CN1082110A - 分离和克隆有酪氨酸-磷酸酶活性的蛋白质 - Google Patents

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Abstract

其细胞外区域包含Arg-Gly-Asp顺序的哺乳 动物受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP酶)或其功能 衍生物。这类PTP酶的例子是II类PTP酶的新成 员。

Description

本发明涉及跨膜酪蛋白磷酸酶，其编码DNA，生产和鉴定这些蛋白质的方法，以及筛选能够结合和抑制或刺激磷酸酶酶促活性之化合物的方法。
蛋白质酪氨酸残基的磷酸化状态在细胞生长控制中起着重要作用。通过调整两种相反作用的蛋白质-酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的相对活性来控制细胞磷酸酪氨酸水平。
几种生长因子受体，以及胰岛素受体都是酪氨酸特异性蛋白质激酶。
受体酪氨酸激酶的活化是通过与它们各自的生长因子或细胞激活素如FGF、EGF、PDGF、GM-CSF和IL-1的相互作用介导的，并通常诱导有丝分裂和生长（Yarden，Yand  Ullrich，A，：Annual  Rev.Biochem.57：443-478，1988）。发现许多致癌基因产物也可作为酪氨酸激酶并与已知的多肽生长因子受体分享广泛的顺序同源性，从而进一步支持酪氨酸磷酸化作用和细胞增殖之间关联的观点。这些观察结果提示，蛋白质酪氨酸磷酸酶因其能够选择性地抵消酪氨酸激酶的作用，而可能在控制细胞生长和活化中起到重要作用。因此，已证明酪氨酸磷酸酶抑制剂能够“可逆地转化”细胞，并且已提出在恶性增殖过程中可能包括PTP酶（PTPase）活性的改变，而形成蛋白质酪氨酸磷酸酶可能作为肿瘤抑制物的概念（Klarlund，J.K.（1985）Cell41∶707-717）。
虽然关于酪氨酸激酶的许多工作已集中在生长调节作用上，但最近中枢神经系统的非增殖细胞中的发现证明了相对大量的酪氨酸激酶活性的存在。例如，胰岛素的受体存在于脑的特定区域中，并在配体刺激后发生特异地自动磷酸化。目前已经证明，大鼠脑中胰岛素受体的分布是与磷酸酪氨酸的分布密切相关的，此提示这种激酶具有体内活性并参予成年动物中枢神经系统的功能（Moss，A.M.，Unger，J.W.，Moxley，R.T.and  Livingston，J.Proc.Natl.Acad.Sci.87∶4453-4457，1990）。
另一方面，最近已报导几种酪氨酸磷酸酶在中枢神经系统中得以选择性地表达，提示它们可能参予调节脑中的酪氨酸激酶活化作用。
如果这些酶参予控制酪氨酸磷酸化途径，则它们的活性可能是酪氨酸激酶的活性应在对特异性细胞过程或配体相互作用的反应中受到调节。确定，迄今已分离出的某些磷酸酶显示有假定的受体型结构，此提示它们的活性是受精细调节的级联过程中的外在配体调节的。很显然，酪氨酸磷酸化配体的分离可代表抑制不受控制的细胞生长（如在恶性增生情况下）的一个重要步骤。
基于它们的结构组织，可将蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP酶）分为三类。Ⅰ类含有其中带有单一催化区域的低分子量非受体分子，其中具有一个单一的催化区域并包括胎盘PTP酶1B（Charbonneau，H.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86∶5252-5256，1989;Chernoff，J.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87∶2735-2789，1990）、T细胞TPT酶（Cool，D.E.et  al.，Proc，Natl.Acad.Sci.86∶5257-5261，1989）和大鼠脑PTP酶（Guan，K.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87∶1501-1505，1990）。Ⅱ和Ⅲ类PTP酶则是受体样跨膜受体。虽然迄今已描述的Ⅱ类的单独成员（HPTPβ和DPTP10D）具有单一的胞浆催化区（Kreuger，N.X.et  al.∶EMBOJ.，9∶3241-3252，1990;Shin-Shay，T.et  al.，∶Cell  67∶675-685，1991），但Ⅲ类成员却在分子的胞浆区域中具有两个重复的假定催化区。Ⅲ类包括白细胞共同抗原（LCA）（Ralph，S.J.，EMBO  J.，6∶1251-1257，1987;Charbonneau，H.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.85∶7182-7186，1988）、LCA相关蛋白质，LAR（Streuli，M.et  al.，J.Exp.Med.，168∶1523-1530，1988）、LAR相关果蝇属蛋白质DLAR和DPTP（Streuli，M.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86∶8698-8702，1989）和人（Krueger，N.X.，Streuli，M.and  Saito，H.，EMBO  J.9∶3241-3252，1990;Kaplan，R.et  al.，Proc，Natl.Acad.Sci.，87∶7000-7004，1990）及小鼠（Sap，J.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87∶6112-6116，1990;Mathews，R.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87∶4444-4448，1990）蛋白质HPTPα、HPTPγ、HPTPδ、HPTPξ。
在不同的磷酸酶的催化区域之间和同一PTP酶内的重复的区域1和2之间有着显著的氨基酸同源性和进化的保守性。具体地说，氨基酸顺序VHCSXG（一字母代码，X优先代表A或D）似乎是酶之活性位点的一个部分（Streuli，M.，Krueger，N.X.，Thai，T.，Tang，M.and  Saito，H.，EMBOJ.，9∶2399-2407，1990）。
