CN1682873A - 知母总皂苷提取物用于制备心肌缺血产品的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药知母总皂苷提取物的新用途，该总皂苷提取物的主要成分为知母皂苷B－II化合物，含量范围是30％～70％；采取本领域常规的提取、分离纯化等方法和步骤，即可得到该提取物。该提取物药理作用较强，诊断和治疗心肌缺血及其相关疾病的效果明显，药材原料来源丰富，制备工艺简单，得率高，化学性质稳定，使用安全，一物多用，且使用范围特别广，能够最大限度地发挥其作用，因此容易推广应用。此外，心血管疾病为临床常见病、多发病，发病率正不断攀升，已成为中国人口的重要死亡原因，研制治疗心血管疾病药物，尤其是预防、诊断、保护、治疗和研究心肌缺血等方面产品特别是药物，能够在较短的时间内产生显著的社会效益和经济效益。

Description

知母总皂苷提取物用于制备心肌缺血产品的用途

技术领域

本发明涉及医药、食品和饮料技术领域，具体地说是涉及中药提取物的用途，更具体地说是涉及知母总皂苷提取物用于制备心肌缺血产品的用途。

背景技术

(一)知母的研究概况

知母(Rhizoma Anemarrhenae)为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的根茎，别名蒜瓣子草、连母，生于山地、干燥丘陵或草原地带，主产河北。每年春、秋季采挖，除去须根及泥土，晒干，习称“毛知母”；除去外皮，晒干称“知母肉”。

知母是多年生草本。叶基生，线形，质稍硬，长20～70cm，宽0.3～0.6cm。花茎高40～60cm，散生鳞片状小苞片；花2～6朵一簇散生地花序轴上，花被片6，黄色或紫堇色；雄蕊3，与内轮花被片对生。蒴果长卵形，具6纵棱。花期5～8月，果期8～9月。

知母性寒，味苦、甘，具有滋阴降火、润燥滑肠的功效，清热泻火，生津润燥；传统上用于外感热病、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥、便秘。用量6～12g。

知母的化学成分主要为知母皂苷A-I、知母皂苷A-II、知母皂苷A-III、知母皂苷A-IV、知母皂苷B-I、知母皂苷B-II、知母皂苷H₁、知母皂苷H₂、知母皂苷I₁、知母皂苷I₂等，并含芒果苷、异芒果苷、胆碱、烟酸、泛酸、多糖类成分等。经国内外学者的研究，知母皂苷是知母中的主要活性成分。

知母皂苷类成分的药理作用文献有如下报道：

1、知母皂苷元(简称：ZMS)、知母皂苷B能显著改善老龄大鼠的学习记忆功能(中药药理与临床，1995；11(3)：18-21；现代中西医结合杂志，2000；9(18)：1755-6；中国老年学杂志，21(5)：379-80；中国发明专利申请《用于治疗阿尔茨海默病的甾类皂苷及其衍生物》，申请日1999年03月26日，进入国家日期2000年11月14日，申请号99806158.1，公开号CN 1301166)。

中国发明专利申请《用于治疗阿尔茨海默病的甾类皂苷及其衍生物》公开了许多皂苷和皂苷元，特别是那些甾类结构的皂苷和皂苷元在治疗认知机能失常和类似疾病中的用途，还公开了治疗方法和药物组合物。

知母中甾体皂苷具有治疗老年性痴呆作用(中国发明专利申请《甾体皂苷防治老年性痴呆的用途及新的甾体皂苷》，申请日1997年09月26日，申请号97119680.X，公开号CN1212966)。

中国发明专利申请《甾体皂苷防治老年性痴呆的用途及新的甾体皂苷》公开了式I甾体皂苷类化合物防治老年性痴呆的用途，新的式II甾体皂苷及含有所述式I甾体皂苷的药物组合物。

2、知母皂苷D具有保护心肌I/R损伤的作用，这一作用可能与其抗PAF、抗血小板聚集和清除自由基等机理有关(首都医学院学报，1994；15(2)：138)。

知母皂苷I₁、知母皂苷B-I、知母皂苷B-II、知母皂苷B-III、知母皂苷A-III具有显著的抗人血小板聚集及延长凝血时间的活性(Clin Chim Acta，1999；289(1-2)：79-88)。

3、知母甾体总皂苷具有雌激素样抗骨质疏松作用、抗炎、抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用(中国发明专利申请《中药知母中甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法》，申请日2001年02月26日，申请号01106195.2，公开号CN 1370537)。

中国发明专利申请《中药知母中甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法》提供了中药知母中甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法，提出了知母甾体总皂苷具有雌性激素样抗骨质疏松作用、抗炎活性及具有抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用，可为知母资源的利用提供新的途径。知母药材经浸泡及煎煮，滤渣取液后再经液体浓缩，直至其重量与所述知母药材重量之比为1～3∶1止，然后再吸附洗脱、脱色、去杂质、经回收干燥后得成品。本发明的工艺路线成本低，重金属含量和农药残留量小，生产过程对环境无污染。

4、知母总皂苷提取物用于制备治疗脑卒中药物的用途(中国发明专利申请《知母总皂苷用于制备防治脑卒中药物的用途》，申请日2003年05月09日，申请号03116824.8，公开号CN 1451384A)。

中国发明专利申请《知母总皂苷用于制备防治脑卒中药物的用途》公开了将知母总皂苷提取物用于制备防治脑卒中(即：脑中风)药物或食品的用途。该公开文件指出，经动物试验，知母总皂苷提取物可明显改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的行为症状、缩小脑梗塞体积、降低脑缺血大鼠脑水肿。并认为拓展了知母总皂苷提取物的用途，为防治脑卒中提供了一种新的药物来源。

(二)常用中草药有效成分的提取分离方法

1、溶剂提取法

(1)原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料(需适当粉碎)中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。这样，发明人就可以通过对中草药成分结构分析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂。总的说来，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。

(2)溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小：②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。常见的提取溶剂可分为以下三类：

①水：水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。

②亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇(又称：酒精)、甲醇(又称：木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低(64℃)，但有毒性，使用时应注意。

③亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。

(3)提取方法：用溶剂提取中草药成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。

①浸渍提取法(简称：浸渍法)：浸渍法系将中草药粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。

②渗漉提取法(简称：渗漉法)：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉、溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀浸出液作为另一批新原料的溶剂之用。

③煎煮提取法(简称：煎煮法)：煎煮法是中国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。

④加热回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的20％～60％，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾3～6小时，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。

⑤连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。

2、分离和纯化方法：

上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质，分离并进行精制。

(1)溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。利用中草药化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。

(2)溶剂萃取法：

①萃取法：溶剂提取萃取法又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高；如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水萃取。提取亲水性强的皂苷则多选用正丁醇、异戊醇和水作萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。

②逆流连续萃取法：是一种连续的溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加溶剂萃取时的接触面。如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。

③逆流分配法：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。

④液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。

(3)大孔吸附树脂法：大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的提取分离和中药新药的开发研制。

大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸附树脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯缩聚而生成，由于改性剂的加入，大孔吸附树脂的极性发生改变，按照树脂的表面性质，吸附树脂一般分为非极性、中极性和极性三类。

非极性吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合物制得的不带任何功能基的吸附树脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附树脂。

中极性吸附树脂指含酯基的吸附树脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯与双甲基丙烯酸酯等交联的一类共聚物。它是在非极性大孔吸附树脂的基础上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈缩聚而成，如中国国内经常使用的AB-8大孔吸附树脂。

极性吸附树脂是指含酰胺基、腈基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂。此外，有时把含氮、氧、硫等配体基团的离子交换树脂称作强极性吸附树脂，强极性吸附树脂与离子交换树脂的界限很难区别。极性大孔吸附树脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亚砜类缩聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美国Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附树脂。

与活性炭和其它吸附剂相比，大孔吸附树脂具有很多的优点，如对某种物质的吸附选择性较高；物理化学稳定性和机械强度较好；品种规格较多，可根据需要改变树脂物理或化学结构；吸附树脂一般为球状颗粒，流体阻力较小等等。因而被广泛应用于化工、医药等领域，近年来关于大孔吸附树脂在天然产物提取分离中的应用研究报道越来越多。大孔吸附树脂对中草药化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、香豆素及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用。对糖的吸附能力很差，对色素的吸附能力较强。

