CN1681933A - 2－酮基－l－古洛糖酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从D－山梨糖醇生产2－KGA或其盐的方法，其中使用Gluconobacter或Acetobacter属的微生物的混合培养物，通过多阶段连续发酵模式或单阶段半连续发酵模式来进行。所述微生物中的一种是G.oxydans DSM 4025。

Description

2-酮基-L-古洛糖酸的生产方法
技术领域
本发明涉及从D-山梨糖醇对2-酮基-L-古洛糖酸(2-keto-L-gulonicacid，2-KGA)进行高产量发酵生产的方法，所述方法通过利用由多阶段连续模式或单阶段半连续(重复补料分批)模式组成的发酵系统来进行。
背景技术
2-KGA是用于生产L-抗坏血酸的重要中间产物。根据公知的Reichstein方法可将该化合物转化为L-抗坏血酸。日本专利公开号40154/1976中公开了通过Acetobacter或Pseudomonas属的微生物从D-山梨糖醇来生产2-KGA的方法。上述微生物能在有氧条件下氧化D-山梨糖醇，产生2-KGA，然而，其产量很低，少于6g/L。由于所述相对低的产量，上述方法远不能用于工业规模的生产，尤其是当D-山梨糖醇作为起始原料的情况下。
已知有若干种Acetobacter(现在被分类到Gluconobacter中)的菌株，例如A.xylinum和A.suboxydans，能从D-山梨糖醇高效生产L-山梨糖。D-山梨糖醇是比L-山梨糖更为廉价的原料，但L-山梨糖能更有效率地转化为2-KGA。
发明内容
本发明提供了用于从D-山梨糖醇以高产量生产2-KGA的方法，所述方法通过多阶段连续发酵或者通过单阶段半连续(重复补料分批)发酵来进行。
更具体地，本发明涉及从D-山梨糖醇来生产2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)或其盐的方法，所述方法通过多阶段连续发酵或单阶段半连续发酵来进行，其中使用属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体的混合培养物，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖；可选地，所述方法还包括从发酵培养液中回收2-KGA。
具体实施方式
根据《布达佩斯条约》的规定，G.oxydans DSM 4025于1987年3月17日被保藏在Gttingen(德国)的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，编号为DSM No.4025。送交保藏者是东方科学仪器进出口集团有限公司，其是为中华人民共和国北京市三里河路52号的中国科学院微生物研究所而送交的。有效的送交保藏者是所述的研究所，其完整地址是中国人民共和国北京市海淀区中关村中国科学院微生物研究所，100080。
该菌株的传代培养物也已于1992年3月30日被保藏在NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST)，TsukubaCentral 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan，这也是根据《布达佩斯条约》的规定，保藏编号为FERM BP-3812。送交保藏者是NipponRoche K.K.，6-1，Shiba 2-chrome，Minato-ku，Tokyo 105-8532 Japan。该传代培养物也是最优选用于本发明的。
多阶段连续发酵包含不止一个发酵容器。多阶段连续系统的一个例子是两阶段连续发酵系统，其由培养基储藏罐、第一发酵罐、第二发酵罐和收获容器构成。通过在整个过程中使用不止一个发酵容器，使得该过程的产量达到最佳。
在传统的分批或补料分批操作中，每批之后弃去生物物质导致了较高的生产成本，反应器清理和启动(接种)所需要的时间导致了反应器生产能力的损失。
2-KGA发酵方法中的多阶段连续培养模式能获得较高的对2-KGA的生产能力以及较高的2-KGA浓度，而且没有残留的D-山梨糖醇和L-山梨糖。这是用于2-KGA钠制备中分离步骤的优选方法。
在所述连续发酵的起始环节，可以应用分批或补料分批操作。
本发明中，无需针对微生物的固定方法，例如化学键或用于细胞保持的物理方法，例如基质包埋，也无需生物物质控制或保持，例如膜系统，就可能从D-山梨糖醇来生产2-KGA。因此，当从D-山梨糖醇到2-KGA的多阶段发酵生产系统建立起来后，对能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖的微生物和G.oxydans DSM 4025进行混合培养就能容易且直接地用作低成本的2-KGA发酵方法。
