MXPA04012912A

MXPA04012912A - Peptidos de las proteina e2, e6 y e7 del virus del papiloma humano 16 y 18 para detectar y/o diagnosticar cancer cervical y otros.

Info

Publication number: MXPA04012912A
Application number: MXPA04012912A
Authority: MX
Inventors: Yao Xiong Hu
Original assignee: Yao Xiong Hu
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2006-06-27
Also published as: US20060110794A1; CN100351268C; US6933123B2; US7267961B2; US20040110925A1; US20050221295A1; AU2003253784A8; AU2003253784A1; US7316908B2; WO2004005469A2; WO2004005469A3; CN1662550A

Abstract

Una secuencia o un peptide aislada de la proteina region temprana de la codificacion de e2, e6 o e7 del papillomavirus humano que es soluble en un medio acuoso, y caracterizo por una falta relativa del trytophan, residuos del methionine y del cysteine, y una abundancia relativa de residuos del glycine y de la asparragina. Tambien se divulgan las secuencias aisladas de la proteina o los peptides las regiones tempranas de la codificacion de e2, e6 o e7 del hpv 16 y 18 y metodologias para detectar o diagnosticar el cancer o las anormalidades celulares pueden incluir la deteccion y/o diagnosticar de condiciones precancerosas o premalas, de displasia cervical, de carcinoma cervical, de koilocytosis, de hiperqueratosis, de lesiones intraepithelial, y de otros canceres. Preferiblemente, las metodologias de la novela para detectar y/o diagnosticar el cancer o las anormalidades celulares de la actual invencion pueden abarcar el steps(1)reacting una muestra del fluido corporal o del tejido fino con secuencias aisladas o peptides de la proteina; (2)forming un complejo del anticuerpo-antibody-peptide; y (3) detectando el complejo del anticuerpo-antibody-peptide.

Description

l'llbli.slu'd: l'br iwo-letw.i cotias cmil ot nr übbrevicui ii.t, — wiii Hü uiicrniitiimat semvli r.port and lo be ir.pubüshc.d ?????? rei cipl of llulí reporl PÉPTIDOS DE LAS PROTEÍNAS E2 E 6 Y E7 DEL VIRUS DEL PAPILLOMA HUMANO 16 Y 18 PARA DETECTAR Y/ O DIAGNOSTICAR CÁNCER CERVICAL Y OTROS.

ANTECEDENTES 1. Campo del Invento El presente invento se relaciona generalmente a los péptidos reactivos con anticuerpos formados contra el virus del papilloma humano (VPH) y en particular, a nuevos péptidos aislados, purificados o derivados de la región temprana de codificación de E2, E6, Y E7 oncoproteínas del VPH y métodos para la detección y/ o diagnóstico de anormalidades celulares epiteliales asociadas al VPH, condiciones pre-cancerígenas y cáncer vía inmuno-ensayo. 2. Arte Previo El virus del papilloma humano (VPH), nombrado de esta manera porque ciertos tipos inducen verrugas o papilomas, provoca virtualmente todos los cánceres cervicales (Nobbenhuis et al., "Relation of Human Papilloma virus status to cervical lesions and consequences for cervical cáncer screening; a prospective study"-"Relación del estatus del virus del papiloma humano con las lesiones cervicales y consecuencias del estudio del cáncer: un estudio prospectivo", The Lancet, 354:20-25, 1999; Cuzick et al., " A systematic review of the roles of human papilloma virus (HPV) testing within cervical screening programme : summary and conclusions"- Revisión sistemática de los roles del virus del papiloma humano, pruebas dentro del programa de estudio cervical: resumen y conclusiones". British Journal of Cáncer, 83:561-565, 2000). Estos incluyen no solo los carcinomas de célula escamosa ( Nobbenhuis et al, 1999) sino también adenocarcinomas ( pirog et al., "Prevalecence of human papilloma virus DNA in different histological subtypes of cervical adenocarcinoma" 1 American Journal of Patology 157:1055-1062, 2000). Estos virus están también fuertemente asociados con los carcinomas vulvares y vaginales (Frisch et al., "Human papilloma virus-associated carcinomas in Hawaii and the mainland US", Cáncer 88:1464-1469, 2000; Sungase et al, "Distinct manifestations of human papilloma viruses in the vagina" International Journal of Cáncer, 72:412-415 1997), as well as cancers of the anus (Frisch et al., 2000) and penis (Gregoire et al., "Preferential association of human papilloma virus with high grade histological variants of penile invasive squamous cell carcinoma" Journal of the National Cáncer Institute, 87:1705-1709, 1995). Además, el VPH puede ser responsable de ciertos tipos de carcinomas en la cabeza y en la región del cuello ( Mellin et al., "Human Papilloma virus (HPV) DNA in tonsillar cáncer: clinical correlates, riesgo y relapso y supervivencia)" International Journal of Cáncer , 89:300-304, 2000; Zumbach et al., "Anticuerpos contra las oncoproteínas E6 y E7 de tipos de virus del papiloma humano tipos 16 y 18 en pacientes con carcinoma de células escamosas en la región de la cabeza y el cuello" International Journal of Cáncer, 85:815-818,2000), parece asociado con los melanomas más mortales ( Dreau, et al" Virus del Papiloma Humano en la biopsia de especímenes de melanoma y sus relaciones con la progresión del melanoma" Annals of Surgery, 231 :664-671 ,2000) y podrán jugar un papel en carcinomas de pulmón (Soini et al., "Presencia del ADN del virus del papiloma humano y acumulación anormal de proteínas p53 en el carcinoma del pulmón" Thorax 51 :887-893, 1996) y quizás de otros tipos de cáncer.