(4)沉淀法：是在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。如铅盐沉淀法：铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅而沉淀。

(5)盐析法：盐析法是在中草药的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

(6)透析法：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。

(7)结晶、重结晶和分步结晶法：鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下，物质本身性质是液体的化合物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般地说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶体的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。

3、常用干燥方法

(1)真空干燥：是基于这样一基本原理：水的饱和蒸气压与温度紧密相关，在真空状态下，水的沸点降低，即在真空下操作也就是在低温下操作，可避免在高温下营养成分如维生素等的破坏，同时提高了干燥速度。真空干燥在食品、制药、化工等行业有广泛的应用，中国也开发和引进了各种真空干燥设备，其结构形式多种多样。常用的形式主要有箱式真空干燥器、双锥式真空干燥器、带式真空干燥器等。这些传统的真空干燥装置主要采用热风，蒸汽或电等加热，利用热传导、对流或辐射原理将热量从外部传到物料内部。真空干燥具有干燥温度低，干燥室内相对缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐变等一系列优点，适合于热敏感性食品物料的干燥，此外设备成本、干燥费用也相对较低。

(2)喷雾干燥：是流化技术用于液态物料干燥的一种方法。因是瞬间干燥，特别适用于热敏性物料，故所得产品质量好，保持原来的色香味，且易溶解。利用喷雾干燥来制备微囊的研究正在进行，它是将心料混悬在衣料的溶液中，经离心喷雾器将其喷入热气流中，所得的产品是衣料包心料而成的微囊，这种微囊粉末可采用于直接压片，也可制备胶囊剂、糖浆剂或混悬剂。

(3)冷冻干燥：是将干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥的一种方法。由于物料在高度真空及低温条件下干燥，故对某些极不耐热物品的干燥很适合。王大林报道了一种喷雾通气冻干新技术，是利用冷的空气或氮气作为介质，迅速流经冻结物使水升华，喷雾冻干制得的产品微粒小、干燥快、时间短、均匀、流动性好，并具良好的速溶性。近年来，对膏状物料和粘稠物料干燥的研究取得了较大进展，流态化技术、喷射技术、惰性载体技术，则是在此研究基础上发展起来的。旋转闪蒸干燥机、热喷射气流干燥机、惰性载体干燥机均适合热敏性物料和膏状物料的干燥。这些新的研究成果用于中药制剂生产，将大大改善中药加工的技术水平，提高生产效率。

(4)远红外加热干燥法：是一项新的干燥技术，其干燥原理是将电能转变为远红外辐射，从而被药材的分子吸收，产生共振，引起分子和原子的振动和转动，导致物体变热，经过热扩散、蒸发和化学变化，最终达到干燥的目的。远红外干燥可节省电能20％～50％，效果较好。

(5)微波干燥法：是一项20世纪60年代迅速发展起来的新技术，微波干燥实际上是通过感应加热和介质加热，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它转变为热量从而达到干燥的目的。微波干燥可杀灭微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中国生产的微波加热成套设备有915mhz和2450mhz两个频率。

(三)心肌缺血的研究概况

心肌缺血定义为相对氧需(或称：氧耗)来说，心肌氧供下降。也就是说，心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心脏的供血不是一成不变的，而是始终存在着波动，但这种波动经过机体自身调节，促使血液供需相对恒定，保证心脏正常工作。如果任何一种原因引起心肌缺血，经机体调节不能满足心脏工作需要，这就构成了真正意义上的心肌缺血。

缺乏足够的血流亦不利于清除有害的代谢产物。此外，血流恢复可能进一步加重损伤的程度(简称：再灌注)。

心脏缺血的原因：血压降低、主动脉供血减少、冠状动脉阻塞，可直接导致心脏供血减少；心瓣膜病、血粘度变化、心肌本身病变也会使心脏供血减少。还有一种情况，心脏供血没有减少，但心脏氧需求量增加了，这是一种相对心肌缺血。

临床显示，引起心肌缺血最主要、最常见的病因，是冠状动脉狭窄。而冠状动脉狭窄的主要原因是动脉粥样硬化。因冠状动脉粥样硬化引起的心脏病就是大家常说的冠心病，即心绞痛及急性心肌梗死。所以，冠心病是心肌缺血的“罪魁祸首”。

1、心肌缺血的代谢与生理机制

越来越多的实验室和临床研究表明，心肌缺血主要是一种代谢病。正常情况下，脂肪酸是心肌氧化磷酸化作用的主要供能方式，其它底物包括葡萄糖、氨基酸、丙酮酸和乳酸。心脏可摄取乳酸(动脉乳酸的20％)作为其备用能源。因此，缺血乏氧代谢情况下，所产生的乳酸亦是心肌缺血的一项重要代谢指标。随着缺血加重，细胞内pH值降低，细胞内代谢产物蓄积后的渗透作用可引起心肌细胞水肿。

(1)急性心肌缺血：可影响心脏的收缩与舒张功能。舒张功能障碍往往早于收缩功能的变化。心肌缺血对心室顺应性的即刻影响与缺血的病因学有关。氧供下降开始时伴有心室顺应性增加，而氧需增加与心室顺应性即刻显著下降有关(即：心室变成僵硬)。心室需要较高的充盈压(简称：LVEDP)，以维持一定的每搏量。此时病人可能表现出室壁运动异常，心律失常和传导阻滞。如果冠状血流下降80％，则可引起心室收缩无力；冠状血流下降95％，则出现心室动力障碍。心肌缺血严重时，LVEDP升高可引起肺水肿。以往认为缺血心肌可呈不可逆性损伤(简称：梗死)或立即恢复。

目前认为，缺血心肌还有其它的生理途径。短暂性严重心肌缺血后，心肌收缩功能可逐渐恢复(简称：心肌顿抑)。

(2)慢性心肌缺血：慢性心肌缺血时随着缺血程度不同，心肌细胞表现出一系列对缺血的适应过程，如心肌顿抑、冬眠、预缺血及凋亡。急性缺血加重时，出现心肌梗死。这些过程相互重叠、相互影响，在不同程度上影响心脏功能。

慢性严重缺血可引起心脏收缩作功下降如慢性室壁运动异常(简称：心肌冬眠)，冬眠心肌普遍存在于可逆的缺血性心肌病患者，也可见于急性冠脉综合征和严重左心衰竭。研究发现，20％～60％的缺血性心肌病患者在血运重建后心功能改善，说明缺血区域的心肌细胞并没有完全坏死，而是由于缺血缺氧处于适应性低活性状态，在恢复血供后这些细胞的功能可以恢复。因此，存活心肌的检测对患者危险性的评估和治疗方法的选择具有十分重要的意义，是近年来研究的热点。

(3)无症状性心肌缺血：无症状心肌缺血是指患者虽然有心脏病，但无症状和体征，而临床检查有心肌缺血的证据，如ST段改变、心肌灌注缺损和室壁运动异常等。通常在发生冠状动脉阻塞后，即出现下述改变：冠状动脉血流量减少，局部供血量和需血量比例发生了改变，冠状窦血氧含量降低；心肌收缩功能和舒张功能减弱；左心室舒张压升高；ECG改变，例如ST段抬高或压低；胸部不适等。但这些异常往往在较短时间内发生，患者有可能永远不出现胸部不适。

也就是说，无症状性心肌缺血是冠心病的一种特殊类型，可以存在于各种冠心病类型之中，也可单独存在，即冠心病人存在心肌缺血发作的客观证据，而不伴有心绞痛或心绞痛等同症状。