D-山梨糖醇在初始生产培养基和用于连续模式的补料培养基中的浓度可以分别是：对半连续模式而言，大约0g/L至大约250g/L；对多阶段连续模式而言，5g/L至250g/L。此外，用于半连续模式的补料培养基中可以含有约20g/L至约800g/L范围内的D-山梨糖醇。用于补料分批模式的补料体积可以根据工作体积和发酵条件而改变。在用于连续模式的补料培养基中D-山梨糖醇的浓度范围内，稀释速率可以被设置为大约0.01h-1至大约0.05h-1。
本发明提供了通过连续发酵从D-山梨糖醇生产2-KGA或其盐的方法，所述方法包括：
(a)在一个或多个发酵容器里，于含有D-山梨糖醇的营养培养基中，培养属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydansDSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征；
(b)向发酵容器中连续加入含有浓度为大约5g/L至大约250g/L的D-山梨糖醇的营养培养基，发酵的稀释速率设置为大约0.01h-1至大约0.05h-1；
(c)连续地从发酵容器中取出发酵培养液；和
(d)从所述发酵培养液中回收2-KGA。
本发明还涉及从D-山梨糖醇生产2-KGA的单阶段半连续发酵方法。所述半连续发酵是获得从D-山梨糖醇对2-KGA的高生产能力的方法，其中，部分培养液被用作下一次发酵的种子。48小时的培养之后，全部培养液中的大约10％(v/v)可被用作第二步的种子，向发酵罐中注满新鲜的营养培养基，并进行培养。对该循环的重复可以持续进行。较之传统的分批或补料分批操作，所述半连续操作能利用培养液作为下一次培养的种子。因此，所述半连续操作可被应用于2-KGA的发酵，而无需进行若干次从小量种子接种的步骤，并且不需要用于准备培养物的时间，例如清理和启动时间。此外，在长时间的发酵过程中反应器都能保持更高的生产能力。
因此，本发明的一个目的是提供通过半连续发酵从D-山梨糖醇生产2-KGA或其盐的方法，所述方法包括：
(a)在发酵容器里，于含有初始浓度为大约0g/L至大约250g/L的D-山梨糖醇的营养培养基和含有浓度为大约20g/L至大约800g/L的D-山梨糖醇的用于补料分批模式的补料培养基中，培养属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征；
(b)用发酵培养液的一部分作为下一次补料分批发酵的种子培养物；
(c)持续重复上述过程，以及
(d)从发酵培养液中回收2-KGA。
种子与下一次发酵的体积比可以在大约0.1％至大约90％(v/v)的范围内，优选在大约5％至大约90％(v/v)的范围内。
一次补料分批发酵的周期可以根据用于下一次发酵循环的种子体积或发酵条件而改变，所述发酵条件例如是D-山梨糖醇在初始生产培养基和在用于补料分批模式的补料培养基中的浓度。
因此，在本发明中，可以将一个补料分批发酵循环的周期与用于下一次发酵的种子的量加以协调，以提高对2-KGA的生产能力。
初始生产培养基中D-山梨糖醇的浓度可以在大约0g/L至大约250g/L之间。此外，用于补料分批模式的补料培养基可以含有大约20g/L至大约800g/L范围内的D-山梨糖醇。
所述连续和半连续发酵可以开展于发酵培养液中溶解氧浓度为大约0.1％至大约100％空气饱和度的情况下，优选为大约5％至大约100％空气饱和度。
因此，本发明的一个方面是提供从D-山梨糖醇生产2-KGA或其盐的方法，所述方法通过多阶段连续发酵或单阶段半连续发酵来进行，其中使用属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体的混合培养物，所述突变体具有G.oxydansDSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖；所述方法中，发酵进行于发酵培养液中溶解氧浓度在大约0.1％至大约100％之间的情况下。在一种优选实施方式中，溶解氧浓度在大约5％至大约100％之间。
除用作本发明起始原料的D-山梨糖醇之外，其它碳源物质也可被加入，例如甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿糖醇等。
若干有机或无机物质也可被用作氮源，例如酵母提取物、肉类提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。可以使用硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等无机物。
上述营养物的混合比例和每种成分的量可随所采用的微生物的属性而改变。起始原料D-山梨糖醇的量、被接种的微生物中的一种相对另一种的量、接种次数和其它培养条件可以根据具体情况的细节来进行选择或确定。
