ES2307770T3 - Moleculas receptoras de las celulas t fijadoras de p53 y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un receptor de células T aislado (TCR) que es capaz de fijar un péptido p53 en el contexto de una molécula MHC, en donde el péptido p53 es la secuencia de aminoácidos Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1), que comprende una cadena Valfa y una cadena Vbeta, en donde la cadena Valfa3 es idéntica al menos en un 90% a la cadena Valfa3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) y en donde la cadena Vbeta es idéntica al menos aproximadamente en un 90% a la cadena Vbeta3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), y que comprende adicionalmente al menos uno de una secuencia enlazadora que es Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO. 4) para un TCR heterodímero o monocatenario o que comprende ulteriormente un enlazador (Gly Gly Gly Gly Ser) >_ 4 (SEQ ID NO. 5) para un TCR monocatenario.

Description

Moléculas receptoras de las células T fijadoras de p53 y usos de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas receptoras de las células T (TCR) que fijan secuencias particulares de la proteína p53 así como métodos para la producción y utilización de tales moléculas. Las moléculas TCR de la invención son útiles para una diversidad de aplicaciones que incluyen propósitos terapéuticos y diagnósticos.

Antecedentes de la invención

Enfoques tradicionales para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer han incluido cirugía, radiación, quimioterapia, antibióticos o terapias de combinación. Sin embargo, dichas terapias no han resultado eficaces contra una mayoría de estas indicaciones. El desarrollo de remedios alternativos para prevenir y/o tratar tales enfermedades humanas es crucial. En los últimos años han emergido enfoques de inmunoterapia y terapia génica que utilizan anticuerpos y linfocitos T como métodos nuevos y prometedores para el tratamiento de las enfermedades humanas.

Un enfoque de este tipo para tratamiento ha incluido el uso de anticuerpos para direccionamiento de agentes terapéuticos o diagnósticos a dianas particulares. Numerosos grupos han logrado avances que giran alrededor del uso de anticuerpos como agente de direccionamiento. Tales avances han incluido la construcción de proteínas de fusión de anticuerpos y moléculas de conjugados de anticuerpos que enlazan anticuerpos con diversas moléculas efectoras, con inclusión de moléculas radiactivas, agentes quimioterapéuticos, toxinas, y proteínas bioactivas adicionales. Los agentes terapéuticos o diagnósticos desarrollados que utilizan tales moléculas están diseñados para causar un efecto particular que está dirigido por el anticuerpo enlazado.

Exactamente del mismo modo que los anticuerpos se han desarrollado como agentes terapéuticos, factores primarios adicionales del sistema inmunitario, los receptores de las células T (TCR), presenta n ventajas singulares como plataforma para desarrollo de agentes terapéuticos. Mientras que los anticuerpos están limitados al reconocimiento de patógenos en la sangre y espacios extracelulares o a dianas proteínicas en la superficie celular, los receptores de las células T pueden reconocer antígenos presentados con moléculas del MHC en las superficies de las células (con inclusión de antígenos derivados de proteínas intracelulares). Dependiendo del subtipo de células T que reconocen el antígeno presentado y se vuelven activas, los receptores de las células T y las células T que alojan receptores de células T pueden participar en el control de diversas respuestas inmunitarias. Por ejemplo, las células T están involucradas en la regulación de la respuesta inmune humoral por inducción de la diferenciación de células B en células productoras de anticuerpos. Además, las células T activadas actúan para iniciar respuestas inmunitarias mediadas por las células. Así, los receptores de las células T pueden reconocer dianas adicionales no asequibles a los anticuerpos.

Una respuesta de células T es modulada por el antígeno que se fija a una molécula receptora de células T. Un tipo de TCR es un heterodímero fijado a la membrana constituido por una cadena \alpha y una cadena \beta que se asemejan a una región variable (V) y constante (C) de inmunoglobulina. La cadena TCR \alpha incluye una cadena V\alpha y C\alpha enlazadas covalentemente, en tanto que cadena \beta incluye una cadena V\beta enlazada covalentemente a una cadena C\beta. Las cadenas V\alpha y V\beta forman una bolsa o hendidura que puede fijar un superantígeno o antígeno en el contexto de un complejo de histocompatibilidad principal (MHC) (conocido en los humanos como complejo HLA). Véase en líneas generales Davis, Ann Rev. of Immunology 3:537 (1985); Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul, compilador, Raven Press Ltd. Nueva Cork (1993).

Se cree que el TCR juega un papel importante en el desarrollo y la función del sistema inmunitario. Por ejemplo, se ha comunicado que el TCR media la destrucción celular, aumenta la proliferación de células B, e impacta en el desarrollo y la gravedad de diversos trastornos que incluyen cáncer, alergias, infecciones virales y trastornos autoinmunes.

Se ha comunicado que la p53 humana es una proteína supresora de tumores, y epítopes peptídicos de p53 son presentados por moléculas particulares del MHC clase I. Adicionalmente, se ha comunicado que p53 es un candidato para una diana de las células T citotóxicas (CTL) de amplio espectro, asociadas a tumores. Véase, v.g., Theobald, M. et al. (1995) PNAS(USA) 92:11993 y las referencias citadas en dicho lugar.

Journal of Immunological Methods 221 (1998) 59-76 describe la presentación de moléculas receptoras de células T funcionales \alpha\beta monocatenarias en la superficie de los bacteriófagos.

WO 02/070556 (documento de acuerdo con Art. 54(3)(4) EPC) describe un polipéptido de un receptor de células T \alpha\beta de murino específico de una proteína p53.

Existe reconocimiento de que formas anormales de la proteína p53 humana están asociadas con una gran diversidad de cánceres. Una creencia es que la versión anormal o mutada invalida las características protectoras de la proteína p53 normal (tipo salvaje). Véase, v.g., Levine, A.J. et al. (1991) Nature (Londres) 351:453.

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Moléculas humanas de clase I que reconocen y fijan específicamente péptidos derivados de la proteína p53 humana han sido descritas. Una molécula de este tipo es HLA-A2.1. Véase, Theobald M. et al., supra.

Sería deseable disponer de moléculas TCR que reconozcan y fijen péptidos derivados de la proteína p53 humana. Sería especialmente deseable disponer de moléculas TCR heterodímeras y monocatenarias que fijen específicamente la secuencia que abarca aproximadamente las posiciones de los aminoácidos 264 a 272 de la proteína p53 humana.

Sumario de la invención

Se han identificado ahora moléculas receptoras de células T (TCR) que fijan un péptido derivado de la proteína p53 humana. La invención se refiere a un receptor de células T aislado (TCR) que es capaz de fijar un péptido p53 en el contexto de una molécula MHC, en donde el péptido p53 es la secuencia de aminoácidos Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1), que comprende una cadena V\alpha y una cadena V\beta, en donde la cadena V\alpha3 es idéntica al menos en un 90% a la cadena V\alpha3 representada en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) y en donde la cadena V\beta es idéntica al menos aproximadamente en un 90% a la cadena V\beta3 representada en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), y que comprende adicionalmente al menos una secuencia enlazadora que es Ara Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO. 4) para un TCR heterodímero o monocatenario o que comprende adicionalmente un enlazador (Gly Gly Gly Gly Ser) \geq 4 (SEQ ID NO. 5) para un TCR monocatenario.

Se describen también métodos para producir y utilizar tales moléculas TCR. La invención tiene un amplio espectro de aplicaciones útiles que incluyen usos terapéuticos y uso en la detección de células que expresan la proteína p53.

Las moléculas TCR de acuerdo con la invención son típicamente heterodímeros o moléculas monocatenarias que fijan secuencia comprendida entre las posiciones de aminoácidos 264 y 272 de la molécula p53 humana; es decir el epítope Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1) que abarca las posiciones de aminoácidos 264 a 272 de la molécula p53 humana.

Moléculas TCR particulares se caracterizan por una diversidad de actividades útiles. Por ejemplo las moléculas TCR heterodímeras descritas en esta memoria pueden utilizarse para detectar la expresión celular de la proteína p53, especialmente en el contexto de un complejo de presentación de antígeno apropiado. Una ilustración de un complejo de este tipo es un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I de los primates que se fija y se presenta a fragmentos inmunológicamente relevantes de CTLs de la proteína p53. Una molécula MHC preferida de clase I es el complejo humano HLA-A2.1 descrito más adelante.

La invención abarca una diversidad de moléculas TCR heterodímeras cuyo contexto está usualmente pre-determinado para adaptarse a un uso propuesto. Por ejemplo, en una realización, se expresan moléculas TCR heterodímeras como moléculas de la superficie celular en una célula recombinante transfectada o modificada por ingeniería genética. Ejemplos de las células se proporcionan más adelante. Adicionalmente moléculas TCR heterodímeras adecuadas se proporcionan en un formato más soluble, v.g., heterodímeros que incluyen una o más secuencias de inmunoglobulina (Ig) como se expone más adelante.

Moléculas TCR heterodímeras más particulares de la invención se caracterizan por una cadena \alpha y una cadena \beta, cadenas que están unidas típicamente una a otra por uno o más enlaces covalentes, y que se definen ulteriormente como se ha especificado arriba. Preferiblemente, tales enlaces covalentes incluyen uno o más enlaces disulfuro. Heterodímeros más preferidos incluyen al menos una cadena V\alpha y al menos una cadena V\beta, cadenas que se configuran preferiblemente para posicionarse eficazmente, dentro o cerca de la hendidura de fijación de heterodímeros, secuencia que abarca las posiciones de aminoácidos 264 a 272 de la molécula p53 humana. Por la expresión "posicionarse eficazmente" debe entenderse que las cadenas V TCR de acuerdo con la invención (formato heterodimero o monocatenario) se asocian para fijarse a una secuencia específica p53 como se determina por los ensayos estándar descritos en esta memoria con inclusión de los test de fijación de células T y ELISA preferidos proporcionados más adelante.

Cadenas V más específicas de las TCRs heterodímeras incluyen la cadena V-\alpha enlazada covalentemente a una cadena C-\alpha y la cadena V-\beta enlazada a una cadena C-\beta. En la mayoría de las realizaciones, la cadena C-\alpha y la cadena C-\beta están enlazadas cada una independientemente a un dominio transmembranal de células adecuado, dominio que está enlazado típicamente además con independencia a un dominio citosólico adecuado. En los casos en que se desean moléculas heterodímeras solubles, puede ser más preferible eliminar al menos el dominio transmembranal, con preferencia de modo esencialmente la totalidad del dominio transmembranal utilizando, v.g., manipulaciones estándar de DNA recombinante.

La invención presenta también otras moléculas TCR útiles que incluyen las moléculas del receptor de células T monocatenario (sc-TCR) descritas en esta memoria. Tales moléculas incluyen generalmente al menos una cadena V\alpha unida, por al menos una secuencia peptídica, a al menos una cadena V\beta. Si se desea, el sc-TCR puede incluir adicionalmente al menos un fragmento de cadena C\alpha y opcionalmente al menos un fragmento de cadena C\beta. La sc-TCR incluirá una cadena V\alpha unida a una cadena V\beta por al menos una secuencia enlazadora peptídica. La disposición de cualquier secuencia V o C en los sc-TCRs no es usualmente importante con tal que se alcancen los resultados de unión deseados. Sin embargo, generalmente se prefiere que las cadenas V\alpha y V\beta sean suficientes para fijarse eficazmente a la secuencia p53 humana que abarca las posiciones de los aminoácidos 264 a 272 como se determina por tests de fijación estándar.