n个PTP酶具有由粘连蛋白型（FN）单独重复顺序（HPTPβ）或由免疫球蛋白区域和FN共同重复顺序（LAR、DLAR和DPTP）组成的粘附分子样细胞外区域，此提示它们可能将细胞-细胞识别与酪氨酸磷酸化作用相偶联。确实已显示细胞生长的密度依赖性抑制作用包括了受调节的酪氨酸磷酸酶活性升高，从而支持了这种活性可能在控制细胞生长、分化和肿瘤生成中起作用的概念。
从酪氨酸磷酸酶在细胞控制机制中的作用即作为在新发现的跨膜信号传递机制中作为潜在抗致癌基因剂和效应物来看，我们已对可能参予这些过程中的其他磷酸酶进行了研究。
因此，本发明提供了哺乳动物受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP酶），其细胞外区域包括Arg-Gly-Asp顺序及其功能衍生物。
这样的PTP酶的例子是Ⅱ类PTP酶。Ⅱ类PTP酶可能是具有跨膜拓扑结构的新的PTP酶PTP35。已分离了两种不同形式的PTP35，它们具有共同的结构特征并且只是在其N末端顺序上有所差异。重要的是，PTP35的细胞外区域与迄今描述的任何其他受体型磷酸酶无关，并且含有Arg-Gly-Asp（RGD）顺序。PTP35的表达似乎在脑内特别有意义，提示它可能在控制中枢神经系统代谢和分化中具有重要作用。此外，当在培养成纤维细胞中研究PTP35时，它似乎参予了控制细胞增殖。还有，磷酸酶PTP35之mRNA的水平似乎可因在加有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）或其他细胞分裂素的培养物中刺激3T3细胞而特异性地增加。
通过使用重组DNA方法，本发明已鉴定了新的受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶。在DNA水平上并基于推测的蛋白质之氨基酸结构进行分析，表明此蛋白质缺少重复催化区，属于Ⅱ类蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP酶），故代表了这一特殊类别之磷酸酶的新的例子。
本文描述的不同形式的PTP35分享共同的特征。基于推测的氨基酸顺序，可以识别出各种不同的功能性区域。基于疏水段（见图1a和1b）的存在，将PTP35分类为包含细胞外区域N末端至疏水段，和细胞内区域C末端至疏水段的跨膜蛋白质。迄今已分离的不同形式的PTP35中推测的蛋白质的细胞内部是完全相同的，其由表现出与先前描述的跨膜磷酸酶的细胞内催化区有显著同源性的独特区域组成。已有人提出，保守的氨基酸顺序IIVHCSDGAGRTG（单字母代码）是磷酸酶催化区的一部分，并且也存在于PTP35中（见图1a和1b）。最大程序的同源性见于小鼠LRPA（Matthews，R.J.，Cahir，E.D.and  Thomas，M，L.，Proc，Natl，Acad.Sci.，87∶4444-4448，1990;Sap。J.et  al，Proc，Natl.Acad.Sci.，87∶6112-6116，1990）和小鼠CD45（Charbonneau，H.，Tonks，N.，Walsh，K.and  Fischer，E.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85∶7182-7186，1988）酪氨酸磷酸酶中。
相反，如Swissprot数据库显示的，已知的细胞外区域顺序则没有显著的同源性。也许细胞外区域的最令人感兴趣的特征是存在Arg-Gly-Asp（RGD）顺序，该顺序是参予细胞识别和粘附机制的许多蛋白质，包括粘连蛋白、胞外粘连蛋白（Vitrone-ctin）、血纤维蛋白原、Von  Willebrand因子和蛋白质GPIIⅢa所共有的。上述各蛋白质的RGD顺序是由负责细胞固着相关过程的，称为整合蛋白（integrin）的结构上相关受体之家族中的至少1个成员识别的。PTP35是发现有RGD顺序的第一个酪氨酸磷酸酶蛋白质，所说的顺序可能具有重要的生物学作用。PTP35之细胞外区域的其他相关特征包括存在2个潜在的N连接的糖基化位点。
因此本发明包括称为PTP35的新的哺乳动物受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP酶），其细胞外区域包括一个Arg-Gly-Asp顺序，或其任何功能衍生物。就其细胞外区域来说，PTP35与其他已知的PTP酶间没有明显的同源性。图1a和1b中显示了两种形式的PTP35的顺序。
本发明的蛋白质可以是天然来源的，或者也可能是以化学或重组方法制备的。如果分子是天然来源的，可用标准蛋白质纯化技术以含有PTP酶的细胞、组织或液体中制得基本上没有其他与PTP酶存在天然联系之蛋白质的制剂。
纯化技术中有代表性的例子是亲和纯化技术，其中使用能与PTP酶的酶促区域或各自受体区域结合的固相底物或配体。另外，亦可结合使用硫酸铵沉淀、分子筛层析及离子交换层析等几种标准方法完成纯化步骤。
可用生物化学方法从各种组织和细胞系中纯化本发明的PTP酶。其中优选的材料是小鼠脑和NIH-3T3细胞系。
本发明包括含有与载体多肽融合之本发明PTP酶或其衍生物的融合蛋白质。
如前所述，按上述方法产生的蛋白质基本上没有其他蛋白质。“基本上没有其他蛋白质”是指该蛋白质中至少90%，甚至至少95%不含其他蛋白质。该蛋白质纯度最好在98%或98%以上。所说的“其他蛋白质”包括在细胞中与PTP酶有天然联系的蛋白质及存在于重组宿主细胞内的蛋白质。
“功能衍生物”是指保留PTP酶之至少一部分功能如磷酸酶酶促活性或使细胞外区域结合配体之功能的PTP酶如PTP35的任何片段、变体、类似物或化学衍生物。功能性衍生物基本上是由细胞内或细胞外区域，或图1中核苷酸279至2874编码的氨基酸顺序组成的。
“片段”是指分子的任何小部分，即较短的肽。
“变体”是指基本上相似于完整肽或其片段的分子。天然变体包括除小鼠以外的不同种哺乳动物（即已分离出PTP35的其他动物源）中的PTP35的同系物。可使用本领域已知的方法直接化学合成或在编码PTP酶的DNA中插入适当的突变以得到PTP酶的合成变体如PTP35。例如，如此得到的变体包括残基的缺失、插入或取代，以及延伸产物。
