WO2021195734A1 - Peptídeos sintéticos miméticos a proteína l1 do hpv, método de diagnóstico de hpv, sistema de diagnóstico de hpv, composição farmacêutica e uso dos mesmos no tratamento ou profilaxia do hpv - Google Patents

Peptídeos sintéticos miméticos a proteína l1 do hpv, método de diagnóstico de hpv, sistema de diagnóstico de hpv, composição farmacêutica e uso dos mesmos no tratamento ou profilaxia do hpv Download PDF

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WO2021195734A1
WO2021195734A1 PCT/BR2021/050139 BR2021050139W WO2021195734A1 WO 2021195734 A1 WO2021195734 A1 WO 2021195734A1 BR 2021050139 W BR2021050139 W BR 2021050139W WO 2021195734 A1 WO2021195734 A1 WO 2021195734A1
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hpv
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peptide
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PCT/BR2021/050139
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Luiz Ricardo Goulart Filho
Bruna França Matias COLOMBO
Emília Rezende VAZ
Robinson Sabino SILVA
João Pedro Tannús GOULART
Mayara Ingrid De Sousa LIMA
Fernanda Van Petten de Vasconcelos AZEVEDO
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Imunoscan Engenharia Molecular Ltda
Universidade Federal De Uberlândia – Ufu
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    • G01N33/571—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses for venereal disease, e.g. syphilis, gonorrhoea

Definitions

  • the present invention relates to the selection and characterization of synthetic peptides, designed and synthesized from the analysis of mimetope phage clones of the immunological epitope of the human papillomavirus (HPV) LI protein. More particularly, the synthesized peptides were immunoreactive and able to detect IgA antibodies in body fluid samples from patients with HPV. Furthermore, the synthesized peptides were able to provoke an immune response in vivo. Particularly the present invention concerns the selection, characterization and use of these new synthesized peptides.
  • the present invention further describes a method for diagnosing HPV, a system for diagnosing HPV by electrochemical detection and a pharmaceutical composition comprising at least one of these new synthesized peptides and the use of these peptides to prepare immunogenic drugs or compositions for treatment. and/or HPV prophylaxis.
  • HPV infection Human papillomavirus (HPV) infection is the
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) It is the most common sexually transmitted viral disease and represents a major public health problem worldwide, due to its high incidence and strong association with malignancies. More than 100 types of HPV have been identified and approximately half of them have high tropism for epithelial cells and mucous membranes, where they can cause benign lesions, cancer or persist asymptomatically. [003] Globally, the main method of detection of HPV is still the Papanicolaou test, because many countries with few resources do not have the technical infrastructure and public health programs to offer supportive testing.
  • Pap smear reduces the incidence of cervical cancer (also known as cervical cancer) and the mortality rate, its detection is limited to the ability of the observer to recognize and classify a variety of cellular abnormalities, when evaluated in isolation, can commonly result in indeterminate or false-negative results.
  • Pap smears, biopsy-guided or not can be invasive and uncomfortable.
  • molecular methods for detecting HPV play an important role in the scenario of early diagnosis of HPV and prevention of cervical cancer and offer promising alternatives as screening tools to improve the sensitivity of conventional cytology [(MOLIJN A., et al. .
  • XICOTÉNCATL L. et al., Molecular diagnosis of human papillomavirus in the development of cervical cancer. Salud Publica Mex. 2009. p. s479-s488); (ARNEY A., BENNETT K.M. Molecular Diagnostics of Human Papillomavirus. Lab. Med. 2010. p. 523-530); (ZARAVINOS A., et al., Molecular detection methods of human papillomavirus (HPV). Int J Biol Markers. 2009;24(4):215-222)].
  • results classified as atypical squamous cells of undetermined significance were 100% positive in detecting HPV-DNA.
  • saliva has been frequently used as a biological fluid in disease diagnosis due to its easy and non-invasive collection.
  • salivary samples have used salivary samples to detect antibodies in various disease diagnoses [(CUEVAS-C ⁇ RDOBA, B., SANTIAGO-GARC ⁇ A, J., Saliva: a fluid of study for OMICS. OMICS. 2014; 18 (2):87- 97); (MALAMUD, D., Saliva as a Diagnostic Fluid. Dent. Clin. North Am. 2011. p. 159-178)].
  • saliva offers characteristic advantages over serum and other body fluids and can provide a cost-effective approach for large population testing.
  • the HPV genome is approximately 8,000 bp, divided into three regions, a long non-coding control region (LCR) that contains the origin of viral DNA replication and the enhancer/promoter elements that regulate viral transcription; the other two coding regions include early (E) and late (L) proteins.
  • LCR long non-coding control region
  • the early region is involved in viral replication and oncogenesis, and encodes six open reading frames (ORFs) E1, E2, E4, E5, E6 and E7.
  • ORFs open reading frames
  • the late region encodes the structural proteins L1 and L2 for the viral capsid. In recent decades, these proteins have been used as a target for vaccine production for use in the treatment or prophylactic of HPV.
  • patent application WO2018085751 describes peptides comprising the amino acid sequences of the E6 and E7 proteins of HPV.
  • the HPV L1 protein has also been a very attractive target for vaccine production due to its self-assembly capacity, which allows the formation of virus-like particles (VLPs) containing highly immunogenic epitopes.
  • patent application BR 112017004181-2 describes a vaccine comprising amino acids of the HPV L1 protein.
  • the DNA sequence of the L1 protein is nearly 80-90% identical to different viral types, making it a powerful candidate for approaches. diagnostics [(BUCK CB, et al. The papillomavirus major capsid protein LI. Virology.
  • Phage Display This technique is based on the insertion of a gene or gene fragment into bacteriophages, resulting in the expression of random peptides with specificity to the target of interest [(Barbas CF. 1993. Recent advances in phage display. Curr Opin
  • Phage display has been used to identify sequences with application in the diagnosis of diseases ([(Hairul Bahara NH, et al. 2013. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 2013 Jul;41 (4):209- 16); (Rakonjac J., et al. Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Curr Issues Mol Biol 13:51-76)], as well as in vaccine development (Gao J., et al. Phage display and its application in vaccine design. Ann Microbiol 2010, 60:13-19).
  • the present patent application aimed to identify and synthesize new mimetic peptides for the HPV LI protein, which had improved ability to be used in a method of diagnosis of HPV, as well as in the production of pharmaceutical compositions for treatment or prevention of HPV.
  • the present patent application describes six (6) new synthetic peptides that were designed and synthesized after in vitro analysis of phage clones obtained by Phage Display and that showed to be potent mimetopes of the immunological epitope of the human papillomavirus LI protein
  • the six (6) peptides were produced chemically with an amidation at the C-terminal region and conjugated to Bovine Serum Albumin (BSA) to the N-terminal cysteine, including a spacer (GGGS).
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • GGGS a spacer
  • PEP1, PEP3 and PEP4 part of the bacteriophage pIII protein sequence (AETVESCL) was added.
  • compositions for use in the treatment and/or prophylaxis of HPV which comprise at least one of the new synthesized peptides described herein, plus at least one pharmaceutically acceptable vehicle, carrier and/or compound.
  • Another modality described herein is the use of new synthetic peptides or pharmaceutical compositions herein described, for the preparation of a drug or immunogenic composition for use in the treatment and/or prophylaxis of HPV.
  • Other modalities described here are: a method of treatment and/or prophylactic of HPV, as well as a Kit to be used in a method of diagnosis, treatment and/or prophylactic of HPV.
  • FIGURE 1A shows the amino acid sequences of all mimotopes selected by Phage Display and their frequencies.
  • FIGURE 1B shows the reactivity of ELISA assays for mimotopes with cervical and salivary samples from patients with HPV (pool) and healthy controls (pool).
  • FIGURE 2A shows the multiple alignments of the deduced sequence of C.B1 phage with the sequences of several HPV types of the L1 protein (HPV06, 11, 16, 18, 33, 45 and 31).
  • FIGURE 2B shows the L1 protein regions of the
  • HPV with probable antigenicity and pairing with a region of the L1 protein of HPV16.
  • FIGURE 2C shows the three-dimensional crystallographic structure of the HPV L1 protein (PDB: 2R5H).
  • FIGURE 2D-E show a three-dimensional model of the predicted structure for the LI protein and location of the likely epitope.
  • FIGURE 2F shows the immunogenicity prediction scale in the 3D structure for the LI protein.
  • FIGURE 3A shows the detection of specific IgA antibody in cervical samples from patients infected with HPV and from uninfected control subjects.
  • FIGURE 3B shows the detection of specific IgA antibody in salivary samples from patients infected with HPV and from uninfected control subjects.
  • FIGURE 3C shows the ROC curve of cervical specimens (C).
  • FIGURE 3D shows the ROC curve of salivary samples (D).
  • FIGURES 4A-D show the detection of
  • Immunoglobulin A by mimotope C.B1 according to genotypic risk classification by Nested-Multiplex PCR (nmPCR) and cytology (Pap).
  • FIGURE 5A shows the titration of phage C.B1 for detection of IgA, IgG and IgM.
  • FIGURE 5B shows the titration of the phage
  • FIGURE 6A shows the alignment of PEP1 in the three-dimensional structure of the main capsid protein (LI) of HPV-16 (PDB: 2R5H).
  • FIGURE 6B shows the alignment of PEP3 in the three-dimensional structure of the main capsid protein
  • FIGURE 6C shows the alignment of PEP4 in the three-dimensional structure of the major capsid protein
  • FIGURE 7A shows the recognition of IgA by peptides synthesized on nitrocellulose membrane (Slot-blot) from a pool of cervical and salivary samples.
  • FIGURE 7B shows an electrochemical curve of cyclic voltammetry in a modified graphite electrode.
  • FIGURE 7C shows the charge density (load/C) of the negative (control) and positive salivary pools for
  • FIGURE 8 shows a schematic representation of the shape of the bioelectrode used in electrochemical detection.
  • FIGURES 9A-B show elysis assays of the peptides PEP 1 and PEP2, respectively, in saliva sample from an HPV positive or negative patient.
  • FIGURES 9C-D show the ROC curves (Receiver
  • FIGURE 10A shows the cell viability of murine macrophage strain (J774A-1) under peptide 1 stimulation.
  • FIGURE 10B shows the cell viability of the murine macrophage lineage (J774A-1) under peptide 2 stimulation.
  • FIGURE 10C shows the cell viability of the murine macrophage lineage (J774A-1) under peptide 3 stimulation.
  • FIGURE 10D shows the cell viability of the murine macrophage lineage (J774A-1) under peptide 4 stimulation.
  • FIGURES 11A-D show the profiles of the production of IgG antibodies in murine serum samples, by ELISA, for evaluation of immunization with the synthesized peptides.
  • FIGURES 12A-D show the titers of IgA antibodies present in murine vaginal mucosa, by ELISA, for evaluation of immunization with the synthesized peptides.
  • FIGURES 12E-F show the general levels of IgA expression represented by linear graphs, according to the mean and standard deviation of antibody production between the first and last immunization for the respective synthesized peptides.
  • FIGURES 13 show the cellular immune response profiles of murine splenocytes obtained from animals immunized with vascins comprising the peptides synthesized .
  • the present patent application describes six (6) new synthetic peptides designed and synthesized after in vitro analysis of phage clones obtained by Phage Display and which showed to be potent mimetopes of the immunological epitope of the L1 protein of the human papillomavirus (HPV).
  • Ph.D.-C7C Phage Display (PD) peptide library kit New England Biolabs, Ipswich, USA
  • the Ph.D.-C7C library was subjected to negative and positive selections against purified IgAs from a pool of individuals in Groups 1 (healthy individuals), 2 (patients with other genital diseases) and 3 (patients with a definitive diagnosis of HPV infection ).
  • a positive selection was performed using unbound phages that were incubated with IgA-bead from patients with a definitive diagnosis of HPV infection (Group 3) under the same conditions.
  • the subtractive selection process was repeated 3 times in the IgA pool of group 1 and twice in group 2, in order to increase the phage specificity for the target.
  • Two strategies for the elution of specific phages were adopted. One of them was added to an acidic pH solution (0.2 M Glycine, pH 2.2) and neutralized with Tris (1M, pH 9.1), followed by 3 cycles of identical selection.
  • Another strategy was defined by competitive elution, using the quadrivalent vaccine against HPV (Gardasil®), which contains virus-like particles (VLPs) from an antigenic region of the virus (LI protein HPV 06, 11, 16 and 18), followed by 2 cycles selection.
  • the eluted phages were amplified in E. coli (ER2738) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), purified using precipitation with polyethylene glycol 8000 and 20% 2.5 M NaCl (w/vol) after each biopanning cycle.
  • Individual bacterial colonies containing amplified phage clones were grown in a microtiter plate and titrated according to the method described by Barbas et al. (Barbas CF, et al. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Raven Press, 2001).
  • a total of 65 clones were randomly selected, 13 obtained by competitive selection strategy and 52 by acid elution, using a library of random peptides expressed in phage. From 65 selected phage clones, 32 possible mimetopes showed different sequences (12 by competitive elution and 20 by acid selection) (Figure IA). Selected phages showed different reactivity when tested against cervical and saliva samples by ELISA ( Figure 1B); two clones had a higher absorbance ratio between the positive and negative pool for HPV in cervical and salivary fluid. Phage C.B1 showed a ratio of 3.09 in the cervical pool and 3.45 in the salivary pool, while phage A.D5 showed a ratio of 1.93 and 2.44 in both samples, respectively.
  • DNA sequencing and bioinformatics analysis [059] After three rounds of selection and elution with acid and two rounds of competitive elution, single-stranded phage DNAs were isolated by the iodinated buffer extraction procedure (Azzazy HME, Highsmith WE Phage display technology: Clinical applications and recent innovations Clin. Biochem. 2002. p. 425-445). Electrophoresis was performed on a 0.8% gel stained with ethidium bromide solution, in order to verify the quality of the DNA.
  • the nucleotide sequence of the gene III insert was sequenced using the DyEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA), with primer -96 glll (5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG) -3') SEQ ID No. 08, according to the manufacturer's instructions, and detected on a MegaBace 1000 automatic capillary sequencer (Amersham Pharmacia Biotech, USA).
  • the amino acid sequence of the nucleotide sequence was predicted using ExPASy software available online (http://www.expasy.org).
  • Antibody epitope prediction of the L1HPV16 protein was performed using the Bepipred Linear Epitope Prediction antigenicity scale (Larsen J.E.P., et al. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immuno Res. 2006; 2:2).