El cáncer cervical es el segundo tipo de cáncer más común entre las mujeres alrededor del mundo. Cada año aproximadamente 450,000 mujeres alrededor del mundo son diagnosticadas con cáncer cervical y casi, 300,000 mujeres mueren por causa de esta enfermedad. Desde el advenimiento de las pruebas organizadas de cáncer cervical mediante la citología hace 50 años, el índice de mortandad del cáncer cervical ha disminuido en forma dramática en países desarrollados. De hecho, se considera que el cáncer cervical se puede prevenir. En este aspecto, una clave 2 importante para la prevención es la identificación a tiempo y manejo de lesiones precancerosas y en cáncer temprano a través de métodos de evaluación accesibles, programas y metodologías. Hoy en día, aproximadamente 12 % del cáncer femenino alrededor del mundo se debe a infecciones de la cerviz por el VPH. Este consenso entre la comunidad médica de que la detección oncogénica sería una manera efectiva de identificar víctimas potenciales del cáncer o de aquellos que se encuentren en alto riesgo de contraer dicha enfermedad. Es notable que la detección del VPH facilitaría la detección temprana de cáncer o de anormalidades celulares que sugieran cáncer al punto y en el momento en el que el cáncer o anormalidades celulares existen en una etapa de curación más pronta. Una metodología primaria para la detección del cáncer cervical ha sido el Papanicolau o prueba de PAP. Por una variedad de razones, la prueba de Papanicolau es menos del ideal como prueba de muestreo. Algunos de los inconvenientes incluyen dificultad para obtener muestras, alto porcentaje de falsos negativos ( hasta 20%) y requerimientos de laboratorios con personal especializado y altamente calificado. Los métodos de estudio de ácido nucleico han sido desarrollados por aquellos conocedores del arte, pero no son el ideal principalmente porque tienen un alto costo e igualmente requieren personal altamente especializado y calificado. Otra ensayo desarrollado por aquellos conocedores del arte implica la llamada "Captura Híbrida de ADN". Sin embargo, este método tiende a sufrir por los altos costos y las dificultades para obtener las muestras, haciendo que sea menos ventajoso como prueba ideal de monitoreo o detección. Recientemente aquellos conocedores del arte han desarrollado metodologías para examinar la utilidad de VPH para propósitos de diagnóstico. En particular, anticuerpos IgA, IgG y IgM criados contra el VPH que han sido empleados en la detección de infección del VPH y para diagnosticar carcinoma y pre- etapas del mismo. Usando las técnicas previas del arte, péptidos inmuno-reactivos asilados del VPH han sido definidos con un epitope que es reactivo con el suero humano. Sin embargo el arte previo no divulga los péptidos del presente invento, no enseña las múltiples combinaciones de complejos de anticuerpos epitopes, que se pueden contemplar para producir ensayos de diagnóstico con una mejor sensibilidad y/o especificación. Dichos artes previos de métodos para el muestreo de cáncer son limitados por el costo, procedimiento de muestreo, precisión equipo y requerimientos de personal. Es por eso que los conocedores del arte, por el bajo costo, simple y sensible a ensayos específicos que se puede realizar en muestras obtenidas del cuerpo que podría ser un avance significativo en el arte. Dichos ensayos se divulgan y se reivindican en el presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES Lo anterior así como otros objetos y características del presente invento serán más aparentes a partir de la siguiente descripción de las reivindicaciones, tomadas en conjunto con las ilustraciones acompañantes. Comprendiendo que estas ilustraciones muestran sólo inclusiones típicas del invento y en consecuencia no deben ser consideradas como limítrofes en el ámbito del invento que será descrito con mayor especificación y detalle a través del uso de las ilustraciones que lo acompañan que son: La Figura uno (1) representa una tabla que muestra los resultados de una prueba de PAP de citología y diagnóstico de inmuno ensayo aplicando la captura de ADN híbrido del VPH en sujetos con y sin displasia asociada al VPH o de otras condiciones pre malignas así como cáncer; y La figura 2 representa una tabla que muestra los resultados del diagnóstico del inmuno ensayo aplicando los péptidos del presente invento en sujetos con o sin displasia asociada al VPH o de otros condiciones pre malignas así como cáncer.

DESCRIPCION Se entenderá que las secuencias de proteína aisladas y las metodologías del presente invento, como se describen e ilustran generalmente en las figuras del presente, se pueden configurar y diseñar en una gran variedad de configuraciones. Aquellos conocedores del arte, claro está, apreciarán las variadas modificaciones a los detalles de la presente que se pueden realizar sin alejarse de las características esenciales del invento, como se describe. Así, las descripción más detallada de las inclusiones del presente invento, como se representa en las Figuras 1 y 2, no pretende limitar el ámbito del invento, como es reivindicado, sino que es representativo de las inclusiones preferidas del presente invento.

El VPH existe como diferentes tipos genéticos o genotipos, designados por números, concernientes con sólo un sub grupo que es oncogénico o que provoca 5 el cáncer. Se han identificado más de 100 genotipos del VPH. Estos genotipos del VPH se conocen también como cepas del VPH o tipos y se designan o se conocen por el número o por "VPH #" en donde el # es el número del oncogénico o del genotipo que provoca el cáncer. El cáncer abrumadoramente proviene del VPH 16 y 18 pero también puede asociarse con el VPH 31 , 33, 35, 45,52, 56 y 58. el virus infecta las células cervicales y otras células que generalmente dan soporte a la propagación del virus, en donde puede provocar cambios anormales en las células que puede conllevar a una vida llena de malignidades. La infección del VPH requiere células que puedan replicar su DNA, específicamente aquellas células en la capa basal de la epidermis. La entrada del VPH dentro de la capa basal epidermial ocurre a través de microlesiones que exponen las células proliferativas básales a la superficie. El virus se conecta a la superficie de la célula receptora y obtiene entrada dentro del cístosol de la célula. La partícula del VPH que inserta, contiene un genoma de ADN de doble liga y cerrado y circular de 7000 a 8000 pares de base compuestos por marcos de lectura abiertos transcritos, E1 a E8, algunas veces conocido como regiones de codificación temprana que se encuentran representadas en forma desigual entre los genotipos de VPH, dos marcos de lectura tardía y una región de control larga sin código. Mucho se ha descubierto sobre como el ADN del VPH se integra dentro de los cromosomas huéspedes y de cómo las oncoproteínas E1 y E2 participan en este proceso. La relevancia para el diagnóstico inmunológico es que los anticuerpos contra el los productos del gen E1 y E2 pueden ser evidencia de que ha ocurrido una infección del VPH. La manera en que la infección del VPH conduce al cáncer incluye interacciones celulares con los productos de los genes de E6 y E7. De otra manera, los genes de E6 y E7 encodifican amino ácidos que son traducidas en secuencias de proteínas o péptidos, que después ¡nteractúan con las estructuras de las células o proteínas que puede conducir al cáncer. Los productos de genes que pueden 6 conducir a un tumor o cáncer se conocen normalmente como proteínas oncogénicas u oncoproteínas. En células huésped, E6 y E7 de productos de Genes, forman complejos con el tumor retinoblastoma y el celular p53 suprimiendo proteínas y regulando la división celular. AI neutralizar funcionalmente o inactivar estas proteínas, las células entran en la fase S del ciclo celular. La oncoproteína E7 desestabiliza aún más el control celular a través de la interacción con la proteína inhibidora de kinasa dependiente de ciclina, p21. Estas interacciones marcan la etapa para controlar la proliferación de células huésped y diferenciación ( es decir transformación), un primer paso en la conversión de células normales a prenoplásticas ( pre-cancerígenas) y por último a la expresión total de cáncer o malignidad. Las oncoproteínas E6 y E7 se expresan constitutivamente en células tumorales y silenciando estos genes crean la reversión del fenotipo maligno. Así, los productos de gen de E6 y E7 parecen antígenos específicos de tumor y posibles blancos o pruebas de anticuerpos en pruebas inmunológicas de cáncer así como antígenos en vacunas para controlar los tumores inducidos por el VPH. Ciertamente las oncoproteínas E6 y E7, parecen blancos naturales para la producción de anticuerpo debido a su expresión consistente en las células cancerígenas cervicales. La respuesta contra la oncoproteína E7 en estudios previos, ha sido moderadamente específica de enfermedad, pero E7lgG y IgA han sido verificadas como fuertemente asociadas con la enfermedad. Los anticuerpos contra las oncoproteínas E6 y E7 se encuentran en altos niveles en suero en pacientes con cáncer cervical en comparación con otros controles no cancerígenos. Además, dichos anticuerpos parecen detectables por medios inmunológicos aún cuando se encuentran presentes en menor cantidad. La sensibilidad para identificar infecciones por VPH y posibles cánceres aumenta con una combinación de pruebas serológicas de proteínas de virus múltiples.. Es por esto que el uso de oncoproteínas da resultados inmunológicos positivos con muestras de pacientes con cáncer cervical.

