CN108164587A - 新的hpv抗原表位 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型HPV抗原表位，其序列为选自SEQ ID NO：1‑5的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：1‑5的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及将所述抗原表位用于检测样品中是否存在抗HPV特别是高危型HPV的抗体以及用于检测受试者中的HPV特别是高危型HPV的感染情况。

Description

新的HPV抗原表位

发明领域

本发明涉及新型HPV抗原表位及其用途。

发明背景

食管癌在世界范围内肿瘤发病率位居第8位。在中国，食管癌的主要组织学类型为食管鳞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。食管鳞癌的发生为环境因素与遗传因素相互作用的结果，其中环境因素包括饮食习惯、吸烟、饮酒等，并且可能与病毒感染相关。

感染是肿瘤发生的因素之一，2008年由感染而导致的肿瘤占所有肿瘤的16.1％。其中人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一种重要的致癌病毒。文献报道90％的宫颈鳞状细胞癌与HPV感染有关，且在口咽鳞状细胞癌中也存在一类与HPV感染有关的亚类。此外有研究报道在食管腺癌中HPV的检出阳性率高达66.7％，且与疾病严重程度相关。

人的一生中感染HPV的可能性超过80％，然而仅高危型HPV(hr-HPV)可能引发恶性肿瘤。hr-HPV包括HPV16、18、33、58等，其中HPV16是宫颈鳞癌和口腔鳞癌中最为常见的病毒亚型之一。hr-HPV的编码蛋白包括早期蛋白(包括E1～E8)和晚期蛋白(包括衣壳蛋白L1、L2)。hr-HPV的致癌作用主要依赖于其致癌蛋白E6、E7的作用，二者可激活不可再生细胞的DNA合成、抑制细胞死亡、阻碍细胞分化。

食管鳞癌与宫颈鳞状细胞癌、口咽鳞状细胞癌从组织学上均起源于鳞状上皮，且食管与口咽部毗邻，因此HPV可能通过口咽部下行至食管，而hr-HPV在食管鳞癌中的感染率与潜在关联是研究热点之一。尽管存在动物模型的证据，但hr-HPV在人食管鳞癌中检出率有巨大差异。同时由于HPV病毒颗粒广泛存在于环境中，在检测过程中容易由于操作不当引入环境中的hr-HPV DNA，污染样本而引起假阳性。故hr-HPV的检测需要严格的实验室操作要求。

大多数病毒感染属于“一过式感染”，病毒颗粒在感染后1～2年就会由于被免疫系统清除而无法通过检测病毒核酸的方式被检测到。然而，病毒感染可通过刺激免疫系统产生记忆T细胞或记忆B细胞的形式在体内留下印记，这些印记在体内存在的时间可长达数十年。因此通过检测血清中病毒抗体的存在，可以了解病毒的累积感染情况，避免由于病毒被清除而造成的低估。

已有研究通过血清学手段检测食管鳞癌中HPV的感染情况，但大部分检测目标是血清中抗HPV病毒样颗粒(Vesicle-like Particles，VLP)的抗体，而检测抗癌蛋白E6、E7抗体则非常少见。研究认为血清抗E6、E7抗体是HPV感染导致肿瘤的高度特异性标志，其水平被认为是头颈癌中一个敏感的预后标志。因此检测血清中抗E6、E7抗体较检测VLP抗体更具有临床意义。

目前的血清学检测手段主要通过ELISA方法检测。ELISA方法主要合成重组蛋白以捕捉血清中的目标抗体。免疫系统识别抗原的关键是抗原表位，而非整个蛋白。使用抗原表位足以捕捉血清中的抗体，避免蛋白非表位部分造成的干扰，提高检测效率。同时与合成整个重组蛋白相比，合成抗原表位费用较为低廉，可降低前期投入成本。此外，可将不同蛋白的抗原表位整合至一张膜或芯片上，提高检测通量。目前针对HPV的抗原表位研究主要在衣壳蛋白L1、L2上，并已形成以hr-HPV L1、L2为靶点的预防性疫苗，用以预防宫颈鳞癌等HPV感染而导致的肿瘤。然而针对hr-HPV癌蛋白E6、E7的抗原表位未见报道。因此，目前仍然存在对于检测血清中HPV相关抗体的改进方法的需要。