La presente invención proporciona ventajas importantes.

Por ejemplo, las TCRs heterodímeras monocatenarias proporcionan, por primera vez, moléculas TCR que reconocen y fijan una secuencia importante de p53. La fijación de dicha secuencia por las moléculas de la invención proporciona un reconocimiento importante y fiable de la proteína p53 supresora de tumores en células cancerosas o precancerosas. Así, en un aspecto de la invención, las moléculas pueden utilizarse diagnósticamente para detectar, y cuantificar en caso deseado, la presencia y cantidad de p53 en células, tejidos y órganos. Dichas células incluyen células cultivadas así como líneas de células primarias, secundarias e inmortalizadas. La capacidad para detectar la proteína p53 es sumamente útil como diagnóstico del cáncer in Vitro e in vivo. Alternativamente, las moléculas TCR de la invención pueden utilizarse para detectar y cuantificar opcionalmente la expresión de p53 en células, particularmente aquéllas que pueden presenta r el antígeno p53 en el contexto de una molécula adecuada de MHC clase I, preferiblemente el complejo HLA-A2.1.

De acuerdo con ello, y en un aspecto, la invención presenta un heterodímero del receptor de células T (TCR) aislado que incluye una cadena V\alpha y una cadena V\beta como se definen anteriormente. El heterodímero es capaz de fijar, preferentemente de modo específico en el contexto de una molécula HLA-A2.1 del MHC, la secuencia de aminoácidos "diana" siguiente: Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1). La fijación preferida se determina por cualquier ensayo de fijación TCR estándar en donde la especificidad de fijación se indica como un aumento en la fijación que es significativamente diferente de la fijación a un TCR irrelevante (de control) (donde la "significación" se determina utilizando métodos estadísticos de rutina conocidos en la técnica, v.g., con p \leq 0,05). Preferiblemente, la fijación es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces mayor que los valores de control. Un ensayo de fijación de TCR específicamente preferido y heterodímero TCR irrelevante se exponen más adelante.

En una realización más específica, la invención presenta un heterodímero del receptor de las células T (TCR) aislado que incluye una cadena \alpha y una cadena \beta en el cual la cadena \alpha comprende, enlazadas covalentemente en secuencia: a) una cadena V\alpha y b) una cadena C\alpha; y la cadena \beta comprende, enlazadas covalentemente en secuencia: c) una cadena V\beta y una secuencia C\beta. El heterodímero es capaz de fijar, en el contexto de una molécula HLA-A2.1 de MHC, el aminoácido diana de SEQ ID NO. 1 que antecede.

Como se ha expuesto, la invención presenta también moléculas sc-TCR que incluyen cadenas V capaces de fijar específicamente la secuencia diana de SEQ ID NO. 1.

En una realización, tales sc-TCRs incluyen al menos una cadena V\alpha enlazada covalentemente a al menos una cadena V\beta por al menos una secuencia enlazadora peptídica. Preferiblemente, tales sc-TCRs incluyen entre una y cinco de tales cadenas V, más preferiblemente una a dos de tales cadenas V. También preferiblemente, dichas cadenas V estarán enlazadas una a otra por entre uno y cinco enlazadores peptídicos, más preferiblemente uno a dos de tales enlazadores. Una sc-TCR más preferida es capaz de fijar, en el contexto de una molécula HLA-A2.1 del MHC, la secuencia de aminoácidos diana siguiente: Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1).

La fijación preferida se determina por cualquier ensayo de fijación de TCR estándar donde la especificidad de fijación se indica como un aumento en la fijación que es significativamente diferente de la fijación a un TCR irrelevante (de control) (donde la "significación" se determina utilizando métodos estadísticos de rutina conocidos en la técnica, v.g., con p \leq 0,05). Preferiblemente, la fijación es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 100 veces mayor que los valores de control. Un ensayo de fijación de sc-TCR específicamente preferido y sc-TCR irrelevante se describe más adelante.

En otro aspecto, la invención presenta al menos un par de segmentos de ácido nucleico (típicamente DNA o RNA) que codifican uno o más de los heterodímeros proporcionados en esta memoria.

En otro aspecto, la invención abarca un vector de DNA que incluye al menos uno de los segmentos de DNA que codifican los heterodímeros TCR. Por ejemplo, un primer segmento de DNA puede codificar la cadena \alpha y un segundo segmento de DNA puede codificar la cadena \beta. En algunos casos, puede ser más deseable proporcionar un solo vector de DNA con segmentos que codifiquen ambas cadenas \alpha y \beta del heterodímero.

Se contemplan también células que incluyen los vectores de DNA descritos en esta memoria.

La invención presenta también un segmento de ácido nucleico (DNA o RNA) que codifica al menos una, preferiblemente entre una y cinco, más preferiblemente una a dos, de las moléculas sc-TCR proporcionadas en esta memoria. Se incluyen también vectores de DNA que incluyen el segmento de ácido nucleico.

En otro aspecto, la invención presenta métodos para identificar una célula o tejido que expresan la proteína p53 en el contexto de una molécula HLA-A2.1 del MHC. En una realización, tales métodos incluyen poner en contacto la célula o tejido con una célula recombinante transducida o modificada por ingeniería genética que comprende los sc-TCR o heterodímeros TCR descritos en esta memoria. Alternativamente, la célula o tejido puede estar en contacto con un sc-TCR soluble o un TCR heterodímero en lugar de (o en combinación con) la célula transducida o modificada por ingeniería genética que expresa el sc-TCR o el heterodímero TCR.

La invención presenta también métodos para identificar células o tejidos que expresan la proteína p53 en el contexto de una molécula HLA-A2.1 del MHC. En ejemplos preferidos de la invención, los métodos incluyen poner en contacto la célula o el tejido con un sc-TCR como se proporciona en esta memoria.

Se abarcan también por la presente invención métodos in vitro para destruir una célula que expresa la secuencia de aminoácidos diana siguiente: Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1) incluyen variantes de dicha secuencia que tienen al menos un reemplazamiento de aminoácido conservador. Métodos más particulares incluyen poner en contacto la célula con una célula transducida o recombinante que expresa una molécula sc-TCR o TCR heterodímera como se proporciona en esta memoria. Métodos adicionalmente preferidos incluyen además poner en contacto la célula con una cantidad de sc-TCR o TCR heterodímera que es generalmente suficiente para lesionar o destruir la célula como se determina por ensayos convencionales (v.g., exclusión de azul tripán, presencia de características apoptóticas, etc.).

En otro aspecto, la presente invención presenta los receptores TCR reivindicados para uso en métodos para el tratamiento del cáncer, que incluyen administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de: a) una célula recombinante transducida o modificada por ingeniería genética que comprende un heterodímero de TCR como se proporciona en esta memoria o b) al menos uno de los sc-TCRs de la invención, preferiblemente uno de tales sc-TCRs. Preferiblemente, el cáncer presenta la regulación creciente de la proteína p53 al menos en 2 veces, preferiblemente al menos en 5 a 10 veces, con preferencia aproximadamente 100 veces como se determina por inmunohistoquímica estándar o citometría de flujo como se expone más adelante.

Otros aspectos y realizaciones de la invención se exponen más adelante.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración esquemática del vector pNAG2.

La Figura 2 es un dibujo esquemático que muestra el vector pSUN27 (depositado como ATCC#209276).

La Figura 3 es un dibujo esquemático que muestra regiones de los vectores que codifican las moléculas híbridas biespecíficas preferidas pBISP/D011.10 y pBISP/149 (depositada como ATCC#203186 con la designación pSUN28).

Las Figuras 4A, 4B y 4C son dibujos que muestran las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico del TCR monocatenario 264 (264 sc-TCR) (SEQ ID NO. 2). Va3 = dominio TCR V\alpha3 (ácidos nucleicos 61-399); secuencia enlazadora (ácidos nucleicos 400-471); Vb3 = dominio TCR V\beta3 (ácidos nucleicos 472-813); Cb = dominio TCR C\beta (ácidos nucleicos 814-1191).

La Figura 5 es un dibujo que muestra el dominio opcional C\alpha (SEQ ID NO. 3) del TCR 264.

Descripción detallada de la invención

Como se ha resumido arriba, los autores de la invención han aislado un heterodímero del receptor de células T (TCR) sumamente útil que incluye generalmente una cadena V\alpha y una cadena V\beta, es decir, un complejo bicatenario. Los heterodímeros fijan, típicamente en el contexto de una molécula HLA-A2.1 del MHC secuencias de aminoácidos entre las posiciones 264 y 272 de la secuencia de la proteína p53 humana, abarcando las posiciones de aminoácidos 264 a 272 de dicha proteína, es decir, la secuencia de aminoácidos "diana" siguiente: Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1). Como se ha resumido también previamente, la fijación satisfactoria se determina por un ensayo de fijación de células T estándar proporcionado más adelante.

La estructura general de muchos heterodímeros TCR existentes naturalmente ha sido publicada. Véase, v.g., Davis Ann. Rev. of Immunology 3: 537 (1985); Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul compilador, Raven Press Ltd. Nueva York(1993) y las referencias expuestas en dicho lugar.

En general, una célula T reconoce el antígeno presentado en las superficies de las células por medio de los receptores de células T expresados en su superficie celular. Los TCRs son heterodímeros enlazados por disulfuro, constituidos en la mayoría de los casos por glicoproteínas de cadenas \alpha y \beta. Las células T utilizan mecanismos para generar diversidad en sus moléculas receptoras análogamente a los mecanismos para la generación de diversidad de anticuerpos que operan en las células B (Janeway and Travers; Immunobiology 1297). Análogamente a los genes de inmunoglobulina, los genes TCR están compuestos por segmentos que se reordenan durante el desarrollo de las células T. Los polipéptidos TCR están constituidos por regiones variables aminoterminales y regiones constantes carboxiterminales. Si bien la región carboxi-terminal funciona como un anclaje transmembranal y participa en la señalización intracelular cuando está ocupado el receptor, la región variable es responsable del reconocimiento de antígenos. La cadena \alpha de TCR contiene regiones variables codificadas por segmentos V y D únicamente, mientras que la cadena \beta contiene además segmentos de unión (J). El reordenamiento de estos segmentos en un repertorio diverso de TCRs capaces de reconocer un número increíblemente grande de antígenos diferentes exhibidos en el contexto de MHC diferentes (sic).

Se han publicado informes de TCRs específicos que reconocen antígenos particulares. Por ejemplo, las solicitudes de patente U.S. pendientes U.S.S.N. 08/813781 y U.S.S.N. 09/422375, y las publicaciones internacionales PCT/US98/04274 y PCT/US99/24645, y las referencias expuestas en dichos lugares describen métodos de preparación y utilización de TCRs específicos.