变体可至少50%，至少70%，至少90%，至少95%，或至少98%同源于PTP酶如PTP35或其片段。缺失、插入、延伸或取代可以是N末端、C末端或内部顺序且包括1个或多个氨基酸，如1个、2个、3个、5个、10个、20个、30个或40个氨基酸。延伸可以是较长的并可构成载体蛋白质。取代通常是保守取代，其中各被取代氨基酸是由生物学上相似的氨基酸取代的。例如，各氨基酸可被有相似大小、疏水性、电荷和/或化学官能团的氨基酸取代。侯选取代是：
A取代G或反之;
V被A、L或G取代;
K被R取代;
S被T取代或反之;
E取代D或反之;以及
Q被N取代或反之。
“类似物”是指基本上相似于完整分子或其片段的非天然分子。
PTP酶的“化学衍生物”如PTP35含有附加的不是肽之正常部分的化学部分。化学修饰的例子包括肽的共价修饰，用双官能试剂衍生及C末端羧基基团的酰胺化。如此洗生的部分可改善PTP酶的物理-化学特性或生物学活性。
本发明的特别优选的实施方案是基本上具有如图1a或1b中所示氨基酸顺序的蛋白质。
本发明的另一个实施方案是基本上由编码PTP酶或其功能衍生物的核苷酸顺序组成的DNA分子。DNA顺序可以是CDNA或基因组DNA形式的。适宜的顺序是PTP35或其衍生物的顺序。
可通过各种本领域中专家熟知的方法和Maniatis  et  al.，Molecular  Cloning∶A  Laboratory  Manual  Second  Edition，Cold  Spring  Harbor  Press，Cold  Spring  Harbour  NY（1989）中描述的方法生产本发明的重组DNA分子。
可用互补于PTP酶家族之保守区域的单链全简并寡核苷酸探针来筛选由能够表达PTP酶基因的细胞系衍生的DNA、cDNA或RNA制剂。优选的探针应是针对编码本发明PTP酶之至少5个氨基酸残基的核苷酸顺序的。已按照这一技术或相似技术克隆了各种基因，例如人醛脱氢酶（Hm，L.C.，et  al.，Proc。Natl.Acad.Sci.USA  82：3771-3775，1985），纤维粘连蛋白（fibronectin）（Suzuki，S.et  al.，EMBO  J.4∶2519-2524，1985）、组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（Pennico，D.et al.，Nature  301∶214-221，1983）。
在使用选择性扩增技术后，即使是很小量的得自某个体的DNA也能用这些方法进行克隆。长时间以来便已了解了能够扩增纯化之核酸片段的重组DNA方法学。
这些方法学一般包括将核酸片段引入DNA或RNA载体中，克隆扩增该载体，并回收已扩增的核酸片段。这些方法学的例子可参见Cohen等人的美国专利No.4，237，224和Maniatis等人的上述文献（已列为本文参考文献）。
最近已描述了能够增加上述所需核酸分子之浓度的体外酶学方法。该方法被称为“聚合酶链反应”或“PCR”（Mullis，K.et  al，Cold  Spring  Harbor  Symp，Ouant.Biol.51∶263-273，1986;Erlich，H.et  al，欧州专利EP50，424;EP84，796，EP258，017，EP237，362;Mullis，K.，EP201，184;Mullis，K.et  al.，美国专利US4，683，202;Erlich，H.美国专利US4，582，788和Saiki，R.et  al，US4，683，194）。
聚合酶链反应提供了即使以前特定核酸顺序未被纯化并且只以单一拷贝存在于特定样品中时亦可选择性地增加该顺序之浓度的方法。该方法可用于扩增单股或双股DNA。该方法实质包括使用两个寡核苷酸探针作为引物，以对所需核酸分子进行模板依赖性聚合酶介导的复制。
在另一实施方案中，本发明提供了基本上由编码如上限定之PTP35的功能衍生物的核苷酸顺序组成的DNA分子。DNA分子可编码本发明PTP酶的变体。这样的DNA分子是可至少40%，至少60%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%同源于图1中所示顺序的分子或其片段。DNA分子可编码具有上述缺失、插入、延伸或取代的本发明的PTP酶。
可用针对编码多肽分子之DNA中核苷酸的位点针对性诱变方法（如参见Adelman  et  al.，DNA2∶183，1983）制备这样的DNA分子，从而产生编码衍生物的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。
为了表达本发明的天然PTP酶或其功能衍生物，必须在适当的表达载体中克隆编码不同顺序的各DNA。表达载体是由于其中存在转录和转译控制顺序而能够表达已克隆到其中的DNA分子并因而能产生多肽的载体。载体可以是质粒或病毒载体。
将表达载体引入适当宿主细胞后即可表达已克隆的顺序。如果使用原核表达载体，则适宜的宿主细胞应是任何能表达已克隆之顺序的原核细胞，如大肠杆菌细胞。同样，如果使用真核表达载体，则适宜的宿主细胞应是任何能表达已克隆之顺序的真核细胞。可使用酵母宿主如酿酒酵母细胞。另外，可使用昆虫细胞，在这种情况下，杆状病毒表达系统是适用的。另一个可选用的宿主是哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵细胞。
可按常规技术使编码本发明PTP酶或其功能衍生物的DNA顺序与载体DNA重组，包括造成适于连接的平头末端或交错终止的末端、进行限制性酶消化以提供适当的末端、必要时充填粘性末端、用碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，并用适当的连接酶进行连接。可用Maniatis等人（文献同上）公开的或本领域已知的技术进行这些操作。
如上所述，适当的表达载体含有能指导和控制基因在适当宿主中表达的转录和转译调节信息。这些顺序被可操作地连接到待表达的基因上，并包括启动子（指导RNA转录开始）、Shine-Dalgarno顺序、加帽顺序、CAAT顺序等（均参予转录和转译的起始过程）。