  • the linear alignment with the C.B1 phage amino acid sequence was crossed with distinct HPV proteins in the studies performed (data not shown) and showed up to six (85.7%) conserved or semi-conserved amino acid residues a an immunogenic protein from different HPV types (types: 06, 11, 16, 18, 31, 33 and 45), the main L1 protein of the HPV capsid (Figure 2A). Preserved (*) and semi-preserved residues are marked in gray in Figure 2A. Five (71.4%) phage amino acid residues
  • HPV16 ( Figure 2B). Antigenicity predictions were made by Bepipred linear epitope prediction scale software. 0 cut-off (Threshold) of 0.35; mean (0.03); minimal antigenicity (-2.684); maximum antigenicity (1.557). Regions with probable antigenicity on a scale above 0.35 are considered antigenic. Window size and central position were respectively 7 and 4. *Structural location of C.B1 in LI capsid protein (residues 194 to 200) of HPV16 ( Figure 2A).
  • Three-dimensional mimetope sequence analyzes were predicted by adding a spacer sequence (GGGS) and amino acids (alanine and cysteine) responsible for the conformation of the peptide from the peptide library. This additional amino acid (ACxxxxxxxCGGGS) was used to make the exposure to the alignment more specific for target recognition.
  • the crystallographed structure of the HPV16 L1 protein (PDB: 2R5H) (Figure 2C) was used to represent the alignment with C.B1 ( Figures 2D-E).
  • Figures 2D and 2E show a 3D model of the predicted structure for the L1 protein and location of the likely epitope.
  • Peptide 1 was originated from phage clone C.B1: ACHHPTSNVCGGGSAETVESCL (SEQ ID NO:01).
  • Peptide 2 was generated from two repeats of the C.B1 clone sequence: ACHHPTSNVCGGGSACHHPTSNVC (SEQ ID NO:1)
  • the third peptide (PEP3) was constructed so chimeric, from the sequences of clones C.B1 and A.D5 (ACHHPTSNVCGGGSACEYEGRNICGGGSAETVESCL (SEQ ID NO 03); while the fourth synthesized peptide (PEP4) was originated from phage A.D5: ACEYEGRNICGGGSAETVESCL (SEQ ID NO 04) .
  • the new peptide designed and synthesized from the phage C.B1 was tested by ELISA assay using individual samples of cervical secretion and saliva. In total, 95.6% (44/46) of cervical samples positive for HPV and 96.3% (26/27) of saliva samples were positive for anti-IgA by PEP1.
  • the PEP1 peptide designed and synthesized from C.B1 phage was able to efficiently discriminate HPV patients and controls (p ⁇ 0.0001) and tested RP (p ⁇ 0.0001), in both fluids ( Figures 3A-B ) .
  • the peptide PEP1 showed 95.65% of sensitivity to detect HPV patients, 71.11% of specificity, 77.19% of PPV, 94.12% NPV, 3.31 PLR and 0.06 NLR.
  • the PEP1 peptide was able to detect HPV positive patients with a sensitivity of 96.3%, specificity of 71.79%, 70.27% of PPV, NPV of 96.55%, PLR of 3.41 and 0.05 NLR.
  • Table 1 Diagnostic performance of immunological evaluation by the peptide mimotope PEP1 in saliva and cervical fluid compared to the test with nested-multiplex PCR.
  • CI confidence interval
  • PPV positive predictive value
  • NPV negative predictive value
  • PVR positive likelihood ratio
  • RVN negative likelihood ratio
  • P probability.
  • the OD group included 7 patients with vaginosis infection (Gardnerella vaginallis), 3 candidiasis (Candida albicans) and 1 HIV positive, while in salivary samples it contained 3 vaginosis (Gardnerella vaginallis), 2 candidiasis (Candida albicans), 2 HIV, 2 cancer (one pancreas and another acute myeloid leukemia), 3 leprosy (Mycobacter ⁇ um leprae), 1 leishmaniasis (Leishmania sp.) and 1 toxoplasmosis (Toxoplasma gondii); all of them with current normal Pap smears ( Figure 4).
  • EXAMPLE 2 Evaluation of the specificity of new peptides designed and synthesized from C.B1 phage for detection of IgA and correlation between cervical and salivary fluids.
  • the cervical secretion pool was diluted at a ratio of 1:20, while the saliva pool was done at a concentration of 1:10, both in blocking buffer. Blots were incubated for 2 hours at room temperature with shaking. The strips were washed 5 times and incubated with anti-IgA antibody conjugated to HRP (1:10000 in blocking solution) for 1 h at room temperature under agitation, dried and the detection procedures were carried out.
  • EXAMPLE 4 Construction and analysis of the bioelectrode [073] To evaluate and validate the applicability of the mimetic peptides selected in this work, since peptides 1, 2, 3 and 4 were shown to be able to detect HPV-specific IgA in saliva and cervical positives, the engineered synthetic peptides were immobilized on electrode surfaces, such as graphite, gold, platinum, glassy carbon electrodes, of carbon paste, electrodes with polymeric material, modified electrodes (for example: modified graphite electrodes, which may be with nanomaterials, metallic nanoparticles, polymers, etc.) inside other electrodes modified or not known by a person skilled in the art. In this specific example, graphite electrodes were used to detect HPV in saliva samples (Figure 8).
  • electrode surfaces such as graphite, gold, platinum, glassy carbon electrodes, of carbon paste, electrodes with polymeric material, modified electrodes (for example: modified graphite electrodes, which may be with nanomaterials, metallic nanoparticles, polymers, etc.
  • auxiliary and reference electrodes can also be selected from the group consisting of: graphite electrode, gold, platinum, glassy carbon, carbon paste electrode, electrode with polymeric material and modified electrode.
  • modified platinum electrodes comprising a platinum plate and silver/silver chloride were used. All solutions were deoxygenated by ultra pure nitrogen bubbling for at least 45 minutes before use.
  • the graphite electrode was mechanically polished with alumina paste (0.3pm), sonicated, washed with deionized water, air dried and pre-conditioned in a solution of H2CIO40.5 mol.L-1 through cyclic voltammetry between 0 and + 1.2V, for 4 cycles, at a scan rate of 50 mV.s - 1.
  • the solution containing 1.5 pg.mL-l of PEP1 probes was deposited on the electrode surface and dried at 37°C for 30 minutes , this procedure being performed twice.
  • the electrodes were immersed in a 0.5% bovine serum albumin (BSA) solution as a blocking agent at 37°C for 1 h. HPV negative and positive samples were applied to the electrode at 37°C for 30 minutes. After each modification, the electrodes were washed with phosphate buffer (Na2HPC>4 0.061 mol.L-1, NafhPCh 0.039 mol.L-1, pH 7.4) for 5 seconds under agitation to remove unbound molecules and dried with ultra nitrogen pure.
  • BSA bovine serum albumin
  • peptides from phage C.B1 and A.D5 SEQ ID No 5 and SEQ ID No 6
  • the peptide synthesized from C.B1 phage was able to differentiate positive and negative samples with greater precision and also because it was obtained from a competition strategy of VLPs containing highly immunogenic regions of HPV.
  • This approach allowed us to discover peptides derived from the peptide library (C.B1 and A.D5) that cover immunogenic regions of the HPV L1 protein.
  • Capsid proteins play an important role in the host's immune response, especially Ll, which has conformational epitopes that lead to the generation of neutralizing IgA and IgG antibodies in infected individuals.
  • the LI major capsid protein of human papillomavirus type 11 recombinant virus-like particles interacts with heparin and cell-surface glycosaminoglycans on human keratinocytes. J Biol Chem. 1999;274(9):5810-5822)].
  • the conserved and semi-conserved residues corresponding to the C.B1 peptide represent a putative epitope of the L1 protein that is conserved in different types of HPV, which probably gave this peptide the ability to be recognized by IgA in the mucous fluids of infected individuals. This inference can be justified by the fact that semi-conserved amino acid residues exhibit physicochemical properties similar to the original residue, allowing antibody binding.
  • the peptides synthesized from phage clones C.B1 and A.D5 were able to detect high titer of IgA antibodies in HPV samples, significantly discriminating positive and negative fluids (p ⁇ 0.01; cervical and saliva samples) when compared to IgG and IgM antibody classes. This result indicates that the phage selection strategy for IgA purified samples was successful.
  • PEP1 detected significantly IgA antibodies in cervical and saliva samples from patients classified as low risk (p ⁇ 0.001 and p ⁇ 0.01, respectively), high risk (p ⁇ 0.0001; both) and multiple HPV infection (p ⁇ 0.0001;both); when compared to the negative control.
  • PEP1 peptide 1
  • PEP1 has a design more similar to the mimotope peptide synthesized PEP-C.B1 and the in vitro experiments shown here were used as an example; showing positive reactivity in the dot blot assay.
  • bioelectrode in saliva samples, as it is non-invasive and easy to obtain.
  • the mimetic peptides selected by PD in this work are able to detect IgA antibodies in saliva and cervical samples from HPV patients with high sensitivity and specificity, and can be readily produced through bacterial cultures, and used in various assays, such as ELISA, electrochemical sensors and many others.
  • the most relevant is the possibility of using saliva as a direct application in a simple bioelectrode test, which can be used to aid medical treatment in patients with HPV.
  • EXAMPLE 5 Assay for HPV diagnostic test evaluation. [081] In order to validate the new diagnostic test that enables the detection of HPV in a way less costly than genotyping and significantly more effective than the pap smear, we performed an elisa assay based on the synthesized peptides of CB.1 (PEP1) or AD.5 (PEP4) in saliva samples from HPV positive patients and negative controls.
  • PEP1 synthesized peptides of CB.1
  • AD.5 PEP4
  • Saliva and cervical samples used in this clinical trial were obtained in a paired fashion from patients during a medical consultation.
  • the specimen from the cervical sample was used to evaluate by means of the Papanicolaou test and by means of the HPV genotyping gold standard to confirm the diagnosis. Therefore, the classification of control and patient samples was based on gold standard diagnostic genotyping analyses.
  • the plate was incubated 1h at 37°C with the detection antibody, anti-IgA antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories-KPL, USA) diluted 1:5,000 in blocking buffer. At the end of the incubation, the wells were washed 5x and developed with SigmaFastTM OPD (Sigma-Aldrich; USA). Absorbance readings were performed in a microplate spectrophotometer at 492nm. [085] Peptides synthesized from the CB.1 phage
  • the HPV genotyping test indicated 65 patients with positive HPV. Of these 65 patients, the Pap smear test indicated 24 patients were positive while the saliva detection test based on C.B1 (PEP1) indicated 61 patients were positive according to genotyping.
  • the synthetic peptides PEP1, PEP2, PEP3 and PEP4, mimetic to HPV LI protein epitopes were designed and synthesized from phage clones selected by Phage Display as shown above. Through cell viability analysis (MTT), three peptides were chosen to evaluate the vaccine potential for HPV. Peptides PEP1, PEP3 and PEP4 were subjected to in silico (prediction of 3D structures as shown above and in Figures 6A-C), in vivo (immunization in female BALB/c mice) and in vitro (ELISA, Splenocyte culture, CBA, Neutralization Assay).
  • the vaccine formulations comprise at least one of the synthesized peptides and at least one pharmaceutically acceptable vehicle, carrier and/or adjuvant.
  • the commercial quadrivalent vaccine (Gardasil®, Merck; USA), which contains recombinant VLPs (Virus-like particles) assembled from LI proteins of HPV types 6, 11, 16 and 18, was used as a positive control for immunization.
  • the mice were divided into six groups of five animals each. Immunizations were performed with 10 mM PEP1 (group G1), 10 mM PEP3 (group G2), as well as 10 mM PEP4 (group G3); all administered in formulations comprising at least half the volume of a pharmaceutically acceptable adjuvant, in a 1:1 ratio (for example: in this case, a 2% aluminum hydroxide suspension, known as Alum - InvivoGen; USA - was used as an adjuvant).
  • a pharmaceutically acceptable adjuvant for example: in this case, a 2% aluminum hydroxide suspension, known as Alum - InvivoGen; USA - was used as an adjuvant.
  • the fourth group of animals represented the control group (G4), which was administered only sterile phosphate buffer saline (PBS).
  • PBS sterile phosphate buffer saline
  • the adjuvant control group (G5) a mixture of PBS and adjuvant was injected, in the same proportion as the vaccine formulations.
  • a positive control group (G6) for immunization against HPV was evaluated, administering 10.5 pg of the total VLPs contained in the commercial vaccine available in addition to the adjuvant used in vaccine formulations formulated with the synthesized peptides, within them proportions.
  • the amount of VLP used in the study was determined according to the literature [(Schellenbacher C, et al. 2009. Chimeric L1-L2 virus-like particles as potential broad-spectrum human papillomavirus vaccines.
  • the vaccine formulations were administered subcutaneously (dorsal), in four doses, with an interval of 15 days between each dose.
  • blood samples via the retro-orbital plexus and vaginal lavage were collected to assess the humoral immune response.
  • O Vaginal lavage was obtained by pipetting with 100 ⁇ l of sterile PBS into the female vaginal canal.
  • the animals were euthanized and, in addition to blood and vaginal lavage, the spleen was removed aseptically, for splenocyte culture and analysis of the cellular immune response by CBA.
  • EXAMPLE 8 Detection of IgG and IgA Antibodies by ELISA
  • the levels of IgG antibodies in serum and IgA in the vaginal wash were determined by indirect ELISA.
  • the peptide-specific IgG antibody titers and the positive control (G6) (Gardasil®, Merck; USA vaccine) used in the immunizations are shown in Figure 11.
  • High-binding 96-well ELISA plates were sensitized to 1, 5 mg/well of each peptide, as well as the total of VLPs contained in the commercial vaccine (VC) Gardasil®. Nonspecific reactivity against BSA (1.5 mg/well) was also evaluated (data not shown).
  • the reaction was blocked with 5% PBS-BSA and serum samples (1:10 dilution) and vaginal wash (1:5 dilution) were added and incubated at 37°C for 1h. Then, the samples were washed 3x in washing buffer (PBS with 0.05% Tween20) and incubated for 1h at 37°C with the respective detection antibodies, both diluted 1:5,000 in blocking buffer.
  • the anti-IgG antibody was used, while the samples of vaginal lavage were tested with anti-IgA antibody, both specific for mice and labeled with peroxidase.
  • the wells were washed 5x and revealed with OPD. Absorbance readings were performed in a microplate spectrophotometer at 492nm.
  • EXAMPLE 9 Culture of Splenocytes and ARC [099] In order to assess the influence of different vaccine formulations on the cellular immune response, the spleens of all animals were removed and macerated to obtain splenocytes. After maceration of the organ, the splenocytes from animals of the same group were pooled and kept in culture for the evaluation of the cellular immune response profile.
  • kit supernatants and cytokine standards were incubated with a mixture of capture microspheres coated with antibodies specific for each cytokine, and with detection antibody labeled with phycoerythrin (PE). After the incubations, 500 pL of the washing solution was added and the material was centrifuged at 200g for 5 minutes. The supernatant was discarded and the samples were resuspended in 100 ⁇ L of the washing solution for later reading in a flow cytometer. The results obtained were analyzed using the FCAP ArrayTM Software, by obtaining calibration curves obtained from the kit standards, and the concentration of analytes in the sample was determined in pg/mL.