培养条件还可以根据所用微生物的种类和特征而改变。培养基的成分当然可以根据具体情况的细节被加以选择或确定，以最有效地产出计划产物，虽然培养温度可以保持在大约13℃至大约36℃之间，优选在大约18℃至大约33℃之间，培养基的pH值可以保持在大约4.0至大约9.0之间，优选在大约6.0至大约8.0之间。
因此，在本发明的一种实施方式中，上述用于通过多阶段连续发酵或单阶段半连续发酵从D-山梨糖醇来生产2-KGA或其盐的方法中，所述发酵进行于pH为大约4.0至大约9.0之间。优选的pH在大约6.0至大约8.0之间。
本发明的另一种实施方式是上述用于通过多阶段连续发酵或单阶段半连续发酵从D-山梨糖醇来生产2-KGA或其盐的方法，其中，所述发酵进行于大约13℃至大约36℃的温度。一种优选的实施方式是温度在大约18℃至33℃之间。
为维持培养基的pH值，可在培养期间的适当时候向所述培养基中加入适当量的任何合适的酸性或碱性试剂。或者，通过加入合适的缓冲液或对培养物进行缓冲也可以达到同样的目的。
通过产L-山梨糖的菌株从D-山梨糖醇生产得到的L-山梨糖可被产2-KGA的菌株所使用，以制成2-KGA。任何能够将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物都可与G.oxydans DSM 4025一起用于本发明。
属于Gluconobacter或Acetobacter属的能够从D-山梨糖醇生产L-山梨糖的微生物的例子包括G.suboxydans IFO 3130、G.suboxydans IFO 3255、G.suboxydans IFO 3256、G.suboxydans IFO 3257、G.suboxydans IFO3258、G.suboxydans IFO 3289、G.suboxydans IFO 3290、G.suboxydansIFO 3291、G.gluconicus IFO 3171、G.gluconicus IFO 3285、G.gluconicusIFO 3286、G.gluconicus IFO 3244、G.albidus IFO 3251、G.albidus IFO3253、G.industrius IFO 3261、G.cerinus IFO 3262、G.cerinus IFO 3263、G.cerinus IFO 3265、G.cerinus IFO 3266、G.cerinus IFO 3267、G.cerinusIFO 3270、G.diacetonicus IFO 3273、G.roseus IFO 3990、A.aceti spp.orleans IFO 3259、A.aceti spp.aceti IFO 3281、A.liquefaciens IFO 12257、A.liquefaciens IFO 12258、A.liquefaciens IFO 12388、A.aceti spp.xylinumIFO 3288、A.aceti spp.xylinum IFO 13693、A.aceti spp.xylinum IFO 13772和A.aceti spp.xylinum IFO 13773。
因此，本发明涉及通过多阶段连续发酵或单阶段半连续发酵从D-山梨糖醇生产2-KGA或其盐的方法，其中使用属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物与G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体的混合培养物，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖，其选自由Gluconobacter suboxydans、Gluconobacter rubiginosus、Gluconobacter albidus、Gluconobacterindustrius、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter diacetonicus、Gluconobacter roseus、Gluconobacter gluconicus、Acetobacter aceti spp.orleans、Acetobacter aceti spp.xylinum和Acetobacter liquefaciens所构成的组。优选的微生物选自由G.suboxydans IFO 3255、G.suboxydans IFO3256、G.suboxydans IFO 3258、G.suboxydans IFO 3290、G.suboxydansIFO 3291、G.gluconicus IFO 3285和G.cerinus IFO 3267所构成的组。更优选地，发酵是通过对G.suboxydans IFO 3291和G.oxydans DSM 4025进行混合培养来进行的。