本发明的启动子顺序可以是原核、真核或病毒的。适当的原核顺序的例子包括λ噬菌体的PR和PL启动子（The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1973;Lambcda Ⅱ，Hendrix，R.W。，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1980）、大肠杆菌的trp、recA、热休克和1acZ启动子以及SV40早期启动子（Benoist，C。et al。，Nature 290∶304-310，1981）。
就Shine-Dalgarno顺序来说，优选的适用调节顺序的例子是以噬菌体MS-2之复制酶基因和噬菌体λ之基因cⅡ的Shine-Dalgarno为代表的。Shine-Dalgarno顺序可直接接在编码PTP35的DNA之后并导致成熟PTP35蛋白质的表达。
另外，编码PTP35或其遗传变体的DNA可以以编码载体肽顺序的DNA顺序为先导。在这种情况下，可产生其中PTP35的N末端与载体肽相融合的融合蛋白质，所说的载体肽可帮助提高蛋白质表达水平和细胞内稳定性，并提供简单的纯化手段。优选的载体肽包括葡萄球菌蛋白A的一个或多个IgG结合区。包含蛋白A之IgG结合区的融合蛋白质很容易用亲和层析法（如在IgG偶联的Sepharose上）纯化成均质物。编码原核生物酶如肠激酶、因子X或溶胶原酶（Procollagenase）之识别位点的DNA顺序可直接接在编码PTP35或其变体之DNA顺序的前面，以允许裂解融合蛋白质而得到成熟的PTP35蛋白质。
另外，适用的表达载体还包含适当的允许筛选被转化之宿主细胞的标志。这样的标志一般是抗生素抗性基因，其可赋予被转化宿主以在含有基因赋予抗性之抗生素的选择性培养基上生长的能力。
使用Maniatis等人（文献同上）所述的本领域专家熟知的技术来转化所选择的宿主。
因此本发明的再一个实施方案是涉及含有编码本发明PTP酶或其功能衍生物之DNA顺序的适当表达载体。编码PTP35或其变体的DNA顺序可以以编码载体肽的顺序为先导，以得到融合蛋白质。
本发明的再一个实施方案是涉及用所说的表达载体转化的，并能在适当的培养条件下产生本发明之PTP酶或其功能衍生物的原核或真核宿主细胞。
本发明还涉及制备本发明PTP酶蛋白质或其功能衍生物的方法，包括
（ⅰ）提供处于使PTP酶或其功能衍生物得以表达之条件下的适当的宿主，和
（ⅱ）纯化如此得到的PTP酶或其功能衍生物。
按下述方法适当地制备宿主：
（a）分离基本上由编码PTP酶或其功能衍生物的核苷酸顺序组成的DNA分子;
（b）将所说的DNA分子插入适当的表达载体中;和
（c）用所说的表达载体转化适当的宿主。
本发明的PTP酶和其功能衍生物可用于试验能提高或抑制磷酸酶活性的化合物的方法中。本发明还可用于诊断涉及本发明PTP酶的疾病。
可在体外系统中试验某被试化合物修饰磷酸酶活性的能力，其中将试验化合物加到纯化的PTP酶蛋白质或其酶促活性衍生物中，使用本领域技术人员已知的标准酶学方法检测对酶活性的影响。
另外，可使用活的或固定的细胞，或者使用得自活的或固定的细胞的膜部分，在全细胞制剂中检测化合物对PTP酶活性的作用。该方法可用于筛选通过蛋白质的细胞外受体部分起作用的化合物，以及直接作用于蛋白质之酶促部分的化合物。将试验化合物与大量表达本发明PTP酶的细胞如NIH-3T3细胞，或与由之得到的膜制剂一起保温。
然后使用本领域已知的方法（Honegger，A.M.et  al.，Cell  50∶199-209，1987;Margolis，B.et  al.，Cell  57∶1101-1107，1989）检测细胞磷酸酪氨酸的量。将结果与在没有试验化合物，或有或没有已知的R-PTP酶活化剂条件下获得的结果相比较。在这些研究中，也可在酪氨酸激酶活化剂存在下检测试验化合物的作用。
刺激PTP酶活性的化合物将会净减少磷酸酪氨酸的量，而抑制PTP酶活性的化合物则导致磷酸酪氨酸量的净增加。
就作为酪氨酸激酶的生长因子受体如表皮生长因子（EGF）和血小板衍生的生长因子（PDGF）的受体来说，酪氨酸磷酸化作用是与细胞生长和致癌基因转化相联系的。活化PTP酶以导致其去磷酸化，将作为反向调节机制以阻止或抑制细胞生长，并可作为内源性调节机制对抗肿瘤。因此，该受体/酶系统的突变或失调可增进对肿瘤的易感性。
胰岛素受体也是一种酪氨酸激酶，并且酪氨酸在携带胰岛素受体之细胞内的磷酸化作用是与正常生理功能联系在一起的。与细胞生长和肿瘤生长的情况相反，活化PTP酶将抵消胰岛素的作用。亚正常PTP酶水平或酶促活性可消除正常的反向调节机制。
虽然如此，但也许更为重要的是，可预料如果PTP酶活性过高或受到不适当的活化，则将会抑制或完全阻止胰岛素对细胞的作用，而导致糖尿病（或胰岛素抗性改变）。
因此，对糖尿病的易感性可能与PTP酶失调有关联。另外，将胰岛细胞中表达的酪氨酸磷酸酶识别为自家抗原，可作为由自家免疫机制引起之细胞破坏的后果，导致糖尿病。在这种情况下，可使用这些磷酸酶的重组细胞外区域阻断自家抗体与胰岛细胞表面上表达之磷酸酶的结合，从而提供直接的治疗效果。
因此，本发明的检测与细胞或组织相关联之PTP酶活性量的方法，可以作为鉴定机体对于与细胞磷酸酪氨酸代谢改变相关联之肿瘤、糖尿病、或其他疾病的易感性的方法。从在脑中特别是在分化中枢神经系统细胞中特异性表达PTP35的角度来看，PTP35活性的调节作用可能在神经元细胞分化和存活中是很重要的。因为已报导脑中的胰岛素受体分布与酪氨酸残基磷酸化的蛋白质的定位相对应，所以在脑中特异性表达的酪氨酸磷酸酶如PTP35的作用，可能在调节该组织内胰岛素受体酪氨酸激酶中有着重要意义。
基于上述考虑，本发明一个实施方案是关于鉴定能够刺激或抑制本发明蛋白质之酶促活性之化合物的方法，其包括：
（a）化合物与纯形式的，或膜制剂形式的，或呈活的或固定化全细胞形式的蛋白质接触;
（b）将步骤（a）中的混合物保温足够时间;
（c）检测蛋白质的酶促活性;
（d）将此酶促活性与在不加化合物保温时测得的蛋白质的酶促活性相比较，从而确定化合物是否可刺激或抑制该活性。
