CN1662550A

CN1662550A - 用于检测和/或诊断宫颈癌和其它癌症的来自人乳头瘤病毒16和18的e2、e6和e7蛋白的肽

Info

Publication number: CN1662550A
Application number: CN03815024.7A
Authority: CN
Inventors: Y·X·胡; M·J·罗森菲尔德
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2023-07-02
Also published as: AU2003253784A8; US20050221295A1; MXPA04012912A; US7316908B2; US7267961B2; US20040110925A1; WO2004005469A2; AU2003253784A1; CN100351268C; US20060110794A1; WO2004005469A3; US6933123B2

Abstract

来自人乳头瘤病毒(HPV)的E2、E6或E7早期编码区的可溶于水介质中的分离的蛋白序列或肽，其特征包括色氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸残基的相对缺乏，以及甘氨酸和天冬酰胺残基的相对丰富。也公开了来自HPV 16和18的E2、E6或E7早期编码区的分离的蛋白序列或肽，以及用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法。检测和/或诊断癌症或细胞异常可以包括检测和/或诊断癌前期或恶化前状况、子宫颈发育异常、子宫颈癌、细胞中空、过度角化、上皮内损害和其它癌症。优选地，本发明的用于检测和/或诊断癌症或细胞异常的新颖方法包括步骤：(1)将体液或组织样品与分离的蛋白序列或肽反应；(2)形成抗体－肽复合物；和(3)检测抗体－肽复合物。

Description

用于检测和/或诊断宫颈癌和其它癌症的来自人乳头瘤病毒16和18的E2、E6和E7蛋白的肽

技术领域

本发明总的来说涉及肽领域，所述肽对于针对人类乳头瘤病毒(HPV)形成的抗体具有活性，更具体地，本发明是涉及从HPV的E2、E6和E7癌蛋白的早期编码区分离、纯化或衍生出的新颖的肽，以及通过免疫测定法(immunoassay)来检测和/或诊断与HPV相关的上皮细胞异常(epithelial cell abnormalities)、癌前期状况(precancerousconditions)和癌症的方法。

背景技术

人类乳头瘤病毒(HPV)实质上可以引起所有的子宫颈癌，如此命名人类乳头瘤病毒的原因在于某些类型可诱导疣或乳头瘤(Nobbenhuis等人，“Relation of human papillomavirus status to cervicallesions and consequences for cervical-cancer screening：a prospectivestudy，”The Lancet，354：20-25，1999；Cuzick等人，“A systematic reviewof the role of human papilloma virus(HPV)testing within a cervicalscreening programme：summary and conclusions，”British Journal ofCancer，83：561-565，2000)。这些癌症不仅包括鳞状细胞癌(Nobbenhuis等人，1999)，而且包括腺癌(Pirog等人，“Prevalence of humanpapillomavirus DNA in different histological subtypes of cervicaladenocarcinoma，”American Journal of Pathology，157：1055-1062，2000)。这些病毒也与如下癌症密切相关：外阴和阴道癌(Frisch等人，“Humanpapillomavirus-associated carcinomas in Hawaii and the mainland US，”Cancer 88：1464-1469，2000；Sugase等人，“Distinct manifestations ofhuman papillomaviruses in the vagina，”International Journal of Cancer，72：412-415，1997)，以及肛门癌(Frisch等人，2000)和阴茎癌(Gregoire等人，“Preferential association of human papillomavirus with high-gradehistologic variants of penile-invasive squamous cell carcinoma，”Journal ofthe National Cancer Institute，87：1705-1709，1995)。

而且，HPV可能是造成头部和颈部区域中某些癌症的原因(Mellin等人，“Human papillomavirus(HPV)DNA in tonsillar cancer：clinicalcorrelates，risk of relapse，and survival，”International Journal of Cancer，89：300-304，2000；Zumbach等人，“Antibodies against oncoproteins E6 andE7 of human papillomavirus types 16 and 18 in patients withhead-and-neck squamous-cell carcinoma，”International Journal of Cancer，85：815-818，2000)，似乎与更致命的黑素瘤有关(Dreau等人，“Humanpapillomarivus in melanoma biopsy specimens and its relations tomelanoma progression，”Annals of Surgery，231：664-671，2000)，在肺癌(Soini等人，“Presence of human papillomavirus DNA and abnormal p53protein accumulation in lung carcinoma，”Thorax 51：887-893，1996)以及可能在其它癌症中也起着作用。

子宫颈癌是全世界妇女中第二常见的癌症。每年全球大约有450,000名妇女被诊断出患有子宫颈癌，接近300,000名妇女死于这一癌症。由于五十年前通过细胞学进行的有组织的子宫颈癌筛选的出现，在发达国家子宫颈癌的死亡率已经显著地下降。事实上，子宫颈癌被认为是可以预防的。在这一点上，预防的关键在于通过可以实施的和支付得起的筛选程序和方法及时鉴别和控制癌前期病变或者早期癌症。

目前，在全球范围内大约有百分之十二(12％)的女性癌症是由子宫颈的HPV感染引起的。在医学界中存在这样的共同看法，即致癌HPV的检测将是鉴别癌症受害者或那些对该疾病存在高风险的个体的一种有效的方式。特别地，HPV检测将有助于癌症或细胞异常的早期检测，在癌症或细胞异常处于更易于治愈阶段的某一时刻时，及时提示癌症。

