳类细胞，尤其是人类来源的细胞，且可被一或多种病源体感染。根据本发明中「宿主细胞」系经感染的细胞或可用于增殖本文所述的核酸的细胞(例如大肠菌)。

本文中所有提及的文献其内容在此引入以供参考。下列非限制的实施例是用来说明本发明。

实施例1：264单-链(sc)TCR的构建

该T细胞克隆，264，可识别人类野生型肿瘤抑制物蛋白质p53(由HLA-A2.1所限定)的肽片段(aa 264至272；LLGRNSFEV)。将该T细胞受体基因克隆至先前所示的三域单链形式以产生可溶性TCR及功能性受体分子。

简单的说，自该T细胞克隆分离mRNA以及利用Marathon cDNA扩增套组(Clontech)制造cDNA。将cDNA纯系进行定序，辨识出两个Vα链(Vα3及Vα13)以及单一Vβ链(Vβ3)。于聚合酶连锁反应(PCR)中该cDNA系作为模板，以引子KC228及KC229或KC226及KC227分别产生5’SfiI-3’SpeIVα3或Vα13片段。然后以相同DNA作为PCR模板，利用引子PRIB4及KC176产生5’XhoI-3’XmaIVβCβ链片段。将Cβ链全长中位于第127个氨基酸，光胺酸，的前的Cβ链截断。

将该α及β链片段克隆至该pGEM-T Easy Vector System(Promega)中以进行DNA定序。将正确的片段以限制酶切割且克隆至表达载体pKC60中(说明于前述的申请中的美国专利申请案第08/813,781号)以创造出两个Vα-(G₄S)₄VβCβscTCR分子、264-A(带有Vα3)以及264-B(带有Vα13)。

将上述的DNA构建体(264-A及264-B)分别以引子ET-TCRF1及KC170或ET-TCRF2及KC170通过PCR再次扩增，以产生5’AgeI-3’ClaI DNA片段。将该片段克隆至pGEM-T Easy VectorSystem(Promega)中以进行DNA定序。

然后将该5’AgeI-3’ClaI DNA片段于引子分别为KC232及KC208或KC231及KC208的PCR中作为模板DNA以产生用于克隆至该CD3ζ融合分子(说明如下)的5’AgeI-3’HpaI DNA片段以及最终的264 IL-2融合分子(说明如下)。

实施例2：CD3ζ融合穿梭载体(shuttle vector)的构建

为了确定该两个Vα链系具有功能的，该264-A及264-B scTCR系以CD3ζ融合分子表达。

「穿梭载体」的构建已说明于前述申请中的美国专利申请案第09/422,375号中，其内容在此引入以供参考。

简单的说，将α及β链TCR片段克隆至表达载体pKC60中以创造出Vα-(G₄S)₄VβCβscTCR分子。将该新的载体命名为pNAG2(第9图)。然后将pNAG2于引子为KC203及KC208的PCR中再次扩增，以产生5’AgeI-3’HpaI/BspEI/NruI/ClaI DNA片段。将该scTCR片段克隆至pGEM-T Easy Vector System中，以及然后将此以pGEM为主的新的载体作为「穿梭载体」，用于引入其它DNA片段以创造双特异性sc分子。

将Sc-Fv DNA以限制酶切割以及克隆至该scTCR的「穿梭载体」的下游。为了将scTCR及sc-Fv连接成单链融合蛋白质，遂以适当的限制酶切割该「穿梭载体」，以脱离先前的连接子DNA片段以及使sc-TCR及Sc-Fv间的连接子序列接合。

于上述的「穿梭载体」的设计中，将终止密码及接合位置引入至该NruI及ClaI限制酶位置之间作为带有「后」引子KC208的scTCR的PCR扩增之一部分。为了帮助接下来进行的双特异性sc蛋白质的纯化，设计了一组经退火的寡核苷酸(annealed oligonucleotides)(KC237及KC238)以引入带有终止密码及接合位置的3’EE卷标(EEEEYMPME)(SEQ ID NO.4)。该经退火的寡核苷酸对将5’NruI-3’ClaI克隆至该已可编码出完整的双特异性sc-TCR分子的「穿梭载体」中。