本发明包括能够与本发明的PTP酶或其衍生物结合的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。该抗体可用于诊断涉及本发明PTP酶的疾病。
生产单克隆和多克隆抗体的方法是已知的。生产多克隆抗体的方法包括用本发明的PTP酶或其衍生物免疫适当的宿主动物如实验动物，并从免疫血清中分离免疫球蛋白。因此，可用PTP酶或衍生物接种动物，然后从动物体内采血并纯化IgG部分。生产单克隆抗体的方法包括使产生所需抗体的细胞永久存活。可使被接种之实验动物的脾细胞与肿瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞（Kohler  and  Milstein，Nature  256∶495-497，1975）。
可用常规方法选择能产生所需抗体的永久存活的细胞。可使杂交瘤生长于培养物中或经腹腔注射到宿主体内以形成腹水或注入同种异型宿主或免疫感受宿主的血流中。可在体外免疫人淋巴细胞，然后用Epstein-Barr病毒转化淋巴细胞以制备人抗体。
为生产单克隆和多克隆抗体，所用实验动物可以是羊、兔、大鼠或小鼠。如必要时，可将本发明的PTP酶或其衍生物作为结合物给药，其中将PTP酶或衍生物例如通过其氨基酸残基之一的侧链偶联到适当的载体多肽上。载体分子一般是生理学上可接受的载体。可分离并根据需要纯化所得到的抗体。
本发明包括检测试验样品中本发明PTP酶或衍生物的方法，该方法包括使试验样品与本发明的抗体接触，并检测与PTP酶或其衍生物结合之抗体的量。该方法可用于诊断与本发明的PTP酶有关的疾病。
可使用ELISA（酶联免疫检测法）方法，如非竞争性ELISA进行检测。一般说来，ELISA方法包括下述步骤：
（ⅰ）将根据本发明的未标记的抗体固定于固相载体上，
（ⅱ）加入含有待检PTP酶或其衍生物的试验样品，以使PTP酶或其衍生物被未标记的抗体俘获，
（ⅲ）加入已标记的根据本发明的抗体，和
（ⅳ）检测已结合的被标记抗体的量。
适当的抗体标记物的例子包括生物素（其可用与过氧化物酶结合的抗生物素蛋白检测）和碱性磷酸酶。
可用Western吸印法检测本发明的PTP酶或衍生物。此方法可包括下列步骤：
（ⅰ）对含有PTP酶或其衍生物的试验样品进行凝胶电泳分离，
（ⅱ）以吸印法将在凝胶中分离的RNA分子转移到固相载体（如硝化纤维素载体）上，和
（ⅲ）使已被标记的根据本发明的抗体与PTP酶或其衍生物结合。
本发明包括检测试验样品中编码本发明之PTP酶或其衍生物的mRNA的方法，该方法包括使存在于试验样品中的mRNA与基本上由图1中所示顺序组成的DNA探针杂交，并检测所得DNA∶mRNA杂交体的量。
亦可用Northern吸印法检测mRNA，该方法包括下列步骤：
（ⅰ）对含有编码本发明PTP酶或其衍生物之mRNA的试验样品进行凝胶电泳分离，
（ⅱ）将在凝胶中分离的RNA分子吸印转移到固相载体（如硝化纤维素载体）上，
（ⅲ）使DNA探针与mRNA杂交，和
（ⅳ）检测已杂交之DNA探针的量。
在了解了本发明的总的特征后，可通过参考下列实施例更容易地理解本发明。下述实施例只是举例说明而不是限制本发明。
图1：PTP35的顺序。其中显示了cDNA克隆PTP35，11（图1a）和PTPT35，12（图1b）的顺序，连同主要开放读码的翻译。DNA顺序：方框内是假定的ATG（克隆11）和CTG（克隆12）起始密码子，以及TGA终止密码子。蛋白质顺序：RGD特征，方框内是假定的跨膜肽和酪氨酸磷酸酶相符主顺序。
图2，A框：对不同小鼠组织中PTP35的Northern印迹分析。使用质粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探针，对20μg小鼠组织的总RNA进行Northern印迹分析。泳道1，肝;泳道2，脾;泳道3，心;泳道4，脑。标出了28S和18S核糖体RNA的位置。示出RNA转移印迹前凝胶的照片，证明各泳道有相等的上样量。B框：在大鼠脑中表达PTP35。使用质粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探针，对10μg从培养2天（泳道1）和8天（泳道2）的大鼠小脑颗粒神经元（cerebellum  granules  neurons）得到总RNA进行Northern印迹分析。标出了28S和18S核糖体RNA的位置。经使同一滤膜再次与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）探针杂交，证实各泳道有相等的上样品。
图3，A框：Swiss NIH 3T3细胞的生长曲线。在添加10%FCS的DMEM培养基中以103细胞/Cm2的密度接种3T3细胞并培养之。每天用胰酶消化细胞单层并计数。B框：细胞生长期间PTP35 mRNA水平的时间过程。使用质粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探针，以Northern印迹杂交法分析20μg从每天收获的细胞中制得的总RNA。标出了28S和18S核糖体RNA的位置。经再次与肌动蛋白探针杂交进一步证实所有泳道均有同样的上样量。
图4，A框：bFGF对3T3细胞中PTP35mRNA之诱导作用的动力学。不用或用30ng/mlbFGF（+）处理细胞，在用bFGF处理后不同时间从细胞中制备总RNA并进行Northern印迹杂交分析。在加入bFGF后24小时最大程度地诱导了PTP35mRNA。经再次与肌动蛋白探针杂交，进一步证实所有泳道均有相同的上样量。示出了28S和18S核糖体RNA的位置。B框：PTP35  mRNA诱导的特异性。处理后24小时对总RNA进行Northern印迹分析。泳道1，对照;泳道2，加30ng/mlbFGF;泳道3，加30ng/ml  bFGF和10μg/ml放线菌酮;泳道4，加10μg/ml放线菌酮;泳道5，加10ng/ml  PDGF;泳道6，加10ng/ml  PDGF和10μg/ml放线菌酮。经再次与肌动蛋白探针杂交，进一步证明所有泳道有相等的上样量。
图5，PTP35细胞外区域的表达。显示用pRI  T33（泳道1）和pRIT33-PTP35XC转化的（泳道2）或未转化的（泳道3）HB101细胞之总细胞提取物的10%SDS-PAGE分析结果。标出了相当于蛋白A（约33KDa）和蛋白A-PTP35XC（约75KDa）之带的位置。