上述微生物被保存于公众保藏单位，用于交付给任何提出要求的人。此类保藏单位之一是Institute of Fermentation，Osaka，Japan(IFO)。
上面定义的微生物中，还包括此类物种的由《国际原核生物命名法规》(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)所定义的具有相同物理-化学属性的同物异名体(synonym)或基原异名体(basonym)。
所述微生物通常在有氧条件下被培养于水性培养基中，所述培养基中含有D-山梨糖醇和适当的营养物，例如氮源和微量元素。然而，任何传统的发酵条件都可被用来实施本发明的方法。
可从反应混合物中分离出根据本方法获得的2-KGA，例如，通过形成盐来分离，或者通过利用产物和周围杂质属性的不同来分离，所述属性例如是溶解度、被吸收性和溶剂间的分布系数。吸附，例如在离子交换树脂上进行的，是一种方便的用于分离产物的方法。可用传统方法对由此得到的产物进行进一步的纯化，例如，通过重结晶或色谱。或者，通过酯化及随后的烯醇化和内酯化，所述的反应混合物能被直接用于向L-抗坏血酸的转化。
下面的实施例将对本发明加以阐述。转化率的计算基于生产出的2-KGA的量与所用的D-山梨糖醇的量之比。
实施例1  控制DO对G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291进 行混合培养从12％的D-山梨糖醇来开展两阶段2-KGA连续发酵
(1)制备G.oxydans DSM 4025菌株的种子培养物
含有8％的L-山梨糖(单独灭菌)、0.05％的甘油、0.25％的MgSO4·7H2O、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母(灭菌前pH为7.0)、0.5％的CaCO3、0.5％的尿素(单独灭菌)和0.03％的消泡剂(Actcol：Takeda)的种子培养基被装入到500ml的Erlenmeyer瓶中(每瓶100ml)，并在121℃灭菌20分钟。将一接种环量的微生物DSM 4025的细胞接种到该种子培养基中，在30℃培养24小时。
(2)制备G.suboxydans IFO 3291的种子培养物
含有2％的D-山梨糖醇、0.3％的酵母提取物(Oriental Yeast)  0.3％的牛肉提取物、0.3％的玉米浆、1％的多聚蛋白胨、0.1％的尿素、0.1％的KH2PO4、0.02％的MgSO4·7H2O、0.1％的CaCO3(灭菌前pH为7.0)和0.03％的消泡剂的种子培养基在121℃进行20分钟的高压灭菌。一接种环量的G.suboxydans IFO 3291的细胞被转移到500ml Erlenmeyer瓶里的100ml种子培养基中，在28℃培养24小时。
(3)接种到主发酵中
每种种子培养物制备100ml(总共的种子体积为200ml)，接种到2L的初始生产培养基中，所述初始生产培养基中含有4％的D-山梨糖醇、1％的玉米浆、0.01％的MgSO4·7H2O、0.025％的KH2PO4、0.4％的酵母提取物(BYF 100：Universal Foods)和0.15％的消泡剂。当2-KGA的浓度通过补料分批模式升高至120g/L，此阶段与90％的溶解氧(dissolvedoxygen，DO)水平相当，之后培养模式就被转变为连续模式。
(4)两阶段连续发酵
在所述两阶段连续发酵系统中，玻璃瓶发酵罐装备了与上述相同的装置。该发酵系统由两个发酵罐组成。这两个发酵罐的工作体积都是2L。为提高对2-KGA的生产能力和提高连续发酵的稀释速率，在连续发酵的起始环节应用了补料分批操作。用于补料分批操作的培养基由60％的D-山梨糖醇、6.67％的玉米浆、0.0287％的MgSO4·7H2O、0.0717％的KH2PO4和0.2％的消泡剂构成。在30小时的补料分批操作阶段，用第一个蠕动泵向主发酵罐提供600ml用于补料分批模式的补料培养基。此后，用第二个蠕动泵来控制连续补料速率。再用第三个蠕动泵将从第一发酵罐中取出的培养液进一步地转移到第二阶段发酵罐中。最后，用第四个蠕动泵将培养液取到收获储藏罐中，而工作体积被保持为2L。温度被控制在28℃，搅拌速度和通气速率被分别设置为800rpm和1.0L/min。用氢氧化钠溶液将pH控制为7.0。
已知对通过上述混合培养从D-山梨糖醇来生产2-KGA的过程进行DO控制，有助于增加G.suboxydans IFO 3291的细胞活性和2-KGA的产量。因此，发酵开始后的9至52小时之间，第一阶段发酵罐的DO水平被控制在10％。DO水平是通过提供混合了纯氧的空气来控制的。在第一发酵罐和第二发酵罐中，稀释速率(D)被设置在0.035h-1至0.045h-1的范围内。发酵持续250小时。表1显示了G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291的混合物在上述两阶段连续模式中的发酵活性。在此连续模式中，平均产生出了74.5g/L的2-KGA。在此连续模式的稳定状态下，第一发酵罐中对2-KGA的生产能力被计算为2.57g/L/h。此外，总生产能力被计算为1.33g/L/h，总的2-KGA摩尔转化率是60.6％。