有关无症状心肌缺血假说：缺血面积较小；有侧支循环；缺血时间较短；心绞痛警报系统有缺陷；患者否认；疼痛阈较高等。

无症状心肌缺血的预后与心绞痛相似，可引起急性心梗，以至猝死，且由于其无症状常不为医生及患者重视。

2、心肌缺血的后果

心肌缺血对心脏和全身都可能带来许多不利影响。心肌缺血可引起心脏功能的明显变化，并诱发一系列严重事件，如心肌梗死、心律失常、肺水肿，甚至死亡。

氧是心肌细胞活动必不可少的物质，而氧是通过血液输送给细胞的。心脏没有“氧仓库”，完全依赖心肌血供，所以一旦缺血，立刻会引起缺氧。缺氧的直接后果是心肌细胞有氧代谢减弱，产能减小，使心脏活动时必需的能量供应不足，引起心绞痛、心律失常、心功能下降。同时，代谢的废物也不能被有效及时地清除，易产生不利影响。

缺血、缺氧、缺能量，最终会影响心脏的收缩功能。若有20％～25％的心肌停止收缩，通常会出现左室功能衰竭；若有40％以上的心肌不能收缩，就会有重度心泵功能衰竭。如果这种情况突然发生，就会出现非常危险的心源性休克。急性心肌梗死就常与这种情况相关。

心肌缺血性胸痛是临床上一种很凶险的症状，处理不及时很可能会有生命危险。心肌缺血性胸痛的易发人群：①中年以上的男性或更年期以后的女性；②有高血压病、高脂血症(尤其高胆固醇血症)、糖尿病、吸烟及肥胖者；③有家族史者，如父亲55岁以前或母亲65岁以前发生了冠心病，其子女即属于有冠心病家族史的人。具有以上危险因素越多越容易发病。

心肌缺血还会损害舒张功能。收缩不良和舒张不良结合起来，易导致心室充盈压升高，引起肺充血，还可引起复杂的物质代谢紊乱和心肌电活动失常。

因此，一旦出现心肌缺血，应找准病因对症治疗，才可避免潜在的严重后果。

目前人们越来越认识到心肌缺血的严重后果。

围手术期处理集中在应用β阻滞剂。一般认为许多急性心肌梗死的病因与冠状动脉不稳定性粥样斑块破裂有关。开始时，斑块破裂引起缺血事件，继而导致冠状血管血栓形成。一般认为高电子束CT上呈现的钙性斑块为斑块破裂高危对象。

3、心肌缺血的监测

心肌缺血需要早期诊断和及时治疗的认识已经深入人心。临床检查心肌缺血的方法有：病史、ECG(静息、运动或动态ECG监测)、收缩期的局部室壁运动、心肌的舒张功能、心肌代谢。

有研究提出，PCWP的升高及其特征性波型是缺血的指标。但是，多数研究认为PAC并不是一个敏感性指标，不应作为主要的监测方法。

TEE是监测心肌缺血的高度敏感性指标。TEE时心肌缺血表现为新的区域性室壁运动异常(简称：RWMAs)、收缩期室壁增厚减少以及心室扩张。CABG手术中体外循环停机后，如果出现RWMAs，则临床后果不良。相反，ECG检测出的缺血或体外循环前的RWMAs与围手术期心脏事件发生率无关。TEE的缺点或问题包括：费用高；不能获取插入TEE前的变化；术中实时分析TEE图像可降低分析结果的准确性；TEE检测可能会分散麻醉医生对更重要生命体征的注意力；麻醉医生是否有资格出示超声结果。

亦有一些学者应用诸多指数来评价心肌氧耗(简称：MVO₂)和心肌缺血，但是其评价麻醉病人的意义尚有待深入研究。

4、心肌缺血的治疗

正常心肌的能量(简称：ATP)供给60％～70％来自游离脂肪酸β氧化，20％～25％为葡萄糖氧化，5％～10％为糖酵解。游离脂肪酸氧化产生等量ATP的耗氧量比葡萄糖氧化的耗氧量高，而且高水平游离脂肪酸氧化可明显抑制葡萄糖氧化的速率。心肌缺血时交感神经兴奋，儿茶酚胺水平升高，继而导致血中游离脂肪酸水平升高；心肌能源供给中游离脂肪酸氧化增加至80％～90％；葡萄糖酵解和葡萄糖氧化的耦联失调，致使心肌细胞内H⁺、Ca²⁺及Na⁺超载，引起细胞酸中毒和损害，使心肌工作效率降低，同时耗能增加。因此，优化心肌能量代谢，尤其是抑制游离脂肪酸氧化，加强心肌葡萄糖代谢有利于减轻心肌缺血引起的组织损伤，改善心肌功能。

缺血性心脏病的传统治疗以对症处理为主，硝酸酯类、肾上腺素β受体阻滞剂、钙通道拮抗剂等通过改善心脏和全身的血流动力学，起到增加心肌供能、减少心肌耗能的目的，是治疗心肌缺血的主要药物。随着对心肌缺血代谢过程的进一步研究和认识，提出了通过干预心肌能量产生的代谢环节、完善线粒体能量代谢而治疗缺血性心脏病的新概念。

曲美他嗪(trimetazidine)是一种抗心肌缺血的新药，主要通过抑制游离脂肪酸代谢，增加葡萄糖代谢，增加心肌能量供应。曲美他嗪可减轻心绞痛症状，改善运动耐量，在心绞痛、缺血性心肌病等的治疗中发挥作用；对稳定型心绞痛，曲美他嗪可单独用于轻度心绞痛患者，减少冠心病患者心绞痛的发作次数和硝酸甘油用量，改善运动耐量；对中、重度心绞痛，曲美他嗪可作为辅助药物，与其他传统抗心肌缺血药物合并使用。单用β受体阻滞剂、钙通道拮抗剂、硝酸盐控制心绞痛不佳时，合用曲美他嗪可明显提高疗效。对急性心肌梗死，曲美他嗪可能减轻急性前壁心肌梗死患者溶栓后的再灌注损伤，减少梗死面积，影响急性心肌梗死后心室重构。

目前对于改善冬眠心肌的研究主要有三个方面：一是积极进行血运重建，其疗效已得到肯定。二是干预心肌代谢。此类药物主要有：脂肪分解抑制剂，如：烟酸及其衍生物、胰岛素等；肉毒碱脂酰转移酶-1(简称：CPT-1)抑制剂，如：L-肉毒碱、哌克西林、乙莫克舍等；脂肪酸β氧化抑制剂，如：曲美他嗪、雷洛嗪等。三是细胞移植，当前还停留在临床前的实验阶段。

目前，已有一些小规模的临床试验对于预心肌代谢的药物在不同临床情况下的疗效进行了观察。DIGAMI研究将620例糖尿病合并急性心梗的患者随机分为两组，在常规治疗基础上，一组给予胰岛素和葡萄糖治疗，另一组给予安慰剂，观察12个月后发现，与对照组相比，胰岛素组患者死亡的相对危险降低29％(P＝0.027)。Diaz等也发现利用GIK治疗3个月可显著降低AMI后患者的病死率，但该研究的规模也比较小。

一些药物可以通过改善冬眠心肌的功能达到心肌保护的目的，如卡维地洛。CHRIST-MAS发现，卡维地洛治疗稳定性心力衰竭患者4个月，可明显改善存活心肌功能，提高射血分数。此外，大量研究显示，ACEI、ARB类药物用于急性心肌梗死早期，也可显著改善患者的住院病死率和心血管事件的发生率，作用机制之一是通过阻断肾素血管紧张素系统而发挥心肌保护作用。

他汀类药物可能通过稳定斑块、保护内皮、改善纤溶-凝血系统功能发挥心肌保护作用。临床研究同样发现在急性冠脉综合征早期应用他汀类可以显著改善患者预后。有关他汀类药物心肌保护的确切机制、是否具有膜稳定和细胞器保护作用还有待进一步研究。

经文献检索等，到目前为止，尚未发现有知母皂苷B-II为主要成分的知母总皂苷提取物在用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病方面的报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种中药知母总皂苷提取物的新用途，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明意在明确知母总皂苷提取物在心肌缺血应用方面的活性，进而将知母总皂苷提取物用于制备心肌缺血产品；所述的心肌缺血产品是指用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品，是包括药物、试剂、食品等中的一种或多种，优选药物。

(一)技术构思

自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务，中国中医药学具有悠久的历史，用中草药预防和治疗疾病方面也积累了丰富的经验，因此从中药中寻找有效的活性成分是一条有效的途径，也是中国创新药物研制的优势之所在。