将scTCR、sc-Fv、连接子，以及卷标DNA片段克隆至该「穿梭载体」中以完成该双特异性sc分子的设计后，以限制酶切割(AgeI-ClaI)该DNA，然后克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN27(第2图)(说明于前述的申请中的美国专利申请案序号第08/943,086号)以创造pBISP/149以及pBISP/D011.10(第3图)。熟于本领域的人士可利用pBISP/149(以pSUN28寄存)与任三个D011.10scTCR质体(pSUN18-ATCC#97895、pSUN19-ATCC#97896、或pSUN27-ATCC#209276)来产生pBISP/D011.10。该USSN 08/943,086的内容在此引入以供参考。

CD3ζ融合载体的构建

简单的说，以鼠的cDNA作为聚合酶链反应(PCR)中的模板，以引子KC312及KC304产生5’HpaI-3’ClaI鼠CD3ζ片段。

将该鼠CD3ζ片段克隆至pGEM-T Easy Vector System中以进行DNA测序。将正确的片段以限制酶切割以及克隆至「穿梭载体」中，有效地移除该存在的连接子、scFv以及EE卷标。

将该CD3ζ基因克隆至该「穿梭载体」中后，以限制酶切割该DNA的AgeI-HpaI处，使其与该264-A及264-B scTCR片段(如上所述)接合，创造出两个新的scTCR/CD3ζ融合物。最后，将该新的DNA制备物以限制酶切割(AgeI-ClaI)，然后克隆至哺乳动物细胞表达载体pSUN28(pBISP/D011.10)，第3图，说明于前述申请中的美国专利申请案序号第09/422,375号。

实施例3：264scTCR/CD3ζ融合分子的表达

将茱凯细胞(Jurkat cell)以冷的DPBS洗涤，预备用于转染作用。将该细胞悬浮于DPBS中且与20ug的以PvuI直线化的264-A/CD3ζ或264-B/CD3 DNA混合。至于冰上5分钟后，利用基因脉冲器(GenePulser，BioRad)，设定为传送250伏特、960μFd的脉冲对该细胞进行电穿孔处理。将经脉冲处理的细胞置于冰上5分钟。将该细胞以10％IMDM培养基(IMDM、10％FBS、2mM谷胺酰胺)稀释成10ml，以及使该细胞在37℃及5％CO₂环境下生长于T-25平方公分的TC培养皿中一整夜。隔日，将该细胞置于含有选择性培养基(10％ IMDM加上1.0mg/mlG418)的96孔盘中。一星期后，将G418的浓度增加到2mg/ml。转染后，将生长的细胞群再培养约2星期以及约于一星期后进行筛选。

利用流式细胞分析法(flow cytometry analysis)筛选出于细胞表面上有scTCR表达的茱凯细胞。呈阳性的转染物系以经萤光-标记的mAb(H57-597)染色进行识别，该经萤光-标记的mAb可检测鼠TCR的Cβ部分结构域。

实施例4：正确的264scTCRVα结构域的识别

将经转染的茱凯细胞(可表达CD3ζ融合分子的264-A或264-B变体)用于细胞活化分析。该分析中，将HLA-A2(于细胞株T2存在下)作为APC。于37℃及5％CO₂环境下将该T2细胞以264肽(或不恰当的肽)装载一整夜。隔日，加入该经转染的茱凯细胞株以及使其与该肽脉冲的APC进行交互作用一整夜。

该转染物通过经264装载的APC所进行专一性的刺激是利用IL-2ELISA评估的。将抗-人类IL-2mAb涂覆于96孔盘上整夜。洗涤该盘以及以10％FBS/DPBS阻断1小时。将阻断剂弹掉以及于37℃下将得自该分析的上清液加入至该盘中反应1小时。经洗涤后，利用另一个共轭至生物素的抗-IL-2mAb来检测经结合的IL-2。于37℃下45分钟后，洗涤该盘以及加入抗生物素蛋白链菌素(strepavidin)-HRP反应15分钟。最后，洗涤该盘以及使用ABTS受质显色。于405nm读取吸光度。