Además de las metodologías del presente invento, también puede ser ventajosos emplear una metodología de diagnóstico o detección que emplee una combinación de productos genéticos, secuencias de proteínas o póptidos de dos o más de los VPH E2, E6 y E7 en sus regiones de codificación temprana. Una combinación de secuencias de proteínas aisladas o de péptidos de VPH E2 con VPH E6 y E7 puede permitir metodologías más sensible y lo específicas para detectar y diagnosticar la integración del virus del VPH ( es decir infección) dentro de la célula huésped así como detectar o diagnosticar VPH asociado con anormalidades celulares. En forma alternativa, una combinación de secuencias de proteínas aisladas o péptidos de VPH E6 con VPH E7, puede permitir metodologías más sensibles y/o específicas para diagnosticar o detectar ciertas anormalidades celulares. Los anticuerpos contra el E2 también se pueden asociar con estados premalignos y cáncer (Stevenson et al " Inverse reiationship between the expression of the human papilloma virus type 16 transcription factor E2 and virus DNA copy number during the progression of cervical intraepithelial neoplasias" Journal of General Virology, 81 :1825-1832, 2001 ; Tonon et al "Physical status of the E2 human papilloma virus 16 viral gene in cervical prenoplastic and neoplastic lesions", Journal of Clinical Virology, 21 : 129.134, 2001 ; Linden et al "Human papilloma virus positive squamous cell carcinoma of the oropharynx: a radiosensitive subgroup of head and neck carcinoma" Cáncer, 92:805-813, 2001 ; Rosales et al., "Antibodies against human papilloma virus (HPV) type 16 and 18 E2n E6 and E7 proteins in sera; correlation with presence of papillomavirus DNA" Journal of Medical Virology, 65:736-744, 2001 ; Sheets et al., "Inmunotherapy of human cervical high grade cervical intraepithelial neoplasia with micro particle- delivered human papillomavirus 16 E7 plasmid DNA" American Journal of Obstetrics and Gynecology, 188:916-926, 2003) pero detalles específicos de como el VPH en su proteína E2 contribuye a la oncogénesis, aún sigue en la obscuridad (Dong et al "Human papilllomavirus type 1 1 E2 proteins repress the homologous E6 promoter by ¡nterfering with the binding of host transcription factors adjacent elements" Journal of virology, 68: 11 15-1127, 1994). 8 Las secuencias de proteínas o péptidos del presente invento pueden ser aislados, purificados o derivados de las regiones de codificación temprana de las oncoproteínas E2, E6 y E7 de VPH 16 y 18. El aislamiento de los péptidos del presente invento se puede basar en su habilidad para reaccionar con anticuerpos formados en le huésped infectado con el VPH oncogénico. Entre los factores específicos empleados en la sección para procesar su solubilidad en soluciones acuosas o de naturaleza hidrofílica. Se asumía que las regiones hidrofílicas de la proteína del producto oncogénico estaban más orientadas hacia la superficie de la proteína completa bajo condiciones nativas o naturales, y de que dicha consecuencia incluye regiones antigénicas contra las cuales la reactividad de anticuerpos puede ocurrir con mayor probabilidad. Antigénico describe una sustancia que el cuerpo considera como extraña o potencialmente peligrosa y contra la cual el cuerpo produce un anticuerpo. Típicamente, un antígeno se compone de proteína o péptido. Un anticuerpo es una proteína especializada producida en el tejido linfático en respuesta a la presencia de un antígeno en particular. El anticuerpo atacará al antígeno y los dejará inactivo. El ataque del anticuerpo comúnmente conlleva a la formación de un complejo antígeno- anticuerpo y se usa de manera indistinta con los términos de complejo de anticuerpo- péptido o complejo de péptido -anticuerpo y complejo de anticuerpo- epítope. Otro factor es la relativa paucisidad de residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos sea mantenida. Más de una cisteína en le residuo terminal de amino fue considerada como inaceptable. Se hicieron intentos para limitar la cisteína en otras partes a lo largo del péptido ya que cisteínas múltiples podrían traer circunstancias previniendo la utilidad en el inmuno ensayo. Los péptidos con cisteína son más susceptibles a la oxidación a un PH neutral y la propensión de las cisteína para la formación de sulfihidrilo podría llevar a la dimerización que impide la conexión de anticuerpos. Además, se observó una pausicidad del triptopan debido al potencial de oxidación elevado de este amino ácido. Se entiende por pausicidad que existen pocas ocurrencias en esta secuencia. Una inclusión aún más preferida de las 9 composiciones de péptidos incluye hasta 8 residuos adicionales de aminoácidos conectados al residuo de la terminal de carboxiio en donde estos residuos son una combinación de glicina y esparraguina. Los residuos adicionales de glicina y esparraguina pueden ayudar a orientar al péptido en el medio acuosos para mejorar la conexión del anticuerpo. Ocho secuencias de proteínas específicas de péptidos que varían de 17 a 23 residuos de aminoácidos en longitud, pueden aislarse, purificarse o derivarse de las oncoproteínas E2, E6 y E7 del VPH 16 y del VPH 18 como se define a continuación. El número de identificación de secuencia (NQ Id. Sec) 1 fue derivado de la región E2 del VPH 18. Decodificado y empleando el acrónimo estándar de tres letras Numero de secuencia 1 , que incluye 22 residuos que conforman de 219 aminoácidos hasta 240 del VPH 18 oncoproteína E2 es de la siguiente manera, con la secuencia comenzando con el residuo de la terminal de aminoácido y terminando en le residuo terminal de carboxiio: Lys GIn Leu Gln His Trp Pro Ser Pro Tyr Ser Ser 1 5 10 Thr Val Ser Val - Gly Thr Ala Lys Thr Tyr (Seq.ld.Ns1) 15 20 Las secuencias de los números 2 y 3 son derivadas de la región de codificación temprana de E2 de VPH 16. Decodificadas empleando las abreviaciones estándar de tres letras, la secuencia número 2, comprendida por los residuos 17 que hacen 112 aminoácidos hasta 131 de VPH 16 E2 de la oncoproteína y la secuencia número 3 que comprende 23 de los residuos que hacen 187 aminoácidos a 209 de la oncoproteína de VPH 16 E2 de la siguiente manera con las secuencias comenzando en el final del residuo de la terminal de aminoácido: His Gly Tyr Thr Val Gln Phe Asp Gly lie Cys 5 10 10 Asn Thr Met His Tyr (Sec. Id. NQ 2) 15 His Ala Gly Gly Gln Val lie Leu Cys Pro Thr Ser 1 5 10 Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu 15 20 (Sec. De id. N- 3) la secuencia número 4 se deriva de la región de codificación temprana de E6 de la región de VPH 6. decodificada empleando las abreviaciones estándar de tres letras en la secuencia número 4, compuesta por 22 residuos que conforman de 62 aminoácidos hasta 83 de la oncoproteína del VPH 16 E6, que es de la siguiente manera, comenzando la secuencia en la terminal residual del aminoácido: Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys 1 5 Leu Lys Phe Tyr Ser Lys lie Ser Glu Tyr (Sec.ld.ne4) 15 20 La secuencia del número 5 se deriva de la región de codificación temprana de E6 del VPH 18. Decodificada empleando las abreviaciones estándar de tres letras, el número de secuencia 5 comprende 22 residuos que conforman de 67 aminoácidos hasta 88 del la oncoproteína del VPH 8 de E6 de la siguiente manera, comenzando la secuencia en la terminal de residuo de aminoácido: Lys Cys lie Asp Phe Gly Ser Arg lie Arg Glu Leu 1 5 10 Arg His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp (sec. Id. N95) 11 Las secuencias número 6 y 7 se derivan de la región de-codificación temprana de E7 de VPH 16. Decodificada empleando las abreviaciones estándar de tres letras. La secuencia número 6 comprende 21 residuos que conforman 27 aminoácidos hasta 46 de la oncoproteína del VPH 16 E7 y el número de secuencia 7 comprende 21 residuos que conforman de 67 aminoácidos hasta 88 de la oncoproteína del VPH 16 E7 de la siguiente manera, con las secuencias comenzando en el extremo de la terminal residual del aminoácido: Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu GIu Asp Glu 1 5 10 lie Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu (sec. Id. Ne6) 15 20 GIu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn 1 5 10 Asp Ser Ser Ser Glu Asp Glu lie Asp (Sec. Id. NQ7) 15 20 El número de secuencia 8 se deriva de la región temprana de codificación E7 del VPH 18. Decodificado empleando las abreviaciones estándar de tres letras, el número de secuencia 8 comprende 22 de los residuos que conforman de 14 aminoácidos hasta 35 de la oncoproteína del VPH 18 E7 de la siguiente manera comenzando la secuencia en la terminal de residuos de aminoácidos.