发明人通过对单味知母药材的总皂苷提取物进行系统的化学成分研究，筛选并证明该总皂苷提取物的活性和用途。

根据文献检索，发明人通过实验发现活性部位知母总皂苷提取物具有多种显著的药理活性。而经过化学成分研究，证明知母活性部位知母总皂苷提取物中的主要成分为知母皂苷B-II化合物。发明人从而推测知母的在预防、诊断、保护和治疗心肌缺血等方面活性的临床药效，也应主要是通过活性部位知母总皂苷提取物特别是知母皂苷B-II的药效来发挥的，研究结果也证明和证实了知母总皂苷提取物特别是知母皂苷B-II具有显著的药理活性。

心血管疾病已成为中国人口的重要死亡原因，研制治疗心血管疾病药物，尤其是预防、诊断、保护和治疗心肌缺血等方面产品特别是药物具有显著的社会、经济效益。

(二)知母总皂苷提取物的制备及其鉴定方法

本发明所说的知母总皂苷提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)提取：取知母原料若干，提取，得提取液，即知母总提取物；

(2)分离纯化：将提取液分离纯化，即得知母总皂苷提取物。

所述的提取方法包括溶剂提取法等本领域公知的所有可以使用的方法。

上文所述的溶剂提取法的提取方法是本领域的常规提取方法，也就是说包括常用的超声提取法、浸渍提取法、渗漉提取法、煎煮提取法、加热回流提取法或连续回流提取法等中的一种或多种；提取次数可以是一次或者是多次。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。各种提取方法包括技术细节在内的所有技术资料，均可以参见有关的教材和相关的技术文献等。

上文所述的溶剂提取法所使用的提取溶剂是本领域的常规提取溶剂，也就是说包括常见的水、亲水性的有机溶剂或亲脂性的有机溶剂等三类提取溶剂的一种或多种；

所述的水是包括水、酸水或碱水等中的一种；

所述的亲水性的有机溶剂是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，包括乙醇、乙醇水溶液、甲醇或丙酮等中的一种或多种，优选乙醇或不同浓度的乙醇水溶液等中的一种或多种，进一步优选不同浓度的乙醇水溶液；

所述的亲脂性的有机溶剂是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，包括石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷等中的一种或多种，优选石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷等中的一种或多种，进一步优选氯仿、乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷等中的一种或多种。

上述提取方法所得到的知母总提取物，需进一步分离纯化。

所述的分离纯化方法是本领域公知的所有可以使用的方法，包括溶剂分离法，溶剂萃取法(包括萃取法、逆流连续萃取法、逆流分配法或液滴逆流分配法等中的一种或多种)，大孔吸附树脂法，沉淀法，盐析法，柱层析法或结晶与重结晶和分步结晶法等中的一种或多种；这些方法均是本领域的公知技术，在需要进一步确证的时候，很容易从有关的教材和相关的技术文献等查阅到包括技术细节在内的所有技术资料。

为了使产品性质稳定，便于使用和保存，还可增加一个优化的步骤，即步骤三：

(3)干燥。

所述的干燥方法是本领域公知的可以使用的方法，包括常压干燥法如经烘箱烘干、减压干燥法、真空干燥法、喷雾干燥法、冷冻干燥法、远红外加热干燥法或微波干燥法等中的一种或多种。

在具体实施时，需要根据现有的资金、技术和有关的要求，采用其中合适的方法，并选取合适的条件等必要的措施以达到预期的目标。而这些方法也均是本领域的公知技术，在需要进一步确证的时候，都是很容易从有关的教材和相关的技术文献等查阅到包括技术细节在内的所有技术资料。

例如，本发明所说知母总皂苷提取物的制备方法可以为：

(1)提取：按常规将知母药材粉碎成粗粉，以10～95％乙醇渗漉提取，收集5～30倍药材体积量渗漉液，即为提取液。

(2)分离纯化：提取液浓缩到浓度为0.5～10∶1(药材重量∶溶液体积)，即为样品液。将样品液通过非极性或弱极性大孔树脂吸附(非极性或弱极性大孔树脂为以苯乙烯为架桥材料的聚苯乙烯型多孔性吸附树脂，如D101、D201、ZTC-1、AB-8、1300-1型大孔树脂等)，用水淋洗除去杂质；再用含水低级醇洗脱，低级醇为甲醇、乙醇或丙醇等C₁～C₅醇类，其浓度为10～40％，体积用量为树脂床体积的5～24倍，收集低级醇洗脱液，浓缩至干，并粉碎；粉末用1.5～2.5倍量(丙酮体积/粉末重量)丙酮溶解，再加入2～12倍量(丙酮体积/粉末重量)丙酮，滤过，将滤液回收溶剂至2～8倍量(丙酮体积/粉末重量)，静置，析出结晶，过滤，以丙酮洗涤结晶，即得本发明的知母总皂苷提取物。

本发明综合应用质谱(简称：MS)，核磁共振氢谱(简称：¹H-NMR)，核磁共振碳谱(简称：¹³C-NMR)以及核磁共振二维谱(简称：2D-NMR)等分析技术对知母总皂苷提取物中的知母皂苷B-II进行了结构鉴定，其含量范围是在30％～70％。

(三)知母总皂苷提取物的药理活性

本发明对知母总皂苷提取物在心肌缺血的预防、诊断、保护、治疗和研究等方面的活性进行了多方面的试验。

供试样品均是采取以上制备方法获得，具体如下：

(1)知母总皂苷提取物中含总皂苷为40％～80％；

(2)知母总皂苷提取物主要成分知母皂苷B-II含量为30％～70％；

知母总皂苷提取物心肌缺血预防、诊断、保护和治疗活性的体外试验

1、对犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型的治疗作用

采用麻醉犬冠状动脉左前降支结扎造成心肌梗塞模型，观察知母总皂苷提取物的治疗作用。实验结果显示，知母总皂苷提取物20mg/kg、60mg/kg、120mg/kg灌胃给药可显著降低犬冠脉结扎后心肌缺血的程度，缩小心肌缺血的范围，作用强度与剂量有一定的关系；定量组织学检测结果与心外膜电图测定结果一致，与生理盐水对照组比较，知母总皂苷提取物可显著减小梗塞范围。知母总皂苷提取物还能显著降低犬冠脉结扎后血清乳酸和肌酸激酶升高的程度；提示其可减轻心肌缺血时的细胞损害，对心肌细胞有保护作用。实验结果表明，知母总皂苷提取物能显著减轻犬心肌梗塞时的心肌缺血程度和范围，减小梗死范围。

2、对麻醉犬心肌耗氧量的影响

实验旨在观察知母总皂苷提取物灌胃给药对麻醉犬心肌耗氧量的影响。结果显示：知母总皂苷提取物低剂量组灌胃给药后心肌耗氧量同生理盐水组相比无显著差异，中、高剂量组可显著降低麻醉犬心肌耗氧量；三个剂量组均可明显降低心肌氧摄取率，增加冠脉流量，降低冠脉阻力，作用强度与剂量有一定的关系。知母总皂苷提取物高剂量组及阳性对照药地奥心血康胶囊可显著降低总外周阻力，各剂量组对犬心输出量无明显影响。

3、对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

实验观察了知母总皂苷提取物灌胃给药对SD大鼠心脏缺血再灌注所致心肌损伤的影响。用3％戊巴比妥钠腹腔麻醉SD大鼠后，左侧第4-5肋间开胸，结扎冠状动脉左前降支，制成急性心脏缺血再灌注模型。灌胃给予知母总皂苷提取物，测定急性心肌缺血60min再灌注损伤120min后血清肌酸激酶(简称：CK)、乳酸脱氢酶(简称：LDH)活性和心肌梗塞范围。结果显示：知母总皂苷提取物低剂量组(60mg/kg)血清LDH、CK活性、心肌梗塞区/心脏重量百分比明显低于模型组(P＜0.05)；中、高剂量组(120，360mg/kg)血清LDH、CK活性、心肌梗塞区/心脏重量百分比非常明显低于模型组(P＜0.01)；地奥心血康胶囊组血清LDH、CK活性、心肌梗塞区/心脏重量百分比非常显著低于模型组(P＜0.01)。结果表明知母总皂苷提取物灌胃给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。