表1：使用3L发酵罐的两阶段连续模式中的发酵活性
状态   总活性 第一阶段 第二阶段
稀释速率(平均：小时-1)     0.0179     0.0443     0.0358
2-KGA浓度(平均：g/L)     74.5     58.0     74.5
对2-KGA的生产能力(g/L/小时)     1.33     2.57     -
2-KGA摩尔转化率(％)     60.6     52.9     60.6
实施例2  通过对G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291的混合 培养从13％的D-山梨糖醇来进行两阶段2-KGA连续发酵
初始生产培养基和用于补料分批模式的补料培养基由与实施例1中所述相同的成分构成。所述两阶段连续发酵按照实施例1中所描述的来进行。所述的两阶段2-KGA连续发酵中使用含有13％的D-山梨糖醇、3％的玉米浆、0.25％的MgSO4·7H2O、0.05％的甘油、酵母提取物(BYF100)和0.15％的消泡剂的连续补料培养基(10L)。
发酵被进行了160小时。在发酵期间保持了相对稳定的发酵活性，在第一和第二发酵罐中，平均D都为0.0361h-1。结果被概括于表2中。在连续模式的稳定状态下生产出了88.2g/L的2-KGA。在该连续模式的稳定状态下，第一发酵罐中对2-KGA的生产能力被计算为2.28g/L/h。总的生产能力被计算为1.59g/L/h，D-山梨糖醇的摩尔转化率为63.0％。使用该连续补料培养基，对2-KGA的生产能力比实施例1中所述至少要高19％。
表2：使用3L发酵罐的两阶段连续模式中的发酵活性
状态   总活性 第一阶段 第二阶段
稀释速率(平均：小时-1)     0.0181     0.0361     0.0361
2-KGA浓度(平均：g/L)     88.2     63.4     88.2
对2-KGA的生产能力(g/L/小时)     1.59     2.28     -
2-KGA摩尔转化率(％)     63.0     51.4     63.0
实施例3  通过对G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291的混合 培养从14％的D-山梨糖醇来进行两阶段2-KGA连续发酵
在此两阶段连续发酵中，在连续补料培养基中D-山梨糖醇的浓度为14％。该连续补料培养基中其它成分与实施例2中的相同。所述两阶段连续发酵按照实施例1中所描述的来进行。初始生产培养基和用于补料分批模式的补料培养基(600ml)与实施例1中所述的培养基相同。
对第一和第二发酵罐而言，D于恰当的时机在分别为0.015至0.060h-1范围内和0.020至0.050h-1的范围内变化，以研究出将D-山梨糖醇完全转化为2-KGA并且在最终的收获罐中没有D-山梨糖醇和L-山梨糖残留的必要的D值。发酵在第700个小时被终止。表3中概括了G.oxydans DSM4025和G.suboxydans IFO 3291的混合物在两阶段连续模式中的发酵活性。在此两阶段连续模式中，表观D为0.0331h-1的情况下，获得了含有75.1g/L 2-KGA的培养液，总的稀释速率被计算为0.0166h-1。总的2-KGA摩尔转化率为48.9％。在该连续模式的稳定状态下，第一发酵罐中对2-KGA的生产能力和总的对2-KGA的生产能力分别被计算为2.07g/L/h和1.24g/L/h。该两阶段连续方法在第一发酵罐中使用了10％的DO控制。在第一发酵罐中进行DO控制能提高G.suboxydans IFO 3291细胞将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的活性，而且2-酮基-D-古洛糖酸(2-keto-D-gluconicacid，2-KD)等副产物不在最终发酵罐的培养液中积累。通过DO控制可以开展更为稳定的2-KGA生产。
表3：使用3L发酵罐的两阶段连续模式中的发酵活性
状态   总活性 第一阶段 第二阶段
稀释速率(平均：小时-1)     0.0166     0.0331     0.0331
2-KGA浓度(平均：g/L)     75.1     62.6     75.1
对2-KGA的生产能力(g/L/小时)     1.24     2.07     -