  • PE phycoerythrin
  • the mitogen ConA was used only as a positive control of the assay and, under its stimulus, the cell culture of all groups of animals produced cytokines, confirming the reliability of the in vitro experiment (data not shown) .
  • Cytokines represent a group of molecules involved in inflammation, immunity, defense and modulation of the immune system to HPV infection.
  • TNF- pro-
  • IFN-g IFN-g
  • IL-17A IL-17A
  • IL-6 anti-inflammatory
  • IL-4 and IL-10 anti-inflammatory cytokines
  • the G1 group (immunized with PEP1) showed no significant difference for TNF-a in any of the stimuli evaluated, but it is clear that there was a small increase between unstimulated cells (NT) and peptides, especially PEP3, which probably acts synergistically since it is a chimeric peptide designed with motifs from PEP1 and PEP4.
  • NT unstimulated cells
  • PEP3 which probably acts synergistically since it is a chimeric peptide designed with motifs from PEP1 and PEP4.
  • G1 was not able to generate a response, however, when stimulated with VC, there was an increase in the production of IL-17A.
  • IL-10 was significantly expressed when stimulated by PEP1 (p ⁇ 0.05) and PEP3 (p ⁇ 0.001). Interestingly, IL-6 was produced under PEP3 and PEP4 stimuli, and increased significantly (p ⁇ 0.0001) when stimulated by CV, showing a similar effect to the group immunized with CV (G6).
  • IL-6 is a cytokine that influences antigen-specific immune responses and inflammatory reactions, being considered one of the main mediators of the acute phase of inflammation. This cytokine has an important role in the balance of Thl/Th2 responses, promoting differentiation to effector Th2 cells when dependent on IL-4 and polarization to Thl via IFN-g signaling. Studies suggest that cervical carcinoma cells can escape host defense mechanisms through downregulation of the IL-6 receptor, indicating its importance in inducing responses against HPV infection.
  • TNF-a is a multifunctional cytokine in the host's response to inflammation and in defense against viral and bacterial infections.
  • This cytokine is capable of decreasing the expression of oncogenes E6 and E7, inducing apoptosis and preventing the growth of cells infected with HPV, in addition to stimulating and mediating responses to chemokines and other inflammatory agents.
  • PEP1 p ⁇ 0.01
  • PEP3 p ⁇ 0.001
  • PEP4 stimuli An opposite effect can be observed with the anti-inflammatory cytokine IL-10, which had a low expression in untreated cells and increased after PEP1 (p ⁇ 0.05), PEP3 (p ⁇ 0.001) and PEP4 stimuli.
  • cytokine IL-10 is able to modulate immune responses in vitro and in vivo, generating down-regulation in inflammatory cytokines such as IFN-g and IL-17. This regulatory mechanism may justify the decrease in IFN-g and IL-17A responses to stimuli, when compared to NT expression.
  • IL-6 had a significant increase (p ⁇ 0.0001) when untreated and under stimulation of all peptides, especially the
  • IL-10 is a pleiotropic cytokine capable of inhibiting the synthesis of other cytokines, especially IFN-Y, in addition to preventing the proliferation of Thl cells, but it is capable of maintaining the development of Th2 responses, which are important for the production of antibodies. Possibly, there was a prevalence of the Th2 profile and consequent inhibition of IFN-g after immunization with the commercial vaccine.
  • This infiltrate would have an important role in combating the infection by secreting pro-inflammatory cytokines such as IL- 12, IFN-g and TNF-a, demonstrating a predominance of Thl-type response.
  • pro-inflammatory cytokines such as IL- 12, IFN-g and TNF-a
  • immunocompromised individuals are at increased risk of HPV infection and progression to virus-associated malignancies.
  • synthesized peptides mimetics of the HPV L1 protein, are capable of detecting IgA antibodies in body fluid samples from patients with HPV.
  • the synthesized peptides were also able to elicit serum humoral (IgG) and vaginal mucosa (IgA) immune responses in vivo.
  • these peptides induced an important cellular immune response with upregulation of pro-inflammatory cytokines and shift to a Thl profile.
  • the chimeric peptide (PEP3) seems to act synergistically, potentiating humoral and cellular responses, with possible production of neutralizing antibodies to HPV-16, indicating a more attractive prophylactic applicability.
  • Synthetic HPV L1 protein mimetic peptides comprising one of the selected amino acid sequences. group consisting of: SEQ ID No. 01, SEQ ID No. 02, SEQ ID No. 03, SEQ ID No. 04, SEQ ID No. 05 and SEQ ID No. 06, or a sequence having at least 85% of identity or similarity to one of the amino acid sequences selected from the group consisting of: SEQ ID N° 01, SEQ ID N° 02, SEQ ID N° 03, SEQ ID N° 04, SEQ ID N° 05 and SEQ ID N° 06.
  • the synthetic peptide is for use in a method of diagnosing HPV or for use in the treatment and/or prophylaxis of HPV.
  • compositions comprising at least one of the synthetic peptides as described in the present application, and at least one pharmaceutically acceptable vehicle, carrier, adjuvant and/or compound.
  • the pharmaceutical composition is a vaccine and may further comprise an aluminum hydroxide solution as an adjuvant.
  • Said pharmaceutical composition being for use in the treatment and/or prophylaxis of HPV.
  • the biological sample is preferably a bodily fluid; contacting the sample with at least one of the synthesized peptides as defined in claim 1;
  • Said method can be used as an ELISA assay or as an electrochemical detection assay.
  • the electrochemical detection test comprises:
  • bioelectrode is a graphite electrode and the method further comprises auxiliary and/or reference electrodes, but particularly where such electrodes comprise a platinum and silver/silver chloride plate.
  • an HPV diagnostic system by electrochemical detection in which it comprises at least one electrode and at least one of the synthetic peptides as described in the present application.
  • the electrode is a graphite electrode and where it comprises at least one of the synthetic peptides as defined in claim 1 incorporated or immobilized on its surface.
  • the system still comprises auxiliary and/or reference electrodes, but particularly in which such electrodes comprise a platinum and silver/silver chloride plate, as well as comprising a potentiostat or similar device for reading the result.
  • Describes a method of treatment and/or prophylactic of HPV which comprises administering to a subject a pharmaceutically effective dose of at least one of the synthetic peptides as described in the present application or a pharmaceutical composition as described in the present application.

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Abstract

A presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptídeos sintéticos, projetados e sintetizados a partir da análise de clones de fagos mimetopos do epítopo imunológico da proteína L1 do papilomavírus humano (HPV). Os peptídeos sintetizados foram imunorreativos e capazes de detectar anticorpos IgA em amostras de fluidos corporais de pacientes com HPV, podendo ser utilizados no diagnóstico do HPV. Além disso, eles foram capazes de provocar resposta imune in vivo. A presente inveção refere-se à seleção, caracterização e utilização desses novos peptídeos sintetizados tanto para o diagnóstico quanto para o tratamento e/ou profilaxia do HPV. A presente invenção ainda descreve um método de diagnóstico de HPV, uma composição farmacêutica e o uso destes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção: "PEPTÍDEOS SINTÉTICOS MIMÉTICOS A PROTEÍNA LI DO HPV, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE HPV, SISTEMA DE DIAGNÓSTICO DE HPV, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS NO TRATAMENTO OU PROFILAXIA DO HPV".
Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se à seleção e caracterização de peptideos sintéticos, projetados e sintetizados a partir da análise de clones de fagos mimetopos do epitopo imunológico da proteína LI do papilomavírus humano (HPV). Mais particularmente os peptideos sintetizados foram imunorreativos e capazes de detectar anticorpos IgA em amostras de fluidos corporais de pacientes com HPV. Além disso, os peptideos sintetizados foram capazes de provocar resposta imune ín vivo. Particularmente a presente inveção refere-se à seleção, caracterização e utilização desses novos peptideos sintetizados. Além disso, a presente invenção ainda descreve um método de diagnóstico de HPV, um sistema de diagnóstico de HPV por detecção eletroquimica e uma composição farmacêutica compreendendo ao menos um destes novos peptideos sintetizados e o uso destes peptideos para preparar medicamentos ou composições imunogências para o tratamento e/ou profilaxia de HPV.
Fundamentos da Invenção
[002] A infecção pelo papilomavirus humano (HPV) é a
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) doença virai sexualmente transmissível mais comum e representa um grande problema de saúde pública mundial, devido a sua alta incidência e forte associação com malignidades. Mais de 100 tipos de HPV foram identificados e aproximadamente metade deles apresenta alto tropismo para células epiteliais e membranas mucosas, onde podem causar lesões benignas, câncer ou persistir de forma assintomática. [003] Globalmente, o principal método de detecção de HPV ainda é o teste de Papanicolaou, porque muitos países com poucos recursos não possuem a infraestrutura técnica e programas de saúde pública para oferecer testes de suporte. Embora o exame de Papanicolaou diminua a incidência de câncer cervical (também conhecido como câncer de colo de útero) e a taxa de mortalidade, sua detecção limita-se às habilidades do observador para reconhecer e classificar uma variedade de anormalidades celulares, quando avaliadas isoladamente, pode resultar comumente em resultados indeterminados ou falso- negativos. O exame de Papanicolau, guiadas ou não por biópsia, pode ser invasivo e desconfortável. Atualmente, os métodos moleculares para detecção de HPV assumem um papel de grande importância no cenário de diagnóstico precoce do HPV e prevenção do câncer cervical e oferecem alternativas promissoras como ferramentas de triagem para melhorar a sensibilidade da citologia convencional [(MOLIJN A., et al.
Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. J. Clin. Virol. 2005 . p. 43-51); (GUTIÉRREZ-
XICOTÉNCATL L., et al ., Molecular diagnosis of human papillomavirus in the development of cervical câncer. Salud Publica Mex. 2009. p. s479-s488); (ARNEY A., BENNETT K.M. Molecular Diagnostics of Human Papillomavirus. Lab. Med. 2010. p. 523-530); (ZARAVINOS A., et al., Molecular detection methods of human papillomavirus (HPV). Int J Biol Markers. 2009; 24(4):215-222)].
[004] Dentre as técnicas moleculares disponíveis, à amplificação do DNA virai através do PCR e os métodos de hibridização são descritos em vários documentos e estão disponível em vários kits de diagnóstico já comercializados (por exemplo, kit Cobas® HPV test; Linear Array® HPV genotyping test; dentre outros). Alguns exemplos de pedidos de patente que descrevem métodos de diagnóstico para o HPV e utilizam como técnica o PCR são os documentos BR 102016003502-3; BR 102017018274-6; US 2019/0153552; WO 2015026827 .
[005] Apesar da grande quantidade de opções disponíveis para o diagnóstico do HPV, ainda sim se observa uma necessidade de se dispor de métodos de diagnóstico com custos mais acessíveis, simples, rápidos, menos invasivos, de alta eficácia, confiabilidade e que possam detectar a presença do agente o mais precocemente possível, uma vez que a infecção por HPV é de progressão lenta e pode ainda contar com falsos- negativos com uso somente do exame de Papanicolau. Estudos mostram que cerca de 63% dos pacientes com HPV-DNA positivo podem ser falsamente tranquilizados como um resultado negativo quando são rastreados usando apenas o teste de Papanicolaou . Além disso, todos esses pacientes tem história prévia de infecção pelo HPV, mas ainda não haviam eliminado a carga virai, e resultados falso-negativos podem afetar diretamente a conduta médica. Além disso, os resultados classificados como células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS) foram 100% positivos na detecção do HPV-DNA. Estes estudos reforçam a importância de implementar novas abordagens para a detecção do HPV como co-teste comparador de achados citológicos.
[006] Recentemente, a saliva têm sido freqíientemente usada como fluido biológico em diagnósticos de doenças devido à sua coleta fácil e não invasiva. Vários estudos utilizaram amostras salivares para detecção de anticorpos em diversos diagnósticos de doenças [(CUEVAS-CÓRDOBA, B., SANTIAGO- GARCÍA, J., Saliva: a fluid of study for OMICS. OMICS. 2014; 18 (2):87-97); (MALAMUD, D., Saliva as a Diagnostic Fluid. Dent. Clin. North Am. 2011. p. 159-178)]. De fato, a saliva oferece vantagens caracteristicas sobre o soro e outros fluidos corporais e pode fornecer uma abordagem custo- efetiva para grandes exames populacionais.
[007] Realizamos uma abordagem adicional em fluidos orais para propor um método rápido e minimamente invasivo para a detecção do HPV, como simples apoio ao diagnóstico de achados citológicos. Para tanto, os valores de IgA das amostras cervicais e de saliva foram avaliados pela correlação de Spearman. Houve correlação positiva significativa (r = 0,59; p <0,0001) entre as respostas de IgA presente nas amostras cervicais e na saliva, sugerindo que dentro de compartimentos mucosos distintos pode haver alguma comunicação. Cameron et al. testaram IgG contra as cápsides de HPV-6, HPV-11 e HPV-16 em amostras orais e séricas, com correlação exata entre TMO (transudato da mucosa oral) e soro (Cameron J.E., et al. Human papillomavirus- specific antibody status in oral fluids modestly reflects serum status in human immunodeficiency virus-positive individuais. Clin Diagn Lab Immunol. 2003; 10(3):431-43), corroborando com nossos resultados.
[008] A história natural da resposta imune oral do HPV não é clara [(Gaester K., et al. Human papillomavirus infection in oral fluids of HIV-1-positive men:prevalence and risk factors. Sei Rep. 2014; 4:6592); (Videla S, Darwich L, Canadas M. Natural History of Human Papillomavirus Infections Involving Anal, Penile, and Oral Sites Among HIV- Positive Men. Sex Transm. 2013; 40(1):3—10)] e a associação salivar com a resposta imune sistémica ainda não foi bem explorada. Até agora, poucos estudos foram relatados sobre a resposta sistémica de anticorpos IgA ao HPV. Passmore et ai. encontraram mais respostas de IgA especificas para HPV- 16 na cavidade oral em relação às respostas cervicais e séricas, no entanto, apenas 1% das mulheres testadas tinham DNA detectável de HPV-16 nos compartimentos salivares (Passmore J-AS, et ai. Cervicovaginal, oral, and serum IgG and IgA responses to human papillomavirus type 16 in women with cervical intraepithelial neoplasia. J Med Virol. 2007; 79(9):1375-1380) . Por outro lado, Golçalves et ai. avaliaram títulos de IgA secretora na saliva de mulheres com orofaringe e HPV genital e concluíram que pacientes com DNA de HPV na orofaringe tinham títulos de IgA extremamente baixos quando comparados a mulheres HPV negativas em amostras de saliva (Gonçalves AKS, et ai. Secretory immunoglobulin a in saliva of women with oral and genital HPV infection. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006; 124(2):227-231). De fato, estudos sobre a comunicação entre os compartimentos mucosos na biologia da resposta imune sistémica ainda são necessários. [009] Desta forma, a busca do diagnóstico molecular é o de gerar marcadores mais baratos, estáveis e de alta sensibilidade para detecção de proteínas alvo em fluídos corporais como a saliva. Em uma das modalidades aqui descritas, propomos novos peptídeos sintetizados para uso em um método de diagnóstico molecular do HPV baseado na detecção de anticorpos IgA apartir de amostras de saliva ou amostras de fluido cervical, com alto potencial de suporte ao exame de Papanicolaou na triagem populacional.