发明内容

本发明通过提供新的HPV抗原表位来解决本领域中存在的上述问题。

在一个实施方案中，本发明提供的HPV抗原表位是高危型HPV抗原表位，优选是HPV16抗原表位。具体地，所述抗原表位是致癌蛋白E6、E7上的抗原表位。更具体地，所述抗原表位是致癌蛋白E6、E7上的B细胞抗原表位。

如本文所用，HPV亚型可分为：高危型HPV，常见的有HPV16、18、31、33、35、45、51、52、56、58、29、68等亚型；低危型HPV，常见的有如HPV6、11、42、43、44等亚型。关于高危型HPV与低危型HPV的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68共13种亚型列为高危HPV，并将HPV26、53、66、73和82共5种亚型列为中等风险HPV。在实际检测时，常常将中等风险HPV亚型也归于高危型HPV。

如本文所用，“抗原表位”指抗原上的一种位点，B细胞和T细胞对该位点可发生特异性应答反应。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定族位点”互换使用。蛋白质、多糖或其它生物多聚物上的B细胞抗原表位可能由生物大分子的不同部分因折叠在一起而组成。这类抗原表位称为构象性或不连续性抗原表位，因为此位点由该多聚物的在线性序列上不连续、但在折叠构象上连续的区段构成。由生物多聚物或其它分子单个区段构成的抗原表位被为连续或线性抗原表位。T细胞抗原表位一般限于线性肽。一个肽抗原表位可含有5个或更多个在空间构象上对该表位是独特的氨基酸。在本公开内容中，除非另外说明，“抗原表位”与“多肽”可交换使用。

如本文所用，“B细胞表位”指的是肽或者蛋白质的特征，其在对含有该抗原的肽(即免疫原)所起的免疫反应中被B细胞受体识别。

在一个实施方案中，本发明提供的HPV抗原表位的序列是选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述HPV抗原表位的序列是与选自SEQ ID NO：1-5的序列具有至少80％、85％、90％、95％或更高的同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了HPV致癌蛋白E6的抗原表位。所述E6的抗原表位的序列是选自SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：1-3的序列具有至少80％、85％、90％、95％或更高的同一性的氨基酸序列。优选地，所述HPV是高危型HPV，优选是HPV16。HPV16致癌蛋白E6的氨基酸序列可以是例如SEQ ID NO：6所示的序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了HPV致癌蛋白E7的抗原表位。所述E7的抗原表位的序列是选自SEQ ID NO：2-5的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：2-5的序列具有至少80％、85％、90％、95％或更高的同一性的氨基酸序列。优选地，所述HPV是高危型HPV，优选是HPV16。HPV16致癌蛋白E7的氨基酸序列可以是例如SEQ ID NO：7所示的序列。

在一个方面，本发明提供了一种分离的多肽分子。所述分离的多肽分子的序列是选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述分离的多肽分子的序列是与选自SEQ ID NO：1-5的序列具有至少80％、85％、90％、95％或更高的同一性的氨基酸序列。

如本文所用，氨基酸序列的“同一性”是指在如有必要的情况下，在对准序列和引入空位后，且不考虑保守替换作为序列同一性的一部分情况下，一个候选序列与其所比较的序列在达到了最大的序列同一性时，它们在序列上一致的氨基酸所占的百分数。

在另一个方面，本发明还提供了编码本发明的抗原表位和/或多肽分子的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的核酸载体、以及包含所述核酸载体的宿主细胞。在一个实施方案中，包含本发明的分离的核酸分子的核酸载体能够在宿主细胞中表达本发明的抗原表位和/或多肽分子。在本领域中，获得如本文所述的编码本发明的抗原表位和/或多肽分子的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的核酸载体、以及包含所述核酸载体的宿主细胞的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，这样的方法可参见例如，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,第3版,J.F.Sambrook和D.W.Russell编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,2001。

如本文所用，术语“核酸”指具有任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式，且包括双链和单链DNA和RNA。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。在本文中，“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。

如本文所用，术语“核酸载体”是指重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。

如本文所用，“宿主细胞”一般为含有核酸载体和/或感兴趣基因的原核或真核宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。