His Leu Gln Pro Gln Asn Glu lie Pro Val Asp Leu 1 5 10 12 Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu (sec. Id. N9 8) 15 20 El uso de péptidos en el método de diagnóstico se basa en el hecho de que los anticuerpos nativos a los epitopes de E2 y E6, y E7, oncoproteínas de VPH 16 y 17 se encuentran en aquellos que sufren de una variedad de VPH asociada con anormalidades celulares que existe en neoplasmas, de estados pre cancerígeno a estados de malignidad. En particular, dicho VPH asociado a anormalidades celulares o displasias puede incluir pero sin estar limitado a Koilocytosis; hiperkeratosis; condiciones pre cancerígenas que incluyen neoplasias epiteliales o lesiones intra epiteliales, displasias de alto grado; y cáncer invasivo o maligno. La displasia generalmente se refiere a la presencia o desarrollo de células anormales, pre malignas o pre cancerígenas. Los neoplasmas malignos asociados con el VPH se discuten anteriormente, el método de diagnóstico incluye tomar una muestra de fluidos corporales o de tejido que probablemente contengan anticuerpos. Esta muestra de preferencia es fácil de obtener y puede ser suero o plasma derivado de una muestra de sangre venosa o de un pinchazo con lanceta en el dedo. Sin embargo, las secreciones cervicales, tejido cervical, tejido de otras partes del cuerpo y otros fluidos corporales contienen anticuerpos y pueden ser empleados como fuente para una muestra. Una vez que el antígeno péptido y el anticuerpo de la muestra reaccionan en un medio adecuado, un ensayo se realiza y se determina la presencia de una reacción de anticuerpo- péptido. El siguiente ejemplo ¡lustrará la práctica del presente invento con mayor detalle. Será de fácil comprensión para aquellos versados en el arte que a partir de los métodos, formulaciones y composiciones de péptidos novedosos de las regiones tempranas de codificación de E2, E6 y E7 del VPH 16 y 18 del presente invento, como generalmente se describe y se ¡lustra en los ejemplos del presente, se deben visualizar como ejemplos de los principios del presente invento y no son restrictivos a una proceso o estructura en particular para implementar estos 13 principios. Así, la siguiente descripción más detallada de las inclusiones preferidas como se representan en el ejemplo 1 no pretende limitar el ámbito o campo del invento, como se reivindica, sino que es representativo de las inclusiones preferidas del invento.