2-KGA摩尔转化率(％)     48.9     45.5     48.9
实施例4  通过对G.oxydans DSM 4025和G.suboxydans IFO 3291的混合 培养从D-山梨糖醇来进行单阶段2-KGA半连续发酵
如实施例1所述的种子培养物，每种取100ml接种到1.5L的初始生产培养基中，所述初始生产培养基中含有2％的D-山梨糖醇、3％的玉米浆、0.25％的MgSO4·7H2O、0.05％的甘油、0.4％的BYF100和0.15％的消泡剂。用于补料分批模式的补料培养基(550ml)的成分由60％的D-山梨糖醇、10.67％的玉米浆、0.023％的MgSO4·7H2O、0.0573％的KH2PO4和0.2％的消泡剂组成。2-KGA半连续生产培养基由与初始生产培养基相同的成分构成。应用到初始培养基和每一批补料培养基中的D-山梨糖醇的量分别为30g和330g。一次补料分批发酵的间隔时间被设置为30小时。当最初的D-山梨糖醇被完全消耗后，开始补料分批发酵模式。
第一次补料分批发酵30小时后，收获90％(v/v)的培养液。留在发酵罐中的剩余10％(v/v)的培养液被用作下一次发酵的种子。再向发酵罐中注满含有与初始生产培养基相同成分的半连续生产培养基。之后，将5％(v/v)的G.suboxydans IFO 3291接种到主发酵罐中。通过持续重复该循环，主发酵罐中的发酵得以被不断地重复。发酵期间用NaOH将pH控制在7.0，对半连续发酵进行10％的DO控制。在从D-山梨糖醇进行的2-KGA半连续发酵中，温度被控制在28℃。搅拌速度和通气速率被分别设置为800rpm和0.75L/分钟。
主发酵重复进行5次，总的发酵时间为165小时。对每批操作而言，初始培养基和补料培养基中D-山梨糖醇的总量是360g。表4显示了半连续模式中的2-KGA发酵活性。2-KGA的产量在119.5g/L至130.7g/L的范围内，平均的2-KGA产量为124.6g/L。每批对2-KGA的生产能力在3.93g/L/h至4.33g/L/h的范围内，对2-KGA的平均生产能力为4.14g/L/h。D-山梨糖醇的摩尔转化率超过了70.0％。该半连续的2-KGA发酵相当稳定，该方法能生产出超过119g/L的2-KGA，并且很容易在长时间的生产中保持超过4.00g/L/h的对2-KGA的平均生产能力。
表4：使用3L发酵罐的单阶段半连续模式中的发酵活性
批次号码 1  2  3  4  5
2-KGA产量(g/L) 123.3  130.7  130.1  119.5  119.6
每批对2-KGA的生产能力(g/L/h) 4.11  4.33  4.30  3.99  3.96
每批使用的D-山梨糖醇总量(g) 360.0  360.0  360.0  360.0  360.0
2-KGA产率(％) 70.0  74.1  73.7  70.0  70.1
实施例5  较短的批次间隔时间对使用新的生产培养基从D-山梨糖醇对2- KGA进行单阶段半连续发酵的影响
一次补料分批发酵的间隔时间被设置为24小时。其中使用的初始生产培养基和半连续生产培养基与实施例4中所描述的是相同的培养基。在该初始培养基和每一批的补料培养基中，D-山梨糖醇的量分别为30g和330g。
主发酵被重复了5次，总的发酵时间为130小时。每批操作中，在初始培养基和补料培养基中的D-山梨糖醇的总量是360g。表5显示了在每批间隔时间较短的情况下半连续模式中的2-KGA发酵活性。2-KGA的产量在105.6g/L至110.8g/L的范围内，平均的2-KGA产量为108.2g/L。每批中对2-KGA的生产能力在4.40g/L/h至4.62g/L/h的范围内，对2-KGA的平均生产能力是4.51g/L/h。该生产能力比实施例4所述的要高8.94％。D-山梨糖醇的摩尔转化率超过了61.0％。间隔时间为24小时提高了半连续操作中对2-KGA的平均生产能力。
表5：使用3L发酵罐的单阶段半连续模式中的发酵活性
批次号码 1  2  3  4  5
2-KGA产量(g/L) 110.8  109.8  107.6  107.0  105.6
每批对2-KGA的生产能力(g/L/h) 4.62  4.58  4.48  4.46  4.40
每批使用的D-山梨糖醇总量(g) 360.0  360.0  360.0  360.0  360.0
2-KGA产率(％) 64.2  63.7  62.4  62.1  61.2

Claims (10)