(四)知母总皂苷提取物的用途

1、概述

本发明的目的是提供一种用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品，包括药物、试剂、食品等中的一种或多种，优选药物。

通过药理活性筛选证明，采用大孔吸附树脂5～75％乙醇洗脱部位得到的知母总皂苷提取物为其预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的活性部位。

经实验研究表明，知母总皂苷提取物灌胃给药可显著降低犬冠脉结扎后心肌缺血的程度，减小梗死范围；可显著降低麻醉犬心肌耗氧量，增加冠脉流量，降低冠脉阻力；灌胃给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。已完成的急性毒性实验证明，小鼠灌胃给药对该活性部位的最大耐受量超过2.0g/kg，相当于临床推荐用药剂量的440倍，表明该有效部位安全可靠，解决了中药复方中成分复杂、有效成分含量低且含有有毒成分的问题。

综上所述，发明人对知母总皂苷提取物进行了理论探索，经过大量的实验研究特别是长期的药理学试验，发现所述及的知母总皂苷提取物有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的活性。因此，知母总皂苷提取物及其组合物可用于制备心肌缺血产品，优选以本发明知母总皂苷提取物为原料制备而成的药物。

2、知母总皂苷提取物及其组合物的使用方法与要求

本发明知母总皂苷提取物可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品，包括药物、试剂、食品等，尤其是药物。

在具体使用方面，本发明所述的知母总皂苷提取物能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解知母总皂苷提取物的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一步优选医药学上可接受的载体。

本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该知母总皂苷提取物的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如甘油或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；稀释剂，如水等；崩解剂，如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等中的一种或多种；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

例如，将活性组分知母总皂苷提取物溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠或醋酸钠等中的一种或多种)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，苯甲醇等)等。

本发明所述及的知母总皂苷提取物还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种，进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明知母总皂苷提取物加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明知母总皂苷提取物和药学上可接受的载体。

知母总皂苷提取物的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的知母总皂苷提取物为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

知母总皂苷提取物的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行心肌缺血及其相关疾病的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。

药物组合物优选含有重量比为0.5％～99％的活性成分知母总皂苷提取物，进一步优选含有重量比为1％～95％的活性成分知母总皂苷提取物，最优选含有重量比为5％～90％的活性成分知母总皂苷提取物。

知母总皂苷提取物的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该知母总皂苷提取物与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该知母总皂苷提取物加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

用于患者时，本发明所述的知母总皂苷提取物剂量为5～20mg/kg·d，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

本发明知母总皂苷提取物及其药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明知母总皂苷提取物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。知母总皂苷提取物的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该知母总皂苷提取物在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该知母总皂苷提取物的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明知母总皂苷提取物的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是5～20mg/kg，更优选为5～10mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的知母总皂苷提取物剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明知母总皂苷提取物的每次和/或每日的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人(如体重60kg)，所述知母总皂苷提取物的单剂量约为50～200mg，优选约100mg，优选每日给药1～3次。可以调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如，治疗或预防应答)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物知母总皂苷提取物。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)该知母总皂苷提取物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性知母总皂苷提取物的技术中的内在限制。

3、知母总皂苷提取物及其组合物的药物剂型和给药途径

本发明所述的知母总皂苷提取物及其组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够用于预防、保护和治疗心肌缺血及其相关疾病；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗或保健，既能够单独直接用于制备治疗或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。

本发明所述的知母总皂苷提取物及其组合物，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978)。

本发明所述的知母总皂苷提取物及其组合物，通常通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明知母总皂苷提取物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该知母总皂苷提取物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述知母总皂苷提取物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。

为了以非肠道给药之外给予本发明知母总皂苷提取物，可能需要用防止其失活的材料对该知母总皂营提取物包衣或与该知母总皂苷提取物一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明知母总皂苷提取物与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆、酊剂或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选注射剂。

此外，知母总皂苷提取物所使用的药材原料在某些情况下也能够单独直接用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品，也能够与许多化学物质进行混合或组合，以组合物的形式直接或间接用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

例如，知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末用于制备用于心肌缺血预防、诊断、保护和治疗产品特别是药物的各种剂型，或者是知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅料用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品尤其是药物的各种剂型，或者是知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末与有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品如药物一起用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品如药物的各种剂型，或者是知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅助药物一起用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品如药物的各种剂型，如片剂、胶囊剂或混悬剂等中的一种或多种，优选胶囊剂。

所述的方法之一是将知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末灌装为胶囊剂，方法之二是将知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末与有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品如药物一起灌装为胶囊剂，方法之三是将知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅助药物一起灌装为胶囊剂；方法之四是将知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅料一起按常规方法直接压为片剂，方法之五是将知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末、有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品如药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂，方法之六是将知母总皂苷提取物所使用的药材原料的粉末、有关的辅助药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂等。

除上述的六种基本方法外，还能够选择知母总皂苷提取物所使用的药材原料的其他形式或对知母总皂苷提取物所使用的药材原料进行本领域公知的方法处理后，制备各种剂型的含有知母总皂苷提取物所使用的药材原料的产品如药物。但是，需要注意的是，在上述直接使用知母总皂苷提取物所使用的药材原料的时候，应先根据所使用的知母总皂苷提取物的剂量要求，换算得到所需要使用的知母总皂苷提取物所使用的药材原料的用量。

综上所述，本发明知母总皂苷提取物及其组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品，优选药物和食品，进一步优选药物。

(四)技术特长

本发明对以皂苷为主要成分的知母总皂苷提取物拓展了新的医药用途，也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病提供了一种新的药物来源。本发明的知母总皂苷提取物安全低毒，药理作用较强，其原料来源丰富、价廉，制备工艺简单，可用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品。

本发明有针对性地研究知母总皂苷提取物，知母总皂苷提取物药理作用较强，其原料来源丰富，制备工艺简单，得率高；且使用安全，一物多用，最大限度地发挥了作用，而且使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

知母总皂苷提取物性质稳定，使用制备的制剂质量稳定，预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的效果明显，故其更适于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病产品的工业化生产。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病等方面的安全原料。

附图说明

图1表示知母总皂苷提取物对犬冠脉结扎心外膜电图ST段总和(∑ST)的影响；

图2表示知母总皂苷提取物对犬冠脉结扎心肌梗塞范围(N-ST)的影响；

图3表示知母总皂苷提取物对犬心肌耗氧量(mL/min.100g-1)的影响；

图4表示知母总皂苷提取物对犬心肌氧摄取率(％)的影响；

图5表示知母总皂苷提取物对犬冠脉流量(ml/min)的影响；

图6表示知母总皂苷提取物对犬冠脉阻力(Kpa/ml/min)的影响。

其中：

表示溶剂对照组

表示阳性对照组 表示小剂量组

表示中剂量组

表示大剂量组

具体实施方式

本发明研究了现有的知母总皂苷提取物的新的药理作用和新的用途，提供了一种能够用于制备心肌缺血预防、诊断、保护和治疗等产品的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用。

(一)制备方法

本发明知母总皂苷提取物的制备方法为：

(1)提取：按常规将粉碎的知母药材用20～95％乙醇热提，首次溶媒体积用量约为生药的4～8倍；或将粉碎的知母药材用20～95％乙醇渗漉提取，溶媒体积用量约为生药的4～12倍；得提取液；将提取液过滤、浓缩，浓缩液离心或过滤；

(2)分离纯化：浓缩液的离心上清液或过滤液通过非极性或弱极性大孔树脂吸附(非极性或弱极性大孔树脂为以苯乙烯为架桥材料的聚苯乙烯型多孔性吸附树脂，如D101、D201、ZTC-1、AB-8、1300-1型大孔树脂等)，用水及20％以下的乙醇淋洗除去杂质；再用含水低级醇洗脱，低级醇为甲醇、乙醇或丙醇等C1～C5醇类，其浓度为30～95％，体积用量为生药的5～15倍，收集低级醇洗脱液，浓缩至无醇；