图6，PTP35细胞内区域的表达。显示PTP35细胞内区域之表达和纯化的10%SDS-PAGE。将超声处理后的可溶性细胞提取物与谷胱甘肽琼脂糖树脂一起保温，彻底清洗后与凝血酶一起保温。在从树脂上释放后，收集培养基中的基本上纯的可溶性PTP35细胞内区域。泳道1，分子量标志物;泳道2，可溶性细胞提取物，泳道3，洗涤培养基;泳道4，加入凝血酶后的等分树脂样品;泳道5，纯的可溶性PTP35细胞内区域。箭头指示GST-PTP35融合体（泳道2）或成熟的PTP35细胞内区域（泳道5）。
实施例1
分离和分析小鼠PTP35cDNA克隆
聚合酶链反应扩增并鉴定PTP35克隆
按常规方法（Maniatis，T.，Frisch，E.F.and  Sambrook，J.，Molecular  Cloning.A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，NY，1989）从活跃生长的Swiss3T3成纤维细胞（ATCCCCL92）中制备总RNA。使用AMV逆转录酶（Boehringer  Mannheim）以10μg总RNA合成第一股cDNA，并使用2个编码保守磷酸酶顺序的简并的引物，以聚合酶链反应（PCR）方法扩增之。包含SalI限制性位点的有意义引物1（5′AAG  CTT  CTG  CAG  GTC  GAC  TTT/CTGG  GAA/G  ATG  GT/A/C/T/G  TGG  CA  3′）之后是编码保守的氨基酸FWEMVWE的简并序列。包含互补于保守之氨基酸VHCSAGA的互补引物4（5′CGA  ATT  CGG  TAC  CGG  ATC  CTG  CCC  CGG  CAC  TGC  AGT  GCA  C  3′）之后是EcoRI限制性位点。使用Taq聚合酶（Perkin-Elmer），以两个引物扩增来自生长之3T3细胞的第一股cDNA链。退火温度为55℃，且聚合反应于72℃下进行。使用Perkin-Elmer热循环器进行40次扩增反应。
用SalI/EcoRI切割有预定的约360bp大小的扩增片段，并再克隆利用同样酶切割的质粒PTZ19R（购自Pharmacia;参见Protein  Engineering  1∶67，1986和Proc.Natl.Acad.Sci.85：4832，1988）中。使用序列酶（Sequenase）（United  States  Biochemicals）直接对双股DNA分析不同重组质粒的序列。按标准序列制备质粒PTZ-PTP35的DNA并用SalI和EloRI酶切割之。用已描述的凝胶电泳和电洗脱法（Maniatis，T.，Frisch，E.F.and  Sambrook，J.：Molecular  Cloning.A  laboratory  manual.Cold  Spring  Harbour  Laboratory，Cold  Spring  Harbour，NY，1989）纯化相当于磷酸酶DNA插入段的360bp片段。
文库筛选
为了得到PTP35的完整DNA顺序，在5×SSC、5×Denhardts、0.1%SDS、250mg/ml鲑精子DNA中于65℃杂交过夜，以高严紧度筛选NIHSwiss 3T3成纤维细胞cDNAλZapⅡ文库（Stratagene，LaJolla，USA）。用已按随机引导方法进行32P标记的得自质粒pTZ-PTP35的360bp SalI/EcoRI片段作为探针（2×106cpm/ml）。于65℃在1×SSC、0.1%SDS中洗涤。从2×105个克隆中选出7个阳性克隆并进一步分析其特性。按制造商（Stratagene，La Jolla，USA）所述方法，从选择的克隆上切掉重组pBluescript SK-质粒的DNA并进行EcoRI消化，以证实其中的插入段的存在和大小。使用二脱氧核苷酸链终止法（Sequenase，United States Biochemical;Proc.Natl.Acad.Sci.74∶5463-5476，1977）和通用的正向和反向引物直接测定不同克隆之双股DNA的顺序。根据限制性酶切图及顺序交迭分析结果，确定重组质粒中EcoRI片段的相对次序及定向。使用内部顺序分析引物以两个方向测定所有区域的顺序。发现所有已定出顺序的克隆均含有同样顺序的部分。还进一步证实了用PCR所获得之片段的顺序。图1a和1b中示出了两个最长的克隆PTP35，11和PTP35，12的顺序。
分析克隆PTP35，11的顺序
使用Geneworks程序（Intelligenetics，CA）进行核苷酸顺序分析。转译cDNA克隆PTP35，11中所含有的顺序后，发现存在有推测在核苷酸505处转译起始的编码790个氨基酸的主要开放读码（在核苷酸124处，381核苷酸上游存在有码内终止密码子）。基于在氨基酸388和408之间存在有疏水段，而将此蛋白质分类为跨膜蛋白质。推测的蛋白质细胞内部分由表现与先前描述的跨膜磷酸酶的细胞内催化区有显著同源性的独特区域组成。已提示作为磷酸酶催化位点之一部分的保守序列VHCSDG存在于PTP35中。因为没有催化区的重复出现，所以蛋白质PTP35属于Ⅱ类酪氨酸磷酸酶。
分析克隆PTP35，12的顺序
使用Geneworks程序（Intelligenetics，CA）分析克隆PTP35，12的顺序。发现该顺序相当于PTP35之克隆11从核苷酸279至末端的顺序，但可能由于可替代的拼接而使两顺序在其5′末端有所不同。
转译包含于cDNA克隆PTP35，12中的顺序后，发现存在一个编码961个氨基酸的主要开放读码，推测转译起始于核苷酸157处的CTG密码子（在核苷酸99处，58核苷酸上游存在一个码内终止密码子）。基于在氨基酸559和579之间存在有疏水段，而将此蛋白质分类为跨膜蛋白质。推测的细胞外区域编码558个氨基酸并包含作为真核细胞分泌信号顺序的短的17氨基酸疏水顺序，且后者可由计算机识别出来。其后将在氨基酸18处开始克隆PTP35，12中编码的成熟PTP35分子。相当于克隆PTP35，11中编码之分子的推测的细胞内部分由表现出与先前描述的跨膜磷酸酶之细胞内催化区有显著同源性的独特区域组成。氨基酸886至899间的顺序IIVHCSDGAGRTG与PTP酶活性的同感顺序相匹配。