[010] O genoma do HPV tem aproximadamente 8.000 pb, dividido em três regiões, uma região controle longa não codificante (LCR) que contém a origem da replicação virai do DNA e os elementos enhancer/promoter que regulam a transcrição virai; as outras duas regiões codificantes incluem proteínas precoces (E) e tardias (L). A região precoce está envolvida na replicação virai e na oncogênese, e codifica seis quadros de leitura aberta (ORFs) El, E2, E4, E5, E6 e E7 . A região tardia codifica as proteínas estruturais LI e L2 para o capsídeo virai. Nas últimas décadas, essas proteínas tem sido usadas como alvo para produção de vacinas para uso no tratamento ou profilático da HPV. Por exemplo, o pedido de patente WO2018085751 descreve peptídeos compreendendo as sequências de amino ácidos das proteínas E6 e E7 do HPV. A proteína LI do HPV tem sido um alvo também muito atrativo para a produção de vacinas devido à sua capacidade de auto-montagem, que permite a formação de partículas semelhantes a vírus (VLPs) contendo epitopos altamente imunogênicos. Por exemplo, o pedido de patente BR 112017004181-2 descreve uma vacina compreendendo amino ácidos da proteína LI do HPV. Além disso, a sequência de DNA da proteína LI é quase 80-90% idêntica a diferentes tipos virais, tornando-se um poderoso candidato a abordagens diagnósticas [(BUCK C.B., et ai. The papillomavirus major capsid protein LI. Virology. 2013; 445(1-2):169-17); (COUTLÉE F., et ai. Use of PGMY Primers in LI Consensus PCR Improves Detection of Human Papillomavirus DNA in Genital Samples Use of PGMY Primers in LI Consensus PCR Improves Detection of Human Papillomavirus DNA in Genital Samples. 2002; 40(3):902-907])].
[011] Recentemente a indústria farmacêutica disponibilizou duas vacinas profiláticas no mercado, uma vacina bivalente Cervarix® e uma vacina quadrivalente Gardasil®, que fornecem forte proteção de anticorpos neutralizantes contra dois virus de alto risco (HPV-16 e HPV-18), que estão associados com cerca de 70% dos casos de câncer cervical (SMITH J.S., 2007. Human papillomavirus type distribution in invasive cervical câncer and high-grade cervical lesions: a meta-analysis update. Int J Cance 7 121:621-632), mas em grande parte não protegem contra outros tipos virais que estão também envolvidos na carcinogênese (SCHILLER, J.T., et ai. 2012. A review of clinicai trials of human papillomavirus prophylactic vaccines. Vaccine 30 (Suppl 5):F123-38). As vacinas profiláticas são produzidas a partir de VLP (Virus Like- Particles) contendo a proteína principal do capsídio virai
(Ll), capaz de gerar resposta baseada em anticorpos neutralizantes tipo-especificos e capaz de gerar resposta baseada em anticorpos neutralizantes tipo-especificos e prevenir a infecção pelo HPV.
[012] Atualmente, muitos estudos têm sido direcionados no sentido de oferecer uma opção profilática que abranja vários tipos de HPV de alto risco em uma única formulação vacinai, como uma eficiente alternativa de prevenção do câncer cervical, bem como de outros tumores HPV-associados. [013] O desenvolvimento de uma vacina baseada no vírus morto ou atenuado é limitada pela falta de sistemas de cultura de tecidos para propagação virai. Uma atrativa opção no desenvolvimento de vacinas profiláticas é a utilização de epítopos conservados das proteínas da cápside virai (LI ou L2) que sejam capazes de desenvolver anticorpos de neutralização cruzada a diferentes tipos de HPV, visto que as vacinas atuais podem futuramente selecionar outros tipos virais considerados de baixa dominância.
[014] Uma interessante ferramenta para descoberta de peptídeos recombinantes com aplicações biotecnológicas tem sido a metodologia de Phage Display (PD). Esta técnica baseia-se na inserção de um gene ou fragmento de gene em bacteriófagos, resultando na expressão de peptídeos aleatórios com especificidade ao alvo de interesse [(Barbas CF. 1993. Recent advances in phage display. Curr Opin
Biotechnol); (Smith GP, Petrenko V a. 1997. Phage Display.
Chem Rev 97:391-410)]. [015] A exibição em fagos tem sido utilizada para identificar sequências com aplicação no diagnóstico de doenças ([(Hairul Bahara N.H., et al. 2013. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 2013 Jul;41 (4):209-16); (Rakonjac J., et al. Filamentous bacteriophage : biology, phage display and nanotechnology applications. Curr Issues Mol Biol 13:51-76)], bem como no desenvolvimento de vacinas (Gao J., et al. Phage display and its application in vaccine design. Ann Microbiol 2010, 60:13-19).
Objetivo da invenção
[016] O presente pedido de patente teve como objetivo identificar e sintetizar novos peptideos miméticos para a proteína LI do HPV, que tivessem capacidade melhorada de serem usados em um método de diagnóstico do HPV, bem como na produção de composições farmacêuticas para tratamento ou preveção do HPV.
Breve descrição da invenção
[017] O presente pedido de patente descreve seis (6) novos peptideos sintéticos que foram projetados e sintetizados após análise in vitro de clones de fagos obtidos por Phage Display e que apresentaram ser potentes mimetópos do epítopo imunológico da proteína LI do papilomavírus humano
(HPV).
[018] Os seis (6) peptideos foram produzidos quimicamente com uma amidação na região C-terminal e conjugados à Albumina de Soro Bovino (BSA) à cisteina N- terminal, incluindo um espaçador (GGGS). Em três peptideos (PEP1, PEP3 e PEP4), adicionou-se parte da sequência da proteína pIII do bacteriófago (AETVESCL). Essas estratégias foram adotas para aumentar a sensibilidade e imunogenicidade em ensaios ín vitro e ín vivo.
[019] Em outra modalidade aqui descrita, tais peptideos apresentaram capacidade de serem reconhecidos por IgA específica para HPV em fluídos corporais. Portanto, se descreve o uso destes peptideos em um método de diagnóstico de HPV, bem como o referido método de diagnóstico em si. Também em outra modalidade se descreve um Kit para ser usado em um método de diagnóstico, bem como um um sistema de detação utilizando um bioeletrodo.
[020] Uma outra modalidade aqui descrito, tais preptídeos apresentaram capacidade de induzirem resposta imunológica contra o HPV. Desta forma se descrevem composições farmacêuticas para uso no tratamento e/ou profilaxia do HPV que compreendem ao menos um dos novos peptideos sintetizados aqui descritos, mais, pelo menos, um veículo, carreador e/ou composto farmacêuticamente aceitável.
[021] Outra modalidade aqui descrita é o uso dos novos peptideos sintéticos ou das composições farmacêuticas aqui descritas, para a preparação de um medicamento ou composição imunogênica para uso no tratamento e/ou profilaxia do HPV. [022] Outras modalidades aqui descritas são: um método de tratamento e/ou profilático do HPV, bem como um Kit para ser usado em um método de diagnóstico, tratamento e/ou profilático do HPV.
[023] Breve descrição das figuras
[024] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:
[025] A FIGURA IA mostra as sequências de aminoácidos de todos os mimotopos selecionados por Phage Display e suas frequências.
[026] A FIGURA 1B mostra a reatividade de ensaios ELISA para os mimotopos com amostras cervicais e salivares de pacientes com HPV (pool) e controles saudáveis (pool).
[027] A FIGURA 2A mostra o alinhamentos múltiplos da sequência deduzida do fago C.B1 com as sequências de diversos tipos de HPV da proteína LI (HPV06, 11, 16, 18, 33, 45 e 31).
[028] A FIGURA 2B mostra as regiões da proteína LI do
HPV com provável antigenicidade e o emparelhamento com uma região da proteína LI de HPV16.
[029] A FIGURA 2C mostra a estrutura cristalográfica tridimensional da proteína LI do HPV (PDB: 2R5H). [030] A FIGURA 2D-E mostram um modelo tridimensional da estrutura predita para a proteína LI e localização do provável epítopo.
[031] A FIGURA 2F mostra a escala de predição de imunogenicidade na estrutura 3D para a proteína LI.
[032] A FIGURA 3A mostra a detecção de anticorpo IgA específico em amostras cervicais de pacientes infectados com HPV e de indivíduos controles não-infectados.
[033] A FIGURA 3B mostra a detecção de anticorpo IgA específico em amostras salivares de pacientes infectados com HPV e de indivíduos controles não-infectados.
[034] A FIGURA 3C mostra a curva ROC de amostras cervicais (C).
[035] A FIGURA 3D mostra a curva ROC de amostras salivares (D).
[036] As FIGURAS 4A-D mostram a detecção de
Imunoglobulina A pelo mimotopo C.B1 de acordo com a classificação genotípica de risco por Nested-Multiplex PCR (nmPCR) e cytologia (Papanicolau).
[037] A FIGURA 5A mostra a titulação do fago C.B1 para detecção de IgA, IgG e IgM.
[038] A FIGURA 5B mostra mostra a titulação do fago
C.B1 para correlação entre os fluidos cervical e salivar.
[039] A FIGURA 6A mostra o alinhamento do PEP1 na estrutura tridimensional da proteína principal do capsídeo (LI) do HPV-16 (PDB: 2R5H).
[040] A FIGURA 6B mostra o alinhamento do PEP3 na estrutura tridimensional da proteína principal do capsideo
(Ll) do HPV-16 (PDB: 2R5H).
[041] A FIGURA 6C mostra o alinhamento do PEP4 na estrutura tridimensional da proteína principal do capsideo
(Ll) do HPV-16 (PDB: 2R5H).
[042] A FIGURA 7A mostra o reconhecimento da IgA pelos peptideos sintetizados em membrana de nitrocelulose (Slot- blot) de um pool de amostras cervical e salivar.
[043] A FIGURA 7B mostra uma curva eletroquimica de voltametria cíclica em eletrodo de grafite modificado.
[044] A FIGURA 7C mostra a densidade de carga (carga/C) dos pools salivares negativos (controle) e positivos para
HPV .
[045] A FIGURA 8 mostra uma representação esquemática do formato do bioeletrodo usado na detecção eletroquimica. [046] As FIGURAS 9A-B mostram ensaios de elisa dos peptideos PEP 1 e PEP2, respectivamente, em amostra de saliva de paciente HPV positivo ou negativo.
[047] As FIGURAS 9C-D mostram as curvas ROC (Receiver
Operator Charactheristic) que indicam a sensibilidade e especificidade dos teste de diagnóstico salivar usando os peptideos PEP1 e PEP2, respectivamente.
[048] A FIGURA 10A mostra a viabilidade celular da linhagem de macrófago murino (J774A-1) sob estimulo do peptideo 1.
[049] A FIGURA 10B mostra a viabilidade celular da linhagem de macrófago murino (J774A-1) sob estimulo do peptideo 2.
[050] A FIGURA 10C mostra a viabilidade celular da linhagem de macrófago murino (J774A-1) sob estimulo do peptideo 3.
[051] A FIGURA 10D mostra a viabilidade celular da linhagem de macrófago murino (J774A-1) sob estimulo do peptideo 4.
[052] As FIGURAS 11A-D mostram os perfis da produção de anticorpos IgG em amostras de soro murino, por ELISA, para avaliação da imunização com os peptideos sintetizados. [053] As FIGURAS 12A-D mostram as titulações de anticorpos IgA presentes em mucosa vaginal murina, por ELISA, para avaliação da imunização com os peptideos sintetizados. [054] As FIGURAS 12E-F mostram os níveis gerais da expressão de IgA representado por gráficos lineares, de acordo com a média e desvio padrão da produção de anticorpos entre a primeira e última imunização para os respectivos peptideos sintetizados.
[055] As FIGURAS 13 mostram os perfis de resposta imune celular de esplenócitos murinos obtidos de animais imunizados com vascinas compreendendo os peptideos sintizados .
Descrição detalhada da invenção
[056] O presente pedido de patente descreve seis (6) novos peptideos sintéticos projetados e sintetizados após análise ín vitro de clones de fagos obtidos por Phage Display e que apresentaram ser potentes mimetópos do epitopo imunológico da proteína LI do papilomavirus humano (HPV).
Seleção dos clones de fagos - mimético do epitopo de LI [057] Para seleção de mimetopos utilizou-se o kit de bibliotecas de peptideos Ph.D.-C7C Phage Display (PD) (New England Biolabs, Ipswich, EUA) baseado numa biblioteca combinada de peptideos aleatórios fundida com a capsideo da proteína pIII do fago M13. A biblioteca Ph.D.-C7C foi submetida a seleções negativas e positivas contra IgAs purificadas de um pool de indivíduos dos Grupos 1 (indivíduos saudáveis), 2 (pacientes com outras doenças genitais) e 3 (pacientes com diagnóstico definitivo de infecção por HPV). Para bioprospecção, foram utilizados lOpL (lxlO11 fagos) da biblioteca Ph.D.-C7C diluída em 190 pL 0,1% de TBS-T. A seleção dos ciclos foi realizada utilizando 20 pL de esferas ligantes a IgAs purificadas de cada grupo. Para seleção negativa, a biblioteca foi incubada com esferas magnéticas acopladas a IgA de indivíduos saudáveis (Grupo 1) durante 30 minutos, com agitação em temperatura ambiente. Então, o sobrenadante com fagos não ligados foi incubado a IgA-beads de pacientes com outras doenças genitais (Grupo 2) por 30 min à temperatura ambiente, com agitação. Após este segundo passo de subtração, foi efetuada uma seleção positiva utilizando fagos não ligados que foram incubados com IgA- bead de pacientes com diagnóstico definitivo de infecção por HPV (Grupo 3) nas mesmas condições. O processo de seleção subtrativa foi repetido 3 vezes no pool de IgA do grupo 1 e duas vezes no grupo 2, a fim de aumentar a especificidade dos fagos para o alvo. Duas estratégias para a eluição de fagos específicos foram adotadas. Uma delas foi adicionado a uma solução de pH ácido (0,2 M Glicina, pH 2,2) e neutralizado com Tris (1M , pH 9.1), seguido de 3 ciclos de seleção idêntica. Outra estratégia foi definida por eluição competitiva, utilizando a vacina quadrivalente contra o HPV (Gardasil®), que contém partículas semelhantes a vírus (VLPs) de uma região antigênica do vírus (proteína LI HPV 06, 11, 16 e 18), seguida de 2 ciclos seleção. Os fagos eluídos foram amplificados em E. coli (ER2738) (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA), purificados utilizando precipitação com polietilenoglicol 8.000 e NaCl 2,5 M a 20% (p/vol) após cada ciclo de biopanning. Colónias bacterianas individuais contendo clones de fagos amplificados foram cultivadas em uma placa de microtitulação e tituladas de acordo com o método descrito por Barbas et al. (Barbas C.F., et al. Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Raven Press, 2001).