(3)干燥：干燥粉碎或喷雾干燥，即为本发明的知母总皂苷提取物，成品收率为生药量的1.5％以上。

本发明知母总皂苷提取物成分分析：经硅胶、sephadexLH-20、ODS等反相色谱担体柱色谱获得了6个化合物，用化学、波谱法测定了结构，分别为：萨尔萨皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(简称：知母皂苷A-III)、吗尔考皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷、26-O-β-D-吡喃葡萄糖基呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(简称：知母皂苷B)、萨尔萨皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(简称：西陵皂苷B)、26-O-β-D-吡喃葡萄糖基呋甾-22，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(简称：知母皂苷B-II)、萨尔萨皂苷元。经HPLC检测，知母总皂苷提取物中知母皂苷B-II、知母皂苷B的含量之和≥50％，知母皂苷B-II含量≥30％，该提取物的最优比例为：知母皂苷B-II、知母皂苷B含量百分比例为75～95∶15～5。

(二)常用的实用剂型

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取知母总皂苷提取物，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一种或几种。每瓶含知母总皂苷提取物10～100mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取知母总皂苷提取物，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含知母总皂苷提取物10～100mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每支含知母总皂苷提取物10～100mg。

本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每瓶含知母总皂苷提取物10～100mg。

本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

下面通过实施例对本发明作详细描述。

实施例1、知母总皂苷提取物的制备方法

100公斤粉碎后的知母药材，投入提取罐，在90～100℃依次用70％乙醇400升热提3次，每次提取时间为90分钟，合并3次提取液，浓缩至80升，过滤，将滤液用蒸馏水调节至100升。再缓缓通过装有350升ZTC-1型大孔树脂(天津正天成澄清技术有限公司生产)的吸附柱，用500升蒸馏水、1000升20％乙醇洗脱除去杂质，再用1000升45％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，干燥粉碎后得黄色粉末，即为本发明的知母总皂苷提取物，共重2.7公斤，按生药量计得率为2.7％。

实施例2、知母总皂苷提取物的另一种制备方法

将知母药材切成薄片，取100kg，以30％乙醇300L浸润12小时后渗漉提取，收集2400L渗漉液。将渗漉液浓缩到150L；浓缩液过滤，滤液通入装有200L的D101型树脂的色谱柱中，依次用蒸馏水3000L、20％乙醇3000L、60％乙醇1200L洗脱，收集60％乙醇洗脱部分，浓缩至干，干燥粉碎后得黄色粉末，即为本发明的知母总皂苷提取物，共重3.1公斤，按生药量计得率为3.1％。

实施例3、知母总皂苷提取物的再一种制备方法

知母干燥药材2.5kg，用75％乙醇溶液50升回流提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压回收至无醇味，过滤得滤液，滤液用蒸馏水调至相对密度1.05左右，上AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗去水溶性杂质，继用不同浓度乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部位，即得富含酚酸苷类和二萜苷类成分的洗脱液，减压回收至干，得知母总皂苷提取物45g。

实施例4、知母总皂苷提取物对犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型的治疗作用

本发明对知母总皂苷提取物通过灌胃给药对犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型的治疗作用进行了试验。

(1)试验方法

将杂种犬(第二军医大学动物中心提供)随机分为5组：阴性对照组、阳性对照组、知母总皂苷提取物低剂量组、知母总皂苷提取物中剂量组及知母总皂苷提取物高剂量组，每组5只。阴性对照组即犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型，给予等量的生理盐水；阳性对照组用地奥心血康胶囊(成都地奥制药有限公司，批号0402061)作为知母总皂苷提取物疗效的对照，临床推荐剂量为0.6g/天/人(相当于甾体总皂苷210mg)，人以60公斤体重计算，为3.5mg/kg/人(甾体总皂苷量)，折算为犬的剂量为7mg/kg，设计阳性对照药剂量相当于受试药的中剂量，故给药剂量为21mg/kg。知母总皂苷提取物犬低剂量为20mg/kg，中剂量为60mg/kg，高剂量为120mg/kg。

根据新药审评要求，制备犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型(制备方法详见《西药新药临床前研究指导原则汇编》的药理学部分，中华人民共和国卫生部药政管理局，1993：61；《药理实验方法学》第二版，人民卫生出版社，1991：830、1113)，各组均用该模型犬试验。各组在冠状动脉结扎后后灌胃给药，阴性对照组给同体积生理盐水。然后观察以下指标：

①对心肌缺血程度(心外膜电图∑ST)及心肌缺血范围(心外膜电图N-ST)的影响：分别在给药后15min、30min、60min、90min、120min、180min记录心外膜电图的变化。心外膜电图观察指标：以ST段升高或降低2mV以上的导联数(NST)和ST段升高值的总和(∑ST)为指标观察给药前后的变化，并计算心肌缺血程度(∑ST)和范围(NST)。以用药后不同时间实测值与用药前进行比较，以用药后不同时间变化百分率(用药前为100％)进行组间比较。

②对心肌梗塞范围的定量组织学检测的影响：结扎3小时后取心脏，称取全心重量；切去心房及右心室，称出左心室重量，并在冠脉结扎线下，平行于冠状沟将左心室切成等厚的4～6片，用生理盐水洗净，置0.05％氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)液37℃染色30分钟。染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接触。染色后立即用水冲去多余染料。梗死区不着色，非梗死区着暗蓝色，剪去着色部分，将未着色的梗死区称重，计算出梗塞区重量占全心及左心室重量的百分比。

③对冠脉结扎后血清生化指标的影响：冠脉结扎前及给药后3小时各取右心室血3ml，3000rpm离心15分钟，取血清测乳酸脱氢酶(简称：LDH)、血清肌酸激酶(简称：CK)。LDH的测定采用LDH测试盒方法(批号：20040719，南京建成生物工程研究所)，CK(批号：20040802，南京建成生物工程研究所)。在UV751GD型紫外/可见光分光光度计上进行(上海分析仪器厂)。

(2)试验结果

①对心肌缺血程度(心外膜电图∑ST)的影响

结果详见图1。从图1看出，知母总皂苷提取物组20～120mg/kg静脉给药后能剂量依赖性地减轻心肌缺血程度，∑ST显著下降(P＜0.01)，小剂量组60～90min与生理盐水组差异非常显著(P＜0.01)；中剂量组从15min起即有显著性差异(P＜0.05)，各时间点与生理盐水组比较，30min时有显著性差异，60～90min有非常显著差异(P＜0.01)；高剂量组60～120min差异非常显著(P＜0.01)。知母总皂苷提取物20～120mg/kg灌胃对狗冠脉结扎引起的急性心肌缺血程度有显著的治疗作用。

②对心肌缺血范围(心外膜电图N-ST)的影响

实验结果见图2。从图2看出，知母总皂苷提取物能剂量依赖性地缩小心肌缺血范围，降低N-ST值。低剂量组20mg/kg各时间点N-ST值降低率与生理盐水组同时间点比较，30min时差异显著(P＜0.05)；中剂量组60mg/kg从15～90min时N-ST值降低率与生理盐水组同时间点比较，有显著差异(P＜0.05)；高剂量组(120mg/kg)从30～180min降低心肌缺血范围与生理盐水组比较，有非常显著差异(P＜0.01)。

③知母总皂苷提取物对心肌梗塞范围的定量组织学检测的影响

实验结果见表1。从表1看出，知母总皂苷提取物20～120mg/kg灌胃能剂量依赖性地减少心肌梗塞范围。知母总皂苷提取物低、中、高剂量组(20、60、120mg/kg)梗塞区/全心的比值和梗塞区/左心室的比值与生理盐水组比较下降显著(P＜0.05，P＜0.01)。其中高剂量组(120mg/kg)心肌梗塞区与全心重量的比值和梗塞区与左心室重量的比值分别由生理盐水组的15.13±1.51％，26.30±2.94％下降到11.20±1.82％，19.32±1.34％。

表1、知母总皂苷提取物对N-BT染色测定心肌梗塞范围的影响( x±s，n＝5只/组)