通过使用本发明的HPV抗原表位，本发明人令人惊讶地发现，在口咽癌、宫颈癌和食管鳞癌患者血清中HPV16E6、E7蛋白的抗体水平均明显高于健康人对照，提示HPV与口咽癌、宫颈癌和食管鳞癌之间的相关性。并且，本发明的HPV抗原表位能够高效地检测食管鳞癌患者血清中的抗HPV抗体(特别是抗高危型HPV的抗体)，检测阳性率高。

因此，在一个方面，本发明提供了用于检测样品中是否存在抗HPV的抗体(特别是抗高危型HPV的抗体，优选抗HPV16的抗体，最优选抗HPV16致癌蛋白E6或E7的抗体)的方法，其包括：a)使本发明的多肽分子和/或抗原表位与样品接触；和b)测定所述样品中与所述多肽分子和/或抗原表位相互作用的抗体的存在。在一个实施方案中，可以采用本领域已知的检测多肽(或抗原)与抗体之间的相互作用的任何方法来进行上述步骤b)中的测定步骤；这样的方法的实例包括但不限于酶联免疫分析法、免疫印迹法、免疫荧光、放射免疫分析法等等；优选地，这样的方法可以是如本说明书实施例中所描述的测定方法。在另一个实施方案中，在步骤a)之前还可以包括将所述多肽分子和/或抗原表位固定在固相支持物上的步骤。在一个实施方案中，所述样品是血清样品。所述样品还可以选自其它样品，例如但不限于血浆样品。

在另一个方面，本发明提供了用于检测受试者中的HPV(特别是高危型HPV，优选HPV16)感染情况(例如，是否携带或感染或曾经感染HPV，特别是高危型HPV，优选HPV16)的方法，其包括：a)使本发明的多肽分子和/或抗原表位与来自受试者的样品接触；和b)测定所述样品中与所述多肽分子和/或抗原表位相互作用的抗体的存在。类似地，可以采用本领域已知的检测多肽(或抗原)与抗体之间的相互作用的任何方法来进行上述步骤b)中的测定步骤。在另一个实施方案中，在步骤a)之前还可以包括将所述多肽分子和/或抗原表位固定在固相支持物上的步骤。在一个实施方案中，所述样品是血清样品。所述样品还可以选自其它样品，例如但不限于血浆样品。所述受试者可以是健康受试者、癌症受试者或患有其它HPV(特别是高危型HPV，优选HPV16)感染相关疾病的受试者。在一个实施方案中，所述癌症包括口咽癌、宫颈癌或食管癌，特别是食管鳞癌。在优选的实施方案中，所述癌症是食管鳞癌。不希望受到理论的约束，据信高危型HPV的感染、整合至宿主基因组中以及编码致癌蛋白E6/E7，会使p53等肿瘤抑制基因的功能失活，与肿瘤发生发展相关；另外，HPV感染与某些类型肿瘤的进展或预后相关(如HPV阳性的口咽癌患者生存期好于HPV阴性患者)；这些证据有助于对癌症进行分子分型、精细分类甚至准确治疗。目前已经发现许多肿瘤与HPV病毒感染具有相关性，如皮肤癌、生殖系统肿瘤、口咽癌、鼻咽癌、食管癌等等。

在一个方面，本发明还提供了包含本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位的试剂，其用于本发明的上述检测和/或诊断方法中。

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位的试剂盒，其用于本发明的上述检测和/或诊断方法中。

在一个实施方案中，所述试剂或试剂盒还包含检测与所述多肽分子和/或抗原表位相互作用的抗体的检测试剂。这样的检测试剂包括但不限于用于例如酶联免疫分析法、免疫印迹法、免疫荧光或放射免疫分析法的试剂。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于固定所述多肽分子的固相支持物，例如硝酸纤维素膜或iPDMS芯片。

如本文所用，术语“固相支持物”是指本文所述的多肽分子和/或抗原表位能够附着至其上的任何支持物，例如以构建多肽阵列。这样的固相支持物是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、iPDMS芯片、微孔板、凝胶等。