用于子宫颈癌的公共卫生筛选的主要方法一直是帕帕尼科拉乌(Pap)涂片(Papanicolaou’s smear)。由于多种原因，帕帕尼科拉乌涂片不是一种理想的筛选测试。缺点包括：获得样品比较困难，假阴性的比率高(高达百分之二十(20％))，以及要求经过高级训练的人员来进行专业化的实验。本技术领域的技术人员已经开发了核酸筛选方法，但这样的方法也不理想，主要是由于其高成本和对经过高级训练人员的类似要求。本技术领域的技术人员开发的另一种检测方法涉及所谓的“DNA杂交捕获(DNA Hybrid Capture)”。然而该方法往往要遭遇高成本和取样困难，从而使其作为理想的筛选检验有点不太适宜。

最近，为了诊断目的，本技术领域的技术人员已经开发了用于检验HPV的方法。更具体地，针对HPV获得的IgA、IgG和IgM抗体已经被用于检测HPV的感染，以及用于诊断癌症或其前期阶段。使用这些现有技术，已经确定从HPV分离的免疫反应性肽具有可与人类血清反应的表位(epitope)。然而，现有技术没有公开本发明的肽，也没有教导抗体-表位复合体的多重组合可以产生具有改进的灵敏度和/或特异性的诊断检测方法。

用于癌症筛选的现有技术方法由于其成本、取样程序、准确度、设备和人员要求而受到限制。因此，正如本技术领域普通技术人员所容易理解的那样，可以在容易获得的个体样品上进行的低成本以及简单、灵敏和特异性的检测方法将是本技术领域的一个显著进步。此处公开且要求保护这样的检测方法。

发明概述

根据本发明，正如此处所具体且广泛描述的，本发明的一个优选实施方案包括新颖的肽，其序列是由HPV 16和18的E2、E6和E7癌蛋白的早期编码区的仔细分析分离出来的。所述肽可以使它们进行高度灵敏和特异的诊断性免疫测定。在那些被HPV相关的肿瘤感染的个体中可以发现E2、E6和E7癌蛋白的抗体。

本发明的肽，在进行修改之前，大小范围为大约17个氨基酸残基到大约23个氨基酸残基，它们可以通过化学方法很容易地合成，并且可以达到高于95％的纯度。尽管可以通过其它方法获得所述肽，但是它们以纯化形式存在时，与随机抗体发生的不希望的交叉反应的可能性通常会极大降低。因此，本发明的纯化肽可以使它们适合于具有高度特异性的诊断性免疫测定。本发明的诊断免疫测定方法的一个优选实施方案可以包括如下步骤：(1)获取可能含有抗体的体液或组织样品；(2)如果存在抗体，使样品与本发明的一种或多种肽反应；和(3)测定反应后的样品是否存在抗体-肽反应。

使用了从HPV 16和18的E6和E7癌蛋白分离、纯化或衍生的肽的免疫测定可以作为已经发生的与HPV相关的恶性肿瘤或恶化前细胞转化(premalignant cell transformation)的可靠指示。同样地，使用了从HPV 16和18的E2区分离、纯化或衍生的某些肽的免疫测定可以作为与HPV相关的感染、恶性肿瘤或恶化前细胞转化的可靠指示。

本发明的最有用的改进或方面之一是在于诊断子宫颈癌，包括鳞状细胞癌和腺癌，以及与致癌性HPV感染相关的任何上皮细胞异常，包括但不限于，细胞中空(koilocytosis)；过度角化；包括上皮内瘤形成或上皮内损害在内的癌前期状况；高度发育异常(high-gradedysplasias)；以及侵入性(invasive)或恶性癌症。除了其在子宫颈癌诊断中的用途，发现由HPV 16和18的E2、E6和E7癌蛋白分离、纯化或衍生的肽的抗体在检测头颈部癌症、小细胞肺癌、阴茎和肛门癌症、黑素瘤和其它由HPV引起或与HPV相关的癌前期或癌症状况中也是有用的。

附图说明

根据下述描述和所附的权利要求，结合考虑附图，本发明的前述和其它目的和特征将更加完全地显而易见。应该理解的是，这些附图仅仅描绘了本发明的典型实施方案，因此，这些附图不应该被认为是对本发明范围的限制，本发明将通过使用附图对其它特异性和细节进行描述，其中：

图1是一个表，该表显示了Pap涂片细胞学和应用了HPV DNA杂交捕获的诊断性免疫测定的结果，这些测定的对象患有或未患有与HPV相关的发育异常或其它的恶化前状况和癌症；

图2是一个表，该表进一步显示了应用了本发明的肽的诊断性免疫测定的结果，所述测定的对象患有或未患有与HPV相关的发育异常或其它的恶化前状况和癌症。

优选实施方案

应该理解到，正如此处在图中所描述和说明的那样，本发明的分离的蛋白序列和方法，可以以大量不同的方式被安排和设计。当然，正如所描述的，本技术领域的普通技术人员应该意识到，此处的细节可以在不背离本发明必要特征的情况下做出各种修改。因此，下面的如图1和2中所表示的对本发明的分离的蛋白序列和方法的实施方案的更详细描述的目的不在于限制本发明所要求保护的范围，仅仅是本发明的优选实施方案的代表。

HPV以不同的基因类型或基因型存在，它们通过数字来表示，对于这些基因型，只有一部分是致癌的或引起癌症的。已经鉴别出多于100种HPV基因型。这些HPV基因型有时被称作HPV病毒株或HPV病毒类型，通常仅仅通过数字或通过“HPV#”来指定或提及，其中“#”是致癌的或引起癌症的基因型的数字标识。癌症主要由HPV 16和18导致，但也可能与HPV 31、33、35、45、51、52、56和58有关。病毒感染子宫颈和其它通常支持病毒繁殖的细胞，在这些地方病毒可能引起能导致对生命构成威胁的恶性肿瘤的异常细胞变化。