组别	剂量	梗塞区/全心(％)	梗塞区/左心室(％)
				生理盐水	2ml/kg	15.13±1.51	26.30±2.94
地臭心血康胶囊	21mg/kg	11.58±1.62**	21.72±2.80*
				知母总皂苷提取物	20mg/kg	12.28±2.71*	22.25±1.31*
知母总皂苷提取物	60mg/kg	11.90±1.03*	21.05±1.84**
				知母总皂苷提取物	120mg/kg	11.20±1.82**	19.32±1.34**

^*P＜0.05，^**P＜0.01与生理盐水组比较

④对冠脉结扎后血清生化指标的影响

实验结果见表2、3。

表2、知母总皂苷提取物对冠脉结扎动脉血清生化指标的影响( x±s，n＝5只/组)

组别	剂量	LDH(IU/L)
					给药前	给药后	后/前
		生理盐水	2ml/kg	267.4±46.2				752.6±107.3	2.84±0.30
地奥心血康胶囊	21mg/kg				279.8±93.1	568.2±156.2	2.09±0.31**
		知母总皂苷提取物	20mg/kg	255.3±53.5				591.6±118.8	2.33±0.19*
知母总皂苷提取物	60mg/kg				266.0±94.4	557.1±193.1	2.10±0.18**
		知母总皂苷提取物	120mg/kg	239.4±72.0				487.2±145.3	2.05±0.27**

^*P＜0.05，^**P＜0.01与生理盐水组比较

表3、知母总皂苷提取物对冠脉结扎动脉血清生化指标的影响( x±s，n＝5只/组)

组别	剂量	CK(IU/L)
					给药前	给药后	后/前
		生理盐水	2ml/kg	325.3±100.1				1040.7±247.5	3.29±0.54
地奥心血康胶囊	21mg/kg				358.3±61.4	831.6±206.6	2.32±0.44**
		知母总皂苷提取物	20mg/kg	334.1±71.9				856.9±179.3	2.59±0.34*
知母总皂苷提取物	60mg/kg				306.6±42.3	695.7±83.8	2.30±0.39**
		知母总皂苷提取物	120mg/kg	297.7±63.8				612.0±94.7	2.09±0.29**

^*P＜0.05，^**P＜0.01与生理盐水组比较

知母总皂苷提取物低、中、高剂量组及阳性对照药地奥心血康胶囊组均能显著的降低血清LDH和CK的升高程度(P＜0.05)。其中高剂量组(120mg/kg)血清LDH、CK可分别由239.4±72.0、297.7±63.8上升到487.2±145.3、612.0±94.7，仅分别上升了2.05±0.27和2.09±0.29倍。

以上试验结果说明，知母总皂苷提取物可明显改善犬冠状动脉结扎后造成心肌梗塞引起的减轻心肌缺血程度与范围、减少心肌梗塞范围、降低血清LDH和CK的升高程度。另外，知母总皂苷提取物还可显著降低麻醉犬心肌耗氧量、对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。这些作用都有利于预防和治疗心肌缺血，因此，知母总皂苷提取物可用于制备治疗心肌缺血的药物或食品。

实施例5、知母总皂苷提取物对麻醉犬心肌耗氧量的影响

本发明对知母总皂苷提取物灌胃对麻醉犬心肌耗氧量的影响进行了试验。

(1)试验方法

将杂种犬(第二军医大学动物中心提供)随机分为5组：阴性对照组、阳性对照组、知母总皂苷提取物低剂量组、知母总皂苷提取物中剂量组及知母总皂苷提取物高剂量组，每组5只。阴性对照组即犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型，给予等量的生理盐水；阳性对照组用地奥心血康胶囊(成都地奥制药有限公司，批号0402061)作为知母总皂苷提取物疗效的对照，临床推荐剂量为0.6g/天/人(相当于甾体总皂苷210mg)，人以60公斤体重计算，为3.5mg/kg/人(甾体总皂苷量)，折算为犬的剂量为7mg/kg，设计阳性对照药剂量相当于受试药的中剂量，故给药剂量为21mg/kg。知母总皂苷提取物犬低剂量为20mg/kg，中剂量为60mg/kg，高剂量为120mg/kg。

实验方法详见《西药新药临床前研究指导原则汇编》的药理学部分，中华人民共和国卫生部药政管理局，1993；《药理实验方法学》第二版，人民卫生出版社，1991)。

(2)试验结果

①对麻醉犬心肌耗氧量的影响：

知母总皂苷提取物低剂量组灌胃后心肌耗氧量同生理盐水组相比无显著性差异(P＞0.05)；中剂量组60～90min可非常显著降低犬心肌耗氧量(P＜0.01)，120min时差异仍显著；高剂量组15min即有显著差异(P＜0.05)，30min-180min差异非常显著(P＜0.01)；地奥心血康组15～120min起耗氧量与给药前相比差异非常显著(P＜0.01)，180min时仍可显著降低心肌耗氧量(P＜0.05)(结果见图3)。

②对麻醉犬心肌氧摄取率的影响：

知母总皂苷提取物灌胃后可显著降低心肌氧摄取率。降低率与生理盐水组同时间点相比，小剂量组在30min起即有显著差异(P＜0.05)，60～120min时差异非常显著(P＜0.01)；中剂量组15min即降低麻醉犬心肌氧摄取率，30min至180min各时间点差异均非常显著(P＜0.01)；高剂量组从30min至180min与生理盐水组比心肌氧摄取率均非常显著降低(P＜0.01)；阳性对照药地奥心血康15min起即有显著差异(P＜0.05)，30min至180min非常显著降低心肌氧摄取率(P＜0.01)。(结果见图4)。

③对麻醉犬冠脉流量的影响：

知母总皂苷提取物各剂量组可增加冠脉流量；增加率与生理盐水组同时间点相比，小剂量组从30min至90min差异非常显著(P＜0.01)；120min时仍有显著差异(P＜0.05)；中、高剂量组则从30～180min差异均非常显著(P＜0.01)。阳性对照药地奥心血康组也可明显增加冠脉流量，从30～180min增加率与生理盐水组同时间点相比差异非常显著(P＜0.01)。(结果见：图5)。

④对麻醉犬冠脉阻力的影响：

知母总皂苷提取物各剂量组可降低冠脉阻力，降低率与生理盐水组同时间点相比，低剂量组(20mg/kg)在30min差异显著(P＜0.05)，60～180min差异非常显著(P＜0.01)；中剂量组(60mg/kg)从30～180min差异非常显著(P＜0.01)；高剂量组(120mg/kg)与阳性对照药地奥心血康从15min起即可显著降低冠脉阻力，30～180min时冠脉阻力降低率与生理盐水组同时间点相比差异非常显著(P＜0.01)(结果见图6)。

以上试验结果说明，知母总皂苷提取物可明显增加麻醉犬冠脉流量，降低冠脉阻力，降低总外周阻力，可明显降低心肌氧摄取率，降低心肌耗氧量。这些作用都有利于预防和治疗心肌缺血，因此，知母总皂苷提取物可用于制备治疗心肌缺血的药物或食品。

实施例6、知母总皂苷提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

本发明对知母总皂苷提取物通过灌胃给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行了试验。

(1)试验方法

将SD大鼠(第二军医大学动物中心提供)随机分为6组：假手术组、生理盐水对照组、阳性对照组、知母总皂苷提取物低剂量组、知母总皂苷提取物中剂量组及知母总皂苷提取物高剂量组，每组10只。阳性对照组用地奥心血康胶囊(成都地奥制药有限公司，批号0402061)作为知母总皂苷提取物疗效的对照，临床推荐剂量为0.6g/天/人(相当于甾体总皂苷210mg)，人以60公斤体重计算，为3.5mg/kg/人(甾体总皂苷量)，折算为大鼠的剂量为21mg/kg，设计阳性对照药剂量相当于受试药的中剂量，故给药剂量为63mg/kg。知母总皂苷提取物犬低剂量为60mg/kg，中剂量为180mg/kg，高剂量为360mg/kg。各组冠脉结扎完毕后灌胃给药，给药体积与缺血再灌注模型组给生理盐水量一致。