[058] Um total de 65 clones foram selecionados aleatoriamente, 13 obtidos por estratégia de seleção competitiva e 52 por meio de eluição ácida, usando uma biblioteca de peptideos aleatórios expressos em fagos. A partir de 65 clones de fagos selecionados, 32 possíveis mimetopos apresentaram diferentes sequências (12 por eluição competitiva e 20 em seleção ácida) (Figura IA). Os fagos selecionados mostraram diferentes reatividades quando testados contra amostras cervicais e de saliva por ELISA (Figura 1B); dois clones obtiveram maior proporção de absorbância entre o pool positivo e negativo para o HPV no fluido cervical e salivar. O fago C.B1 apresentou uma proporção de 3,09 no conjunto cervical e 3,45 no conjunto salivar, enquanto que o fago A.D5 apresentou uma proporção de 1,93 e 2,44 em ambas as amostras, respectivamente. O pool positivo de HPV em ambos os clones resultou em diferenças significativas (p< 0,0001) nos dois fluidos quando comparado com o fago (RP) ( SEQ ID N°07) e o grupo de controle (Two- way ANOVA com o teste de comparações múltiplas de Tukey). Devido à maior reatividade do fago C.B1 em comparação com os outros clones de fagos, vamos demonstrar, como exemplo aqui, os resultados das investigações adicionais que foram realizadas com este clone.
Sequenciamento de DNA e Análise bioinformática [059] Após três ciclos de seleção e eluição com ácido e duas rodadas de eluição competitiva, os DNAs de cadeia simples dos fagos foram isolados pelo procedimento de extração com tampão iodado (Azzazy H.M.E., Highsmith W.E. Phage display technology: Clinicai applications and recent innovations. Clin. Biochem. 2002. p. 425-445) . A eletroforese foi realizada em gel de 0,8% corado com solução de brometo de etidio, a fim de verificar a qualidade do DNA. A sequência nucleotidica da inserção do gene III foi sequenciada usando o Kit de Sequenciamento de Ciclos DyEnamic ET Dye Terminator (GE Healthcare, Pittsburg, PA, EUA), com o primer -96 glll (5’-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3 ’) SEQ ID N°08, de acordo com as instruções do fabricante, e detectadas em um sequenciador capilar automático MegaBace 1000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA). A sequência de aminoácidos da sequência nucleotidica foi predita usando o software ExPASy disponível on-line (http://www.expasy.org). O alinhamento entre as sequências foi realizado usando o programa ClustalW2 (http://www,ebi.ac.uk/Tools/msa/ , e a similar-dade com proteínas do HPV foi
Figure imgf000021_0001
verificada usando a pesquisa BLASTp (http: // www. ncbi.nlm.nih.gov/blast) . A estrutura tridimensional do HPV16 LI foi obtida do Banco de Dados de Proteína (PDB: 2R5H)
(Bishop B., et ai. Crystal structures of four types of human papillomavirus L1 capsid proteins: Understanding the specificity of neutralizing monoclonal antibodies. J Biol
Chem. 2007; 282(43):31803-31811) e a análise de similaridade foi predita usando o Pepitope Server (Mayrose I., et ai. Pepitope: Epitope mapping from affinity-selected peptides. Bioinformatics . 2007; 23(23):3244-3246). O grau de antigenicidade da proteína L1HPV16 foi calculado para toda a sua estrutura tridimensional pelo programa Epitopia Server (http://epitopia.tau.ac.il/) (Rubinstein N.D., et ai. Epitopia: a web-server for predicting B-cell epitopes. BMC Bioinformatics . 2009; 10:287). A predição de epitopo de anticorpo da proteína L1HPV16 foi realizada utilizando a escala de antigenicidade de Predição de Epitopo Linear Bepipred (Larsen J.E.P., et ai. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res. 2006; 2:2). [060] O alinhamento linear com a sequência de aminoácidos do fago C.B1 foi cruzado com proteínas distintas do HPV nos estudos realizados (dados não mostrados) e mostrou até seis (85,7%) resíduos conservados ou semi-conservados de aminoácidos a uma proteína imunogênica de diferentes tipos de HPV (tipos: 06, 11, 16, 18, 31, 33 e 45), a principal proteína LI do capsídeo do HPV (Figura 2A). Resíduos conservados (*) e semi-conservados estão marcados em cinza na figura 2A. Cinco (71,4%) resíduos de aminoácidos do fago
C.B1 foram emparelhados com uma região da proteína LI de
HPV16 (Figura 2B). As predições de antigenicidade foram feitas pelo software Bepipred linear epitope prediction scale. 0 cut-off (Threshold) de 0,35; média (0,03); antigenicidade minima (-2,684); antigenicidade máxima (1,557). Regiões com provável antigenicidade na escala acima de 0,35 são consideradas antigênicas. O tamanho da janela e posição central foram respectivamente 7 e 4. *Localização estrutural do C.B1 na proteína do capsídeo LI (resíduos de 194 a 200) do HPV16 (Figura 2A).
[061] Análises tridimensionais da sequência do mimetopo foram previstas adicionando uma sequência espaçadora (GGGS) e aminoácidos (alanina e cisteína) responsáveis pela conformação do peptídeo da biblioteca de peptídeos. Este aminoácido adicional (ACxxxxxxxCGGGS) foi usado para que a exposição ao alinhamento se torne mais específica para o reconhecimento do alvo. A estrutura cristalografada da proteína LI de HPV16 (PDB: 2R5H) (Figura 2C) foi utilizada para representar o alinhamento com C.B1 (Figuras 2D-E). As figuras 2D e 2E mostram um modelo 3D da estrutura predita para a proteína LI e localização do provável epítopo. Em vermelho encontra-se a região mimética do peptídeo sintetizado a partir do clone de fago C.B1: SEQ ID N°05 (PEP- C.B1). Embora os resultados dos testes adicionais utilizando o clone de fago C.B1 não tenham sido demonstrados aqui, sintetizamos também a região mimética ao LI de HPV do clone de fago A.D5: SEQ ID N°06 (PEP-A.D5). [062] O mapeamento dos epitopos revelou regiões antigênicas e apresentou diferentes graus de imunogenicidade, os quais são representados em sua estrutura tridimensional (Figura 2F). A escala de predição de imunogenicidade na estrutura 3D para a proteína LI foi realizada pelo Epitopia Server.
Design e síntese dos novos peptídeos [063] Após a bioinformática e a análise in vitro dos clones de fagos e dos peptídeos sintetizados a partir dos clones dos fagos C.B1 e A.D5 (PEP-C.B1 e PEP-A.D5) como potentes miméticos para detecção de HPV, quatro novas sequências peptídicas foram projetadas e sintetizadas quimicamente. As sequências foram sintetizadas com amidação da região C-terminal e conjugação da Albumina de Soro Bovino (BSA) a cisteína na região N-terminal, incluindo um espaçador (GGGS) e sequência da proteína pIII do fago (AETVESCL) como estratégia para aumentar a sensibilidade e imunogenicidade. [064] Foram selecionados os dois mimetopos que apresentaram à maior reatividade para a síntese dos peptídeos (C.B1 e A.D5) (em destaque nas sequências) gerando 4 novas sequências. O peptideo 1 (PEP1) foi originado do clone de fago C.B1: ACHHPTSNVCGGGSAETVESCL (SEQ ID N°01). O peptideo 2 (PEP2) foi gerado a partir de duas repetições da sequência do clone C.B1: ACHHPTSNVCGGGSACHHPTSNVC (SEQ ID
N°02). O terceiro peptideo (PEP3) foi construído de forma quimérica, a partir das sequências dos clones C.B1 e A.D5 (ACHHPTSNVCGGGSACEYEGRNICGGGSAETVESCL (SEQ ID N°03); enquanto que o quarto peptideo sintetizado (PEP4) foi originado do fago A.D5: ACEYEGRNICGGGSAETVESCL (SEQ ID N°04).
Análise de Bioinformática dos novos peptídeos
[065] Os peptídeos PEP1, PEP2, PEP3 e PEP4 foram submetidos a análises in silico. Os estudos prévios indicaram uma maior similaridade das sequências sintetizadas com regiões de epítopo da proteína LI do HPV (dados não mostrados) sendo, portanto, a proteína escolhida para as predições estruturais (3D). A representação da estrutura tridimensional com a proteína LI do HPV foi predita em uma das cadeias da proteína, contudo o capsídeo virai é composto por 5 cadeias idênticas, formando uma estrutura circular pentamérica .
[066] Através de ferramentas de bioinformática deduzimos as regiões miméticas de três dos novos peptídeos sintetizados, PEP1, PEP3 e PEP4, e a proteína LI do HPV-16 (Figura 6A-C). Interessantemente, o peptideo quimérico PEP3 (Figura 6B) apresentou maior cobertura à proteína LI em regiões sabidamente imunogênicas, indicando grande potencial em gerar resposta imune semelhante à proteína nativa do HPV- 16. As regiões de localização mimética dos peptídeos estão representadas por esferas coloridas na Figuras 6A-C. EXEMPLO 1: Avaliação dos novos peptídeos projetados e sintetizados a partir do fago C.B1 como um peptídeo mimético de epitopo potencial para o diagnóstico de HPV
[067] Como exemplo, o novo peptídeo projetado e sintizado a partir do fago C.B1 (PEP1) foi testado por ensaio ELISA utilizando amostras individuais de secreção cervical e saliva. No total, 95,6% (44/46) das amostras cervicais positivas para HPV e 96,3% (26/27) das amostras de saliva foram positivas para anti-IgA pelo PEP1. O peptídeo PEP1 projetado e sintetizado a partir do fago C.B1 foi capaz de discriminar eficientemente pacientes com HPV e controles (p <0,0001) e RP testados (p <0,0001), em ambos os fluidos (Figuras 3A-B) . A curva ROC (Receiver Operator Charactherístíc) foi significativa em amostras cervicais (p <0,0001; AUC = 0,9145) e saliva (p <0,0001; AUC = 0,9364). O ponto de corte foi determinado de acordo com os maiores valores de sensibilidade e especificidade obtidos pela curva ROC (Figuras 3C-D). Para avaliar o desempenho diagnóstico do referido peptídeo PEP1 foram calculados os valores de odds ratio, razão de verossimilhança positiva (PLR), razão de verossimilhança negativa (NLR), valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN) (Tabela 1). O odds ratio diagnóstico nas amostras cervicais e de saliva foi de
9,93 e 10,21 e os valores de P associados foram significativamente iguais a 0,003 e 0,031, respectivamente. Em comparação com o diagnóstico para a detecção do HPV por PCR, considerado "padrão ouro", em amostras cervicais, o peptideo PEP1 mostrou 95,65% de sensibilidade para detectar pacientes HPV, 71,11% de especificidade, 77,19% de PPV, 94,12% de NPV, 3,31 de PLR e 0,06 de NLR. Em amostras de saliva, o peptideo PEP1 foi capaz de detectar pacientes HPV positivos com sensibilidade de 96,3%, a especificidade de 71,79%, 70,27% de PPV, NPV de 96,55%, PLR de 3,41 e 0,05 de NLR.
[068] Tabela 1 : Desempenho diagnóstico da avaliação imunológica pelo peptideo mimotopo PEP1 na saliva e no fluido cervical comparados ao teste com a nested-multiplex PCR.
Figure imgf000027_0001
[069] Abreviaturas: IC, intervalo de confiança; PPV, valor preditivo positivo; NPV, valor preditivo negativo; RVP, razão de verossimilhança positiva; RVN, razão de verossimilhança negativa; P, probabilidade.
[070] Os pacientes foram estratificados de acordo com os resultados de genotipagem (nmPCR) em negativas, de baixo risco, alto risco e múltiplas infecções. De acordo com os resultados obtidos no exame citológico, os pacientes foram subdivididos em normal, normal com genotipagem positiva
(nmPCR +), ASCUS, CIN1, NIC2, NIC3, CCE (carcinoma de células escamosas) e outras doenças (DO). Nas amostras cervicais, o grupo OD incluiu 7 pacientes com infecção por vaginose (Gardnerella vaginallis), 3 candidiase (Candida albicans) e 1 HIV positivo, enquanto em amostras salivares continha 3 vaginose (Gardnerella vaginallis), 2 candidiase (Candida albicans), 2 HIV, 2 câncer (um pâncreas e outra leucemia mieloide aguda), 3 hanseniase (Mycobacteríum leprae), 1 leishmaniose (Leishmania sp.) e 1 toxoplasmose (Toxoplasma gondii); todos eles com papanicolau normal atual (Figura 4). RP (fago randômico) fago inespecifico usado como controle negativo do C.B1. Curiosamente, houve um aumento significativo na detecção de anticorpos anti-IgA C.B1 em pacientes genótipo-positivos, equivalente a p = 0,0002 (cervical) ep = 0,0028 (saliva) em baixo risco, e p <0,0001 em alto risco risco e múltiplos genótipos, em ambos os fluidos testados, mostrando perfil semelhante para detectar anticorpos cervicais e salivares (Figuras 4A-B). Com relação aos achados citológicos, nas amostras cervicais, podemos observar aumento significativo da detecção pelo mimético nos pacientes com NIC1 (p = 0,009) e NIC2 (p = 0,004) e aumento discreto nos pacientes sem alterações celulares causadas pelo HPV mas positivas ao nmPCR (Figura 4C). Por outro lado, as amostras de saliva apresentaram aumento significativo nos pacientes positivos para nmPCR (p 0,006) e ASCUS (p
0,0002), cujos resultados mostraram 100% de positividade para detecção de HPV-DNA, além disso, houve tendência de aumento nos pacientes classificados em CIN1 e CIN2 (Figura 4D).
EXEMPLO 2: Avaliação da especificidade dos novos peptídeos projetados e sintetizados a partir do fago C.B1 para detecção de IgA e correlação entre os fluidos cervical e salivar.