实施例Ⅱ
分析PTP35  mRNA的表达
组织中的PTP35  mRNA分布
每泳道使用20μgRNA，按照标准程序（Maniatis，T.et al.，文献同上）对得自小鼠脾、心、脑和肝细胞的总RNA（购自Clonetech，CA）进行Northern印迹分析。使用文库筛选中所用的SalI/EcoRI片段作探针（2×106cpm/ml）在50%甲酰胺、5×SSC、1×Denhardt′s，0.1%SDS和250mg/ml鲑精子DNA中于42℃杂交过夜。42℃下，在1×SSC、0.1%SDS中洗涤。高严紧度洗涤并没有显著地影响杂交结果。
Northern分析（图2，A框）揭示了小鼠组织内，特别是脑组织内PTP35表达的高特异性特征。在该组织中，除了以高水平表达约3200bp的mRNA外，还以较低水平表达约1400bp的较小的第二种mRNA。
分析PTP35mRNA调节作用
基于PTP35在小鼠脑内的特异性表达，研究大鼠小脑颗粒神经元中PTP35mRNA的表达。按已述方法（A.Frandsenand A.Schousboe：Int.J.of Dev.Neurosci，8（2）：209-216，1990）从大鼠脑组织中分离初级细胞。在35mm平皿中以3×106个细胞/平皿接种细胞并培养8天。在第2天（分化差）和第8天（分化状态好）收获细胞，分离总RNA并按上述方法（Maniatis，T.et al.，文献同上）进行Northern印迹杂交。使用通常的杂交和洗涤条件（参见上文）。用SalI/EcoRI PTP35片段作为探针（2×106cpm/ml）。如图2B所示，大鼠小脑颗粒神经元可以高水平表达如小鼠脑组织中表达的同样大小（约3200bp）的PTP35mRNA。在分化状态良好、长出伸展的轴突并且在细胞与细胞有相互连接的细胞中表达水平较高，此提示PTP35与大鼠小脑颗粒神经元分化和存活有关。分析了生长的NIH3T3细胞中对PTP35mRNA表达的调节作用。在添加10%胎牛血清（FCS）（Gibco）的DMEM培养基（Gibco）中以低密度（103个细胞/cm2）接种NIH3T3细胞并培养7天。每隔一天换一次培养基。每天从两个平皿中胰酶处理后收获细胞样品并计数。图3，A框显示了3T3细胞的生长曲线。同时每天收获细胞并制备总RNA，然后按已述方法（Maniatis，T.et al.，文献同上）使用每泳道20μgRNA进行Northern印迹分析。使用SalI/EcoRI PTP35片段作探针（2×106cpm/ml），在标准条件（见上文所述）下进行杂交。图3，B框内显示了Northern印迹杂交的结果。其中可看到在小鼠和大鼠脑中观察到的同样大小（约3200bp）有优势信号的mRNA。
分析从不同培养天数之细胞制得的mRNA的稳定态水平，表明PTP35mRNA表达与细胞生长有着直接的关联。在生长活跃的细胞中观察到最大mRNA水平，而在合会的、静止期3T3细胞上则可见表达水平降低以至很少或不表达，这表明PTP35参予对细胞生长的调节。
检查碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）刺激对NIH3T3细胞中PTP35mRNA水平的影响。将细胞以半会合浓度（3×104个细胞/cm2）接种在DMEM+10%FCS中，并在DMEM培养基+0.4%FCS中保温24小时。然后加入30ng/mlbFGF并定时收获经如此处理的细胞和未处理的对照组细胞。制备总RNA并按已述方法（Maniatis，T.et al.，文献同上）使用PTP35 SalI/EcoRI片段作探针进行Northern印迹分析。杂交条件同样是一般常用的。如图4所示，bFGF刺激后PTP35mRNA稳定态水平提高，并在24小时后达到峰值。当于10μg/ml放线菌酮存在下进行bFGF刺激时，这一作用没有受到抑制。在用血小板衍生的生长因子（PDGF）和血清刺激后，也观察到同样的作用。
实施Ⅲ
在原核细胞中表达PTP35
载体pRIT33（可得自Pharmacia;参见Methods  in  Enzy  mology  185∶144-161，1990）是质粒pRIT2的衍生物，并且是为了在诱导λPr启动子后在大肠杆菌中温度可诱导性表达细胞内杂交蛋白质而设计的。另外，可用1mMIPTG诱导已插入到λPr启动子上游lacUV5启动子而获得表达。该构建体含有处于λPr启动子控制下的葡萄球菌蛋白A的IgG结合区。多克隆位点有利于在蛋白A的3′侧插入外来基因。在蛋白A编码顺序的末端存在有编码因子X之识别位点的顺序。蛋白A转录终止顺序被插入到紧接多克隆位点的下游处。为了得到蛋白A-PTP35融合体蛋白质，将编码PTP35蛋白质的顺序插入到质粒pRIT33中。从质粒PTP35，4（其为筛选实施例1中所述文库后分离的一个克隆）中重新得到PTP35顺序。PTP35，4相当于含有以下述方式定向之PTP35编码顺序的质粒pB luescript SK-：其5′末端的前面是多聚接头的BamHI位点，且其3′末端之后是多聚接头的SalI位点。从质粒PTP35，4中分离一个包含PTP35编码顺序的均3000bp的StuI-SalI片段（图1b，克隆12的核苷酸590至3561），并再克隆到已用SmaI和SalI切割的质粒pRIT33中。将SmaI和StuI平头连接在一起，从而使PTP35顺序直接接在pRIT33中的因子X识别顺序之后，而得以在码内有适当的定位。所得质粒pRIT33-PTP35携带一个编码120KDa融合体蛋白质的开放读码，所说的融合体蛋白质包含N末端的蛋白A，其后是由原核细胞裂解所需之特定顺序分隔开的PTP35蛋白质。
此外，亦可在大肠杆菌中作为蛋白A融合蛋白质分别表达包含397个氨基酸的PTP35的细胞外区域部分。为了分离编码该区域的顺序，用NcoI切割质粒PTP35，4并用Klenow  DNA聚合酶充填突出的末端以得到平头末端。然后用StuI切割该质粒并将带有平头末端的1200bp片段（相当于克隆PTP35，12的核苷酸590至1804）再克隆到用SmaI切割并去磷酸化的质粒pRIT33中。所得质粒pRIT33-PTP35XC携带一个编码约75KD蛋白质的开放读码，所说的蛋白质包括蛋白A和其后的由原核裂解特异性顺序分开的PTP35细胞外区域氨基酸。