EJEMPLO 1 1. Síntesis de las Secuencias de Aminoácidos o Péptidos Aunque los péptidos del invento pueden ser obtenidos de una variedad de arte y métodos previos, pero sin estar limitada a la tecnología recombinante y otras fuentes de biotecnología, la síntesis química es el método preferido ya que facilita la acumulación de una cantidad adecuada de péptidos en forma sustancialmente pura de 95% a 99% por peso en el presente caso. La síntesis de péptidos se puede lograr en una escala de 0.25 usando (9 fluorenil) methoxicarbonyl (FMOC) aminoácidos L protegidos, con súper ácido -labílico 2- resina de chlorotritilo ( Novabiochem, Nottingham, Reino Unido) como soporte sólido. Se puede pre cargar una resina dentro de un vehículo de reacción, lavado con dimetyl formamido y después drenado completamente. A esta resina se le puede agregar 10 mi. De 205 de piperidina en dimetil formamido. Esta mezcla después se puede agitar durante 5 minutos y después drenar. Otros 10 mi de 20% de piperidina en dimetil formamido se puede añadir y después la mezcla se agita durante 30 minutos. Después de drenar, la resina se puede lavar con dimetil formamido cuatro veces y después una vez con diclorometano. Las perlas de resina se pueden considerar preparadas apropiadamente si se tornan de color azul usando la prueba estándar de ninhidrino. Por cada aminoácido se puede preparar una solución acopladora de la siguiente manera: 1 mmol Fmoc aminoácido de su elección; 2.1 mi 0.45 M 2-(1 H-benzotriazole-1-yl)-1 ,1 ,3,3- tetrametiluronio-hexafluoruro-fosfato /hidrobenzotriazol 14 {1 mmol}; 348 µ LO de N, N diisopropiletilamino {2mmol. La mezcla se puede agitar por un mínimo de 30 minutos. El vehículo de reacción puede ser drenado y la resina lavada cuatro veces con dimetilformamido y una última vez con diclorometano. Se puede realizar una prueba estándar con ninidrino para asegurar el acoplamiento del aminoácido. Por cada aminoácido se puede añadir la solución de acoplamiento a la resina en el orden apropiado, repitiendo la reacción de acoplamiento hasta que los aminoácidos estén colocados a lo largo del péptido. El péptido completo puede ser partido de la resina mediante una reacción por dos horas con una solución de 5% de H2O, 5% de fenol, 3% de thionasole, 3% de ethaneditiol, 35 de triisopropilisanol, 81 % de ácido trifluoracético. Después de la división la mezcla de resina se puede filtrar en metil-tibutil-éter frío y secado en nitrógeno gaseoso. El peso molecular del péptido puede ser revisado por una cromatografía de Matriz asistida por un espectrómetro de masa y la pureza déla cromatografía líquida de alto desempeño empleando una columna de C18300A 5 µ. Las secuencias de péptido sintetizado pueden ser de aproximadamente 95 a 99% de nivel de pureza, pero se pone énfasis que niveles menores de pureza también son adecuados para propósitos del ensayo. 2. Almacenamiento de las secuencias de aminoácidos Las secuencias de aminoácidos pueden ser suspendidas en PBS a aproximadamente un pH de 7.0 a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml y puede ser almacenado en contenedores sellados a aproximadamente - 209 C. 3. Unión por Anhídrido Málico de secuencias de aminoácidos a placas de Título Se pueden emplear REACTI-BIND ® placas de poli estireno activado de anhídrido málico ( Pierce, Rockford, Illinois). Cada secuencia de aminoácido puede ser diluida a 12.5 µ 1 mL con un suavizador de cubierta ( 100mM de bicarbonato de sodio como suavizador, pH 9.4). a cada pozo de título, 100// L (1 .25 µ g) de la 15 secuencia diluida se puede añadir. La placa puede ser entonces incubada por durante una hora a temperatura ambiente con agitación. La placa puede vaciarse y el líquido puede vertirse en una toalla de papel limpia. Cada pozo puede ser lavado con 100 µ L de agua como suavizante (0.15 de albúmina de suero bovino y 0.05% Entre-20 en solución salina de fosfato como suavizante, pH 7.0) . esto puede repetirse por un total de tres veces. Cada vez, la placa puede ser vaciada y el líquido residual vertido a una toalla de papel limpia. A cada pozo, 200 µ L de solución bloqueadora ( 3% de albúmina de suero bovino y 0.05% de Entre-20 en una solución salina de fosfato como suavizante, pH 7.0) se puede añadir. La solución bloqueadora se puede dejar en cada pozo durante 1 minuto. La placa de título puede ser vaciado por inversión. El Llenado con solución bloqueadora y el vacío se puede realizar tres veces. Las placas de título terminadas se pueden secar a temperatura ambiente y almacenarse a 4- C hasta por cuatro meses. 4. Recolección de muestras todas las muestras pueden tomarse de sujetos femeninos por médicos o asistentes médicos durante las visitas al ginecólogo. Los hisopos de algodón se pueden emplear para recolectar células endo cervicales. Las células para la muestra de PAP ThinPrep Pap Smear (Cytyc Corporation, Stanford, CT) se pueden dispersar en una solución de ThinPrep preservative. Las células de VPH ADN Hybrid Capture Assay (Digene Corporation, Silver Spring, MD) pueden ser suspendidas en el mismo medio. Tanto el ThinPrep Pap Smear o muestra de PAP como el HPV DNA Hybrid Capture Assay ( por sus siglas en Inglés) se estudiarán a continuación. La sangre venosa se puede obtener por métodos prescritos de flebotomía con una aguja de doble punta de calibre 21 o 22 en un tubo de ensayo . un total de 7-9 mi de sangre se puede tomar de cada paciente. Después de permitir la formación de coagulantes de 15-20 minutos a temperatura ambiente, la sangre puede 16 centrifugarse a 2,500 g durante 15 minutos. El suero puede ser separado por aspiración de la células coaguladas, mediante el uso de una pipeta desechable, dispensada dentro de tubos de Eppendorf a 0.25 mi aliquots para almacenarse a -80QC. 5. Inmunoensavo para las muestras negativas, el suero se puede obtener de sujetos femeninos vírgenes de edades entre 14 y 15 años y de adultos sexualmente activos, mujeres monógamas, de más de 25 años con historias de carencia de anormalidades en las muestras de Pap y verificación de ADN de la ausencia de VPH. Las pruebas positivas consistieron en suero obtenido de sujetos femeninos diagnosticados con cáncer cervical o enfermedad pre cancerígena. El suero de control se puede diluir a 1 :25 con un suavizante ( 0.15 de albúmina de suero bovino a 0.55 entre-20 en una solución salina fosfatada suavizada de pH 0.7). a cada pozo, 100 µ I de suero diluido puede ser agregado y la placa de ensayo puede ser incubada durante una hora a temperatura ambiente mediante agitación. Cada pozo después puede ser enjuagado tres veces cada uno con 200 µ? de suavizante de lavado. Cada enjuague tiene una duración de 5 minutos. La placa puede ser vaciada cada vez eliminando el líquido residual en una toalla limpia de papel.

A cada pozo se le puede añadir 100 µ L de peroxidasa de raíz fuerte ratón-conjugado- anti humano IgG diluido 1 :12,000 con lavado suavizante. La placa de ensayo puede incubarse durante una hora a temperatura ambiente. Empleando pipetas múltiples, cada pozo puede ser enjuagado con 200 µ L de lavado suavizante cuatro veces. Cada enjuague puede realizarse durante cinco minutos. Antes de cada enjuague, la placa debe ser vaciada y el líquido residual absorbido en una toalla de papel. Se le puede añadir a cada pozo 100 µ L 3,3', 5, 5? De tetrametilbenzidina, un sustrato de peroxidasa de raíz fuerte. Esta se puede incubar a temperatura 17 ambiente hasta que un obvio color verdiazul se desarrolle, comúnmente en un periodo de 10 a 15 minutos y la reacción se detiene al colocar 150 µ L 1.5 de ácido sulfúrico ( H2SO4) en cada pozo. 6. Pruebas Comparativas - ThinPrep prueba de Pap y HPV DNA Hvbrid Capture ( captura de ADN híbrido de VPHV ThinPrep Pap test- las muestras de Pap se pueden emplear para verificación citológica de la presencia o ausencia de anormalidades celulares indicativas de cáncer o de una condición pre cancerígena. Permitida por la US Food and Drug Administration FDA como reemplazo de la muestra convencional de Pap, el ThinPrep Pap Test supera las limitaciones del método convencional. Al mejorar la forma en que se prepara la laminilla, el ThinPrep Pap test puede mejorar la calidad de la prueba. En ensayos clínicos el test ThinPrep Pap mejoró la detección de lesiones menos severas o de menos grado en un 65% en poblaciones de estudio y en un 6% en poblaciones de alto riesgo. También redujo el número de menos especímenes menos adecuados en más de un 50%. En lugar de esparcir la muestra cervical en una laminilla como se hace con la muestra convencional de Pap, el hisopo cervical puede ser enjuagado en una solución preservativa. El espécimen puede ser enviado a un laboratorio clínico certificado, en donde un instrumento, el ThinPrep 2000 Processor se puede emplear para dispersar y filtrar los contenidos para reducir sangre, mucosa e inflamación. Una capa delgada de células cervicales se puede depositar mecánicamente en una laminilla, dando como resultado una preparación uniforme de células bien preservadas y listas para un examinación bajo el microscopio. Las laminillas pueden ser examinadas bajo el microscopio e interpretadas por citólogos ginecólogos certificados.

La prueba Hybrid Capture II HPV DNA- la prueba de captura híbrida de ADN de VPH II ( Digene Corporation, Silver springs, MD) se puede emplear como comparativo de pruebas de ELISA que emplean péptidos del invento. La FDA 18 aprueba el uso de pruebas de ADN de VPH oncogénico, como un seguimiento reflexivo re resultados anormales de pruebas de Pap o de (ASCUS) Células escamosas de importancia indeterminada. Ciertamente, la prueba Hybrid capture II HPV DNA discierne el virus del ADN y no la enfermedad cervical, pero todos los estados pre-cancerígenos o cancerígenos incluyen la presencia de ADN de VPH. La captura híbrida implica la hibridización molecular que emplea pruebas no radioactivas con amplificación de la detección de aquellas que son híbridas por luminiscencia química. El material para el análisis puede ser desnaturalizado y reacciona con pruebas génicas específicas formando ARN /ADN que es capturado por anticuerpos que cubren las paredes del tubo. Para dar seguimiento a los híbridos inmovilizados, estos se pueden hacer reaccionar con anticuerpos específicos contra ARN/ADN conjugados con fosfatasa alcalina. Formando un estrato estable, los híbridos del ácido nucleico pueden ser detectados por luminiscencia química vía espectrometría. La prueba se puede realizar de acuerdo con el protocolo del fabricante empleando una placa y pruebas para "alto riesgo de cáncer" o tipo VPH "oncogénicas" . Las determinaciones de VPH pueden ser cuantitativas con muestras que producen lecturas de 1 o más veces controles positivos (1pg/ mL ADN VPH ó 5000 copias genómicas de VPH por pruebas) considerados como con contenido de virus de ADN. 7.- Visualización /interpretación de Pruebas de ELISA completadas.