Adicionalmente, se han producido TCRs específicos particulares por métodos recombinantes como TCRs solubles monocatenarios (sc-TCR). Métodos para la producción y utilización de sc-TCRs han sido expuestos y se describen en la solicitud de patente U.S. pendiente 08/943.086, y la solicitud internacional PCT/US98/20263.

Heterodímeros TCR preferidos de la invención incluyen una cadena \alpha y una cadena \beta enlazadas covalentemente una a otra en virtud de al menos un enlace disulfuro y que son como se define arriba. La unión no covalente, v.g., enlaces de hidrógeno, entre las cadenas ha sido consignada. Cada una de las cadenas puede estar comprendida entre aproximadamente 150 y aproximadamente 350 aminoácidos de longitud, con preferencia entre aproximadamente 200 y aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente entre aproximadamente 250 y aproximadamente 290 aminoácidos de longitud, siendo útil para la mayoría de las aplicaciones de la invención una longitud de aproximadamente 280 aminoácidos. Las moléculas TCR heterodímeras de acuerdo con la invención están opcionalmente glicosiladas.

Por la expresión "molécula HLA-A2.1 del MHC" se entiende una molécula del MHC de clase I de primate, preferiblemente una molécula humana, que es capaz de generar o de ser reconocida por los linfocitos T citotóxicos A2.1 restringidos y reactivos con los tumores (CTLs) que llevan TCRs específicas para péptidos que tienen la secuencia obtenida de la proteína p53 humana. Una secuencia de aminoácidos preferida está comprendida por lo general entre aproximadamente el aminoácido 250 y aproximadamente el aminoácido 290 de la secuencia de p53 humana, con preferencia entre aproximadamente el aminoácido 264 y aproximadamente el aminoácido 272 de dicha secuencia, prefiriéndose para la mayoría de las aplicaciones secuencias que abarcan posiciones del aminoácido 264 al amino-ácido 272 de la proteína p53.

Moléculas HLA-A2.1 del MHC más preferidas de acuerdo con la invención son proteínas integrales de membrana que incluyen a menudo una cadena pesada de glicoproteína que tiene tres dominios extracelulares (a saber, \alpha1, \alpha2 y \alpha3), un dominio transmembranal y un dominio citoplásmico. La cadena pesada está asociada típicamente de modo no covalente con una subunidad de microglobulina \beta2 soluble. Los dominios \alpha1 y \alpha2 de la cadena pesada se pliegan uno a otro para formar el surco de fijación de péptidos para una secuencia p53 particular. La asociación entre la cadena pesada y la microglobulina \beta2 puede ayudar a estabilizar el surco de fijación del péptido. La molécula del MHC puede estar constituida por prácticamente cualquier combinación de una cadena pesada de clase I existente naturalmente o recombinante (o fragmentos de la misma) y una molécula de microglobulina \beta2 existente naturalmente o recombinante (o fragmentos biológicamente activos de la misma).

Información relativa a la secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de p53 humana está disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI)-Genetic Sequence Data Bank (GenBank) en la Nacional Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD 20894. GenBank está disponible también en internet en la dirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Véase, Benson, D.A. et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25: 1 para una descripción de GenBank. Véase también Theobald, M. et al. (1995), supra (que describe también el esquema de numeración de los aminoácidos de p53 adoptado en esta solicitud).

Se ha comunicado que la expresión de la proteína p53 supresora de tumores está regulada en sentido creciente en las células malignas. Se ha demostrado también que el 50% de todos los tumores expresan niveles incrementados de p53 en su superficie (Holliston, M.D. et al., Science (1991), 253:49).

Información relativa a la producción y utilización de la molécula humana HLA-A2.1 MHC, particularmente en el contexto de células tumorales que expresan p53 ha sido publicada por Theobald, M. et al. (1995), supra. Véanse también los documentos PCT/US97/03611 y USSN 08/812.393 presentado el 5 de marzo de 1997, cuyas solicitudes reivindican el beneficio de USSN 60/012.845 presentada el 5 de marzo de 1996.

Métodos para la detección de la unión productiva entre la molécula HLA-A2.1 MHC y una secuencia de aminoácidos obtenida de la secuencia de la proteína p53 han sido publicados, v.g. por Theobald, M. et al. (1995), supra. En general, los métodos implican la utilización de ensayos de competición reconocidos para evaluar la unión del péptido p53 a la molécula HLA-A2.1. Véanse también las solicitudes PCT/US97/03611, USSN 08/812.393, y USSN 60/012.845.

Moléculas TCR heterodímeras de acuerdo con la invención incluyen una cadena V\alpha que es al menos idéntica en un 90% a la cadena Va3 representada en las Figuras 4A-C más adelante, preferiblemente idénticas desde 95% a 100%. Heterodímeros adicionales de la invención incluyen una cadena V\beta que es idéntica al menos en un 90% a la cadena Vb3 representada en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), con preferencia desde 95% a 100% idénticas.

Preferiblemente, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, se alinean las secuencias para propósitos de comparación óptima (v.g., se introducen lagunas en uno o ambos de un primero y un segundo aminoácidos para alineación óptima y las secuencias no homólogas no se tienen en cuenta para propósitos de comparación). Una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo constituido por 25 a 600, de modo habitual aproximadamente 50 a aproximadamente 200, y de modo más habitual aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las cuales una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias se alinean óptimamente. Para identificar secuencias con el % de identidad apropiado como se describe en esta memoria, la ventana de comparación pude comprender cualquiera de los intervalos de segmentos arriba descritos.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de lagunas, y la longitud de cada laguna que precisa ser introducida para alineación óptima de las dos secuencias. Los residuos de aminoácidos en posiciones de aminoácidos correspondientes se comparan luego. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición (como se utiliza en esta memoria, "identidad" de aminoácido es equivalente a "homología" de aminoácido).

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias puede determinarse utilizando un algoritmo matemático como es conocido en la técnica (véase, v.g., Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., compilador, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453, 1970) que forma parte del programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), por al algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981), por los métodos de búsqueda de semejanza de Pearson & Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988) and Altschul, et al. (Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, and BLAST en el paquete de software de Wisconsin Genetics (disponible de Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por alineación manual e inspección visual (véase, v.g., Ausubel et al., supra).

Los parámetros de laguna pueden modificarse para adaptarlos a las necesidades de un usuario. Por ejemplo, cuando se emplea el paquete de software GCG, puede utilizarse una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de laguna de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. Pesos ilustrativos de laguna utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, pueden ser 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4, mientras que pesos de longitud ilustrativos pueden ser 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El porcentaje de identidad entre dos aminoácidos puede determinarse también utilizando el algoritmo de E. Myers y W. Miller (CABIOS 4:11-17, 1989) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.

Así, por el término "100% idéntico" se entiende que los aminoácidos de una cadena V en cuestión son 100% homólogos a la cadena TCR V\beta o V\alpha naturalmente existente correspondiente o variantes alélicas de la misma con las mismas características de unión (v.g., sin diferencia significativa alguna en la especificidad y afinidad de unión). Es decir, la cadena V en cuestión tiene la misma longitud y la misma secuencia de aminoácidos que la cadena correspondiente y existente naturalmente o variantes alélicas de la misma con las mismas características de unión.

Moléculas heterodímeras adicionalmente preferidas de la invención incluyen una secuencia C\alpha y C\beta que tienen al menos aproximadamente 90% de identidad con las secuencias de las cadenas C\alpha y C\beta representadas en las Figuras 5 [SEQ ID NO. 3] y 4A-C (SEQ ID NO. 2), respectivamente. Preferiblemente, las secuencias C\alpha y C\beta están comprendidas entre 95% y 100% de identidad con las secuencias de las cadenas C\alpha y C\beta representadas en las Figuras 5 y 4A-C.

La estructura general de las moléculas sc-TCR y métodos de producción y utilización de las mismas han sido descritos en el documento USSN 08/813.781 pendiente y PCT/US98/04274.

Véanse también los documentos USSN 08/943.086 pendiente y PCT/US98/20263 para una descripción adicional relativa a la producción y utilización de moléculas sc-TCR.

Como se ha estipulado anteriormente, la presente invención presenta proteínas receptoras de células T monocatenarias (sc-TCR) muy útiles que incluyen generalmente entre una y cinco cadenas V\alpha enlazadas covalentemente a entre una y cinco cadenas V\beta por entre una y cinco secuencias enlazadoras peptídicas. sc-TCR preferidos incluyen una cadena V\alpha y una cadena V\beta enlazadas una a otra por una secuencia enlazadora peptídica como se estipula en esta memoria.

sc-TCRs adicionalmente preferidos son típicamente capaces de unirse, en el contexto de la molécula HLA-A2.1 MHC, a péptidos que tienen una secuencia obtenida de la proteína p53 humana. La secuencia de aminoácidos es la secuencia que abarca las posiciones de aminoácidos 264 a 272 de la proteína p53. La unión satisfactoria se determina preferiblemente por el ensayo ELISA estándar del receptor de células T (TCR) descrito más adelante.

Las moléculas sc-TCR de acuerdo con la invención incluyen una cadena V\alpha que es idéntica al menos en un 90% a la cadena Va3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) más adelante, preferiblemente idéntica entre 95% y 100%. Las moléculas sc-TCR incluyen una cadena V\beta que es idéntica al menos en un 90% a la cadena Vb3 representada en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), preferiblemente idéntica entre 95% y 100%.

Moléculas sc-TCR adicionalmente preferidas de la invención incluyen una secuencia C\beta que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de una cadena C\beta que se muestra en las Figuras 4A-C. Preferiblemente, la secuencia C\beta es idéntica entre 95% y 100% a la secuencia de la cadena C\beta que se muestra en las Figuras 4A-C.

Se ha descubierto que la cadena C\alpha no siempre se requiere para demostrar una unión satisfactoria de sc-TCR en el ensayo ELISA estándar del receptor de las células T (TCR). En estas realizaciones, no es necesario incluir la cadena C\alpha como parte de la molécula sc-TCR. Por ejemplo, véanse las Figuras 4A-5C más adelante (que describen secuencias 264 sc-TCR especialmente preferidas). Sin embargo, las moléculas sc-TCR pueden incluir al menos una cadena C\alpha (como se muestra en Figura 5, por ejemplo) o un fragmento funcional de la misma, preferiblemente de 1 a 5 de tales cadenas, siendo adecuada una sola cadena C\alpha de este tipo.

En realizaciones de la invención en las cuales un sc-TCR particular incluye la cadena C\alpha o un fragmento funcional de la misma, dicha cadena exhibirá preferiblemente al menos 90% de identidad a la secuencia de la cadena C\alpha representada en la Figura 5 (SEQ ID NO. 3). Preferiblemente, dicha secuencia es idéntica entre 95% y 100% a la secuencia de la cadena C\alpha que se muestra en la Figura 5 (SEQ ID NO. 3).

Secuencias sc-TCR más particulares en línea con la invención incluyen aquéllas que tienen, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una cadena V\alpha3 como se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2); 2) un enlazador peptídico; y 3) una cadena V\beta3 como se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2). En una realización, la molécula sc-TCR incluye adicionalmente una cadena C\beta como se proporciona en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) enlazada preferiblemente al término C de la cadena V\beta3.