[071] Como exemplo, a reatividade cruzada do novo peptideo projetado e sintetizado a partir do fago C.B1 (PEP1) para anticorpos IgG, IgM e IgA foi testada em amostras cervical e saliva (Figura 5A) e em ambos os casos houve diferença significativa (p <0,01) entre os pacientes HPV e controles. Além disso, na detecção de anticorpos tipo IgA, os pacientes HPV permaneceram acima da linha de corte média (0,203) estabelecida anteriormente. Embora as amostras cervicais testadas com IgG tenham apresentado diferença estatística entre pacientes com e sem HPV, todas as amostras testadas para IgG e IgM foram posicionadas abaixo da linha de corte. Uma correlação linear positiva foi encontrada entre as amostras cervicais e de saliva (Figura 5B), com os coeficientes de correlação de Spearman de rs = 0,5959 (p <0,0001).
EXEMPLO 3: Validação do peptideo sintético como plataforma de diagnóstico do HPV
[072] Para avaliar o reconhecimento destes novos peptideos sintéticos (PEP1, PEP2, PEP3 e PEP4) a anticorpos
IgA presentes em amostras cervicais e de saliva, uma membrana de nitrocelulose foi cortada e fixada em dois papéis de filtro no aparato de dot blot. Aliquotas de 10pg total de VLPs da vacina quadrivalente Gardasil® (a), usado como controle positivo para detecção de HPV, bem como 10pg de cada peptideo (PEPP1 (b); PEP2 (c); PEP3 (d); e PEP4 (e)), foram transferidas para a membrana de nitrocelulose sob vácuo por 20 minutos (Figura 7A). Após lavagens a membrana foi corada com solução de Ponceau e cortada para incubar 4 tiras de um pool (n = 10) de amostras de swabs cervicais de pacientes com HPV positivo (1) e de indivíduos saudáveis com HPV negativo (2) e um pool de amostras de swabs de saliva de pacientes com HPV positivo (3) e de indivíduos saudáveis com HPV negativo (4). O pool de secreção cervical foi diluído na proporção de 1:20, enquanto o pool de saliva foi feito na concentração de 1:10, ambos em tampão de bloqueio. Os blots foram incubados durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação. As tiras foram lavadas 5 vezes e incubadas com anticorpo anti-IgA conjugado com HRP (1: 10000 em solução bloqueio) durante 1 h à temperatura ambiente sob agitação, enxugadas e os procedimentos de detecção foram realizados. Houve reconhecimento entre a vacina contra o HPV e os peptideos 1, 3 e 4 com anticorpos IgA do pool de HPV- positivos, em fluidos cervicais (diluição 1:20) e salivares (diluição 1:10). 0 peptideo 2 (PEP2), o único peptideo projetado e sintetizado com uma repetição da sequência do clone C.B1 mostrou uma capacidade inferior de detectar IgA em amostras positivas, apresentando uma linha muito discreta na FIGURA 7A para pacientes com HPV positivo (3). Em pool negativo, ambas as amostras cervical e salivar não apresentaram interação com os peptideos sintéticos testados, no entanto, houve marcação discreta da vacina, que contêm VLPs não purificadas, em pool de saliva negativo. Esses resultados indicam que pode ter ocorrido reatividade cruzada com outros componentes presentes na vacina, comumente usados em várias formulações de vacinas. Para validar os novos peptideos sintetizados como candidatos em um novo método de diagnóstico de HPV, de acesso simples e não invasivo, utilizamos os peptideos projetados e sintetizados como plataforma de detecção em amostras salivares. Como exemplo mostraremos os resultados do PEP1.
EXEMPLO 4 : Construção e análise do bioeletrodo [073] Para avaliar e validar a aplicabilidade dos peptideos miméticos selecionados neste trabalho, uma vez que os peptideos 1, 2, 3 e 4 demonstraram serem capazes de detectar IgA especifica para HPV em amostras de saliva e cervical positivas, os peptideos sintéticos projetados foram imobilizados em superfície de eletrodos, como por exemplo eletrodos de grafite, de ouro, de platina, de carbono vitreo, de pasta de carbono, eletrodos com material polimérico, eletrodos modificados (por exemplo: eletrodos de grfite modificados, podendo ser com nanomateriais, nanoparticulas metálicas, polímeros e etc.) dentro outros eletrodos modificados ou não conhecidos por um técnico no assunto. Nesse exemplo especifico foram usados eletrodos de grafite, para detecção de HPV em amostras de saliva (Figura 8). A titulo de exemplo, mostraremos aqui apenas os resultados dos testes com o PEP1 (SEQ ID N°01). Utilizou-se um pool de amostras de saliva (1:10 diluídas em tampão fosfato) de pacientes com infecção por HPV e indivíduos aparentemente saudáveis (controle negativo). Os estudos eletroquímicos foram realizados em um potenciostato (CH Instruments, EUA). Um disco de grafite (6,15 mm de diâmetro, pureza de 99,99%) da Alfa Aesar foi usado como eletrodo de trabalho. Placas de platina e prata/cloreto de prata (3,0 mol.L-1) foram utilizadas nesse exemplo como eletrodos auxiliar e de referência, respectivamente. Os eletrodos auxiliar e de referência podem também ser selecionados do grupo que consiste de: eletrodo de grafite, de ouro, de platina, de carbono vítreo, de pasta de carbono, eletrodo com material polimérico e eletrodo modificado. Nesse exemplo particular foram usados eletrodos de platina modificado compreendendo uma placa de platina e prata/cloreto de prata. Todas as soluções foram desoxigenadas por nitrogénio ultra puro borbulhando por pelo menos 45 minutos antes do uso. O eletrodo de grafite foi polido mecanicamente com pasta de alumina (0,3pm), sonicada, lavada com água desionizada, seca ao ar e pré-condicionada em solução de H2CIO40,5 mol.L-1 através de voltametria cíclica entre 0 e + 1,2V, por 4 ciclos, a uma taxa de varredura de 50 mV.s - 1. A solução contendo 1,5 pg.mL-l de sondas PEP1 foi depositada na superfície do eletrodo e seca a 37°C por 30 minutos, sendo este procedimento realizado duas vezes. Em seguida, os eletrodos foram imersos em solução de albumina de soro bovino a 0,5% (BSA), como agente de bloqueio a 37°C durante 1 h. As amostras negativas e positivas para HPV foram aplicadas ao eletrodo a 37°C, por 30 minutos. Após cada modificação, os eletrodos foram lavados com tampão fosfato (Na2HPC>4 0,061 mol.L-1, NafhPCh 0,039 mol.L-1, pH 7,4) por 5 segundos sob agitação para remover moléculas não ligadas e secas com nitrogénio ultra puro. A detecção foi realizada em solução de 10 mmol.L-1 K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 contendo 0,1 mol.L-1 KC1 Os resultados mostraram aumento nos valores atuais do par redox na presença de amostra positiva para HPV, indicando que a biomolécula alvo (IgA) interagiu com o eletrodo de grafite modificado com peptídeo (Figura 7B). Houve aumento significativo (p = 0,013) nos valores de densidade de carga do pico de oxidação de [Fe(CN)6]4 - / [Fe(CN)6] 3- na presença de amostras positivas em relação às amostras controle (Figura 7C).
Avaliação dos novos peptídeos sintetizados para uso no diagnóstico de HPV.
[074] Com todos os testes realizados, incluindo os que não foram aqui demonstrados, concluímos que dois clones de fago apresentaram alta reatividade e apresentaram melhores diferenças de sinal entre pacientes com HPV e indivíduos aparentemente saudáveis e contra o fago aleatório (p
<0,0001), os peptídeos oriundos do fago C.B1 e do A.D5 (SEQ ID No 5 e SEQ ID No 6). O peptídeo sintetizado a partir do fago C.B1, foi capaz de diferenciar amostras positivas e negativas com maior precisão e também por ter sido obtido a partir de uma estratégia de competição de VLPs contendo regiões altamente imunogênicas do HPV. Esta abordagem nos permitiu descobrir peptídeos derivados da biblioteca de peptídeos (C.B1 e A.D5) que cobrem regiões imunogênicas da proteína LI do HPV. As proteínas do capsídeo têm papel importante na resposta imune do hospedeiro, especialmente Ll, que possui epítopos conformacionais que levam à geração de anticorpos neutralizantes IgA e IgG em indivíduos infectados. Além disso, outra vantagem que os peptídeos selecionados poderiam oferecer seria a identificação de pacientes com diferentes tipos de HPV, em comparação com outras proteínas do papilomavírus ; as sequências de aminoácidos da maioria das porções de LI estão bem conservadas entre os tipos virais [(Buck C.B., et al. The papillomavirus major capsid protein LI. Virology. 2013; 445 (1-2):169-174); (Joyce JG, Tung JS, Przysiecki CT, Cook JC, Lehman ED, Sands JA, et al. The LI major capsid protein of human papillomavirus type 11 recombinant virus-like particles interacts with heparin and cell-surface glycosaminoglycans on human keratinocytes. J Biol Chem. 1999; 274(9):5810-5822)].
[075] Por exemplo, no alinhamento linear do peptídeo C.B1, houve resíduos de aminoácidos conservados e semi- conservados com proteína a proteína LI de HPV16 (71,4%), HPV18 (85,7%), HPV45 (85,7%), HPV31 (71,4%), HPV11 (57,1 %), HPV33 (57,1%) e HPV06 (42,8%). As regiões de epítopo de proteína foram previstas pelo modo Bepipred, que combinam a propriedade de hidrofilicidade de aminoácidos com um Modelo de Markov Oculta (HMM) para prever epítopos de células B. Neste trabalho, obtivemos todos os resíduos de aminoácidos (na posição 194-200) do peptídeo C.B1 com pontuações acima do limiar quando usamos a proteína LI de HPV16 como modelo, o que indica que o peptídeo tem potencial para induzir resposta imune humoral. A estrutura 3D do peptídeo C.B1 foi realizada por modelagem de homologia que foi amplamente utilizada em muitas áreas de análise e estudo baseados em estrutura. O servidor PDB foi usado para pesquisar as proteínas do HPV e descobriu que a estrutura do LI HPV16 (2R5H) foi o melhor modelo com a maior identidade. Além disso, a proteína LI do HPV16 foi analisada quanto às suas propriedades físico-químicas e estruturais-geométricas através do software Epitope Server, mostrando homologia principalmente nas regiões de antigenicidade média e alta. Os resíduos conservados e semi-conservados correspondentes ao peptídeo C.B1 representam um epítopo putativo da proteína LI que é conservado em diferentes tipos de HPV, o que provavelmente deu a este peptídeo a capacidade de ser reconhecido por IgA em fluidos mucosos de indivíduos infectados. Essa inferência pode ser justificada pelo fato de que resíduos semi-conservados de aminoácidos exibem propriedades físico-químicas semelhantes ao resíduo original, permitindo a ligação do anticorpo.
[076] No presente estudo, os peptídeos sintetizados a partir dos clones de fagos C.B1 e A.D5 foram capazes de detectar alto título de anticorpos IgA em amostras de HPV, discriminando significativamente fluidos positivos e negativos (p <0,01; amostras cervicais e de saliva), quando comparados às classes de anticorpos IgG e IgM. Este resultado indica que a estratégia de seleção dos fagos para amostras purificadas com IgA foi bem sucedida. Além disso, o PEP1 detectou anticorpos IgA significativamente nas amostras cervicais e de saliva de pacientes classificados como de baixo risco (p <0,001 e p <0,01, respectivamente), alto risco (p <0,0001; ambos) e infecção múltipla por HPV (p <0,0001; ambos); quando comparado ao controle negativo. Quando as amostras cervicais foram estratificadas nos achados citológicos, houve aumento significativo da NIC1 (p <0,01) e NIC2 (p <0,01) com tendência à diminuição das amostras de NIC 3 e câncer (CCS) em relação ao controle. Nas amostras de saliva, houve aumento significativo do ASCUS (p <0,01) e detecção de 66,7% de NIC1, 100% de NIC2 e 33% de NIC3. Esses resultados sugerem que, após a infecção pelo HPV, o nivel de anticorpos IgA locais (colo do útero) e sistémicos (saliva) aumenta, como tentativa de controlar a infecção; no entanto, com a progressão da doença e a manutenção virai, pode haver perda da resposta imune humoral. Estudos indicam que após a infecção natural, 70-80% dos indivíduos soroconverteram para respostas de anticorpos, em contraste, uma minoria estimada entre 10-20% não remove eficazmente o virus e mantém o DNA do HPV positivo com uma infecção virai persistente; esses indivíduos estão em risco de progressão para lesões pré- neoplásicas (NIC 2/3) e, portanto, de câncer invasivo.
[077] Outro dado relevante é que todos os pacientes diagnosticados com ASCUS (significância indeterminada) tinham presença de DNA do HPV e foram 100% detectados pelo peptideo mimotopo em ambos os casos, tanto de secreções cervicais como em saliva (p <0,01). Além disso, pacientes com resultados falso-negativos em esfregaços de Papanicolaou (nmPCR +) foram positivos em 86,6% de secreção cervical e
93,7% de saliva (p <0,001), através da detecção pelo PEP- C.B1 e baixa reatividade cruzada contra outros genitais e doenças infecciosas em ambos os fluidos. Esses resultados reforçam a necessidade de confirmar o diagnóstico citológico por outro método na triagem populacional do HPV, pois essas medidas podem refletir diretamente no manejo clinico e na estatística do câncer do colo do útero.
[078] Para validarmos uma nova plataforma de detecção de HPV, dos quatro novos peptídeos projetados e sintetizados, selecionamos os resultados obtidos com o peptídeo 1 (PEP1) para demonstrar como exemplo. O PEP1 apresenta design mais similar ao peptído mimotopo sintetizado PEP-C.B1 e foi usado os experimentos in vitro aqui mostrados como exemplo; mostrando reatividade positiva no ensaio de dot blot. Por fim, testamos um bioeletrodo em amostras de saliva, por ser não invasivo e de fácil obtenção. Nos últimos anos, pequenos peptídeos sintéticos que mimetizam ligantes a biomoléculas, como enzimas, anticorpos, receptores, proteínas transmembrana e transportadores, têm sido usados como elemento de reconhecimento biológico no desenvolvimento de biossensores com uma ampla variedade de analitos alvo [ (Scarano S, Vestri A, Ermini ML, Minunni M. SPR detection of human hepcidin-25: A criticai approach by immuno- and biomimetic-based biosensing. Biosens Bioelectron. 2013; 40 (1):135-140); (Choi, J.H., et ai. A novel Au-nanoparticle biosensor for the rapid and simple detection of PSA using a sequence-specific peptide cleavage reaction. Biosens Bioelectron. 2013; 49:415-419); (Pavan, S., et ai. Short peptides as biosensor transducers. Anal. Bioanal. Chem. 2012. p. 3055-3070)].As interações que ocorrem na superfície do eletrodo podem ser observadas através do monitoramento das alterações na transferência de elétrons de um sistema redox bem conhecido, [Fe(CN)6]4 - / [Fe(CN)6]3_. Este par redox foi utilizado para avaliar a interação do peptídeo com as amostras no transdutor por voltametria cíclica. Estudos mostram que alguns resíduos de aminoácidos presentes em proteínas possuem cadeias laterais aromáticas, que são suscetíveis à oxidação (Enache, T. a., et ai. Peptide methionine sulfoxide reductase A (MsrA): direct electrochemical oxidation on carbon electrodes. Bioelectrochemistry . 2013; 89:11-8). Esse aumento dos valores atuais observados após a interação do peptídeo com anticorpos presentes em uma amostra positiva, ocorreu devido à presença desses aminoácidos oxidáveis que estão interagindo com o mediador utilizado no sistema. Os resultados mostrados aqui como exemplo indicam que o PEP1 imobilizado na superfície da grafite foi capaz de discriminar amostras negativas e positivas. Indicando assim o potencial dos novos peptideos sintetizados aqui descritos de serem imobilizados na superfície de um eletrodo ou sensores eletroquímicos, para serem usados no diagnóstico de HPV. [079] Neste estudo, a infecção por HPV oral não foi testada e, portanto, sua influência nos dados aqui apresentados não é conhecida. Acreditamos que os espécimes salivares tenham desempenhado um papel significativo na detecção de anticorpos, provavelmente através da comunicação entre os diferentes compartimentos mucosos, porém estudos mais profundos ainda são necessários. O teste de fluidos orais é uma alternativa atraente para o diagnóstico, portanto, sua validação para a plataforma de bioeletrodos pode fornecer uma ferramenta útil como um co-teste para exames de Papanicolau na triagem de HPV da população.