La presencia de complejos de péptldos-anticuerpos se puede señalar al visualizar los cambios químicos que ocurren con la formación del complejo anticuerpo-péptidos. Los cambios físico-químicos pueden ocurrir en conexión con reacciones de oxidación u de otras reacciones químicas. Las reacciones físico-químicas se pueden detectar empleando un espectrómetro o similar. La parte inferior de la placa de título puede limpiarse con 70% de etanol y la placa de título cargada dentro del espectrómetro. La absorbencia se puede leer a 450 19 nm, con 100 MI de solución de TBM además de 100 ml_ de 2N HCI empleado como control en blanco. 8. Resultados Los resultados comparando la citología de la muestra de Pap, los ensayos de HVP DNA de Digene y los inmuno-ensayos de acuerdo con el invento se muestran en las figuras 1 y 2. en referencia ahora a las figuras 1 y 2, 16 sujetos femeninos fueron examinadas. Las muestras de las mujeres en la categoría de prueba de pre- probabilidad en virtud de su historial sexual y/o historia de pruebas de Pap fueron negativas en todas las muestras de todos las pruebas realizadas, evidenciadas por los valores de absorbencia que tuvieron como promedio 0.19 comparado con 0.42 de los sujetos con varios estados de la enfermedad con la única excepción discutida a continuación, esto indicó un bajo índice de falsos positivos y un alto valor de predicción negativa. Las muestras de los sujetos con una baja probabilidad previa a la prueba en virtud de su historial sexual y/o historial de pruebas de Pap tuvo en su mayoría bajos niveles de absorbencia como se mencionó anteriormente. Sin embargo, la sujeto 6 fue excepcional en términos de los valores más altos de VPH E2 en complejos de anticuerpos- antígeno, con un promedio de 0.42 con 0.44 para la Sec. De Id. Ne 1 ,0.32 para la Sec. De I.D. Ne 2 y 0.49 para la Sec. De Id. De nQ 3. la sujeto 6 arrojó valores de absorbencia que tenían un promedio de 0.21. esta información no es indicador de infección o displasia. Sin detección de ADN de VPH en la sujeto 6, es muy probable que el alto nivel de absorbencia de VPH E2 fuera vestigio de una infección previa pero ahora curada de VPH. Las muestras de mujeres con un alto índice de probabilidad previa a la prueba por virtud de historial patológico/ clínico comprobable, mostraron inmuno ensayos realizados de acuerdo con el invento como positivos e indicando valores de absorbencia más altos. Los valores promedios de absorbencia fueron de 0.42 para el suero de los sujetos enfermos 8-16 y de 0.47 con consideración de péptidos derivados de las oncoproteínas de E6 y E7. Además, estos valores son 20 significativamente más altos en promedio que los valores de absorción de sujetos saludables o no enfermos ( p <0.001). Estos resultados señalan un valor predictivo de alta positividad. Ya que algunos casos uno o más ensayos mostraron valores de absorción menores, el mérito de emplear combinaciones de péptidos se demuestra. Los indicadores de bajos falsos positivos y de altos positivos reales indican la alta sensibilidad de la prueba y la alta especifidad para enfermedades pre cancerígenas y cáncer.

De central importancia son las sujetos 15 y 16 que tuvieron patología probada de adenocarcinoma cervical, que las sujetos 13 y 14 tenían patología probada de carcinoma cervical probado de célula escamosa y que el suero de estas sujetos se caracterizaba por sus alto valores de absorción. Es de igual importancia que el escrutinio de la muestra de Pap de la sujeto 15 no arrojó resultados de anormalidades en vista de la importante enfermedad cervical. La citología de la muestra de Pap puede no detectar adenocarcinomas y aumenta la utilidad de los péptidos presentes en este invento. También es notable que el suero de la sujeto 7 mostró menor absorción de virtualmente todos los péptidos del presente invento comparado con los resultados de las sujetos 8-16. aunque la sujeto 6 llegó con diagnóstico patológico probado de anormalidades celulares, los inmuno ensayos empleando péptidos del invento estaban más de acuerdo con resultados negativos de ADN. Esta información fue considerada como indicadora de que las células anormales no tenían nada que ver con el virus oncogénico y la poca probabilidad en consecuencia de una futura progresión de la enfermedad a una displasia o cáncer más serios. Estos resultados señalan que la utilidad del presente invento es aún mayor. A partir de la anterior discusión, será apreciado que el presente invento proporciona secuencias de proteína reactiva de anticuerpo o péptidos novedosos aislados del VPH 16 y 18 E2, E6 y E7 de las regiones de codificación temprana. En el diseño preferido, las secuencias de las proteínas o péptidos proporcionaron Un marcador para una prueba especifica, más simple, más rápida, menos costosa, más sensible para detectar o diagnosticar, no sólo las infecciones por 21 VPH, si que casi si no es que todas las anormalidades celulares asociadas por VPH, células pre cancerígenas, cáncer y neoplasmas. A diferencia del arte previo, el presente invento proporciona metodologías para detectar o diagnosticar cáncer y anormalidades celulares mediante la obtención de muestras de tejido, reaccionando la muestra con una novedosa secuencia de péptidos aislados del VPH 16 y 18 E2, E6 y E7 de las regiones de codificación temprana, para formar un complejo de anticuerpos- péptidos; Y detectar el complejo anticuerpos-péptidos. El presente invento puede incluirse en otras formas específicas sin alejarse del espíritu de sus características esenciales. Las inclusiones especificadas se consideran en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas. El ámbito del invento en consecuencia, se indica en las reivindicaciones acompañantes en lugar de al descripción previa. Todos los cambios que vienen dentro del significado y el ámbito de equivalencia de las reivindicaciones se debe considerar dentro del ámbito del presente. 22