En una realización de la molécula sc-TCR específica que antecede, el sc-TCR incluye adicionalmente la cadena C\alpha como se proporciona en la Figura 5 (SEQ ID NO. 3), estando enlazada covalentemente de modo preferible la cadena entre el término C de la cadena V\alpha y el término N de un enlazador peptídico.

Cadenas V\alpha y V\beta típicas de las moléculas TCR heterodímeras y monocatenarias descritas en esta memoria tienen generalmente una longitud de 200 a 400 aminoácidos, preferiblemente una longitud de 300 a 350 aminoácidos. Métodos para determinar la longitud de aminoácidos se conocen en el campo incluyen electroforesis en gel de poliacril-amida.

Como se ha expuesto, las moléculas sc-TCR de la invención incluyen una o más secuencias enlazadoras peptídicas posicionadas preferiblemente entre las cadenas V\alpha y V\beta, definiéndose el enlazador como anteriormente. La secuencia enlazadora es preferiblemente flexible a fin de no retener la secuencia derivada de la proteína p53 humana (y presentada en el contexto de la molécula HLA-A2.1) en una conformación simple deseada. Específicamente, la secuencia enlazadora peptídica puede estar posicionada entre las cadenas variables TCR típicamente para aumentar la flexibilidad de unión entre dichas cadenas. El enlazador comprende predominantemente aminoácidos con cadenas laterales pequeñas, tales como glicina, alanina y serina, a fin de proporcionar flexibilidad. Con preferencia aproximadamente 80 ó 90 por ciento o más de la secuencia enlazadora comprende residuos glicina, alanina o serina, particularmente residuos glicina y serina. Para TCRs heterodímeras, la secuencia enlazadora está enlazada convenientemente a la cadena \beta de la molécula TCR, aunque la secuencia enlazadora podría estar unida también a la cadena \alpha de la molécula TCR. Alternativamente, la secuencia enlazadora puede estar enlazada a ambas cadenas \alpha y \beta de la molécula TCR.

Véanse las referencias siguientes para descripción suplementaria relativa a la producción y utilización de moléculas sc-TCR: Novotny, J. et al. PNAS (USA) 88: 8646 (1991); Soo Hoo, W.F. et al. PNAS (USA) 89: 4759 (1992); Wülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol 242: 655 (1994); Kurucz, I. et al PNAS (USA) 90: 3830 (1993); PCT WO 96/13593; Ward, E.S. et al, J. MoL Biol. 224: 885, (1992); Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256: 859 (1996); Mariuzza, R.A. and Winter, G., (1989) 264:7310; Gascoigne, N.R.J., et al, PNAS (USA) (1987), 84: 2936.

De acuerdo con la invención, la secuencia enlazadora es ASGGGGSGGG (es decir, Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly) (SEQ ID NO. 4] repetida tantas como cuatro o más veces, enlazada preferiblemente al primer aminoácido del dominio \beta del TCR. Secuencias enlazadoras adecuadas pueden identificarse fácilmente de manera empírica. Adicionalmente, el tamaño y las secuencias adecuados de las secuencias enlazadoras pueden determinarse también por técnicas convencionales de modelización por ordenador basadas en el tamaño y la forma predichos de la molécula TCR.

De acuerdo con ello, y en una realización, la invención presenta moléculas sc-TCR particulares en las cuales al menos una de las secuencias peptídicas, preferiblemente una de las mismas tiene la secuencia siguiente: Gly Gly Gly Gly Ser (repetida tantas como cuatro o más veces) (SEQ ID NO. 5).

Véase también la solicitud de patente, asimismo pendiente, titulada T-Cell Receptor Fusions and Conjugates and Methods of Use Thereof, presentada el 5 de junio de 2001 (USSN 09/874.907 por los inventores Jon A. Weidanz, Kimberlyn F. Card, y Hing C. Wong) para información adicional relativa a moléculas particulares relacionadas con 264 TCR.

En algunas situaciones puede ser útil producir las moléculas sc-TCR de la presente invención de modo polivalente, v.g., para aumentar la valencia del sc-TCR. Expuesto brevemente, la proteína TCR polivalente se produce por enlace covalente mutuo entre dos y cuatro proteínas (iguales o diferentes) utilizando v.g., técnicas estándar de marcación biotina-estreptavidina, o por conjugación a soportes sólidos adecuados tales como cuentas de látex. Proteínas reticuladas químicamente (por ejemplo reticuladas a dendrímeros) son también especies polivalentes adecuadas. Por ejemplo, la proteína puede modificarse por inclusión de secuencias que codifican residuos de amino-ácidos con cadenas laterales químicamente reactivas tales como Cys o His. Tales aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas pueden estar posicionados en una diversidad de posiciones en la proteína enlazada, preferiblemente distales a la región de fijación de antígeno del TCR. Por ejemplo, el término C de un fragmento de cadena C\beta de una proteína soluble puede estar enlazado covalentemente a un marcador de purificación proteínico u otra proteína que incluye uno o más aminoácidos reactivos de este tipo. Cadenas laterales adecuadas pueden incluirse para enlazar químicamente dos o más proteínas a una partícula dendrímera adecuada para dar una molécula multivalente. Los dendrímeros son polímeros químicos sintéticos que pueden tener uno cualquiera de cierto número de grupos funcionales diferentes de su superficie (D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26: 91-101 (1993)). Dendrímeros ilustrativos para uso de acuerdo con la presente invención incluyen, v.g., el dendrímero de poliamina "starburst" E9 y el dendrímero de poliamina "combust" E9, que pueden enlazarse a residuos cisteína.

La presentación eficaz de una secuencia de p53 humana como se proporciona en esta memoria a una molécula TCR de la invención puede determinarse por una diversidad de ensayos específicos, que incluyen los ensayos de fijación de células T y ELISA TCR expuestos más adelante. Alternativamente, la presentación eficaz puede detectarse y cuantificarse si se desea por monitorización de la actividad de una célula T siguiendo la inducción o la inhibición de la proliferación de células T, o la iniciación o inhibición de una respuesta inmune a un sitio o diana particular. Tales ensayos adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, ensayos in vitro que incluyen pasos secuenciales de cultivo de células T para proliferación de las mismas, y puesta en contacto de las células T con un complejo MHC-antígeno peptídico seguido por evaluación de la respuesta biológica por las células. Véanse las solicitudes USSN 08/813.781 y PCT/US98/04274 para ejemplos más específicos de tales ensayos.

En un aspecto, la funcionalidad de una molécula TCR se determina por monitorización de la capacidad del TCR para reconocer el péptido p53 apropiado en el contexto de una molécula MHC apropiada (v.g., HLA-2A), v.g., por monitorización de la fijación del TCR a complejos MHC:péptido p53. Tales complejos pueden presentarse en una célula, en cuyo caso la funcionalidad TCR se mide poniendo en contacto un TCR marcada con una célula presentadora de p53 y midiendo la unión a la célula en comparación con la unión a una célula que no presenta p53. Las células marcadas pueden detectarse microscópicamente o por utilización de ensayos de citometría de flujo como son rutinarios en la técnica.

En otro aspecto, se utiliza un ensayo no basado en células, tal como un Ensayo TCR de Inmunosorbente Unido a Enzima (ELISA). Por ejemplo el TCR puede unirse directamente a un soporte y puede medirse su capacidad para unirse a complejos MHC:péptido p53, o bien el complejo MHC:p53 puede unirse al soporte y puede medirse la capacidad del complejo para unirse al TCR. Soportes adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, pocillos de una placa de microtitulación, placas de cultivo de células, smembrana, sustratos de vidrio o polímeros, y análogos. En lugar de la unión directa del TCR al soporte, el soporte puede estar recubierto con un anticuerpo que reconoce el TCR de tal manera que el anticuerpo unido puede capturar y unir luego indirectamente el TCR al soporte. Controles adecuados para tales ensayos serán obvios para los expertos en la técnica, e incluyen, pero sin carácter limitante, moléculas MHC unidas a antígenos irrelevantes, TCR's que no reconocen p53, tampón, etc. En un ELISA TCR, puede estar marcada la molécula TCR o el MHC o péptido. Preferiblemente, la molécula unida al soporte no está marcada. Como se utiliza en esta memoria, "marcado" hace referencia a marcación directa o indirecta. Así, una "molécula TCR marcada" puede comprender un marcador enlazado directamente a ella o puede comprender un TCR unido indirecta o directamente por una pareja de fijación marcada, tal como un anticuerpo, que reconoce el TCR o que reconoce un anticuerpo unido al TCR. Como se utiliza en esta memoria, "enlazado" hace referencia a una asociación estable entre dos moléculas que puede ser covalente o no covalente.

Los ensayos para monitorizar la funcionalidad de TCR pueden incluir también ensayos para medir la transducción de señales mediada por TCR. En un aspecto, un constructo de ácido nucleico que codifica un heterodímero TCR se introduce en una célula que no expresa un TCR o al menos no expresa un TCR de la misma especificidad. La capacidad de la célula que expresa TCR para transducir las señales apropiadas después de la unión a un complejo p53:MHC puede monitorizarse luego. Por ejemplo, puede medirse la capacidad de la célula que expresa TCR para producir IL-2. sc-TCRs pueden también transfectarse en células. En tales ensayos, el sc-TCR se expresa preferiblemente como una fusión con un polipéptido de dominio transmembranal (v.g., de una molécula de inmunoglobulina) y más preferiblemente, como una fusión con un dominio de señalización citoplásmico apropiado. En un aspecto, el dominio de señalización citoplásmico es una molécula CD3 zeta. Los complejos MHC:p53 pueden estar presentados por moléculas presentadoras de antígeno naturales o modificadas por ingeniería genética, o pueden ser complejos aislados.

La capacidad de un TCR para mediar una respuesta citolítica puede determinarse también. Para un ensayo de este tipo, un constructo de ácido nucleico que codifica una molécula TCR se introduce preferiblemente en una célula que puede expresar moléculas co-estimuladoras apropiadas.

En la totalidad de los ensayos anteriores, un TCR "funcional" es uno que demuestra función incrementada (v.g., unión incrementada, transducción de señales incrementada, tal como producción de IL-2, destrucción de células incrementada, y funciones análogas) en comparación con un TCR de control que no se une a un complejo MHC:p53. La cantidad de función incrementada necesaria para demostrar un "TCR funcional" dependerá necesariamente del tipo de ensayo utilizado. Por ejemplo, en un aspecto, un valor de ensayo que indica un TCR funcional es aproximadamente 10% mayor, aproximadamente 15% mayor, aproximadamente 20% mayor, aproximadamente 30% mayor, aproximadamente 40% mayor, aproximadamente 50% mayor, aproximadamente 60% mayor, aproximadamente 70% mayor, aproximadamente 80% mayor, aproximadamente 90% o aproximadamente 100% mayor que un valor obtenido para un TCR de control. En otros ensayos, un valor de ensayo que indica un TCR funcional es aproximadamente 2 veces mayor, aproximadamente 4 veces mayor, aproximadamente 8 veces mayor, aproximadamente 10 veces mayor, aproximadamente 20 veces mayor, aproximadamente 30 veces mayor, aproximadamente 40 veces mayor, aproximadamente 50 veces mayor, aproximadamente 60 veces mayor, aproximadamente 70 veces mayor, aproximadamente 80 veces mayor, aproximadamente 90 veces mayor, o aproximadamente 100 veces mayor que un valor obtenido para un TCR de control. Para otros ensayos, un valor de ensayo que indica un TCR funcional es uno que es diferente de modo estadísticamente significativo de un valor obtenido de un ensayo de control con p < 0,05. Una persona con experiencia en la técnica puede evaluar rutinariamente las medidas de significación para ensayos particulares utilizados.