在另一个方面，本发明还提供了包含本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位的各种组合物，特别是药物组合物和疫苗组合物。该组合物可有效用于治疗与HPV(特别是HPV16)感染相关的病症，包括但不限于口咽癌、宫颈癌和食管癌，特别是食管鳞癌。

包含本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位的各种组合物可以包含按多肽分子和/或抗原表位的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择合适的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington’s PharmaceuticalSciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack Publishing Co.)。

可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。

当用作疫苗时，所述的疫苗可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或媒介物配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。

另外，本发明的疫苗的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分(IL-12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)等)。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的多肽分子和/或抗原表位施用于对象。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

在一个方面，本发明还涉及本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位在制备用于检测样品中是否存在抗HPV的抗体(特别是抗高危型HPV的抗体，优选抗HPV16的抗体，最优选抗HPV16致癌蛋白E6或E7的抗体)的试剂或试剂盒中的用途。

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位在制备用于检测受试者中的HPV(特别是高危型HPV，优选HPV16)感染情况(例如，是否携带或感染或曾经感染HPV，特别是高危型HPV，优选HPV16)的试剂或试剂盒中的用途。

在另一个方面，本发明还涉及本发明的分离的多肽分子和/或抗原表位在制备治疗性抗体、组合物或疫苗中的用途。可采用本领域熟知的任何方法来使用本发明的多肽分子和/或抗原表位制备治疗性抗体、组合物和/或疫苗。所采用的具体方法可由本领域技术人员根据实际应用常规选择。

应理解，除非明确指出相反，否则本文所用的所有技术与科学词语与本发明所属领域中的普通技术人员一般理解的意义相同。比如，Singleton和Sainsbury，Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology第二版，John Wiley和Sons，NY(1994)；Hale和Marham，The HarperCollins Dictionary of Biology，Harper Perennail，NY(1991)，是向本领域普通技术人员提供了许多本发明中用到的词语的综合词典。尽管与本文描述的相似或者等同的任何方法和材料可用于本发明的实践中，但在本文描述了优选的方法和材料。通过参考附图以及下文的实施例，可以更好地理解本发明，但应理解，附图及实施例仅用于举例说明的目的，并非旨在限制本发明。

附图描述

图1显示了抗原多肽阵列合成示意图。(a)当HPV病毒感染人体时，合成的E6/E7蛋白刺激机体产生针对其的特异性抗体。(b)将E6/E7蛋白全序列分解成以相等的氨基酸残基数叠瓦式重合的等长肽段，并合成于相应的载体上(NC膜或iPDMS膜)并与人血清孵育，随后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗孵育。(c)显色后读取图像信息，并通过灰度扫描软件，将图片信息转化为数字信号。

图2显示了HPV16E6/E7致癌蛋白血清杂交信号分析。(a).ESCC血清杂交信号热图，M：食管癌混合血清杂交信号热图；S：单人血清：肿瘤组织中检测出hr-HPV E6mRNA阳性的病例。红色代表较强的血清杂交信号，蓝色代表较弱的血清杂交信号。(b).ESCC血清杂交信号曼哈顿图：M：食管癌混合血清杂交信号热图；S：单人血清：肿瘤组织中检测出hr-HPVE6mRNA阳性的病例。以阴性对照的信号值作为基线(0％)，信号最强的多肽点为100％，绘制一个相对信号曼哈顿图。紫虚线对应相对信号强度为30％，＞30％的区域我们认为是可能存在抗原表位，应进一步分析。红虚线代对应相对信号强度为70％，绿色虚线框区域代表相对信号强度＞70％的肽段，认为是抗原性较强的抗原区域。

图3显示了抗原表位的生物信息学评价。(a,c)HPV16E6(a)和E7蛋白(b)抗原表位不同的生物信息学计算方法结果，依次为线性，抗原性，可及性，亲水性，可塑性，β转角。黄色区域为合理范围。(b和d)生物信息学预测表位与实验筛选表位的重叠区域对比。红色代表实验筛选出的HPV16E6(b)和HPV16E7(d)蛋白抗原表位区段，天蓝代表线性，粉红色代表抗原性，紫色代表可及性，深蓝代表亲水性，绿色代表可塑性，黄色代表β转角。