HPV感染能够复制它们的DNA的细胞，特别是那些基底表皮层中的细胞。HPV通过将基底增殖细胞暴露于表面的微小损伤进入基底表皮层。病毒附着于细胞表面受体，从而进入细胞胞质中。具有感染性的HPV颗粒含有7000到8000个碱基对的闭环双链DNA基因组，包括8个早期转录的开放阅读框，即E1到E8，有时被称作早期编码区，它们在各HPV基因型中的表现并不是同等的，HPV基因组还包括两个晚期开放阅读框和一个非编码长控制区。

关于HPV DNA如何整合到宿主染色体中，以及E1和E2癌蛋白质如何参与到该过程中已经有很多发现。免疫学诊断的关联性在于，针对E1和E2基因产物的抗体可能是HPV感染已经发生的迹象。

HPV感染导致癌症的方式包括E6和E7基因产物的细胞相互作用。换一种说法，编码氨基酸的E6和E7基因被翻译成蛋白序列或肽，然后与细胞结构或蛋白相互作用，从而可以导致癌症。可能导致肿瘤或癌症的基因产物通常被称作致癌蛋白或癌蛋白。

在宿主细胞中，E6和E7基因产物与细胞p53和调控细胞分裂的眼癌肿瘤抑制蛋白形成复合物。通过功能性地中和或灭活这些蛋白，细胞进入细胞周期的S期。E7癌蛋白进一步通过与依赖于细胞周期蛋白的激酶抑制剂蛋白p21的相互作用破坏细胞控制的稳定性。这些相互作用为控制宿主细胞增殖和分化(即转化)创造了条件，这是正常细胞转化为肿瘤发生前(即癌前期)细胞，并最终转化为恶性肿瘤或癌症的完全表达中的第一个步骤。

E6和E7癌蛋白在肿瘤细胞中被组成型地表达，使这些基因沉默可以使恶性表现型逆转。因此，E6和E7基因产物似乎是肿瘤特异性抗原，并且在免疫学的癌症检测中是抗体的可能靶标或探针，还可以在控制HPV诱导型肿瘤的疫苗中用作抗原。

事实上，E6和E7癌蛋白似乎是抗体产生的天然靶标，这是由于它们在子宫颈癌细胞中的一致表达。在早期研究中针对E7癌蛋白的响应仅仅具有适度的疾病特异性，但现在E7IgG和IgA已经被检验为具有很强的疾病相关性。与非癌症对照组的抗体相比，针对E6和E7癌蛋白的抗体在子宫颈癌病人血清中的水平较高。而且，甚至当以较低量存在时，这样的抗体似乎也可以通过免疫学方法检测。多种病毒蛋白的血清实验的组合可以增加鉴别HPV感染和可能的癌症的灵敏度。因此，对于来自子宫颈癌病人的样品，应用两种癌蛋白，产生了阳性的免疫学结果。

除了本发明的方法，应用利用了来自HPV E2、E6和E7早期编码区中的两个或多个的基因产物、蛋白序列或肽的组合的检测或诊断方法，也是有益的。来自HPV E2以及HPV E6或E7的分离出的蛋白序列或肽的组合可以允许更灵敏和/或更特异的用于检测或诊断HPV病毒整合(即感染)到宿主细胞中，以及检测或诊断与HPV相关的细胞异常的方法。作为选择，来自HPV E6和E7的分离出的蛋白序列或肽的组合可以允许更灵敏和/或更特异的用于检测或诊断某些细胞异常的方法。

针对E2的抗体也可能与恶化前状况和癌症有关(Stevenson等人，“Inverse relationship between the expression ofthe human papillomavirustype 16 transcription factor E2 and virus DNA copy number during theprogression of cervical intraepithelial neoplasias，”Journal of GeneralVirology，81：1825-1832，2001；Tonon等人，“Physical status of the E2human papilloma virus 16 viral gene in cervical preneoplastic andneoplastic lesions，”Journal of Clinical Virology，21：129-134，2001；Lindel等人，“Human papillomavirus positive squamous cell carcinoma of theoropharynx：a radiosensitive subgroup of head and neck carcinoma，”Cancer，92：805-813，2001；Rosales等人，“Antibodies against humanpapillomavirus(HPV)type 16 and 18 E2，E6 and E7 proteins in sera：correlation with presence of papillomavirus DNA，”Journal of MedicalVirology，65：736-744，2001；Sheets等人，“Immunotherapy of humancervical high-grade cervical intraepithelial neoplasia withmicroparticle-delivered human papillomavirus 16 E7 plasmid DNA，”American Journal of Obstetrics and Gynecology，188：916-926，2003)，但关于HPV E2蛋白如何有助于瘤形成的具体细节仍然不清楚(Dong等人，“Human papillomavirus type 11 E2 proteins repress the homologous E6promoter by interfering with the binding of host transcription factors toadjacent elements，”Journal of Virology，68：1115-1127，1994)。

本发明的蛋白序列或肽可以分离、纯化或衍生于HPV 16和18的E2，E6和E7癌蛋白的早期编码区。本发明的肽的分离可以基于其与致癌性HPV感染的宿主中形成的抗体反应的能力。在选择过程中所用的特定因素包括在水溶液中的溶解性或亲水性质。可以设想到，在自然或天然条件下，癌基因产物蛋白的亲水区域更可能定向于该完整蛋白的表面，并且这样的区域包括抗体反应性将最可能针对其发生的抗原区域。