En general, la preparación del TCR de la invención puede realizarse por procedimientos descritos en esta memoria y por técnicas de DNA recombinante reconocidas que implican, v.g., reacciones de amplificación en cadena de polimerasa (PCR), preparación de DNA plasmídico, escisión de DNA con enzimas de restricción, preparación de oligonucleótidos, ligación de DNA, aislamiento de mRNA, introducción del DNA en una célula adecuada, transformación o transfección de un hospedador, y cultivo del hospedador. Adicionalmente, las moléculas TCR pueden aislarse y purificarse utilizando agentes caotrópicos y métodos electroforéticos, de centrifugación y cromatográficos bien conocidos. Véase en general, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. (1989); and Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989) para descripción relativa a estos métodos.

Véanse también los documentos USSN 08/813.781 y PCT/US98/04274 y la solicitud de patente asimismo pendiente a la que se ha hecho referencia arriba titulada T-cell Receptor Fusions and Conjugates and Methods of Use Thereof presentada el 5 de junio de 2001 (USSN 09/874.907 por los inventores Jon A. Weidanz, Kimberlyn F. Card, y Hing C. Wong) para información de fundamentos más específica relativa a la producción y utilización de las moléculas descritas en esta memoria.

Como se ha expuesto, las moléculas preferidas de acuerdo con la invención demuestran una fijación satisfactoria en aquello a lo que se hace referencia en esta memoria como un ensayo de fijación de células T estándar o ELISA TCR. Por la expresión "ensayo de fijación de células T estándar" se entiende un test de fijación que detecta y preferiblemente cuantifica la fijación entre una célula T adecuada y una molécula MHC complejada con un antígeno. Expuesto brevemente, un test preferido implica proporcionar una molécula MHC marcada de modo detectable, poner en contacto la molécula MHC marcada (complejada con el antígeno) y la célula T en condiciones conducentes a la formación de un complejo MHC-antígeno:célula T y monitorizar la formación de dicho complejo utilizando métodos estándar de detección. La formación del complejo puede cuantificarse en caso deseado. Pueden utilizarse también otros ensayos para la función TCR como se han descrito arriba.

Las moléculas TCR preferidas que incluyen los heterodímeros y moléculas monocatenarias proporcionadas en esta memoria son generalmente de tamaño suficiente para permitir la fijación específica del TCR a la molécula MHC. En realizaciones en las cuales el MHC está complejado con un antígeno, a lo que se hace referencia también como una molécula péptido-MHC, las moléculas TCR contienen al menos los bucles de fijación CDR que forman la bolsa de fijación MHC:péptido. Moléculas \alpha/\beta TCR útiles que contienen una bolsa de fijación MHC:péptido están constituidas preferiblemente por al menos el dominio variable de cadena \alpha (aproximadamente desde el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 110 y hasta aproximadamente el aminoácido 130 dependiendo de la longitud de CDR de la cadena \alpha) y el dominio variable de la cadena \beta (aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 110 a aproximadamente el aminoácido 130 dependiendo de la longitud CDR de la cadena \beta).

Moléculas TCR más preferidas para uso de acuerdo con esta invención exhiben actividad de fijación significativa en aquello a lo que se ha hecho referencia en esta memoria como el test de fijación estándar de células T. Preferiblemente, la molécula TCR se fija específicamente a su complejo MHC-molécula de antígeno cognada a un nivel que es significativamente diferente de la fijación a un TCR irrelevante (de control) (donde la "significación" se determina utilizando métodos estadísticos de rutina conocidos en la técnica, v.g., con p < 0,05). Preferiblemente, la fijación es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces mayor que los valores de control. Ejemplos de moléculas de control adecuadas incluyen una molécula TCR 149 como se proporciona, v.g., en los documentos USSN 08/813781; U.S.S.N.09/422375; PCT/US98/04274, y PCT/US99/24645.

Ensayos de fijación de células T in vitro e in vivo muy útiles han sido descritos en las Solicitudes de Patente PCT publicadas Núms. PCT/US95/09816, PCT/US96/04314 y PCT/US97/01617, así como en las Solicitudes de Patente U.S. pendientes Núms. de Serie 08/382.454, 08/596.387 y 08/943.086. Los ensayos de fijación de células T descritos pueden utilizarse o adaptarse fácilmente en caso necesario para identificar una unión satisfactoria entre las moléculas TCR de esta invención y la secuencia de aminoácidos de p53 descrita presentada en el contexto de una molécula MHC apropiada.

Un ejemplo preferido del test de fijación de células T estándar ha sido descrito en una solicitud de patente asimismo pendiente, presentada en fecha 16 de mayo de 2001, titulada Modulation of T-cell Receptor Interactions (USSN 09/859.012 por los inventores Peter Rhode, Vaughan Wittman, Jon A. Weidanz, Martin Burkhardt, Kimberlyn F. Card, Rony Tal, Jorge Agevedo, and Hing C. Wong). La solicitud de patente que antecede, asimismo pendiente, presentada en 16 de mayo de 2001 es una continuación en parte de USSN 60/206.920.

En particular, el ejemplo 15 de la solicitud asimismo pendiente presentada en fecha 16 de mayo de 2001 describe una ilustración del test estándar de fijación de células T. Típicamente, el test implica producir células T que expresan el TCR objeto de interés, v.g., un heterodímero de acuerdo con la invención; y teñir a continuación dichas células con una molécula MHC adecuada de clase I, particularmente la molécula HLA-A2.1. Métodos para tinción de las células T que implican tecnologías convencionales biotina/estreptavidina han sido descritos en la solicitud de patente asimismo pendiente presentada en fecha 16 de mayo de 2001. Como se ha descrito, un formato de detección preferido es la citometría de flujo, aunque pueden ser más preferidas otras estrategias de detección para algunas aplicaciones.

Por la expresión "ELISA estándar del receptor de células T (TCR)" deben entenderse incluidos, pero sin carácter limitante, uno cualquiera de los ensayos adecuados descritos, v.g., en la solicitud que antecede asimismo pendiente, presentada el 16 de mayo de 2001. Un ensayo preferido indica la manipulación de constructos TCR monocatenarios o heterodímeros utilizando, v.g., un ELISA basado en placa. Expuesto brevemente, el ensayo implica la marcación detectable del TCR monocatenario o heterodímera, la puesta en contacto de la molécula TCR marcada con una molécula MHC adecuada cargada con péptido, preferiblemente la molécula HLA-A2.1 descrita en esta memoria, en la cual la puesta en contacto tiene lugar en condiciones suficientes para formar un complejo TCR:MHC-péptido. Estrategias de marcación preferidas se exponen a lo largo de la solicitud asimismo pendiente presentada en fecha 16 de mayo de 2001 e incluyen estrategias estándar de marcación biotina/estreptavidina. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 15 de la solicitud asimismo pendiente presentada en fecha 16 de mayo de 2001.

Como se ha expuesto, las moléculas TCR de la invención se unen, típicamente en el contexto de una molécula HLA-A2.1 MHC, a una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 264 y el aminoácido 272 de la secuencia de la proteína p53 humana, abarcando las posiciones de amino-ácidos 264 a 272 de dicha proteína, es decir, la secuencia de aminoácidos "diana" siguiente: Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1).

La invención proporciona adicionalmente secuencias de ácido nucleico (DNA o RNA) y particularmente secuencias de DNA que codifican las presentes moléculas TCR con inclusión de heterodímeros preferidos y constructos monocatenarios. Tales secuencias de DNA se llevan a cabo preferiblemente por un vector adecuado para replicación extracromosómica tal como un fago, virus, plásmido, fagémido, cósmido, YAC, o episoma. En algunas realizaciones, el vector de DNA puede codificar otra proteína adyuvante cuya sola función es facilitar métodos preparativos descritos en esta memoria y obtener cantidades importantes de la proteína. La secuencia de DNA puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Una diversidad de sistemas hospedador-vector pueden utilizarse para expresar la secuencia codificante de la proteína. Éstos incluyen sistemas de células de mamífero infectados con virus (v.g., virus vaccinia, adenovirus, etc.) o transfectados con un vector de expresión; sistemas de células de insecto infectados con virus (v.g., baculovirus); microorganismos tales como levadura que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con DNA de bacteriófago, DNA plasmídico o DNA de cósmido. Dependiendo del sistema hospedador-vector utilizado, puede utilizarse uno cualquiera de cierto número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Véase en líneas generales Sambrook et al., supra y Ausubel et al., supra).

En general, un vector de DNA preferido de acuerdo con la invención comprende una secuencia de nucleótidos unida por enlaces fosfodiéster que comprenden, en una dirección 5' a 3', un primer sitio de clonación para introducción de una primera secuencia de nucleótidos que codifica una cadena TCR, enlazada operativamente a una secuencia que codifica una molécula efectora, es decir una proteína de fusión o conjugado.

Como se utiliza en esta memoria, una "molécula efectora" hace referencia a una secuencia de aminoácidos tal como una proteína, polipéptido o péptido; un azúcar o polisacárido; un lípido o un glicolípido, glicoproteína, lipoproteína o agente químico que puede producir los efectos deseados que se exponen en esta memoria. Así, moléculas adecuadas incluyen factores reguladores, enzimas, anticuerpos, o fármacos así como DNA, RNA y oligonuceótidos. La molécula biológicamente activa o efectora puede ser existente naturalmente, o puede sintetizarse a partir de componentes conocidos, v.g., por síntesis recombinante o química y puede incluir componentes heterólogos. Una molécula biológicamente activa o efectora tiene por regla general un peso molecular comprendido entre aproximadamente 0,1 y 100 KD o mayor, hasta aproximadamente 1000 kD, con preferencia entre aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 y 50 KD a juzgar por técnicas estándar de clasificación de moléculas tales como centrifugación o electroforesis en gel SDS-poliacrilamida. Efectos deseados de la invención incluyen, por ejemplo, inducir la proliferación celular o la muerte celular, iniciar una respuesta inmune o actuar como molécula de detección para propósitos diagnósticos como se determinan por los ensayos descritos más adelante, con inclusión de un ensayo que incluye pasos secuenciales de cultivo de células para hacer proliferar las mismas, y la puesta en contacto de las células con un complejo de fusión TCR de la invención seguido por evaluación de si el complejo de fusión TCR inhibe el desarrollo ulterior de las células.

En la mayoría de los casos, se preferirá que cada uno de los componentes de la proteína de fusión codificados por el vector de DNA se proporcione en un formato de "casete". Por el término "casete" se entiende que cada componente puede emplearse fácilmente en sustitución de otro componente por métodos recombinantes estándar. Para producir el vector codificante de las moléculas TCR proporcionadas en esta memoria, la secuencia que codifica la molécula TCR se enlaza a una secuencia vectora por el uso de ligasas adecuadas.