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una secuencia aislada de proteínas o péptidos de E2, E6 ó E7 en la región de codificación temprana del Virus del Papiloma Human (VPH) que es soluble e un medio acuoso y caracterizada por la relativa escasez de triptopán, metionina y residuos de cisteína y la relativa abundancia de residuos de glicina y esparraguina. 2. La secuencia aislada de proteína o péptido como se define en la reivindicación 1 en donde el VPH es seleccionado de un grupo que consiste de 16,18,31 ,33,35,45,51 ,51 ,56 y 58. 3. Una secuencia de proteína o péptidos aislada como se define en la reivindicación 1 que comprende uno o más residuos adicionales de glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 4. Una secuencia aislada de proteína o péptido de VPH para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares, dicha secuencia de proteína aislada o péptido seleccionada de un grupo que consiste en: Una región de codificación de E2 de VPH 18 como se establece en la Sec. De Id. Na 1. Una región de codificación de E2 de VPH 16 como se establece en la Sec. De Id. Ne 2. Una región de codificación de E2 de VPH 16 como se establece en la Sec. De Id. Ne 3. Una región de codificación de E6 de VPH 16 como se establece en la Sec. De Id. Ne 4. Una región de codificación de E6 de VPH 18 como se establece en la Sec. De Id. NQ 5. Una región de codificación de E7 de VPH 16 como se establece en la Sec. De Id. N- 6. 23 Una región de codificación de E7 de VPH 16 como se establece en la Sec. De Id. N9 7. y Una región de codificación de E7 de VPH 18'como se establece en la Sec. De Id. Ng 8. 5. Una secuencia de proteína o péptidos aislada como se define en la reivindicación 4 que incluye uno o más residuos de glicina añadidos a I residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 6. La secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 4, que incluye una o más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 7. La secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 4 que incluye una combinación de residuos de glicina y esparraguina, añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 8. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 4 en donde el VPH es seleccionado de un grupo que consiste de 31 ,33,35,45,51 ,52,56 y 58. 9. La secuencia de proteína aislada o péptidos que incluye un región de codificación temprana de E2 del VPH 18 establecidos en la SEC. DE ID. N- 1. 10. Una secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 9 que incluye uno o más residuos adicionales de glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 11. La secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 9 que incluye uno o más residuos de esparraguina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteína o péptidos. 24 12. La secuencia aislada de proteína o péptidos como se define en la reivindicación 9 que incluye una combinación de glicina y residuos de esparraguina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 13. Una secuencia aislada de proteínas o péptidos que incluye una región de codificación temprana de E2 del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. Ne 2. 14. Una secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 13 que incluye residuos adicionales de glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptidos. 15. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 13 que incluye uno o más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal de residuo de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptidos. 16. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 13, que incluye una combinación de residuos de glicina y esparraguina añadidos a la secuencia aislada de proteínas o péptidos. 17. Una secuencia de proteína aislada o péptidos que incluye una región de codificación temprana de E2 del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. Ns 3. 18. Una secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 17 que incluye uno ó más residuos adicionales de glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptidos. 19. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 17 que incluye una o más residuos de esparraguina añadidos al residuo de la terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada. 20. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 17 que incluye una combinación de glicina y residuos de 25 esparraguina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada. 21. La secuencia de proteína aislada o peptidos incluye una región de codificación temprana de E6 del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. N9 4. 22. Una secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 21 que incluye residuos adicionales de glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 23. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 21 que incluye uno o más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptidos. 24. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 21 , que incluye una combinación de residuos de esparraguina y glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteína o péptidos. 25. Una secuencia de proteína aislada o péptidos que incluye una región de codificación temprana de E6 del VPH 18 como se establece en SEC DE ID Ne 5. 26. Una secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 25 que incluye uno o más residuos adicionales de glicina añadidos al residuo terminal de carboxilo de la secuencia aislada de proteína o péptidos. 27. La secuencia aislada de proteínas o péptidos definida en la reivindicación 25 que incluye uno más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 28. La secuencia de proteína aislada o péptido definida en la reivindicación 25 que incluye una combinación de glicina y residuos de esparraguina 26 añadidos a la terminal de residuo de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 29. Una secuencia aislada de proteína o péptidos que incluye E7 de la región de codificación temprana de VPH como se establece en la SEC. DE ID. N9 6. 30. Una secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 29 que incluye uno o más residuos adicionales de glicina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 31. La secuencia aislada de proteína o péptido como se define en la reivindicación 29 que incluye uno o más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteína o péptidos. 32. La secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 29 que incluye una combinación de glicina y residuos de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 33. Una secuencia aislada de proteína o péptidos que incluye E7 en la región de codificación temprana del VPH 16 como se establece en SEC DE ID. Ne 7. 34. Una secuencia aislada de proteínas o péptidos como se define en la reivindicación 33 que incluye uno o más residuos adicionales de glicina añadidos ala terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada. 35. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 33 que incluye uno o más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteína o péptidos. 36. La secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 33 que incluye una combinación de residuos de glicina y 27 esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 37. Una secuencia de proteína aislada o péptidos que incluye E7 en la región de codificación temprana de VPH 18 establecida en la SEC. DE ID. N- 8. 38. Una secuencia de proteína aislada o péptido como se define en la reivindicación 37 que incluye uno más residuos adicionales de glicina añadidos ala terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteínas o péptidos. 39. La secuencia aislada de proteínas o péptidos como se define en la reivindicación 37 que incluye uno o más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 40. La secuencia de proteína aislada o péptidos como se define en la reivindicación 37 que incluye una combinación de residuos adicionales de glicina y esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia aislada de proteínas o péptidos. 41. Un método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares dicho método incluye los pasos de: Reaccionar una muestra de fluido o tejido corporal que con probabilidad contenga anticuerpos con una o más secuencias de proteínas aisladas de E2, E6 y E7 en las regiones de codificación temprana del Virus del Papiloma humano (VPH) seleccionadas de un grupo que consiste de una E2 de la región temprana de codificación de VPH 18 como se establece en la SEC DE ID. Na1 , y una región de codificación temprana de E2 del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. Na 2; una región de codificación temprana de E2 del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. Ne 3; Una región de codificación temprana de E6 del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. N- 4; Una región de codificación temprana de E6 de la región de VPH 18 como se establece en la SEC. DE ID. Na 5; una región de codificación temprana de E7 de la región del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. Na 6; Una 28 región de codificación temprana de E7 de la región del VPH 16 como se establece en la SEC. DE ID. NQ 7; una región de codificación temprana de E7 de la región VPH 18 como se establece en la SEC. DE ID. N9 8. Formando un complejo de anticuerpos- péptidos que comprende por lo menos una de dichas secuencias de proteínas aisladas o péptidos y dicha muestra de anticuerpos; y detectar dicho complejo de anticuerpo- péptidos 42. -El método para detectar p diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde el VPH es seleccionado de un grupo que consiste de 31 ,33,35,45,51 ,56 y 58. 