抗原性描述的是一种被人体视作外源的或潜在危险的物质，人体会针对这样的物质产生抗体。抗原通常包括蛋白或肽。抗体是在对特定抗原的存在作出响应的过程中在淋巴组织中产生的一种特异性蛋白。抗体将攻击抗原，使其变为无害。抗体的攻击通常导致形成抗原-抗体复合物，该术语经常与如下术语互换使用：抗体-肽复合物，或肽-抗体复合物，抗体-表位复合物。

另一个因素是要使氨基酸序列中的半胱氨酸残基在总体上维持在相对缺乏的水平。在氨基端残基处多于一个半胱氨酸被认为是不可接受的。由于多个半胱氨酸将预示着该肽不能在免疫测定中使用的情形，所以也做了一些尝试来限制沿着肽链的其它位置的半胱氨酸。具有半胱氨酸的肽在中性pH下更易于氧化，并且半胱氨酸易于形成巯基的这一倾向可能导致二聚化作用，这会阻碍抗体的结合。

另外，由于色氨酸的高的氧化势(oxidative potential)，所以希望该氨基酸在总体上表现为较为缺乏。缺乏的意思是尽可能少的出现，丰富的意思是对在序列出现的数量没有限制。肽物质的一个更优选的实施方案包括将多达8个的其它氨基酸残基附着在羧基末端残基上，在羧基末端残基上的那些残基是甘氨酸和天冬酰胺的任何组合。额外的甘氨酸和天冬酰胺氨基酸残基可以有助于使肽适应水介质，从而可以增强与抗体的结合。

正如下面所描述的，8个特异性蛋白序列或肽可以从HPV 16和HPV 18的E2、E6和E7癌蛋白中分离、纯化或衍生出来，这8个特异性蛋白序列或肽的长度范围在17到23个氨基酸残基之间。序列标识编号(SEQ.ID.NO.)为1的序列来源于HPV 18的E2区。序列1如下，包括22个残基，由HPV 18 E2癌蛋白的氨基酸219到240构成，该序列被译码并且使用标准的三个字母缩略词表示，所表示的序列从氨基末端残基开始，在羧基末端残基结束：

Lys Gln Leu Gln His Thr Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val

1 5 10 15

Gly Thr Ala Lys Thr Tyr(SEQ.ID.NO.1)

20

序列2和3来源于HPV 16的E2早期编码区。使用标准的三个字母缩略词来译码，序列号2和3如下，序列2包括17个残基，由HPV16 E2癌蛋白的氨基酸112到131构成，序列3包括23个残基，由HPV16 E2癌蛋白的氨基酸187到209构成，序列在氨基末端残基端开始：

Lys His Gly Tyr Thr Val Gln Phe Asp Gly Ile Cys Asn Thr Met His

1 5 10 15

Tyr(SEQ.ID.NO.2)

His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser

1 5 10 15

Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu(SEQ.ID.NO.3)

20

序列4来源于HPV 16的E6早期编码区。使用标准的三个字母缩略词来译码，序列号4如下，该序列号包括22个残基，由HPV 16 E6癌蛋白的氨基酸62到83构成，序列在氨基末端残基端开始：

Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe

1 5 10 15

Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr(SEQ.ID.NO.4)

20

序列5来源于HPV 18的E6早期编码区。使用标准的三个字母缩略词来译码，序列号5如下，该序列号包括22个残基，由HPV 18 E6癌蛋白的氨基酸67到88构成，序列在氨基末端残基端开始：

Lys Cys Ile Asp Phe Gly Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser

1 5 10 15

Asp Ser Val Tyr Gly Asp(SEQ.ID.NO.5)

20

序列6和7来源于HPV 16的E7早期编码区。使用标准的三个字母缩略词来译码，序列6和7如下，其中序列6包括21个残基，由HPV 16 E7癌蛋白的氨基酸26到46构成，序列7包括21个残基，由HPV 16 E7癌蛋白的氨基酸67到88构成，序列在氨基末端残基端开始：

Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly

1 5 10 15

Pro Ala Gly Gln Ala Glu(SEQ.ID.NO.6)

20

Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

1 5 10 15

Ser Glu Asp Glu Ile Asp(SEQ.ID.NO.7)

20

序列8来源于HPV 18的E7早期编码区。使用标准的三个字母缩略词来译码，序列号8如下，该序列号包括22个残基，由HPV 18 E7癌蛋白的氨基酸14到35构成，序列在氨基末端残基端开始：

His Leu Gln Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His

1 5 10 15

Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu(SEQ.ID.NO.8)

20

这些肽在诊断方法中的应用是基于如下事实，即针对HPV16和18的E2、E6和E7癌蛋白的天然表位的抗体被发现存在于那些遭受了各种与HPV相关的细胞异常的个体中，所述与HPV相关的细胞异常是存在于赘生物中的细胞异常，包括从癌前期状况到恶性肿瘤。更具体地，这样的与HPV相关的细胞异常或发育异常可以包括但不限于，细胞中空；过度角化；癌前期状况，包括上皮内瘤形成或上皮内损害；高度发育异常；和侵入性或恶性癌症。发育异常是一般性地意指异常的、恶化前的或癌前期细胞的存在或发展。上面讨论了与HPV相关的恶性肿瘤。