1.一种用于从D-山梨糖醇生产2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)或其盐的方法，所述方法通过多阶段连续发酵或单阶段半连续发酵来进行，其中使用属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydans DSM4025(FERM BP-3812)或其突变体的混合培养物，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖；可选地，所述方法还包括从发酵培养液中回收2-KGA。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的多阶段连续发酵包括如下步骤：
(a)在一个或多个发酵容器里，于含有D-山梨糖醇的营养培养基中，培养属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydansDSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征；
(b)向发酵容器中连续加入含有浓度为大约5g/L至大约250g/L的D-山梨糖醇的营养培养基，发酵的稀释速率设置为大约0.01h-1至大约0.05h-1；
(c)连续地从发酵容器中取出发酵培养液；和
(d)从所述发酵培养液中回收2-KGA。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述的半连续发酵包括如下步骤：
(a)在发酵容器里，于含有初始浓度为大约0g/L至大约250g/L的D-山梨糖醇的营养培养基和含有浓度为大约20g/L至大约800g/L的D-山梨糖醇的用于补料分批模式的补料培养基中，培养属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物以及G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)或其突变体，所述属于Gluconobacter或Acetobacter属的微生物能从D-山梨糖醇生产L-山梨糖，所述突变体具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征；
(b)用发酵培养液的一部分作为下一次补料分批发酵的种子培养物；
(c)持续重复上述过程，以及
(d)从所述发酵培养液中回收2-KGA。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述种子培养物与下一次补料分批发酵的体积比在大约0.1％至大约90％v/v的范围内，优选在大约5％至大约90％v/v的范围内。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的发酵进行于发酵培养液中溶解氧的浓度在大约0.1％至大约100％之间的情况下，优选在大约5％至大约100％之间。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵开展于pH在大约4.0至大约9.0之间的情况下，优选在大约6.0至大约8.0之间。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵开展于温度在大约13℃至36℃之间，优选在大约18℃至大约33℃之间。
8.如权利要求1所述的方法，其中能将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物是选自由Gluconobacter suboxydans、Gluconobacter rubiginosus、Gluconobacter albidus、Gluconobacter industrius、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter diacetonicus、Gluconobacter roseus、Gluconobactergluconicus、Acetobacter aceti spp.orleans、Acetobacter aceti spp.xylinum和Acetobacter liquefaciens所构成的组中的微生物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述的微生物选自由G.suboxydansIFO 3255、G.suboxydans IFO 3256、G.suboxydans IFO 3258、G.suboxydans IFO 3290、G.suboxydans IFO 3291、G.gluconicus IFO 3285和G.cerinus IFO 3267所构成的组。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述的发酵通过对G.suboxydansIFO 3291和G.oxydans DSM 4025进行混合培养来开展。
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