Si se desea, pueden incluirse otras secuencias de nucleótidos en el constructo génico. Por ejemplo, una secuencia promotora, que controla la expresión de la secuencia codificante de la molécula TCR, o una secuencia conductora, que dirige el complejo de fusión TCR a la superficie de la célula o al medio de cultivo, puede incluirse en el constructo o estar presente en el vector de expresión en el cual se inserta el constructo. Una inmunoglobulina o promotor CMV se prefiere particularmente para expresión en células de mamífero.

Se hace resaltar que los componentes de las moléculas TCR de esta invención que incluyen, pero sin carácter limitante, cadenas variables, dominios transmembranales, cadenas constantes, etc., pueden organizarse prácticamente en cualquier orden con tal que alguno sea capaz de realizar su función deseada.

Pueden emplearse varias estrategias para expresar las moléculas TCR proporcionadas en esta memoria. Por ejemplo, la molécula sc-TCR que une la secuencia de aminoácidos diana de SEQ ID NO. 1 en el contexto de una molécula HLA puede incorporarse en un vector adecuado por medios conocidos tales como por el uso de enzimas de restricción para realizar cortes en el vector para inserción del constructo seguida por ligación. El vector que contiene el constructo génico recombinante se introduce luego en un hospedador adecuado para expresión del péptido de fusión TCR. Véase, generalmente, Sambrook et al., supra. La selección de vectores adecuados puede realizarse empíricamente basada en factores relacionados con el protocolo de clonación. Por ejemplo, el vector debería ser compatible con, y tener el replicón apropiado para el hospedador que se está empleando. Adicionalmente, el vector tiene que ser capaz de acomodar la secuencia de DNA que codifica la molécula TCR que va a expresarse. Células hospedadoras adecuadas incluyen células eucariotas y procariotas, preferiblemente aquellas células que pueden transformarse fácilmente y exhibir crecimiento rápido en el medio de cultivo. Células hospedadoras específicamente preferidas incluyen procariotas tales como E. coli, Bacillus subtilis, etc. y eucariotas tales como células animales y cepas de levadura, v.g., S. cerevisiae. Se prefieren generalmente células de mamífero, particularmente J558, NSO, SP2-O o CHO. Otros hospedadores adecuados incluyen, v.g., células de insecto tales como Sf particularmente 9. Se emplean condiciones de cultivo convencionales. Véase Sambrook, supra. Pueden seleccionarse luego líneas de células transformadas o transfectadas estables. Las células que expresan una molécula TCR pueden determinarse por procedimientos conocidos. Por ejemplo, la expresión de una molécula TCR, preferiblemente un heterodímero enlazado a una inmunoglobulina, puede determinarse por un ELISA específico para la inmunoglobulina enlazada y/o por inmunotransferencia.

Como se ha mencionado en líneas generales arriba, puede utilizarse una célula hospedadora para propósitos preparativos a fin de propagar el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada. Así, una célula hospedadora puede incluir una célula procariota o eucariota en la cual se pretende específicamente producir la proteína de fusión. Así, células hospedadoras incluyen específicamente células y órganos de bacterias, de levadura, de mosca, de gusano, de planta, de rana y de mamífero que son capaces de propagar el ácido nucleico que codifica la fusión. Ejemplos no limitantes de líneas de células de mamífero que pueden utilizarse incluyen células CHO dhfr (Urlaub y Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1989)), células 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)) o células de mieloma tales como SP2 o NSO (Galfre y Milstein, Meth. Enzymol. 73(B):3 (1981)).

Células hospedadoras capaces de propagar ácido nucleico codificante de un TCR heterodímero o monocatenario abarcan asimismo células eucariotas distintas de células de mamífero, con inclusión de células de insecto (v.g., Sp. frugiperda), levadura (v.g. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha; como ha sido revisadoen líneas generales por Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486-496 (1992)), células fúngicas y células de plantas. Se contemplan también ciertos procariotas tales como E. coli y Bacillus.

Ácido nucleico codificante de una proteína de fusión deseada puede introducirse en una célula hospedadora por técnicas estándar para transfección de células. El término "transfectar" o "transfección" tiene por objeto abarcar todas las técnicas convencionales para introducir ácido nucleico en células hospedadoras, con inclusión de co-precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación, microinyección, transducción viral y/o integración. Métodos adecuados para transfectar células hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook et al. supra, y otros libros de texto de laboratorio.

La presente invención proporciona adicionalmente un proceso de producción para aislar una cualquiera de las moléculas TCR descritas en esta memoria. En el proceso, una célula hospedadora (v.g., una célula de levadura, hongo, insecto, bacteria o animal), en la cual se ha introducido un ácido nucleico codificante de la proteína de interés enlazado operativamente a una secuencia reguladora, se deja crecer a escala de producción en un medio de cultivo para estimular la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de interés. Subsiguientemente, la molécula TCR se aísla de las células hospedadoras cosechadas o del medio de cultivo. Pueden utilizarse técnicas estándar de purificación de proteínas para aislar la proteína de interés del medio o de las células cosechadas. En particular, las técnicas de purificación pueden utilizarse para expresar y purificar una proteína TCR deseada en gran escala (es decir, al menos en cantidades de miligramos) a partir de una diversidad de implementaciones que incluyen botellas rodantes, matraces de centrifugadora, placas de cultivo de tejidos, biorreactores, o fermentadores.

Una molécula TCR expresada de acuerdo con la invención puede aislarse y purificarse por métodos conocidos. Típicamente, el medio de cultivo se centrifuga y el sobrenadante se purifica luego por cromatografía de afinidad o inmunoafinidad, v.g., cromatografía de afinidad de Proteína-A o de Proteína-G, o un protocolo de inmunoafinidad que comprende el uso de anticuerpos monoclonales que fijan la molécula TCR expresada. Tales moléculas pueden separarse y purificarse por combinación apropiada de técnicas conocidas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, métodos que utilizan solubilidad tales como precipitación con sal y precipitación con disolvente, métodos que utilizan la diferencia de peso molecular tales como diálisis, ultrafiltración, filtración con gel, y electroforesis en gel SDS-poliacrilamida, métodos que utilizan una diferencia en carga eléctrica tales como cromatografía en columna de intercambio iónico, métodos que utilizan afinidad específica tales como cromatografía de afinidad, métodos que utilizan una diferencia en hidrofobicidad tales como cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa, y métodos que utilizan una diferencia en punto isoeléctrico tales como electroforesis de enfoque isoeléctrico y columnas de afinidad de metales tales como Ni-NTA. Véase, en líneas generales, Sambrook et al. y Ausubel et al. supra para descripción relativa a estos métodos.

Se prefiere que particularmente las moléculas TCR monocatenarios de la presente invención sean sustancialmente puras. Es decir, las moléculas se han aislado de los sustituyentes celulares que las acompañan naturalmente, de tal manera que las proteínas de fusión están presentes preferiblemente al menos con una homogeneidad de 80% ó 90% a 95% (p/p). Tales proteínas que tienen al menos homogeneidad de 98 a 99% (p/p) son muy preferidas para muchas aplicaciones farmacéuticas, clínicas y de investigación. Una vez sustancialmente purificada, la proteína debe estar sustancialmente exenta de contaminantes para aplicaciones terapéuticas. Una vez purificadas parcialmente o hasta pureza sustancial, las moléculas TCR solubles, preferiblemente en un formato monocatenario, pueden utilizarse terapéuticamente o en la realización de ensayos in vitro o in vivo como se describe en esta memoria. La pureza sustancial puede determinarse por una diversidad de técnicas estándar tales como cromatografía y electroforesis en gel.

Las moléculas TCR truncadas de la invención contienen una molécula TCR que está truncada suficientemente de tal manera que la molécula TCR de la invención puede secretarse en el medio de cultivo después de su expresión. Así, una molécula truncada TCR, sc-TCR, fusión o complejo TCR no incluirá típicamente regiones ricas en residuos hidrófobos, típicamente los dominios transmembranales y citoplásmicos de la molécula TCR. Así, por ejemplo, para una molécula TCR truncada preferida de la invención, preferiblemente desde aproximadamente los residuos de aminoácidos 199 a 237 de la cadena \beta y desde aproximadamente los residuos de aminoácidos 193 a 230 de la cadena \alpha de la molécula TCR no están incluidos en el complejo TCR truncado.

Por el término "soluble" o término similar se entiende que la molécula TCR de la invención, usualmente pero sin carácter exclusivo un constructo monocatenario, no se sedimenta fácilmente bajo centrifugación con fuerza G baja (v.g., menor que aproximadamente 30.000 revoluciones por minuto en una centrífuga estándar) de un tampón acuoso, v.g., medios de células. Adicionalmente, la molécula es soluble si se mantiene en solución acuosa a una temperatura mayor que aproximadamente 5-37ºC y a pH neutro o aproximadamente neutro en presencia de una concentración baja o nula de un detergente aniónico o no iónico. En estas condiciones, una proteína soluble tendrá a menudo un valor de sedimentación bajo, v.g., menor que aproximadamente 10 a 50 unidades Svedberg.

Las soluciones acuosas a que se hace referencia en esta memoria tienen típicamente un compuesto tampón para estabilizar el pH, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5-9, y un intervalo de concentración iónica entre aproximadamente 2 mM y 500 mM. A veces se añade un inhibidor de proteasa o un detergente no iónico suave. Adicionalmente, puede añadirse si se desea una proteína portadora tal como seroalbúmina bovina (BSA) o seroalbúmina humana (HSA) hasta unos cuantos mg/ml. Tampones acuosos ilustrativos incluyen solución salina estándar tamponada con fosfato, solución salina tamponada con Tris, u otros tampones y formulaciones de medios de células bien conocidas.

Las presentes moléculas TCR son adecuadas para uso in vitro o in vivo con una diversidad de células que son cancerosas, precancerosas o tumorígenas. Preferiblemente, tales células expresan niveles altos de proteína p53 cuando se comparan con células normales (de tipo salvaje) que no se sabe sean cancerosas, precancerosas, o tumorígenas.

Las moléculas de la invención serán especialmente útiles para un paciente humano que padece o se sospecha que padece una enfermedad, trastorno o afección maligna asociada con la expresión anormal de p53 (v.g., una sobreexpresión al menos doble de la molécula ). Por ejemplo, las moléculas de la invención o derivados de las mismas serán particularmente útiles en el direccionamiento de tumores en pacientes humanos asociados con la expresión anormal de p53. Ejemplos específicos de enfermedades que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen cánceres, v.g., de mama, próstata, etc., así como otros trastornos o afecciones específicos mencionados en esta memoria.

La administración de las moléculas de la invención puede hacerse por una diversidad de rutas adecuadas que incluyen las rutas oral, tópica (con inclusión de transdérmica, bucal o sublingual), nasal y parenteral (con inclusión de inyección intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intradérmica o intramuscular), siendo generalmente preferidas las rutas oral o parenteral. Se apreciará también que el método de administración y la cantidad de dosificación preferidos pueden variar, por ejemplo, con la condición y edad del receptor. Dosificaciones eficaces pueden monitorizarse por determinación de los puntos finales terapéuticos clínicos estándar tales como regresión del tumor, disminución de la expresión de marcadores específicos de cáncer (con inclusión de p53), proliferación celular disminuida, resultados de biopsia mejorados o normales, y análogos.