图4显示了抗原表位的三维结构模拟图。HPV16E6蛋白抗原表位用E6蛋白的晶体模型模拟：表位(1)：SLYGTTLEQQYNKP由β转角和β折叠组成；表位(2)：CQKPLCPEEK由α螺旋和β转角组成；表位(3)：IRGRWT由β折叠组成。HPV16E7蛋白抗原表位用HPV45E7蛋白的晶体结构模拟，(4)(TLHEYMLDLQ PETT)和(5)(SSEEEDEIDG)位于E7蛋白N端的不稳定区域。

图5显示了使用所鉴定的E6和E7抗原表位多肽检测个体受试者血清中的抗体水平的结果。采用多肽芯片在更大的人群中进行单个病例的血清筛查，并将信号强度转化为Log₂SNR值。(a)HPV16E6/E7的表位在人群中的响应程度。横坐标代表前部分筛选出来的抗原表位，纵坐标代表在ESCC人群(红色，n＝100)和健康人群(蓝色，n＝81)各个抗原表位对应的平均log₂SNR值。食管癌人群血清中各个抗原表位的响应度均高于健康人群。(b)ESCC和健康人群中每个表位响应程度的分布散点图。横坐标代表抗原表位，纵坐标为log₂SNR，SNR≥2认为是阳性反应抗原表位(紫线)。

图6显示了食管癌患者血清与宫颈癌患者血清中反应点的分布情况的比较结果。

实施例

在开发检测血清中HPV相关抗体的改进方法的过程中，本发明人通过肽段扫描技术来鉴定食管鳞癌患者血清中抗HPV16癌蛋白E6、E7的抗体的抗原表位。将HPV16E6、E7蛋白序列以肽段的形式，叠瓦式排列后点样至硝酸纤维素膜上；通过与食管鳞癌患者混合血清孵育，检测反应的化学信号。通过对反应信号的数值化、均一化、标准化处理，经分析后得到候选表位。此外，通过不同的预测方法对HPV16E6、E7蛋白的抗原表位进行预测，并与实验得到的表位进行比对，评估鉴定所得表位的可靠性。进一步分析将鉴定所得抗原表位点样至硝酸纤维素膜或iPDMS多肽芯片上，通过独立检测每个血清样本中的对抗原表位的反应程度，获得食管鳞癌患者血清中抗HPV16E6、E7蛋白的阳性率，验证抗原表位的有效性以及临床使用前景。结果显示，本发明的HPV抗原表位能够高效地检测食管鳞癌患者血清中的抗HPV抗体(特别是抗高危型HPV的抗体)，检测阳性率高。

通过以下实施例，可以更好地理解本发明，但应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，并非意欲限制本发明。还应理解，以下实施例中所使用的实验材料和方法不意欲是限制性的，本领域技术人员熟知用于替换这些实验材料和方法的等价材料和方法。

研究对象

选择2010年2月至2015年6月,就诊于中国医学科学院肿瘤医院胸外科的食管鳞癌患者和性别年龄匹配的健康体检人群血清。经所在医院伦理委员会批准,在知情同意前提下,分别用血清采血管采集食管鳞癌患者术前静脉血并分离血清保存并于-80℃冰箱，血清避免反复冻融，冻融3次以上的血清不能用于本实验。食管鳞癌患者中位年龄为65(45～79)岁,健康人群中位年龄为65(40～80)岁。

实验材料

15×15mm²iPDMS膜芯片(SJ Biomaterials,Suzhou,China)，多肽由GL Biochem公司合成(GL Biochem，shanghai,China)。人IgG(H-IgG)购于DGCS-Bio公司(DGCS-Bio，Beijing,China)。辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(HRP-IgG)购自ZSGB-Bio公司(ZSGB-Bio，Beijing,China)，过氧化物酶共轭稳定器/稀释剂和化学发光底物购自ThermoFischer公司(Thermo Fischer，USA)，ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)。