[080] Em conclusão, os peptídeos miméticos selecionados por PD neste trabalho são capazes de detectar anticorpos IgA em amostras de saliva e cervical de pacientes HPV com alta sensibilidade e especificidade, podendo ser prontamente produzidos através de culturas bacterianas, e usados em vários ensaios, tais como ELISA, sensores eletroquímicos e muitos outros. No entanto, o mais relevante é a possibilidade de usar a saliva como aplicação direta em um teste simples de bioeletrodos, que pode ser usado para auxiliar o tratamento médico em pacientes com HPV.
EXEMPLO 5: Ensaio para avaliação de teste de diagnóstico de HPV. [081] Com objetivo de validar o novo teste diagnóstico que possibilite a detecção do HPV de forma menos onerosa que a genotipagem e significativamente mais eficaz que o exame de papanicolau, realizamos um ensaio de elisa baseado nos peptideos sintetizados do CB.1 (PEP1) ou AD.5 (PEP4) em amostras de saliva de pacientes HPV positivo e controles negativas.
[082] Amostras de saliva e amostra cervical utilizadas neste ensaio clinico foram obtidas de forma pareada de pacientes durante consulta médica. A espécimen da amostra cervical foi utilizada para avaliar por meio do exame de Papanicolau e por meio do padrão-ouro de genotipagem para HPV para confirmação do diagnóstico. Portanto, a classificação de amostras controles e doentes foi baseada em análises diagnóstica padrão-ouro de genotipagem.
[083] Adicionalmente, também foi realizada a comparação da acurácia, sensibilidade e especificidade entre os testes de diagnóstico salivar baseados no elisa dos peptideo sintetizados do CB.1 (PEP1) ou AD.5 (PEP4) em comparação ao teste de triagem Papanicolau.
[084] Placas de ELISA com 96 poços de alta ligação (MaxisorpTM, NUNC; USA) foram sensibilizadas a 1,0 mg/poço de cada peptideo, bem como do total de VLPs contidos na vacina comercial (VC) Gardasil® (Merck;USA). Após a incubação, a reação foi bloqueada com 5% de PBS-BSA e amostras de saliva (diluição de 1:10) foram adicionadas e incubadas a 3°C durante lh. Em seguida, as amostras foram lavadas 5x em tampão de lavagem (PBS com 0,05% de Tween20).
A placa foi incubada lh a 37°C com o anticorpo de detecção, anticorpo anti-IgA (Kirkegaard & Perry Laboratories-KPL, USA) diluído a 1:5.000 em tampão de bloqueio. Ao final da incubação, os poços foram lavados 5x e revelados com OPD SigmaFastTM (Sigma-Aldrich; USA). A leitura das absorbâncias foi realizada em espectrofotômetro de microplacas a 492nm. [085] Os peptideos sintetizados a partir do fago do CB.1
(PEP1) ou AD.5 (PEP4) foram capazes de discriminar eficientemente (p <0,0001) pacientes com HPV (positivo) e controles (negativos) (Figura 9A e 9C, respectivamente). Adicionalmente, a análise das curvas ROC (Receiver Operator
Charactheristic) que indicam a sensibilidade e especificidade dos testes de diagnóstico salivar baseado nos peptideos sintetizados do CB.1 (PEP1) ou AD.5 (PEP4) foram significativas (p <0,0001). Especificamente a Curva ROC baseada em peptideos do C.B1 (PEP1) apresentou sensibilidade de 94% e especificidade de 64% (Figura 9B). Adicionalmete, a Curva ROC baseada em peptideos do A.D5 (PEP4) apresentou sensibilidade de 85% e especificidade de 50% (Figura 9C). [086] Neste contexto, foi possível observar que ambos os peptideos sintetizados do CB .1 (PEP1) ou AD.5 (PEP4) apresentaram acurácia adequada para aplicação em testes de diagnóstico. Em uma população com coletas pareadas de 148 mulheres, o teste de genotipagem de HPV indicou 65 pacientes com HPV positivo. Destas 65 pacientes, o teste de Papanicolau indicou 24 pacientes positivas enquanto o teste de detecção por saliva baseado no C.B1 (PEP1) indicou 61 pacientes com positivas em concordância com a genotipagem.
Avaliação do Potencial Vacinai dos novos peptídeos sintetizados .
[087] Os peptídeos sintéticos PEP1, PEP2, PEP3 e PEP4, miméticos a epítopos da proteína LI do HPV, foram projetados e sintetizados a partir de clones de fagos selecionados por Phage Display como demonstrado acima. Através de análises de viabilidade celular (MTT), três peptídeos foram escolhidos para avaliação do potencial vacinai para o HPV. Os peptídeos PEP1, PEP3 e PEP4 foram submetidos a análises in silico (predição de estruturas 3D como mostrado acima e nas Figuras 6A-C), in vivo (imunização em camundongos fêmeas BALB/c) e in vitro (ELISA, Cultura de esplenócitos, CBA, Ensaio de Neutralização).
EXEMPLO 6: Ensaio de Viabilidade celular (MTT) e Formulações vacinais
[088] Para avaliar possíveis efeitos citotóxicos dos peptídeos sintetizados e determinar as concentrações ideais das formulações vacinais, utilizou-se o método colorimétrico de viabilidade celular MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil- tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (Figura 10A-D). Para tanto, 5xl05 células de uma linhagem de macrófago murinho (J774-A1) foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços, em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 0,1% de antibiótico gentamicina. As células foram incubadas a 37°C em estufa umidifiçada contendo 95% de ar e 5% de CO2, durante 4 horas para aderência celular. Após este período, adicionou-se os peptídeos (PEP1, PEP2, PEP3 e PEP4) nas concentrações de 1 mM, 10 mM, 20 mM e 30 mM. Ao fim da incubação de 24h com os peptídeos, foi acrescentado 10 pL de MTT aos poços de cultivo celular, na concentração de 5 mg.mL-1. Em seguida, a placa foi mantida na estufa, sob as mesmas condições já descritas, durante 4 horas. Por conseguinte, adicionou-se 50 pL de SDS (Sódio Dodecil Sulfato) a 10% e a placa foi mantida na estufa a 37°C, durante 16h. A absorbância foi obtida em leitora de microplacas a 590 nm. Todos os tratamentos foram realizados em triplicatas.
[089] Os resultados mostraram diminuição na viabilidade celular em concentrações acima de 10 pM, sobretudo para o peptídeo 2 (Figura 10b), sendo esta concentração selecionada para as formulações vacinais. Como o PEP2 revelou grande diferença estatística em doses acima de 10 mM (p<0,0001) quando comparadas ao controle, bem como redução de mais de
50% da viabilidade celular, optamos por exclui-lo dos ensaios in vivo subsequentes.
Exemplo 7: Imunização animal e Espécimes coletadas
[090] Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com os princípios éticos da Academia Brasileira de Experimentação Animal e foi aprovado pelo Comité de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Uberlândia, sob o protocolo número 001/15. Os experimentos foram realizados em camundongos fêmeas BALB/c, com idades de 4-6 semanas. Três peptídeos sintetizados foram selecionados para as formulações vacinais: o peptídeo 1 (PEP1), o peptídeo quimérico 3 (PEP3) e o peptídeo 4 (PEP4). As formulações vacinais compreenderam ao menos um dos peptídeos sintetizados e ao menos um veículo, carreador e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A vacina comercial quadrivalente (Gardasil®, Merck; USA), que contém VLPs (Virus-like particles) recombinantes montados a partir das proteínas LI dos tipos de HPV 6, 11, 16 e 18, foi usada como controle positivo da imunização. Os camundongos foram divididos em seis grupos de cinco animais cada. As imunizações foram realizadas com 10 mM do PEP1 (grupo Gl), 10 mM do PEP3 (grupo G2), bem como 10 mM do PEP4 (grupo G3); todos administrados em formulações compreendendo ao menos metade do volume de um adjuvante farmaceuticamente aceitável, na proporção 1:1 (por exemplo: nesse caso, uma suspenção de hidróxido de alumínio a 2%, conhecido por Alúmen - InvivoGen; USA - foi usada como adjuvante). O quarto grupo de animais representou o grupo controle (G4), o qual foi administrado apenas o tampão fosfato salina (PBS) estéril. No grupo controle de adjuvante (G5) foi injetado uma mistura de PBS e adjuvante, na mesma proporção das formulações vacinais. Ainda, um grupo controle positivo (G6) de imunização contra o HPV foi avaliado, administrando-se 10,5 pg do total de VLPs contidos na vacina comercial disponível em adição ao adjuvante usado nas formulações vacinais formuladas com os peptideos sintetizados, dentro das mesmas proporções. A quantidade de VLP utilizada no estudo foi determinada de acordo com a literatura [(Schellenbacher C, et al. 2009. Chimeric L1-L2 virus-like particles as potential broad-spectrum human papillomavirus vaccines. J Virol 1283:10085-10095); (Thõnes N, Herreiner A, Schãdlich L, Piuko K, MUller M. 2008. A direct comparison of human papillomavirus type 16 LI particles reveals a lower immunogenicity of capsomeres than viruslike particles with respect to the induced antibody response. J Virol 82:5472- 5485)].
[091] As formulações vacinais foram administradas por via subcutânea (dorsal), em quatro doses, com intervalo de 15 dias entre cada dose. Antes de cada imunização, amostras de sangue via plexo retro-orbital e lavado vaginal foram coletadas para a avaliação da resposta imune humoral. O lavado vaginal foi obtido por pipetagem com 100 pL de PBS estéril, no canal vaginal das fêmeas. Duas semanas após a última imunização os animais foram eutanasiados e, além do sangue e do lavado vaginal, o baço foi removido assepticamente, para cultura de esplenócitos e análise da resposta imune celular por CBA.
EXEMPLO 8: Detecgão de Anticorpos IgG e IgA por ELISA [092] Os níveis dos anticorpos IgG no soro e IgA no lavado vaginal foram determinados por ELISA indireto. Os títulos de anticorpos IgG específicos aos peptídeos e ao controle positivo (G6) (vacina Gardasil®, Merck; USA) utilizados nas imunizações estão apresentados na Figura 11. [093] Placas de ELISA com 96 poços de alta ligação foram sensibilizadas a 1,5 mg/poço de cada peptideo, bem como do total de VLPs contidos na vacina comercial (VC) Gardasil®. A reatividade inespecifica contra o BSA (1,5 mg/poço) também foi avaliada(dados não apresentados). Após a incubação, a reação foi bloqueada com 5% de PBS-BSA e amostras de soro (diluição de 1:10) e lavado vaginal (diluição de 1:5) foram adicionadas e incubadas a 37°C durante lh. Em seguida, as amostras foram lavadas 3x em tampão de lavagem (PBS com 0,05% de Tween20) e incubadas lh a 37°C com os respectivos anticorpos de detecção, ambos diluídos a 1:5.000 em tampão de bloqueio. Em amostras de soro, utilizou-se o anticorpo anti-IgG, enquanto que as amostras do lavado vaginal foram testadas com o anticorpo anti-IgA, ambos específicos para camundongos e marcados com peroxidase.Ao final da incubação, os poços foram lavados 5x e revelados com OPD. A leitura das absorbâncias foi realizada em espectrofotômetro de microplacas a 492nm.
[094] Conforme esperado, anticorpos de animais imunizados com o peptídeo quimérico PEP3 (G2) mostraram crescente e significante reconhecimento de todos os peptídeos testados após a segunda dose da formulação vacinai (p<0,0001; e p<0,001 no dia 30 ao ser testado contra o PEP4), quando comparados ao grupo controle (PBS - G4). Entretanto, este grupo não foi capaz de reconhecer VLPs presentes no grupo controle positivo (G6). Como os peptídeos sintetizados apresentam motivos miméticos a regiões de epítopo da proteína LI do HPV, a indução de anticorpos com especificidade para a proteína íntegra pode ser limitada. Por outro lado, a resposta imune a patógenos é naturalmente direcionada à epítopos imunodominantes. Estes resultados são corroborados por Riddell et ai. (Riddell MA, et ai. 2000. Identification of immunodominant and conformational epitopes in the capsid protein of hepatitis E vírus by using monoclonal antibodies. J Virol 74:8011-8017) que avaliaram diferentes resíduos de aminoácidos da proteína do capsídeo do vírus da hepatite E, inferindo que epítopos imunodominantes do cápsideo podem apresentar respostas diferenciadas de anticorpos, porém importantes na geração de imunidade protetora à infecção. Os grupos de animais imunizados com os peptideos PEP1 (Gl) e PEP4 (G3) também apresentaram resposta, no entanto a mesma foi menos pronunciada na indução de anticorpos IgG, quando comparada com o PEP3 (G2).
[095] Intrigantemente, após as imunizações houve aumento da produção de anticorpos IgA na mucosa vaginal em todos os animais tratados com os peptideos sintetizados, sobretudo após o último ciclo de vacinação (Figuras 11A-C), de modo contrário, não houve expressão de anticorpos IgA específicos a vacina comercial usada no grupo controle positivo (G6) (Figura 12d).