实验方法详见《西药新药临床前研究指导原则汇编》的药理学部分，中华人民共和国卫生部药政管理局，1993；《药理实验方法学》第二版，人民卫生出版社，1991)。

(2)试验结果

心肌缺血再灌注后，血清LDH、CK活性明显增加，心肌梗塞区重量明显增加，与假手术对照组比较有非常显著性差异(P＜0.01)；知母总皂苷提取物低剂量组(60mg/kg)血清CK活性、心肌梗塞区/全心重量百分比低于模型组，差异具有显著性意义(P＜0.05)；知母总皂苷提取物中、高剂量组(120、360mg/kg)血清LDH、CK活性、心肌梗塞区/全心重量百分比低于模型组，差异具有非常显著性意义(P＜0.01)；地奥心血康胶囊组血清LDH、CK活性、心肌梗塞区/全心重量百分比明显低于模型组(P＜0.01)(见：表4)。

表4、知母总皂苷提取物对大鼠心脏缺血再灌注损伤的影响( x±s，n＝10)

组别	剂量	CK(IU/L)	LDH(IU/L)	梗塞区/全心(％)
					假手术组生理盐水组地奥心血康组低剂量组中剂量组高剂量组	3ml/kg3ml/kg63mg/kg60mg/kg120mg/kg360mg/kg	644.86±93.18964.06±107.87ΔΔ812.44±85.74**847.02±106.74*807.1 2±89.57**767.60±97.39**	694.81±100.541212.42±168.32ΔΔ944.03±182.19**1016.88±195.42*932.80±128.09**839.68±156.46**	--33.50±4.1226.31±3.78**28.68±3.56*25.79±3.68**23.43±4.51**

^*P＜0.05，^**P＜0.01与生理盐水组比较；

^ΔΔP＜0.01与假手术组比较。

知母总皂苷提取物灌胃对缺血再灌注所致SD大鼠心肌损伤有保护作用，可明显抑制缺血再灌注所致大鼠心肌损伤时LDH、CK溢出，降低血清LDH、CK活性，缩小心肌梗塞区重量，并有一定的量效关系。与实验剂量的地奥心血康胶囊比较，中剂量知母总皂苷提取物的效果与地奥心血康胶囊相似。

实施例7、知母总皂苷提取物粉针剂的制备

取知母总皂苷提取物30g，加入右旋糖苷30g，加500ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至2000ml，加3.0g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；灌装到无菌的西林瓶中，每瓶2ml，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。

实施例8、知母总皂苷提取物粉针剂的制备

取知母总皂苷提取物60g，加500ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；冷冻干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。

实施例9、知母总皂苷提取物粉针剂的制备

取知母总皂苷提取物40g，加入乳糖50g，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；喷雾干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。

实施例10、知母总皂苷提取物粉针剂的制备

(1)处方

注射用知母总皂苷提取物半成品	150g
		甘露醇	400g
注射用水	加至10000ml
		共制成	10000瓶

(2)制备工艺

按以上处方称取处方量知母总皂苷提取物，加入到适量注射用水中，搅拌使其溶解；加入处方量甘露醇，搅拌使完全溶解，加注射用水至全量；加入液体量的0.1％针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；灌装，半轧塞；冷冻干燥，压塞轧盖。共制得9735瓶，成品率为97.35％。

实施例11、知母总皂苷提取物小针剂的制备

取知母总皂苷提取物5g，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶10ml，灭菌即可。

实施例12、知母总皂苷提取物小针剂的制备

取知母总皂苷提取物10g，加入丙二醇30g，加200ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶5ml，灭菌即可。

实施例13、知母总皂苷提取物葡萄糖输液的制备

取知母总皂苷提取物2g，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加2000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶100ml，灭菌即可。

实施例14、知母总皂苷提取物葡萄糖输液的制备

取知母总皂苷提取物2g，加入葡萄糖250g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。

实施例15、知母总皂苷提取物氯化钠输液的制备

取知母总皂苷提取物1g，加入氯化钠90g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至10000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。

实施例16、知母总皂苷提取物片剂的制备

(1)处方

知母总皂苷提取物	1000.0g
		微晶纤维素	1170.0g
预胶化淀粉	690.0g
		乳    糖	125.0g
5％PVP无水乙醇	适量
		硬脂酸镁	15.0g
共制成	10000片

(2)制备工艺

按以上处方分别称取处方量的主药与辅料，按等量递加法混合均匀后照处方工艺项下进行制软材、制颗粒，干燥，整粒等过程，计算好片重后用单冲压片机和10.5mm浅凹冲模压片，控制裸片硬度5～7kg，共制得片剂9698片，成品率为96.98％。

采用滚转喷雾法包衣，包衣工艺如下：

包衣液的配制：胃溶薄膜衣料：85G61235，由上海卡乐康包衣技术有限公司提供

包衣工艺：将待包衣裸片(硬度5～7kg)放入包衣锅中，启动搅拌装置和鼓风加热装置，待裸片温度升至40℃时，开始打开喷枪对准片床的上1/3处喷入包衣液包衣，控制片床温度38～42℃，气磅压力6kg，包衣液流速为50mL/min，包衣膜重占包衣片重的3％。

实施例17、知母总皂苷提取物片剂的制备

取知母总皂苷提取物100g，微晶纤维素80g、乳糖15g、预胶化淀粉60g，过筛，混合均匀，用适量10％PVP乙醇溶液制软材，制粒，干燥，加入硬脂酸镁3g，整粒，压片，制成1000片。

实施例18、知母总皂苷提取物胶囊剂的制备

(1)处方

知母总皂苷提取物	1000.0g
		微晶纤维素	1000g
羧甲基淀粉钠	140g
		无水乙醇	适量
滑石粉	80g
		共制成	10000胶囊

(2)制备工艺  按以上处方分别取原料药知母总皂苷提取物及处方中其它辅料分别过100目筛，置60℃烘干，称取处方量知母总皂苷提取物与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等量递加法混合均匀，用适量无水乙醇制软材，30目筛制粒，50～60℃干燥2小时，用30目筛整粒，加入处方量的滑石粉和羧甲基淀粉钠混合均匀。

实施例19、知母总皂苷提取物胶囊剂的制备

取知母总皂苷提取物100g、微晶纤维素100g、羧甲基淀粉钠14g、滑石粉8g，分别过100目筛，置60℃烘干，取知母总皂苷提取物与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等量递加法混合均匀，用适量无水乙醇制软材，30目筛制粒，50～60℃干燥2小时，用30目筛整粒，加入处方量的滑石粉和羧甲基淀粉钠混合均匀。

Claims (14)

1.知母总皂苷提取物在制备心肌缺血产品中的应用。

2.知母总皂苷提取物的组合物在制备心肌缺血产品中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的知母总皂苷提取物的主要成分为知母皂苷B-II化合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的知母皂苷B-II化合物在知母总皂苷提取物中含量范围是30％～70％。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的心肌缺血产品是指用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心肌缺血及其相关疾病的产品。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的知母总皂苷提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)提取：取知母原料若干，提取，得提取液，即知母总提取物；

(2)分离纯化：将提取液分离纯化，即得知母总皂苷提取物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的提取方法是包括溶剂提取法在内的本领域公知的所有可以使用的方法。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的提取方法是溶剂提取法。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的提取方法是：取知母药材若干，加入提取溶剂混合，提取，将提取液过滤、浓缩，即得知母药材总提取物。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的分离纯化方法是包括溶剂分离法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、沉淀法、盐析法、柱层析法或结晶与重结晶和分步结晶法中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的分离纯化方法是包括溶剂萃取法或大孔吸附树脂法中的一种。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的大孔吸附树脂法的操作包括如下步骤：

(1)将样品液通过大孔吸附树脂柱，用水淋洗除去杂质；

(2)用含水低级醇洗脱，收集低级醇洗脱液；

(3)浓缩至干，并粉碎；粉末用丙酮溶解、滤过、回收，静置，析出结晶，过滤，洗涤结晶，即得知母总皂苷提取物。

13.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的知母总皂苷提取物的制备方法还包括干燥的步骤。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的干燥方法是包括常压干燥法、减压干燥法、真空干燥法、喷雾干燥法、冷冻干燥法、远红外加热干燥法或微波干燥法中的一种或多种。

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