在用包含λPR启动子之热敏感性阻遏物（Nilsson，B.and  Abrahmsen，L.，Methods  in  Enzymology  185∶144-161，1990）的称为pRITc1857的相容性质粒共转化的HB101大肠杆菌细胞（J.Mol.Biol.41∶454，1969）中分析蛋白A-PTP35XC融合体蛋白质的表达情况。
将温度从30℃改变到42℃（热休克）以使阻遏物失活并从而诱导启动子开始转录。另外亦可在用1mM  IPTG诱导lacUV5启动子后获得表达。因为该启动子从不会完全静止，所以在30℃下长时间培养被转化的克隆也可高水平地表达蛋白质。图5显示了在30℃下生长3天后所达到的融合蛋白质表达水平。当在这些条件下生长时，蛋白A-PTP35XC融合体蛋白质的量约占总细胞蛋白质的20%。如所期望的，杂交蛋白质在SDS-PAGE上的表观分子量为75KD。
实施例Ⅳ
在原核细胞中表达PTP35磷酸酶区域
为了在大肠杆菌中表达重组蛋白质，已设计了pGEX系列的质粒（可购自Pharmacia;参见Smith，D.and  Kevin，J.（1988）Gene  67∶31-40），其中所说的重组蛋白质是作为与Sj26即由寄生蠕虫日本血吸虫编码的26KD谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的C末端形成的融合体表达的。可在非变性条件下，在固相化谷胱甘肽柱上的亲和层析法从粗制细菌溶胞产物中纯化这些融合体蛋白质。此外，已对载体进行了基因工程操作，从而可在用位点特异性蛋白酶如凝血酶消化后从融合体蛋白质上裂解掉GST载体，以得到实际上纯的有用的成熟重组多肽。
为了得到GST-PTP35PTP酶区域，分别用含有BamHI和Eco  RI位点的5′和3′引物，以PCR扩增编码假定之细胞内区域（克隆PTP35，12中编码的蛋白质的氨基酸583-961）的顺序。然后将此顺序插入已用同样的酶切割的质粒pGKX-2T中。所得到的称为pFC221的质粒编码一个约70KD的融合蛋白质，该蛋白质由氨基末端的GST和其后PTP35的稳定的PTP酶区域组成。可按已述方法（Smith，D.and  Kevin，J.（1988）Gene67∶31-40）在用IPTG诱导后在DH52菌株中高水平表达此融合蛋白质。为了纯化PTP35的PTP酶区域可将超声处理细胞后得到的可溶性溶胞产物与琼脂糖-谷胱甘肽树脂（Pharmacia，Sweden）一起保温。保温后，彻底洗涤树脂以除去非特异性结合，再与催化活性量的凝血酶一起保温以从结合于树脂上的GST部分中释放掉PTP酶区域。然后收集有可溶性PTP酶区域的保温培养基，加入40%甘油后将酶等分并于-80℃下冷冻保存。图6中显示了一个表达并在琼脂糖-谷胱甘肽树脂柱上纯化GST-PTP35PTP酶区域的实例。

Claims (20)

1、其细胞外区域包括Arg-Gly-Asp顺序的哺乳动物受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP酶)或其功能衍生物。
2、根据权利要求1的PTP酶，其为天然来源的，并且基本上没有与之天然有关联的其他蛋白质。
3、根据权利要求1或2的PTP酶，其基本上具有图1a或1b中所示的氨基酸顺序或其功能衍生物。
4、包含与载体多肽融合的根据权利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物的融合蛋白质。
5、基本上由编码根据权利要求1之PTP酶或其功能衍生物的核苷酸顺序组成的DNA分子。
6、根据权利要求5的DNA分子，其为cDNA分子。
7、根据权利要求5的DNA分子，其为基因组DNA分子。
8、根据权利要求5至7中任一项的DNA分子，其中编码载体多肽的核苷酸顺序连接到所说的编码PTP酶或其功能衍生物的顺序上。
9、根据权利要求4的融合蛋白质或根据权利要求8的DNA分子，其中载体多肽包括一个或多个葡萄球菌蛋白A的IgG结合区。
10、含有根据权利要求5至9中任一项的DNA分子的表达载体。
11、根据权利要求10的表达载体转化的宿主。
12、根据权利要求11的宿主，其为真核宿主。
13、根据权利要求11的宿主，其为原核宿主。
14、根据权利要求13的宿主，其为大肠杆菌。
15、制备根据权利要求1的PTP酶或其功能衍生物的方法，该方法包括：
（ⅰ）提供处于能使PTP酶或其功能衍生物得以表达之条件下的根据权利要求11至14中之任一项的宿主;和
（ⅱ）纯化如此得到的PTP酶或其功能衍生物。
16、根据权利要求15的方法，其中所说的宿主是按下述步骤制备的：
（a）分离基本上由编码所说的PTP酶或其功能衍生物的核苷酸顺序组成的DNA分子;
（b）将所说的DNA分子插入到适当的表达载体中;和
（c）用所说的表达载体转化适当的宿主。
17、鉴定能刺激或抑制根据权利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物之酶促活性的化合物的方法，该方法包括：
（a）使化合物与纯的膜制剂或完整的活的或固定的细胞形式的PTP酶或其功能衍生物接触;
（b）将步骤（a）的混合物保温足够长时间;和
（c）将步骤（a）之混合物的酶促活性与不加化合物保温的PTP酶或其功能衍生物的酶促活性相比较，从而确定该化合物是否刺激或抑制上述活性。
18、能够与根据权利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物结合的多克隆或单克隆抗体。
19、检测试验样品中的根据权利要求1的PTP酶或其功能衍生物的方法，该方法包括使试验样品与根据权利要求18的抗体接触，并检测结合到PTP酶或其功能衍生物上的抗体的量。
20、检测试验样品中的编码根据权利要求1的PTP酶或其功能衍生物之mRNA的方法，该方法包括使存在于试验样品中的mRNA与基本上由图1所示顺序组成的DNA探针杂交，并检测所得DNA∶mRNA杂交体的量。
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