诊断方法包括获取可能含有抗体的体液或组织的样品。该样品优选为易于获得的样品，可以是来源于静脉血样品的血清或血浆，或甚至来源于指尖刺伤。然而，子宫颈分泌物、子宫颈组织、来自人体其它部分的组织、或其它的体液被已知含有抗体，它们就可以被用作样品的来源。一旦肽抗原和样品抗体被允许在合适的介质中反应，那么就可以进行测定来确定是否存在抗体-肽反应。

下述实施例将进一步详细地举例说明本发明的实施。本技术领域的技术人员应该能容易地理解到，正如此处在实施例中所描述和阐明的，下述方法、配方以及来自本发明的HPV 16和18的E2、E6和E7早期编码区的新颖肽的组合物被看作是本发明的原理的例证，本发明并不限于实施那些原理的特定结构或过程。因此，下面在实施例1中所表达的对本发明的方法、配方和组合物的优选实施方案的更详细的描述的目的不在于限制本发明所要求保护的范围，它们仅仅是本发明的优选实施方案的代表。

实施例1

1. 氨基酸序列或肽的合成

尽管本发明的肽可以通过多种现有方法获得，这些现有方法包括但不限于重组技术和其它生物技术来源，但目前化学合成是优选的方法，这是由于其有助于积累可观数量的基本上纯化的形式，在本例中肽的重量占95％到99％之间。肽的合成可以在0.25scale上实现，使用(9-芴基)甲氧基羰基(FMOC)保护的L-氨基酸，用高级的酸不稳定的2-氯三苯甲基树脂(Novabiochem，Nottingham，UK)作为固体支持物。树脂可以被预先加入到反应容器中，用二甲基甲酰胺洗涤，然后将液体彻底排空。可以将10ml的含有20％哌啶的二甲基甲酰胺加入到该树脂中。然后将该混合物振荡5分钟，将液体排空。可以再次加入10ml的含有20％哌啶的二甲基甲酰胺，将混合物振荡30分钟。在排空液体后，用二甲基甲酰胺将树脂洗涤四次，然后用二氯甲烷洗涤一次。如果应用标准的水合茚三酮测试发现树脂珠变为蓝色，那么可以认为树脂珠被恰当地制备出来。

对于各种氨基酸，可以如下制备偶联溶液：选择1mmol Fmoc氨基酸；2.1mL 0.45M 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium-六氟-磷酸/氢化苯并三唑[1mmol]；348μL的N，N-二异丙基乙胺[2mmol]。将该混合物振荡30分钟。可以将反应容器中液体彻底排空，用二甲基甲酰胺将树脂洗涤四次，最后用二氯甲烷洗涤一次。进行标准的水合茚三酮测试来确定氨基酸的偶联。对于每一个氨基酸，可以将偶联溶液以适当的次序加入到树脂中，重复偶联反应，直到所有氨基酸被置于沿着肽链的适当位置。

通过用如下成分的溶液反应两个小时，可以从树脂上切割出完整的肽：5％H2O，5％苯酚，3％茴香硫醚，3％乙二硫醇，3％三异丙基硅烷，81％三氟乙酸。在切割后，树脂混合物可以被过滤到冷的甲基-叔丁基-醚中。然后可以用冷的甲基-叔丁基-醚将沉淀的肽洗涤两次，在气态氮下干燥。可以通过基质辅助激光解吸-飞行时间质谱来检验肽的分子量，通过高效液相色谱检验纯度，使用的是C18399A 5μ柱。合成的肽序列的纯度水平可以是大约95-99％，但需要强调的是，对于测定目的来说，较低的水平也可以被认为是合适的。

2. 氨基酸序列的存储

制备出的氨基酸序列可以悬浮于PBS中，大约7.0的pH值，浓度为大约1mg/mL，可以在大约-20℃的温度保存在密封小瓶中。

3. 氨基酸序列通过顺丁烯二酐结合到滴定板上

可以应用REACTI-BIND^TM顺丁烯二酐活化的聚苯乙烯平板(Pierce，Rockford，IL)。可以用包被缓冲液(100mM碳酸氢钠缓冲液，pH 9.4)将各氨基酸序列稀释到12.5μg/mL。可以将100μL(1.25μg)稀释的序列溶液加入到各滴定孔中。然后可以将平板在室温下振荡温育1小时。可以将平板中液体倒空，将残余液体吸到清洁纸巾中。可以用100μL洗涤缓冲液(含有0.1％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液，pH7.0)洗涤各个孔。可以将这一步骤总共重复三次。每一次都可以倒空平板并将残余液体吸到清洁纸巾中。在各个孔中可以加入200μL封闭溶液(含有3％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液，pH7.0)。

可以将封闭溶液在各孔中保留1分钟。然后可以通过倒置倒空滴定板。添加封闭溶液和倒空可以进行三次。可以在室温下干燥完成的滴定板，可以于4℃保存4个月。

4. 样品收集

所有样品由医生或医生助理在妇产科检查过程中取自女性对象。可以用药用棉签来收集子宫颈内细胞。可以将用于ThinPrep Pap涂片(Cytyc Corporation Stamford，CT)的细胞分散在ThinPrep防腐溶液中。可以将用于HPV DNA杂交捕获分析(DNA Hybrid Capture assay)的细胞悬浮在相同介质中。下面对ThinPrep Pap涂片和HPV DNA杂交捕获分析做进一步的说明。