实施例1：HPV16癌蛋白E6和E7抗原表位的获得

1、硝酸纤维素膜制备

利用斑点合成(SPOT synthesis)技术(可参见例如，中国专利申请公开号CN1602204)合成覆盖HPV16E6/E7全部氨基酸序列的多肽阵列，每条肽段长度为18个氨基酸，相邻两条肽段之间重叠长度为16个氨基酸。将肽段合成序列输入电脑后，多肽合成仪AutoSpot(可购自例如Intavis AG，德国)在MultiPep软件程序的控制下将特定的氨基酸点样到活化的硝酸纤维素膜表面。

2、检测食管鳞癌患者混合血清中抗体存在情况

将合成的HPV16E6/E7多肽硝酸纤维素膜按顺序浸于100％，75％和50％的乙醇中各5分钟，转移至1×PBS中30min；将膜置于封闭液(0.2％Tween-20和5％脱脂牛奶的PBST)；1×PBST洗膜1次，10min；血清的稀释：将10个人的血清等量(10ul)混合至100ul，震荡混匀，用封闭液按1：1000的比例稀释血清；阳性对照抗体的稀释：用封闭液按1:500的比例稀释HPV16E6多克隆(山羊抗人)(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)。将混合血清和阳性对照分别与多肽阵列共孵育，4℃轻摇过夜；复温至室温，1×PBST洗膜3次，每次10min；二抗孵育：多肽阵列与1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗山羊或山羊抗人IgG二抗室温孵育2h；1×PBST洗膜3次，每次10min；ECL显影液显影，ImageQuant^TM LAS 4000数字成像系统曝光。

在图1中显示了多肽阵列合成的示意图

3、食管鳞癌患者血清中抗HPV16癌蛋白E6、E7抗原表位鉴定

孵育血清、成像后采集图像信息，通过Image J软件对每个信号点上的反应强度数值化，得到每个信号点反应强度具体数值，并绘制成热图展示出HPV16E6、E7蛋白抗原表位分布情况(图2a)。以阴性对照(健康人血清)的信号值作为基线(0％)，信号最强的多肽点为100％，绘制一个相对信号曼哈顿图(图2b)。以30％为阈值，＞30％的肽段点被认为是阳性肽段，连续的阳性点区域考虑存在B细胞抗原表位。

4、候选抗原表位的生物信息学评价

为了进一步验证筛选出来的抗原表位是否合理，我们采用了生物信息学的方法在IEDB数据库中(http://tools.immuneepitope.org/org/bcell)，通过抗原表位的6种理化性质(线性，亲水性，可塑性，表面可及性，抗原性，β转角)，利用相应的算法预测HPV16E6和E7蛋白的线性表位(图3a和c)。不同算法中，得分高于阈值的区域被认为是有效的抗原决定簇的区域。多肽扫描实验筛选出的抗原表位与预测表位区段重叠，说明实验筛选出的表位在理化性质上是合理的(图3b和d)。

5、HPV16癌蛋白E6和E7抗原表位的获得

肽段信号曼哈顿图上＞30％的肽段联合生物信息学分析，因此我们总共筛选出了5个抗原表位(表1)。3个来自HPV16E6癌蛋白(SLYGTTLEQQYNKP，CQKPLCPEEK，IRGRWT)，2个来自HPV16E7癌蛋白(TLHEYMLDLQPETT，SSEEEDEIDG)(见表1)。其中抗原性最强的分别是HPV16E6的CQKPLCPEEK和HPV16E7的TLHEYMLDLQPETT。

表1：HPV16癌蛋白E6、E7抗原表位

另外我们用HPV16E6蛋白晶体结构模型来模拟各抗原表位HPV16E6蛋白抗原表位用E6蛋白的晶体模型模拟：表位1：由β转角和β折叠组成；表位2：由α螺旋和β转角组成；表位3：由β折叠组成。HPV16E7蛋白抗原表位用HPV45E7蛋白的晶体结构模拟，4和5位于E7蛋白N端的不稳定区域(图4)。