Las moléculas de la invención pueden utilizarse en terapia solas o en asociación con otros medicamentos tales como aquéllos que tienen actividad farmacológica reconocida para tratar las indicaciones deseadas. Medicamentos ilustrativos incluyen terapéuticas reconocidas tales como cirugía, radiación, quimioterapia u otras formas de inmunoterapia (v.g., vacunas, terapias basadas en anticuerpos). La molécula de esta invención puede administrarse antes, durante o después de dichas terapias en caso necesario.

Si bien una o mas moléculas de la invención pueden administrarse solas, las mismas pueden estar también presentes como parte de una composición farmacéutica en mezcla con excipientes convencionales, es decir, sustancias vehículo orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para administración parenteral, oral u otra administración deseada y que no reaccionan de modo perjudicial con los compuestos activos y no son perjudiciales para el receptor de las mismas. Composiciones farmacéuticas de la invención comprenden en general una o más moléculas TCR de la invención o constructos de DNA que codifican tales moléculas TCR, junto con uno o más excipientes aceptables. Los excipientes deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin carácter limitante, agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceites de perfumes, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales (sic), hidroximetil-celulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse en caso deseado o mezclarse con agentes adyuvantes, v.g., lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y análogas que no reaccionan desfavorablemente con las moléculas activas de la invención.

Para aplicación parenteral, son particularmente adecuadas soluciones, preferiblemente soluciones aceitosas o acuosas así como suspensiones, emulsiones, o implantes, con inclusión de supositorios. Las ampollas son dosis unitarias convenientes.

Para aplicación enteral, son particularmente adecuadas tabletas, grageas o cápsulas que tienen como vehículo aglutinante talco y/o carbohidratos o análogos, siendo el excipiente preferiblemente lactosa y/o almidón de maíz y/o almidón de patata. Puede utilizarse un jarabe, elixir o análogo en los casos en que se emplea un vehículo edulcorado. Pueden formularse composiciones de liberación sostenida que incluyen aquéllas en las cuales el componente activo está protegido con recubrimientos diferencialmente degradables, v.g., por microencapsulación, recubrimientos múltiples, etc.

Los compuestos terapéuticos de la invención pueden incorporarse también en liposomas. La incorporación puede realizarse de acuerdo con procedimientos conocidos de preparación de liposomas, v.g., tratamiento por ultrasonidos y extrusión. Métodos convencionales adecuados de preparación de liposomas se describen también en, v.g., A.D. Bangham et al., J. Mol. Biol, 23:238-252 (1965); F. Olson et al., Biochim. Biophys. Acta, 557:9-23 (1979); F. Szoka et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 75:4194-4198 (1978); S. Kim et al., Biochim. Biophys. Acta, 728:339-348 (1983); and Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986).

La invención proporciona también las moléculas TCR para uso en métodos de provocación de una respuesta inmune en un mamífero tal como un humano, que incluyen vacunación de un mamífero tal como un humano contra un trastorno diana asociado con la sobreexpresión de p53 tal como el cáncer.

Estos métodos comprenden administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una secuencia de DNA que comprende un vector de DNA que codifica una molécula TCR de la invención. La preparación de vectores de expresión de moléculas TCR se ha descrito anteriormente y en los ejemplos que siguen. Métodos para administración de DNA plasmídico, absorción de dicho DNA por las células del paciente administrado y expresión de proteínas han sido publicados. Véase Ulmer, J.B., et al., Science (1993) 259:1745-1749.

Vectores de DNA que codifican moléculas TCR de la invención se administran convenientemente a un mamífero con inclusión de un humano, preferiblemente por inyección intramuscular. La administración de cDNA a la musculatura esquelética de un mamífero con absorción subsiguiente del vector de expresión administrado por las células musculares y expresión de la proteína codificada por el DNA ha sido descrita por Ulmer et al. y representa un protocolo ilustrativo [Ulmer, J.B., et al., Science 259:1745-1749]. La dosis óptima para una aplicación terapéutica dada puede determinarse por medios convencionales.

Además del uso para tratamiento de trastornos humanos, las moléculas TCR de la invención y los constructos de DNA de la invención que codifican tales moléculas TCR tendrán uso significativo para aplicaciones veterinarias, v.g., tratamiento de trastornos del ganado tales como ganado vacuno, ovejas, etc., y mascotas tales como perros y gatos utilizando los antígenos p53 cognados y moléculas MHC apropiadas para las especies animales.

Se apreciará que las cantidades preferidas reales de una molécula TCR dada de la invención o constructo de DNA que codifica la misma utilizadas una terapia dada variarán de acuerdo con el compuesto o compuestos activos particulares que se utilicen, las composiciones particulares formuladas, el modo de aplicación, el sitio de administración particular, el peso del paciente, el estado general de salud, el sexo, etc., la indicación particular que se esté tratando, etc., y otros factores de este tipo que son reconocidos por los expertos en la técnica con inclusión del médico o veterinario que tiene a su cargo el tratamiento. Las tasas óptimas de administración para un protocolo de administración dado pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica utilizando tests de determinación de la dosificación convencionales conducidos, v.g., con relación a las directrices que anteceden y los ensayos descritos en esta memoria.

Un "polipéptido" hace referencia a cualquier polímero constituido de modo preferible esencialmente por cualquiera de los 20 aminoácidos naturales con indiferencia de su tamaño. Aunque el término "proteína" se utiliza a menudo con referencia a proteínas relativamente grandes, y el término "péptido" se utiliza a menudo con referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en el campo se solapa en muchos casos. El término "polipéptido" hace referencia generalmente a proteínas, polipéptidos, y péptidos a no ser que se indique otra cosa. Los péptidos útiles de acuerdo con la presente invención tendrán por lo general un peso molecular comprendido entre aproximadamente 0,1 y 100 KD o mayor, hasta aproximadamente 1000 KD, con preferencia entre aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 y 50 KD a juzgar por técnicas estándar de clasificación por tamaños moleculares tales como centrifugación o electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Como se utiliza en esta memoria, el término "célula" tiene por objeto incluir cualquier línea de células primarias o células inmortalizadas, cualquier grupo de células de este tipo, como en un tejido o un órgano. Preferiblemente, las células son de mamífero y particularmente de origen humano, y pueden estar infectadas por uno o más patógenos. Una "célula hospedadora" de acuerdo con la invención puede ser una célula infectada o puede ser una célula tal como E. coli que puede utilizarse para propagar un ácido nucleico descrito en esta memoria.

Los ejemplos no limitantes siguientes son ilustrativos de la invención.

Ejemplo 1 Construcción del TCR monocatenario (sc) 264

El clon de células T, 264, reconoce un fragmento peptídico (aa 264-272; LLGRNSFEV) [SEQ ID NO. 1] de la proteína p53 supresora de tumores humana de tipo salvaje restringida por HLA-A2.1. El gen del receptor de las células T se clonó en un formato monocatenario de 3 dominios que se había demostrado previamente produce moléculas del receptor TCR solubles y funcionales.

Resumidamente, se aisló mRNA del clon de células T y se produjo cDNA utilizando el Kit de Amplificación de cDNA Marathon (Clontech). La secuenciación de los clones de cDNA identificó dos cadenas V alfa distintas (V alfa 3 y V alfa 13) y una sola cadena V beta (V beta 3). El cDNA se utilizó como molde en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores KC228 y KC229 o KC226 y KC227 para producir fragmentos 5' SfiI-3' SpeI V alfa 3 o V alfa 13, respectivamente. Se utilizó luego el mismo DNA como un molde PCR con iniciadores PRIB4 y KC176 para generar un fragmento de cadena 5' XhoI-3' XmaI V beta C beta. La cadena C beta se truncó inmediatamente antes del residuo cisteína en el aminoácido 127 de la cadena C beta de longitud total.

Los fragmentos de cadena alfa y beta se clonaron en el Easy Vector System pGEM-T (Promega) para determinación de la secuencia de DNA. Los fragmentos correctos se digirieron por restricción y se clonaron en el vector de expresión pKC60 (descrito previamente en la solicitud de patente U.S. pendiente No. 08/813.781) para crear dos moléculas de sc-TCR V alfa-(G_{4}S)_{4} V beta, C beta, 264-A (con V alfa 3) y 264-B (con V alfa 13).

Los constructos de DNA arriba descritos (264-A y 264-B) se reamplificaron por PCR con los iniciadores ET-TCRF1 y KC170 o ET-TCRF2 y KC170, respectivamente, para generar fragmentos de DNA 5' AgeI-3' ClaI. Los fragmentos se clonaron en el Easy Vector System pGEM-T para determinación de la secuencia de DNA.

Los fragmentos 5' AgeI-3' ClaI se utilizaron luego como el DNA molde en PCR con iniciadores KC232 y KC208 o KC231 y KC208, respectivamente, para producir fragmentos de DNA 5' AgeI-3' HpaI para clonación a fin de producir la molécula de fusión CD3 zeta o vectores que comprendían tales moléculas (descritos más adelante) y eventualmente la molécula de fusión 264 IL-2 o vectores que comprendían tales moléculas (descritos más adelante).

Ejemplo 2 Construcción del Vector de Fusión Lanzadera CD3 zeta

Para determinar cuál de las dos cadenas V alfa era funcional, se expresaron ambos sc-TCR 264-A y 264-B como moléculas de fusión CD3 zeta.

La construcción de un "vector lanzadera" ha sido descrita previamente en la solicitud de patente U.S. pendiente, No. 09/422.375.

Resumidamente, se clonaron fragmentos TCR de cadena alfa y beta en el vector de expresión pKC60 para crear una molécula sc-TCR V alfa-(G_{4}S)_{4} V beta C beta. El nuevo vector se designó pNAG2 (Fig. 9). Se reamplificó luego pNAG2 por PCR con los iniciadores KC203 y KC208 para generar un fragmento 5' AgeI-3' HpaI/BspEI/NruI/ClaI. El fragmento sc-TCR se clonó en el Easy Vector System pGEM-T, y este nuevo vector basado en pGEM se utilizó luego como "vector lanzadera" para introducción de otros fragmentos de DNA a fin de crear una molécula sc biespecífica o de fusión.

Se digirió luego por restricción DNA sc-Fv y se clonó en el "vector lanzadera" aguas abajo del sc-TCR. Para conectar el sc-TCR y sc-Fv juntos como una proteína de fusión monocatenaria, el "vector lanzadera" se digirió con las enzimas de restricción apropiadas a fin de desprender el fragmento de DNA enlazador previo y permitir la ligación de secuencias enlazadoras entre el sc-TCR y el sc-Fv.