通过规定的静脉切开放血术方法获得静脉血液，将21或22号双向针头插入到“红色端(red top)”管子中。可以从各个对象获取总共7-9mL血液。允许其在室温下保持15-20分钟以形成血液凝块，可以于2500g将血液离心15分钟。可以使用一次性吸管，通过抽吸从凝结的细胞中分离出血清，以0.25ml的等分量分配到微量离心管中，于-80℃储存。

5. 免疫测定

对于阴性样品，可以从年龄在14-15之间的处女获得，也可以从年龄大于25岁、性生活活跃、单配偶的成年妇女获得，这些对象没有Pap涂片异常历史并且通过DNA验证不存在HPV。阳性样品包括从诊断出子宫颈癌或癌前期疾病的妇女获得的血清。可以将目标和对照组血清用洗涤缓冲液(含有0.1％牛血清清蛋白和0.5％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液，pH7.0)以1∶25稀释。可以将100μL稀释的血清加入到各个孔中，将测定板在室温下振荡温育1小时。然后可以将各个孔润洗三次，每一次使用200μL洗涤缓冲液。每次润洗可以持续5分钟。每次都可以通过将残余液体吸到清洁纸巾上来倒空平板。

可以在各个孔中加入100μL辣根过氧化物酶偶联的鼠抗人IgG，其已经用洗涤缓冲液以1∶12000稀释。然后可以在室温下将测定板温育1小时。可以使用多道吸液器，用200μL洗涤缓冲液将每个孔润洗四次。每次润洗持续5分钟。在每次润洗之前，可以倒空平板，并且将残余液体吸到纸巾上。

可以在每一个孔中加入100μL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，用作辣根过氧化物酶的底物。可以将其在室温下温育，直到可以通过视觉观察到明显的竹绿色显色，这通常是在10-15分钟内发生，然后通过将150μL1.5M硫酸(H₂SO₄)放入到各孔中来终止反应。

6. 对比测试——ThinPrep Pap测试和HPV DNA杂交捕获

ThinPrep Pap测试——ThinPrep Pap测试Pap涂片可以被用于指示癌症或癌前期的细胞异常是否存在的细胞学检验。ThinPrep Pap测试经由美国食品与药品管理局许可，可以作为传统Pap涂片的一种替代，其克服了传统方法的局限性。通过改进样品载片的制备方法，ThinPrepPap测试可以有效地提高测试的质量。在临床试验中，ThinPrep Pap测试提高了低级和更严重病变的检测，在筛选人群中提高了65％，在高风险人群中提高了6％。它的使用也将不太适合的样本的数量降低了不止50％。

不同于传统Pap涂片中将子宫颈样品涂到载片上的做法，子宫颈药签可以在盛有防腐溶液的小瓶中被润洗。样本可以被送到合格的临床实验室，在该实验室可以使用ThinPrep 2000处理器设备来分散和过滤内容物，从而减少血液、粘液和炎症。然后薄的平整的子宫颈细胞层可以用机械沉积到载片上，结果得到良好防腐处理的细胞的均匀制备物，其可准备用于精确的显微镜检验。由有资格的妇产科细胞学家对载片进行显微镜检验和解释。

杂交捕获II HPV DNA测试——杂交捕获II HPV DNA测试(Digene Corporation，Silver Springs，MD)被用来与使用了本发明所述肽的ELISA测试作比较。由美国食品与药品管理局批准对致癌HPVDNA进行测试，作为不典型鳞状细胞性质未定(Atypical SquamousCells of Undetermined Significance，ASCUS)或其它异常Pap结果的自身的进一步测试。事实上，杂交捕获II HPV DNA测试辨认的是病毒DNA而不是子宫颈疾病，但所有癌前期和癌症状况都涉及HPV DNA的存在。杂交捕获涉及分子杂交，其中使用了非放射性探针，并对杂交分子的化学发光检测进行扩增。可以将分析的材料变性，并与特异性基因探针反应，形成杂交RNA/DNA，杂交RNA/DNA被覆盖于管壁上的抗体捕获。为了进行固定化的杂交，可以与碱性磷酸酶偶联的RNA/DNA的特异性抗体反应。形成稳定的基层物质(substratum)后，核酸杂交可以通过光谱测定法利用化学发光来检测。

所述测试可以根据制造商的实施方案来进行，其中使用了基于微量滴定板的型式以及用于“高致癌风险”或“致癌”HPV型的探针。人类乳头瘤病毒的测定可以是定量的，其中样本所产生的读数是被认为含有病毒DNA的阳性对照的读数的一倍或者多倍(每次测试使用1pg/mL HPV DNA或5000个HPV基因组拷贝)。

7. 完整ELISA测试的可视化/解释

抗体-肽复合物的存在可以通过将抗体-肽复合物的形成所带来的物理化学变化可视化来转化为信号。物理化学变化的发生可能与氧化反应和其它化学反应有关。物理化学反应可以使用分光光度计或类似仪器来检测。

可以用70％乙醇清洁滴定板的底部，将滴定板装载到分光光度计中。可以在450nm处读取吸光度，用100mL TMB溶液与100mL 2N HCl作为空白对照。

8. 结果

将Pap涂片细胞学、Digene HPV DNA测试和根据本发明进行的免疫测定进行比较，结果如图1和2所示。现在参考图1和2，对16个女性对象进行了测试。在实际上进行的所有测试的所有样品中，来自于藉由性生活史和/或Pap涂片史判断为具有低的测试前概率(pre-testprobability)的女性的样品都是阴性的，证据是吸光度的平均值为0.19，而与之相比，具有不同疾病状况的对象的平均值为0.42，一个异常例外在下面被讨论。这表明假阳性和高的阴性预测值的比例很低。