实施例2：抗原表位在大人群样本中的验证

将获得的抗原表位序列点样至iPDMS多肽芯片上，芯片分别与不同个体血清样本进行杂交。先用血清稀释液湿润多肽芯片反应器表面3分钟；血清用血清稀释液(1％牛血清白蛋白,1％酪蛋白,0.5％蔗糖,0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.5％吐温-20，0.01M磷酸盐缓冲液,pH＝7.4)按1:200稀释成200μL，移至多肽芯片反应器并在摇床上孵育(4℃，120转/min，孵育2小时)，在每一批实验中应设置一例阴性对照(200μl血清稀释液)；孵育完毕后用洗液冲洗芯片表面3次，并用吸引器吸干剩余的洗液；往各反应器中加入山羊抗人—IgG，静置孵育(4℃，1小时)，随后洗液冲洗3次；用洗耳球吹干芯片表面，将A、B发光液按1：1混合，每张芯片表面滴入15μL发光液并铺匀(芯片膜不宜吹干过久，在2min内滴加发光液)，移至曝光架上；调整LAS 4000参数(16bit，高分辨率，2min)并完成曝光。

将每个信号点的强度进行数值化、均一化处理后，通过转化得到每个信号点的信噪比(Signal to Noise Ratio，SNR)。信号点的信噪比强度若大等于2则认为是反应阳性点，一个样本具有2个以上反应阳性点则认为该样本为HPV16E6/E7血清抗体阳性。通过此标准检测了100例食管鳞癌患者和81例健康对照中HPV16E6/E7血清抗体的阳性率(见图5以及下表2)。检测结果显示抗原表位可有效捕捉血清中抗HPV16E6/E7抗体。同时发现在食管鳞癌患者血清中HPV16E6/E7抗体水平显著高于健康对照，提示hr-HPV感染可能与食管鳞癌的发生发展有关，具有临床意义。

表2食管鳞癌患者和健康人群中HPV16E6/E7机体免疫反应

此外，同时比较了食管癌患者血清与宫颈癌患者血清中反应点的分布情况，发现二者之间的分布存在相似性，提示鉴定所得抗原表位除了可应用于食管鳞癌患者中HPV感染的检测与鉴定以外，还有希望应用于宫颈癌患者中HPV的检测与治疗(图6)。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> 新的HPV抗原表位

<130> IDC160157

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ile Arg Gly Arg Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 158

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒16型E6蛋白

<400> 6

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

145 150 155

<210> 7

<211> 98

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒16型E7蛋白

<400> 7

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

Claims (17)

1.一种分离的多肽分子，其为：

(a)选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列；或

(b)与选自SEQ ID NO：1-5的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

2.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1所述的多肽分子。

3.一种核酸载体，其包含权利要求2所述的核酸分子，并且能够在细胞中表达权利要求1所述的多肽分子。

4.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸载体。

5.一种试剂，其包含权利要求1所述的分离的多肽分子。

6.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的分离的多肽分子。

7.权利要求5的试剂或权利要求6的试剂盒，其还包含检测与所述多肽分子相互作用的蛋白的检测试剂，所述蛋白包括抗体。

8.权利要求6或7的试剂盒，其还包含用于固定所述多肽分子的固相支持物。

9.一种用于检测样品中是否存在抗HPV特别是高危型HPV的抗体或用于检测受试者中的HPV特别是高危型HPV的感染情况的方法，包括：

a)使权利要求1所述的分离的多肽分子与所述样品或来自所述受试者的样品接触；和

b)测定所述样品中与所述多肽分子相互作用的抗体的存在。

10.权利要求9的方法，其中所述样品包括血清样品。

11.权利要求9或10的方法，其中所述检测受试者中的HPV特别是高危型HPV的感染情况包括检测受试者是否携带或感染或曾经感染HPV特别是高危型HPV。

12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述高危型HPV包括HPV16。

13.权利要求9-12中任一项的方法，其中所述受试者包括癌症受试者。

14.权利要求13的方法，其中所述癌症包括口咽癌、宫颈癌或食管癌，特别是食管鳞癌。

15.权利要求9-13中任一项的方法，其中在步骤a)之前还包括将所述多肽分子固定在固相支持物上的步骤。

16.权利要求1所述的分离的多肽分子在制备用于检测样品中是否存在抗HPV特别是高危型HPV的抗体或用于检测受试者中的HPV特别是高危型HPV的感染情况的试剂或试剂盒中的用途。

17.权利要求1所述的分离的多肽分子在制备治疗性抗体、组合物或疫苗中的用途。