En el diseño del "vector lanzadera" expuesto anteriormente, se introdujeron un codón de parada y un sitio de corte y empalme entre los sitios de restricción Nru/I y ClaI, como parte de la amplificación PCR del sc-TCR con el iniciador "de retroceso" KD208. Para ayudar a la purificación) aguas abajo de la proteína sc biespecífica, se determinó un juego de oligonucleótidos reasociados (KC237 y KC238) a fin de introducir un marcador 3' EE (EEEEYMPME) (SEQ ID NO. 4) con un codón de parada y sitio de corte y empalme. El par de oligonucleótidos reasociados se clonó 5'NruI-3'ClaI en el "vector lanzadera" que codificaba ya la molécula sc-TCR biespecífica completa.

Después de la clonación del sc-TCR, sc-Fv, enlazador, y fragmentos de DNA marcadores en el "vector lanzadera" para completar el diseño de la molécula sc biespecífica, se digirió por restricción el DNA (AgeI/ClaI) y se clonó en el vector de expresión de células de mamífero pSUN27 (Fig. 2) (descrito previamente en la Solicitud de Patente U.S. pendiente No. 08/943.086 para crear pBISP/149 y pBISP/D011.10 (Fig. 3). pBISP/D011.10 puede ser generado por un experto en la técnica utilizando pBISP/149 que está depositado como pSUN28 y cualquiera de tres plásmidos D011.10scTCR (pSUN18-ATCC#97895, pSUN19-ATCC#97896, o pSUN27-ATCC#209276).

Construcción del Vector de Fusión CD3 zeta

De modo resumido, se utilizó cDNA murino como el molde en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los iniciadores KC312 y KC304 para producir un fragmento murino CD3 zeta 5'HpaI-3'ClaI.

El fragmento murino CD3 zeta se clonó en el Vector Easy System pGEM-T para determinación de la secuencia de DNA. El fragmento correcto se digirió por restricción y se clonó en el "vector lanzadera", separando eficazmente el enlazador existente, sc-FV y el marcador EE.

Después de la clonación del gen CD3 zeta en el "vector lanzadera", se digirió el DNA AgeI-HpaI para permitir la ligación con los fragmentos sc-TCR 264-A y 264-B (arriba descritos), creando dos nuevas fusiones sc-TCR/CD3 zeta. Finalmente, las nuevas preparaciones de DNA se digirieron por restricción (AgeI-ClaI) y se clonaron en el vector de expresión de células de mamífero pSUN28 (vector pBISP/DO11.10), Fig.3 descrito previamente en la Solicitud de Patente U.S. pendiente No. 09/422.375.

Ejemplo 3 Expresión de Moléculas de Fusión 264 sc-TCR/CD3 zeta

Se prepararon células Jurkat para transfección por lavado con DPBS fría. Las células se resuspendieron en DPBS y se mezclaron con 20 \mug de DNA 264-A/CD3 zeta o 264-B/CD3 zeta, linealizado con PvuI. Después de 5 minutos en hielo, se sometieron las células a electroporación utilizando un y se añadió Gene Pulser BioRad) ajustado para suministrar un pulso de 250 voltios, 980 \muFd. Las células pulsadas se pusieron en hielo durante 5 minutos. Las células se diluyeron en 10 ml de medio IMDM al 10% (IMDM, FBS 10%, glutamina 2 mM) y se dejaron crecer en un matraz T-25 cm^{2} TC durante una noche a 37ºC con 5% de CO_{2}. Al día siguiente, se extendieron las células en placas de 96 pocillos con medio selectivo (IMDM al 10% más 1,0 mg/ml de G418). Después de una semana, se aumentó la concentración de G418 hasta 2 mg/ml. Las colonias que crecían se realimentaron aproximadamente dos semanas después de la transfección y se cribaron aproximadamente una semana después.

Las células Jurkat transfectadas se cribaron respecto a expresión superficial de sc-TCR utilizando análisis por citometría de flujo. Los transfectantes positivos se identificaron por tinción con un mAb marcado fluorescentemente (H57-597) que detecta una porción del dominio C beta del TCR murino.

Ejemplo 4 Identificación del Dominio alfa 264 sc-TCR V Correcto

Las células Jurkat transfectadas que expresaban la versión 264-A o 264-B de la molécula de fusión CD3 zeta se utilizaron el ensayo de activación de células. En el ensayo, se utilizó la línea T2 de células presentadoras de HLA-A2 como la APC. Las células T2 se cargaron con el péptido 264 (o un péptido irrelevante) durante una noche a 37ºC con 5% de CO_{2}. Al día siguiente, se añadieron las líneas Jurkat transfectadas y se dejaron interaccionar con las APCs pulsadas con el péptido durante una noche.

La estimulación específica de los transfectantes por las APCs cargadas con 264 se evaluó utilizando un ELISA de IL-2. Un mAb anti-IL-2 humana se recubrió pasivamente durante una noche sobre una placa de 96 pocillos. La placa se lavó y se bloqueó con 10% FBS/DPBS durante una hora. El reactivo de bloqueo se desprendió y los sobrenadantes del ensayo se añadieron a la placa durante una hora a 37ºC. Después del lavado, se detectó la IL-2 fijada utilizando otro mAb anti-IL-2 conjugado con biotina. Después de 45 minutos a 37ºC, se lavó la placa y se añadió estreptavidina-HRP durante 15 minutos. Finalmente, se lavó la placa y se reveló utilizando ABTS como sustrato. La absorbancia se leyó a 405 nm.

Basándose en el ensayo de activación de células, el dominio V alfa 3 es funcional. Únicamente las células que expresaban la molécula 264-A se estimulaban para producir IL-2 en presencia de APCs cargadas con el péptido 264.

La Tabla 1, que se presenta en la página siguiente, muestra la secuencia primaria de diversos oligonucleótidos utilizados en los ejemplos que anteceden.

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TABLA 1

1

Claims (32)

1. Un receptor de células T aislado (TCR) que es capaz de fijar un péptido p53 en el contexto de una molécula MHC, en donde el péptido p53 es la secuencia de aminoácidos Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val (SEQ ID NO. 1), que comprende una cadena V\alpha y una cadena V\beta, en donde la cadena V\alpha3 es idéntica al menos en un 90% a la cadena V\alpha3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) y en donde la cadena V\beta es idéntica al menos aproximadamente en un 90% a la cadena V\beta3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), y que comprende adicionalmente al menos uno de una secuencia enlazadora que es Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO. 4) para un TCR heterodímero o monocatenario o que comprende ulteriormente un enlazador (Gly Gly Gly Gly Ser) \geq 4 (SEQ ID NO. 5) para un TCR monocatenario.

2. El TCR aislado de la reivindicación 1, en donde la molécula MHC comprende una molécula HLA.

3. El TCR aislado de la reivindicación 2, en donde la molécula HLA comprende HLA A2.1.

4. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la cadena \alpha comprende, enlazadas covalentemente en secuencia: a) una cadena V\alpha y b) una cadena C\alpha.

5. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la cadena \beta comprende, unidas covalentemente en secuencia: c) una cadena V\beta, y una secuencia C\beta.

6. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la fijación se determina por monitorización de la fijación del TCR a una molécula MHC complejada con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO. 1.

7. El TCR aislado de la reivindicación 6, en donde la fijación se monitoriza en un ELISA TCR o un ensayo estándar de fijación de TCR.

8. El TCR aislado de la reivindicación 6, en donde la fijación se monitoriza por medida de la transducción de señales por el TCR.

9. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la fijación entre la secuencia de aminoácidos y la molécula TCR se incrementa al menos aproximadamente en dos veces cuando se compara con un heterodímero TCR de control.

10. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la fijación entre la secuencia de aminoácidos y el heterodímero TCR está aumentada al menos aproximadamente en un 10% con relación a un heterodímero TCR de control.

11. El TCR aislado de las reivindicaciones 1-10, que comprende adicionalmente una secuencia C\beta que tiene una identidad de al menos aproximadamente 90% en secuencia de aminoácidos con la cadena C\beta que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2).

12. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la cadena C\alpha tiene una identidad de al menos aproximadamente 90% en la secuencia de aminoácidos con la cadena C\alpha que se muestra en Figura 5 (SEQ ID NO. 3).

13. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el TCR comprende un heterodímero.

14. El TCR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el TCR comprende un TCR monocatenario.

15. El TCR monocatenario (sc-TCR) aislado de la reivindicación 14, en donde la cadena V\alpha está enlazada covalentemente a una cadena V\beta por la secuencia del enlazador peptídico.

16. La sc-TCR de cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en donde el sc-TCR comprende un dominio transmembranal.

17. La sc-TCR de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde el sc-TCR comprende un dominio de señalización citoplásmico.

18. La sc-TCR de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en donde el sc-TCR comprende en secuencia 1) una cadena V\alpha3 como se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), 2) el enlazador peptídico, y 3) una cadena V\beta3 como se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2).

19. La sc-TCR de la reivindicación 18 que comprende adicionalmente una cadena C\beta como se proporciona en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) enlazada al término C de la cadena V\beta3.

20. La sc-TCR de cualquiera de las reivindicaciones 18-19, que comprende adicionalmente un fragmento de la cadena C\alpha como se proporciona en la Figura 5 (SEQ ID NO. 3), estando enlazado covalentemente el fragmento entre el término C de la cadena V\alpha y el término N del enlazador peptídico.

21. Un ácido nucleico aislado en donde el ácido nucleico codifica un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

22. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 21.

23. Una célula que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 21 o un vector de acuerdo con la reivindicación 22.

24. Un par de segmentos de DNA que codifican el heterodímero de la reivindicación 13, en donde un primer segmento de DNA codifica la cadena V\alpha y un segundo segmento de DNA codifica la cadena V\beta, en donde la cadena V\alpha codificada es idéntica al menos aproximadamente en un 90% en secuencia de aminoácidos a la cadena V\alpha3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2) y en donde la cadena V\beta codificada es idéntica al menos aproximadamente en un 90% en secuencia de aminoácidos a la cadena V\beta3 que se muestra en las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2).

25. El par de segmentos de DNA que se indica en la reivindicación 24, en donde el segundo segmento codifica adicionalmente una cadena C\beta que es idéntica al menos aproximadamente en un 90% en secuencia de aminoácidos a la cadena C\beta de las Figuras 4A-C (SEQ ID NO. 2), estando enlazado el término C de la cadena codificada V\beta al término C de la cadena codificada C\beta.

26. Un método de identificación de una célula o tejido que expresa p53, que comprende poner en contacto la célula o tejido con un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

27. Un método de identificación de una célula o tejido que expresa p53, que comprende poner en contacto la célula o tejido con una célula de acuerdo con la reivindicación 23.

28. Un método in vitro de destrucción de una célula que expresa el péptido p53 en el contexto de una molécula MHC, comprendiendo el método poner en contacto la célula con la célula de acuerdo con la reivindicación 23.

29. El método in vitro de la reivindicación 28, en donde el método comprende adicionalmente formar un complejo inmune entre la molécula MHC y un TCR expresada en la célula de la reivindicación 23.

30. El método in vitro de la reivindicación 29, en donde el método comprende adicionalmente inducir una respuesta inmune suficiente para destruir la célula.

31. El TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20 para uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizándose el cáncer por regulación creciente de p53.

32. La célula de acuerdo con la reivindicación 23 para uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula de acuerdo con la reivindicación 23.