如上所述，来自于藉由性生活史和/或Pap涂片史判断为具有低的测试前概率的对象的样品大部分具有较低的吸光度。然而，对象6例外，其HPV E2抗体-抗原复合物具有较高值，平均值为0.42，其中SEQID NO 1为0.44，SEQ ID NO 2为0.32，SEQ ID NO 3为0.49。而对象6的其它抗体-抗原复合物产生的吸光度平均值为0.21。这些数据不是感染或发育异常的指示。在对象6中没有检测到HPV DNA，这些高的HPV E2吸光度非常可能是先前存在的但现在已经清除的HPV感染的证据。

来自于藉由已证实的临床/病理史判断为具有高的测试前概率的女性的样品大部分在根据本发明进行的免疫测定中显示为阳性，这由较高的吸光度值来指示。对于来自患病对象8-16的血清，平均吸光度值为0.42，仅仅考虑那些源自E6和E7癌蛋白的肽的话，平均吸光度值为0.47。而且，这些值平均起来显著高于来自未患病或健康对象的吸光度值(p＜0.001)。这些结果指示了高的阳性预测值。由于在一些情况下，有一次或多次测定会产生稍微低一些的吸光度值，这证明了应用肽的组合的优点。低的假阳性和高的真阳性表明这是一种用于癌前期疾病和癌症的高灵敏度的和高特异性的测试。

非常重要的是，对象15和16具有在病理学上已经证实的子宫颈腺癌，对象13和14具有在病理学上已经证实的子宫颈鳞状细胞癌，来自这些对象的血清的一个特征是具有较高的吸光度值。同样重要的是，虽然患有严重的子宫颈疾病，但对象15的Pap涂片检查的结果却没有发现细胞异常。Pap涂片细胞学可能对腺癌产生错误判断，这凸现了本发明的肽的有用性。

同样显著地，当与对象8-16的结果相比较时，来自对象7的血清对于实际上本发明的所有肽均显示出较低的吸光度。尽管对象6伴随有证实为诊断出细胞异常的病理学，但是使用本发明所述肽的免疫测定与阴性DNA结果更一致。认为这些数据表明，细胞异常与致癌病毒无关，并且由此导致的疾病进一步发展为更严重的发育不良或癌症的可能性较小。正如此处所描述的，这些结果指出了本发明的进一步的实用性。

从上述讨论应该意识到，本发明提供了从HPV 16和18 E2、E6和E7早期编码区分离出的新颖的能够与抗体反应的蛋白序列或肽。在优选的设计中，新颖的蛋白序列或肽提供了一种用于简单、快捷、低成本、更灵敏和更特异的测试的标识物，其不仅用于检测或诊断HPV感染，而且用于检测或诊断大部分——即使不是所有的——与HPV相关的细胞异常、癌前期细胞、癌症和赘生物。

与现有技术不同，本发明提供了这样的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，即获得人体组织样品，使该样品与从HPV 16和18 E2、E6和E7早期编码区分离出的新颖的蛋白序列或肽反应，以形成抗体-肽复合物；检测所述抗体-肽复合物。

本发明可以以不背离本发明精神或必要特征的其它特定形式来实施。所描述的实施方案在所有方面都仅仅被视作例证，而不是限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求来指明，而不是由前述描述来限定。在权利要求的等同意义和范围内发生的所有变化都包括在本

发明的范围内。

序列表

<110>Y·X·胡

<120>用于检测和/或诊断宫颈癌和其它癌症的

来自人乳头瘤病毒16和18的E2、E6和E7蛋白的肽

<130>CPUSZ42759

<150>US 60/394,172

<151>2002-07-02

<150>US 10/612,818

<151>2003-07-01

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV 18的E2区

<400>1

Lys Gln Leu Gln His Thr Pro ser Pro Tyr Ser ser Thr Val Ser Val

1 5 10 15

Gly Thr Ala Lys Thr Tyr

20

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV 16的E2早期编码区

<400>2

Lys His Gly Tyr Thr Val Gln Phe Asp Gly Ile Cys Asn Thr Met His

1 5 10 15

Tyr

<210>3

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV 16的E2早期编码区

<400>3

His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser

1 5 10 15

Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu

20

<210>4

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV 16的E6早期编码区

<400>4

Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr

1 5 10 15

Ser Lys Ile Ser Glu Tyr

20

<210>5

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV18的E6早期编码区

<400>5

Lys Cys Ile Asp Phe Gly Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser

1 5 10 15

Asp Ser Val Tyr Gly Asp

20

<210>6

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV16的E7早期编码区

<400>6

Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro

1 5 10 15

Ala Gly Gln Ala Glu

20

<210>7

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV 16的E7早期编码区

<400>7

Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Ser

1 5 10 15

Glu Asp Glu Ile Asp

20

<210>8

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>源自HPV 18的E7早期编码区

<400>8

His Leu Gln Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu

1 5 10 15

Gln Leu Ser Asp Ser Glu

20

Claims

1.来自人乳头瘤病毒(HPV)的E2、E6或E7早期编码区的可溶于水介质中的分离出的蛋白序列或肽，其特征在于色氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸残基的相对缺乏，以及甘氨酸和天冬酰胺残基的相对丰富。