基于细胞活性分析，该Vα3区域系具有功能的。只有于经264装载的APC存在下，该264-A分子经刺激而产生IL-2。

表1，如下页所示，显示出前述实施例中所使用的各种寡核苷酸之一级序列。

表1

KC228	SEQ ID NO.7	5’-gag gtg gcc cag ccg gcc atg gcc cag tca gtg acgcag c-3’
KC228	SEQ ID NO.7	5’-gag gtg gcc cag ccg gcc atg gcc cag tca gtg acgcag c-3’	KC229KC226	SFQ ID NO.8SEQ ID NO.9	5’-gag gtg act agt gtc tgg ctt tat aat tag-3’5’-gag gtg gcc cag ccg gcc atg gcc gag cag gtggag cag c-3’
KC227PRIB4KC176ET-TCRF1KC170	SEQ ID NO.10SEQ ID NO.11SEQ ID NO.12SEQ ID NO.13SEQ ID NO.14	5’-gag gtg act agt gtt tga ttt aac aga gag-3’5’-ggg ggg ctc gag caa ttc aaa agt cat tca gac tc-3’5’-gag gtg gag ccc ggg gtc tgc tcg gcc cca ggc-3’5’-ccc acc ggt cag tca gtg acg cag ccc-3’5’-gtg gag ttc gaa aag tgt act tac gtt tgt ctg ctc ggcccc ag-3’	KC229KC226	SFQ ID NO.8SEQ ID NO.9
KC227PRIB4KC176ET-TCRF1KC170			ET-TCRF2KC232KC208	SEQ ID NO.15SEQ ID NO.16SEQ ID NO.17	5’-ccc acc ggt gag cag gtg gag cag ctt-3’5’-gag gtg acc ggt cag tca gtg acg cag c-3’5’-gtg gag atc aag tgt act tac gtt ttc att atc gcg atccgg agt taa cgt ctg ctc ggc ccc ag-3’
KC231KC312	SEQ ID NO.18SEQ ID NO.19	5’-gag gtg acc ggt gag cag gtg gag cag c-3’5’-gag gtg gtt aac gat ccc aaa ctc tgc tac ttg cta gatgga atc ctc-3’	ET-TCRF2KC232KC208	SEQ ID NO.15SEQ ID NO.16SEQ ID NO.17
KC231KC312	SEQ ID NO.18SEQ ID NO.19		KC304	SEQ ID NO.20	5’-gag gtg atc gat aag tgt act tac gtt ttt agc gag ggggca ggg c-3’

虽然本发明的优选具体实施例已使用特定术语说明，这些描述仅供说明的目的，且应了解在不悖离下列权利要求的精神及范围下可进行各种改变及变化。

Claims

1.一种分离的T细胞受体(TCR)，包括Vα及Vβ链，该T细胞受体可与MHC分子中的p53肽结合。

2.根据权利要求1所述的分离的TCR，其中所述的p53肽包括下列氨基酸序列：Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val(SEQ ID NO.1)。

3.根据权利要求1或2所述的分离的TCR，其中所述的MHC分子包括HLA分子。

4.根据权利要求3所述的分离的TCR，其中所述的HLA分子包括HLAA2.1。

5.根据权利要求1至4任一项所述的分离的TCR，其中所述的α链包括共价连接的序列：a)Vα链及b)Cα链。

6.根据权利要求1至5任一项所述的分离的TCR，其中所述的β链包括共价连接的序列：c)Vβ链以及Cβ序列。

7.根据权利要求1至6任一项所述的分离的TCR，其中所述的结合是通过监测该TCR与MHC分子的结合而决定，该MHC分子是与如SEQID NO.1的氨基酸序列的肽复合。