43. - El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicha secuencia de proteína aislada o péptido incluye por lo menos uno o más residuos adicionales de glicina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptido. 44. Todo para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicha secuencia de proteínas aisladas o péptidos incluye uno más residuos adicionales de esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de dicha secuencia de proteína aislada o péptidos. 45. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares definido en la reivindicación 41 en donde la secuencia aislada de proteínas o péptidos incluye una combinación adicional de residuos de glicina y esparraguina añadidos a la terminal residual de carboxilo de la secuencia de proteína aislada. 46. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde los residuos de cisteína de dicha secuencia aislada de proteína o péptidos es sustituido con residuos de carboximetilcisteína. 29 El método para detectar o diagnosticar anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico es dirigido para la detección o diagnóstico de epitope de VPH. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho epitope de VPH es una región antígena contraria en donde la reactividad del anticuerpo ocurrirá. El método para detectar o diagnosticar cáncer y anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico es dirigido para la detección o diagnóstico de anormalidades celulares asociadas con el VPH. El método para detectar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico se dirige a la detección o diagnóstico de condiciones pre malignas o precancerosas asociadas con el VPH. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico es dirigido para la detección o diagnóstico de cáncer asociado con el VPH. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico se dirige para la detección o diagnóstico de displasia cervical. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico sirve para detectar o diagnosticar carcinoma cervical. El método para detectar o diagnosticar cáncer celular o anormalidades como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico está dirigido a la detección o diagnóstico de 30 anormalidades celulares cervicales seleccionada de un grupo que consiste de coilocitosis, hiperkeratosis, condiciones pre cancerígena que incluyen lesiones epiteliales, displasias de alto nivel, cáncer invasivo y cáncer maligno. El método para detectar o diagnosticar cáncer celular o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicho método de diagnóstico es dirigido a la detección o diagnóstico de adenocarcinoma del cerviz uterino. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicha secuencia de proteínas aisladas o péptidos de dicha codificación temprana de E2 comprende ala detección o diagnóstico de una oncoproteína epítope de VPH. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicha secuencia de proteínas aisladas o péptidos de dicha codificación temprana de E2 comprende ala detección o diagnóstico transformación de células pre malignas, una condición pre cancerígena o cáncer. El método para detectar o diagnosticar cáncer celular o anormalidades como se define en la reivindicación 41 en donde dicha secuencia de proteínas o péptidos aislada de dicha región de codificación temprana de E6 del VPH, incluye la detección o diagnóstico de transformación de células pre malignas una condición pre cancerígena o cáncer. El método para detectar o diagnosticar cáncer celular o anormalidades como se define en la reivindicación 41 en donde dicha secuencia de proteínas aisladas o péptidos de dicho VPH E7 de la región de codificación temprana comprende la detección o diagnóstico de la transformación de células pre malignas, una condición pre cancerígena o cáncer. 31 El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde dicha detección cuenta con un paso adicional que es la inspección visual del cambio de color de dicho complejo anticuerpo- péptido. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 41 en donde el paso de detección incluye otro paso que incluye la inspección de dicho complejo anticuerpo.-péptido para visualizar cambios físico-químicos. El método para detectar o diagnosticar cáncer o anormalidades celulares como se define en la reivindicación 61 en donde dicha inspección incluye un paso adicional de inspección de dicho complejo anticuerpo-péptido usando un espectrómetro. 32 LISTA DE SECUENCIA <110> Impact Diagnostics <120> péptidos de E2, E6 y E7 proteínas del virus del papiloma humano 16 y 18 para detectar o diagnosticar cáncer cervical y otros cánceres asociados al Virus del papiloma humano. <130> 3352-2-2-1 <150> US 60/394, 172 <151> 2002-07-02 <150> US ( todavía sin asignar) <151> 2003-07-01 <160> 8 <170> patente en versión 3.1 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de la región E2 del VPH 18 <400> 1 Lys Gln Leu Gln His Thr Pro Ser Pro Tyr Ser Ser 33 Val Ser Gly Thr Ala Lys Thr Tyr 15 20 <210> 2 <211 > 17 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> >223> derivada de E2 de la región de codificación temprana de VPH 16 <400> 2 Lys His Gly Tyr Thr Val Gln Phe Asp Gly lie Cys 1 5 10 Asn Thr Met His Tyr 15 <210> 3 <21 1 > 23 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de E2 en su región de codificación temprana de VPH 16 <400> 3 His Ala Gly Gly Gln Val lie Leu Cys Pro Thr Ser 34 5 10 Val Phe Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu 15 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de la región de codificación temprana de E6 del VPH 6 <400> 4 Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys 1 5 10 Leu Lys Phe Tyr Ser Lys lie Ser Glu Tyr 15 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de la región de codificación temprana de E6 del VPH 18 <400> 5 Lys Cys lie Asp Phe Gly Ser Arg Glu Leu Arg His 5 10 Ser Asp Val Tyr Gly Asp 35 15 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de la región de codificación temprana de E7 de la región del VPH 16 <400< 6 Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu 1 5 10 He Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu 15 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de la región de codificación temprana de E7 de la región del VPH 16 <400> 7 Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn 1 5 10 Asp Ser Ser Ser Glu Asp Glu He Asp 36 15 20 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> derivada de la región de codificación temprana de E7 del VPH 18 <400> 8 His Leu Gln Pro Gln Asn Glu lie Pro Val Asp 1 5 10 Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu 15 20 37 BREVE RESUMEN Y OBJETOS DEL INVENTO De acuerdo con el invento como se cubre y se describe ampliamente en el presente, una de las inclusiones preferidas del presente invento incluye péptidos novedosos, cuyas secuencias fueron aisladas a partir del análisis cuidadoso de las regiones de codificación tempranas de E2 y E7 oncoproteínas del VPH 16 y 18. los péptidos se prestan a un inmuno ensayo altamente sensible y específico de diagnóstico. Los anticuerpos de las oncoproteínas E2, E6 y E7 se pueden encontrar en aquellos individuos infectados con neoplasmas asociados al VPH. Los péptidos del presente invento, varían en tamaño, previo a cualquier modificación, de aproximadamente 17 residuos de amino ácidos a aproximadamente 23 residuos de amino ácidos que pueden- ser sintetizados inmediatamente por procedimientos químicos y se pueden obtener en niveles de pureza que exceden el 95%. Aunque los péptidos se pueden obtener por otros medios, en su forma pura existe una muy escasa probabilidad de una reactividad cruzada no deseada con anticuerpos al azar. Es por eso, que los péptidos puros del presente invento se pueden usar para el diagnóstico de inmuno ensayos de alta especificación. Una de las inclusiones preferidas de método de diagnóstico de inmuno ensayo del presente invento incluye los pasos de (1) tomar una muestra de fluido corporal o tejido que contenga probablemente los anticuerpos; (2) si los anticuerpos se encuentra presentes, reaccionar la muestra con uno o más de los péptidos del presente invento; y (3) ensayar la muestra reactiva para detectar la presencia de una reacción de anticuerpos- péptidos. Los inmuno ensayos que emplean los péptidos aislados, purificados o derivados de E6 y E7 oncoproteínas de VPH 16 y 18 pueden servir como indicadores confiables de la transformación de malignidad o pre-malignidad de células que ya ha tenido lugar. De la misma forma, los inmuno ensayos que emplean ciertos péptidos aislados, purificados o derivados de la región E2 del 38 VPH 16 y 18 , también pueden ser indicadores confiables déla infección asociada del VPH, malignidad o transformación de células pre-malignas. Uno de los aspectos de desarrollo más importantes del presente invento se encuentra en el diagnóstico de carcinoma cervical, tanto de células escamosas así como de adenocarcinoma, así como cualquier anormalidad celular epitelial asociada con infección oncogénica del VPH incluyendo pero sin estar limitada a coilocitosis; hiperkeratosis, condiciones pre cancerígenas que incluyen neoplasias intra epiteliales o lesiones intra epiteliales; displasias de alto grado; y cáncer maligno o invasivo. Además de la utilidad para el diagnóstico de cánceres cervicales, encontrar anticuerpos de péptidos aislados, purificados o derivados del VPH E2, E6 y E7 oncoproteínas del VPH 16 y 18, puede ser invaluable para detectar cáncer del cuello y de la cabeza, pequeñas células cancerígenas del pulmón, carcinomas del pene y del ano, melanoma y otros estados pre cancerígeno provocados por o de otra forma asociados con el VPH. 39