2.如权利要求1的分离出的蛋白序列或肽，其中所述HPV选自16、18、31、33、35、45、51、52、56和58。

3.如权利要求1的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

4.来自HPV的分离出的蛋白序列或肽，其可用于检测或诊断癌症或细胞异常，所述分离出的蛋白序列或肽选自：

如SEQ.ID.NO.：1中所阐述的HPV 18的E2早期编码区；

如SEQ.ID.NO.：2中所阐述的HPV 16的E2早期编码区；

如SEQ.ID.NO.：3中所阐述的HPV 16的E2早期编码区；

如SEQ.ID.NO.：4中所阐述的HPV 16的E6早期编码区；

如SEQ.ID.NO.：5中所阐述的HPV 18的E6早期编码区；

如SEQ.ID.NO.：6中所阐述的HPV 16的E7早期编码区；

如SEQ.ID.NO.：7中所阐述的HPV 16的E7早期编码区；和

如SEQ.ID.NO.：8中所阐述的HPV 18的E7早期编码区。

5.如权利要求4的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

6.如权利要求4的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

7.如权利要求4的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

8.如权利要求4的分离出的蛋白序列或肽，其中HPV选自31、33、35、45、51、52、56和58。

9.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：1中所阐述的HPV 18的E2早期编码区。

10.如权利要求9的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

11.如权利要求9的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

12.如权利要求9的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

13.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：2中所阐述的HPV16的E2早期编码区。

14.如权利要求13的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

15.如权利要求13的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

16.如权利要求13的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

17.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：3中所阐述的HPV16的E2早期编码区。

18.如权利要求17的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

19.如权利要求17的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

20.如权利要求17的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

21.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：4中所阐述的HPV16的E6早期编码区。

22.如权利要求21的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

23.如权利要求21的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

24.如权利要求21的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

25.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：5中所阐述的HPV18的E6早期编码区。

26.如权利要求25的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

27.如权利要求25的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

28.如权利要求25的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

29.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：6中所阐述的HPV16的E7早期编码区。

30.如权利要求29的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

31.如权利要求29的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

32.如权利要求29的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

33.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：7中所阐述的HPV16的E7早期编码区。

34.如权利要求33的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

35.如权利要求33的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

36.如权利要求33的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

37.分离出的蛋白序列或肽，包括如SEQ.ID.NO.：8中所阐述的HPV18的E7早期编码区。

38.如权利要求37的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

39.如权利要求37的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

40.如权利要求37的分离出的蛋白序列或肽，进一步包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

41.用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，所述方法包括如下步骤：

使可能含有抗体的体液或组织样品与来自人乳头瘤病毒(HPV)的E2、E6和E7早期编码区的分离出的一种或多种蛋白序列或肽反应，其中所述早期编码区选自如SEQ.ID.NO.：1中所阐述的HPV 18的E2早期编码区、如SEQ.ID.NO.：2中所阐述的HPV 16的E2早期编码区、如SEQ.ID.NO.：3中所阐述的HPV 16的E2早期编码区、如SEQ.ID.NO.：4中所阐述的HPV 16的E6早期编码区、如SEQ.ID.NO.：5中所阐述的HPV 18的E6早期编码区、如SEQ.ID.NO.：6中所阐述的HPV16的E7早期编码区、如SEQ.ID.NO.：7中所阐述的HPV 16的E7早期编码区，和如SEQ.ID.NO.：8中所阐述的HPV 18的E7早期编码区；

形成抗体-肽复合物，其包括所述分离出的蛋白序列或肽的至少一种和所述的样品抗体；和

检测所述抗体-肽复合物。

42.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中HPV选自31、33、35、45、51、52、56和58。

43.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述分离出的蛋白序列或肽包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的甘氨酸残基。

44.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述分离出的蛋白序列或肽包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的一个或多个额外的天冬酰胺残基。

45.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述分离出的蛋白序列或肽包括在所述分离出的蛋白序列或肽的羧基末端残基处添加的甘氨酸和天冬酰胺残基的组合。

46.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述分离出的蛋白序列或肽的所述半胱氨酸残基被羧甲基半胱氨酸残基取代。

47.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断HPV表位。

48.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述HPV表位是抗体反应性将针对其发生的抗原性区域。

49.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断与HPV相关的细胞异常。

50.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断与HPV相关的癌前期或恶化前状况。

51.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断与HPV相关的癌症。

52.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断子宫颈发育异常。

53.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断子宫颈癌。

54.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断选自细胞中空、过度角化、包括上皮内损害在内的癌前期状况、高度发育异常、侵入性癌症和恶性癌症的子宫颈细胞异常。

55.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述诊断方法是涉及检测或诊断子宫颈的腺癌。

56.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中从所述HPV E2编码区分离出的所述蛋白序列或肽包括检测或诊断来自HPV的癌蛋白表位。

57.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中从所述HPV E2编码区分离出的所述蛋白序列或肽包括检测或诊断恶化前细胞转化、癌前期状况或癌症。

58.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中从所述HPV E6编码区分离出的所述蛋白序列或肽包括检测或诊断恶化前细胞转化、癌前期状况或癌症。

59.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中从所述HPV E7编码区分离出的所述蛋白序列或肽包括检测或诊断恶化前细胞转化、癌前期状况或癌症。

60.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述检测步骤进一步包括在视觉上检查所述抗体-肽复合物的颜色变化的步骤。

61.如权利要求41的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述检测步骤进一步包括检查所述抗体-肽复合物的物理化学变化。

62.如权利要求61的用于检测或诊断癌症或细胞异常的方法，其中所述检查步骤进一步包括使用分光光度计检查所述抗体-肽复合物。