8.根据权利要求7所述的分离的TCR，其中所述的结合作用是利用TCRELISA或标准TCR结合分析进行监测。

9.根据权利要求7所述的分离的TCR，其中所述的结合作用是由测量TCR的信号转导进行监测。

10.根据权利要求7至9任一项所述的分离的TCR，其中，与对照组TCR杂二聚体相较下，该氨基酸序列与TCR分子间的结合作用增加了至少2倍。

11.根据权利要求7至9任一项所述的分离的TCR，其中，相对于对照组TCR杂二聚体，该氨基酸序列与TCR杂二聚体间的结合作用增加了至少10％。

12.根据权利要求1至11任一项所述的分离的TCR，其中所述的Vα链与第4A至C图(SEQ ID NO.2)中所示的Vα3链具有至少90％的氨基酸序列同一性。

13.根据权利要求1至12任一项所述的分离的TCR，其中所述的Vβ链与第4A至C图(SEQ ID NO.2)中所示的Vβ3链具有至少约90％的氨基酸序列同一性。

14.根据权利要求1至13任一项所述的分离的TCR，还包括与第4A至C图(SEQ ID NO.2)中所示的Cβ链具有至少约90％的氨基酸序列同一性的Cβ序列。

15.根据权利要求1至14任一项所述的分离的TCR，其中所述的Cα链与第5图(SEQ ID NO.3)中所示的Cα链具有至少约90％的氨基酸序列同一性。

16.根据权利要求1至15任一项所述的分离的TCR，其中所述的TCR包括一杂二聚体。

17.根据权利要求1至16任一项所述的分离的TCR，其中所述的TCR包括单链TCR。

18.根据权利要求17所述的分离的单链TCR(scTCR)，其中所述的Vα链是通过肽连接子序列而共价连接至Vβ链。

19.根据权利要求17至18任一项所述的sc-TCR，其中所述的sc-TCR包括穿膜结构域。

20.根据权利要求17至19任一项所述的sc-TCR，其中所述的sc-TCR包括细胞质信号结构域。

21.根据权利要求17至20任一项所述的sc-TCR，其中所述的sc-TCR依序包括1)如第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Vα3链，2)肽连接子，以及3)如第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Vβ3链。

22.根据权利要求21所述的sc-TCR，还包括如第4A至C图(SEQ ID NO.2)所提供的经连接至Vβ3链的C端的Cβ链。

23.根据权利要求21至22任一项所述的sc-TCR，还包括如第5图(SEQID NO.3)所提供的Cα链的片段，该片段是共价连接至Vα链的C端与肽连接子的N端间。

24.根据权利要求21至23任一项所述的sc-TCR，其中所述的肽连接子具有下列序列：Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID：5)重复至少4次。

25.一种分离的核酸，其中该核酸可编码根据权利要求1至24任一项所述的TCR。

26.一种载体，其包括根据权利要求25所述的核酸。

27.一种细胞，其包括根据权利要求25所述的分离的核酸或根据权利要求26所述的载体。

28.一种可编码权利要求16所述的杂二聚体的DNA对片段，其中，第一DNA片段可编码该Vα链以及第二DNA片段可编码该Vβ链。

29.根据权利要求28所述的DNA对片段，其中，经编码的Vα链与第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Vα3链具有至少约90％的氨基酸序列同一性。

30.根据权利要求28至29所述的DNA对片段，其中，经编码的Vβ链与第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Vβ3链具有至少约90％的氨基酸序列同一性。

31.根据权利要求28至30所述的DNA对片段，其中所述的第二片段进一步可编码Cβ链，Cβ链该与第4A至C图(SEQ ID NO.2)所示的Cβ链具有至少约90％的氨基酸序列同一性，该经编码的V-β链的C端是与该经编码的Cβ链的C端连接。

32.一种鉴别表达p53的细胞或组织的方法，包括使细胞或组织与权利要求1至24任一项所述的TCR接触。

33.一种鉴别表达p53的细胞或组织的方法，包括使细胞或组织与权利要求27所述的细胞接触。

34.一种杀死表达p53于MHC分子中的细胞的方法，该方法包括使细胞与权利要求27所述的细胞接触。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的方法还包括使MHC分子与表达于权利要求27所述的细胞上的TCR形成免疫复合物。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述的方法还包括诱发足以杀死该细胞的免疫反应。

37.一种治疗癌症的方法，包括对哺乳动物给予治疗上有效量的权利要求1至24任一项所述的TCR，该癌症是以向上调的p53为特征。

38.一种治疗癌症的方法，包括对哺乳动物给予治疗上有效量的权利要求27所述的细胞。