[096] Embora não tenha ocorrido aumento significante, os gráficos lineares (Figura 12e-h) demonstraram que os grupos imunizados com os peptideos PEP1 e PEP3 tenderam a produzir mais anticorpos IgA na mucosa vaginal que os demais grupos avaliados. Por outro lado, não houve detecção de anticorpos IgA específicos à vacina comercial na mucosa vaginal, nem mesmo no grupo controle positivo (G6). A produção de IgA secretora na mucosa vaginal durante a infecção natural é baixa e ocorre a longo prazo, porém esses anticorpos podem impedir sucessivas reinfecções.
[097] Embora todos os peptideos sintetizados tenham apresentado resultados promissores, indicando que os mesmos possuem potencial para ativação da imunidade humoral local e sistémica, acreditamos que o peptideo sintetizado PEP3 seja o candidato com maior potencial em induzir uma proteção semelhante a infecção natural, com produção de anticorpos IgG e IgA locais e sistémicos.
[098] Estes achados são confirmados nos estudos acima que demonstraram o potencial de uso no diagnóstico de HPV, onde estes peptideos mimotopos foram capazes de reconhecer IgA presentes em secreções corporais, mais particularmente salivar e cervical, de pacientes infectadas por HPV.
EXEMPLO 9: Cultura de Esplenócitos e CRA [099] A fim de avaliar a influência das diferentes formulações vacinais sobre a resposta imune celular, os baços de todos os animais foram removidos e macerados para a obtenção dos esplenócitos. Após a maceração do orgão, os esplenócitos dos animais do mesmo grupo foram unidos em um pool e mantidos em cultura para a avaliação do perfil de resposta imune celular.
[0100] A concentração das células de cada grupo foi ajustada para 5xl05/poço e adicionadas em placas para cultura celular de 96 poços. As células foram então tratadas com os seguintes estímulos: 10 mM do PEP1 (Gl), PEP3 (G2) e PEP4 (G3); e 10,5 mm da vacina comercial (VC) (G6); todos avaliados individualmente. A concanalina A (ConA; 2,5 mg/poço) foi usada como um controle da reação (dados não mostrados) . Células não tratadas também foram avaliadas (NT)
(PBS; G4) e controle de adjuvante (Alúmen; G5) (Figura 13). [0101] Todos os estímulos e controles foram realizados em quadriplicatas . Por fim, a cultura foi incubada a 37°C em estufa umidificada contendo 95% de ar e 5% de CO2 pelo período de 72h. Ao final da cultura dos esplenócitos, o sobrenadante foi coletado para a dosagem das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IFN-g, TNF-a, IL-17A e IL-10, por citometria de fluxo utilizando o kit BD™ Cytometric Bead Array (CBA; USA) Mouse Thl, Th2 e T17. Em resumo, os sobrenadantes e os padrões de citocinas do kit foram incubados com uma mistura de microesferas de captura recobertas com anticorpos específicos para cada citocina, e com anticorpo de detecção marcado com ficoeritrina (PE). Após as incubações, foi acrescentado 500 pL da solução de lavagem e o material foi centrifugado a 200g, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as amostras foram ressuspendidas em 100 pL da solução de lavagem para posterior leitura em citômetro de fluxo. Os resultados obtidos foram analisados utilizando o Software FCAP Array™, por meio da obtenção de curvas de calibração obtidas dos padrões do kit, sendo a concentração dos analitos na amostra determinada em pg/mL.
[0102] O mitógeno ConA foi usado apenas como controle positivo do ensaio e, sob seu estímulo, a cultura celular de todos os grupos de animais produziu citocinas, confirmando a confiabilidade do experimento in vitro (dados não mostrados) .
[0103] As citocinas representam um grupo de moléculas envolvidas na inflamação, imunidade, defesa e modulação do sistema imune à infecção pelo HPV. No presente estudo, nós avaliamos o potencial dos peptideos sintetizados em induzir citocinas pró- (TNF- , IFN-g, IL-17A, IL-6, IL-2) ou anti- inflamatórias (IL-4 e IL-10), após as imunizações. Devido os níveis indetectáveis de expressão da IL-4 em todos os grupos de animais, essa citocina não foi representada nos gráficos. Todas as análises estatísticas foram realizadas em relação ao grupo controle PBS (G4). Cada estímulo celular (NT, PEP1, PEP3, PEP4 e VC) foi avaliado individualmente.
[0104] O grupo G1 (imunizado com o PEP1) não apresentou diferença significante para o TNF-a em nenhum dos estímulos avaliados, porém percebe-se que houve um pequeno aumento entre as células não estimuladas (NT) e os peptideos, em especial o PEP3, que provavelmente atua de maneira sinérgica visto que é um peptídeo quimérico desenhado com motivos do PEP1 e do PEP4. Em relação às citocinas inflamatórias IFN- Y, IL-17A e IL-2; o G1 não foi capaz de gerar resposta, entretanto, quando estimulado com a VC houve aumento da produção de IL-17A.
[0105] A IL-10 foi significantemente expressa quando estimulada pelo PEP1 (p<0,05) e PEP3 (p<0,001). Curiosamente, a IL-6 foi produzida sob os estímulos do PEP3 e PEP4, e aumentou significativamente (p<0,0001) quando estimulada pela VC, apresentando um efeito semelhante ao grupo imunizado com a VC (G6).
[0106] A IL-6 é uma citocina que influencia respostas imunes antígeno-específicas e reações inflamatórias, sendo considerada um dos principais mediadores da fase aguda da inflamação. Essa citocina possui papel importante no balanço das respostas Thl/Th2, promovendo diferenciação para células Th2 efetoras quando dependente de IL-4 e polarização para Thl via sinalização de IFN-g. Estudos sugerem que células de carcinoma cervical podem escapar dos mecanismos de defesa do hospedeiro através da downregulation do receptor da IL-6, indicando sua importância em induzir respostas contra a infecção por HPV.
[0107] O grupo G2 (imunizado com o PEP3) manteve um padrão de resposta significantemente aumentado (p<0,0001) para o TNF-a quando avaliado sem estímulo e sob todos os tratamentos de peptídeos. Embora tenha diminuído a expressão do TNF- no tratamento com a VC, ainda assim, houve aumento significante (p<0,05), indicando que essas células possuem potencial de resposta inflamatória mesmo frente a proteína íntegra do HPV e que a imunização com o PEP3 foi capaz de gerar um "status" inflamatório, já que as células mesmo sem estímulo in vitro produziram TNF- significativamente. [0108] O TNF-a é uma citocina multifuncional na resposta do hospedeiro à inflamação e na defesa contra as infecções virais e bacterianas. Essa citocina é capaz diminuir a expressão dos oncogenes E6 e E7, induzir a apoptose e impedir o crescimento de células infectadas por HPV, além de estimular e mediar respostas de quimiocinas e outros agentes inflamatórios .
[0109] O IFN-g e a IL-17A, no grupo G2, apresentaram o mesmo padrão de resposta, com significante aumento (p<0,0001 e p<0,01, respectivamente) da produção de citocinas no estado NT e diminuição frente aos estímulos, sendo que o IFN-g ainda se manteve significante quando estimulado por PEP1 (p<0,01) e PEP3 (p<0,05). Um efeito contrário pode ser observado com a citocina anti-inflamatória IL-10, que teve uma pequena expressão nas células não tratadas e elevação após os estímulos PEP1 (p<0,05), PEP3 (p<0,001) e PEP4. Sabe-se que a citocina IL-10 é capaz de modular respostas imunes ín vitro e ín vivo, gerando down-regulation em citocinas inflamatórias como IFN-g e IL-17. Esse mecanismo regulatório pode justificar a diminuição das respostas do IFN-g e da IL- 17A frente aos estímulos, quando comparados à expressão NT. A IL-6 teve significante aumento (p<0,0001) quando não tratada e sob estímulo de todos os peptídeos, sobretudo o
PEP3, e embora tenha diminuído quando estimulada com a VC, ainda assim apresentou significante produção (p<0,05). Interessantemente, houve importante elevação (p<0,0001) da produção de IL-2 com manutenção dos níveis frente todos os estímulos. Estes resultados sugerem que as imunizações com os peptídeos sintetizados, particularmente com o peptídeo quimérico PEP3, induziram um status inflamatório nas células imunes, possibilitando mecanismos de resposta celular com desvio para o perfil Thl, criticamente importante para a proteção contra o HPV. O grupo G3 (imunizado com o PEP4) apresentou discreto aumento de TNF- apenas quando estimulado pelo PEP3. Além disso, houve importante expressão de IL-17A quando as células não foram tratadas (p<0,01) e estímulo da VC (p<0,01) e ligeiro aumento de IL-6 sob tratamentos com o PEP3 e PEP4. De fato, o PEP4 foi o peptídeo sintetizado que menos gerou respostas imunes relevantemente protetoras à infecção por HPV. Os resultados de bioinformática revelaram que a região mimética ao peptídeo é menos exposta, o que pode justificar um pouco esse resultado menor quando comparado com os outros peptídeos. Contudo, o peptídeo quimérico que apresenta motivos do PEP1 e PEP4 parece agir de maneira sinérgica, indicando que, embora o PEP4 esteja em uma região de difícil acesso para a geração de resposta imune, trata-se de uma região importante para a indução de imunidade ao HPV.
[0110] Os animais imunizados com a vacina quadrivalente comercial (VC) do HPV, grupo G6, apresentaram significante aumento das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-6
(p<0,0001 para ambas) após estimulo in vitro com a própria vacina e discreto aumento de ambos na presença dos peptideos. As citocinas IL-17A e IL-2 tiveram respostas semelhantes, com produção significante (p<0,0001 para ambas) apenas quando tratadas com a VC. O IFN-g não foi suficientemente produzido no grupo G6, porém possui papel crucial na regulação de quase todas as fases das respostas imunitárias e inflamatórias, sendo importante para a manutenção do perfil Thl que confere proteção contra as infecções virais. Por outro lado, houve alta expressão da IL-10 (p<0,0001) sob estimulo da VC. A IL-10 é uma citocina pleiotrópica capaz de inibir a síntese de outras citocinas, especialmente o IFN- Y, além de impedir a proliferação de células Thl, mas é capaz de manter o desenvolvimento de respostas Th2, importantes para a produção de anticorpos. Possivelmente, houve uma prevalência do perfil Th2 e conseguinte inibição de IFN-g após a imunização com a vacina comercial.
[0111] O principal mecanismo envolvido na resposta imune contra a infecção pelo HPV parece ser a resposta celular adaptativa. Estudos observaram uma importante correlação entre o aumento do infiltrado de linfócitos T (CD4+ e CD8+) e macrófagos e a regressão espontânea de verrugas genitais.
Este infiltrado teria um importante papel no combate à infecção por secretar citocinas pró-inflamatórias como IL- 12, IFN-g e TNF-a, demonstrando predomínio de reposta do tipo Thl. Por outro lado, indivíduos imunodeprimidos (HIV positivos ou transplantados) apresentam maior risco de infecção por HPV e progressão para as malignidades associadas ao vírus.
[0112] Nossos resultados sugerem que os peptídeos sintetizados são capazes de imunomodular respostas celulares a um perfil Thl e, ainda, sensibilizam células imunes a um status inflamatório propício para atuação antiviral.
[0113] Em resumo, demonstramos que os peptídeos sintetizados, miméticos da proteína LI do HPV, são capazes de detectar anticorpos IgA em amostras de fluidos corporais de pacientes com HPV. Os peptídeos sintetizados também foram capazes de eliciar respostas imunes humorais séricas (IgG) e de mucosa vaginal (IgA) ín vivo. Além disso, os referidos peptídeos induziram importante resposta imune celular com upregulation de citocinas pró-inflamatórias e desvio para um perfil Thl. Curiosamente, o peptídeo quimérico (PEP3) parece atuar de forma sinérgica, potencializando respostas humorais e celulares, com possível produção de anticorpos neutralizantes para o HPV-16, indicando uma aplicabilidade profilática mais atrativa.
[0114] Portanto, o presente pedido de patente descreve
Peptídeos sintéticos miméticos a proteína LI do HPV que compreendem uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N° 01, SEQ ID N° 02, SEQ ID N° 03, SEQ ID N- 04, SEQ ID N° 05 e SEQ ID N° 06, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com umas das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N° 01, SEQ ID N° 02, SEQ ID N° 03, SEQ ID N- 04 , SEQ ID N- 05 e SEQ ID N° 06. Em que o peptideo sintético é para uso em um método de diagnóstico do HPV ou para uso no tratamento e/ou profilaxia de HPV.
[0115] Descreve composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um dos peptideos sintéticos tal como descritos no presente pedido, e pelo menos um veiculo, carreador, adjuvante e/ou composto farmacêuticamente aceitável. Em que a composição farmacêutica é uma vacina e pode compreender adicionalmente uma solução de hidróxido de alumínio como adjuvante. A referida composição farmacêutica sendo para uso no tratamento e/ou profilaxia do HPV.
[0116] Descreve o uso de ao menos um dos peptideos sintéticos descritos no presente pedido ou da composição farmacêutica descrita no presente pedido para a preparação de uma composição imunogênica ou vacina para uso no tratamento e/ou profilaxia do HPV.
[0117] Descreve o uso de ao menos um dos peptideos sintéticos descritos no presente pedido em um método de diagnóstico do HPV.
[0118] Descreve um método de diagnóstico de HPV em que compreende as etapas de:
- preparar a amostra biológica, em que a amostra biológica é preferencialmente um fluido corporal; colocar a amostra em contato com ao menos um dos peptideos sintetizados tal como definidos na reivindicação 1; e
- ler o resultado.
[0119] O referido método pode ser usado como um ensaio de ELISA ou como um ensaio de detecção eletroquímica.
[0120] O ensaio de detecção eletroquímica compreende:
- preparação de um bioeletrodo; incorporação ou imobilização de ao menos um dos peptideos sintéticos tal como definidos na reivindicação 1 no referido bioeletrodo;
- preparação do bioeletrodo com o peptído incorporado ou imobilizado para receber a amostra biológica; preparação para leitura do conjunto bioeletrodo, peptídeo sintético imobilizado e amostra biológica;
- leitura do resultado.
[0121] Em que o bioeletrodo é um eletrodo de grafite e que o método compreende ainda eletrodos auxiliares e/ou de referência, mas particularmente em que tais eletrodos compreendem uma placa de platina e prata/cloreto de prata.
[0122] Descreve um sistema de diagnóstico de HPV por detecção eletroquímica em que que compreende ao menos um eletrodo e ao menos um dos peptideos sintéticos tal como descritos no presente pedido. Em que o eletrodo é um eletrodo de grafite e em que o mesmo compreende ao menos um dos peptideos sintéticos tal como definidos na reivindicação 1 incoporados ou imobilizados na sua superfície.
[0123] O sistema ainda compreende eletrodos auxiliares e/ou de referência, mas particularmente em que tais eletrodos compreendem uma placa de platina e prata/cloreto de prata, bem como ainda compreende um potenciostato ou aparelho similar para leitura do resultado.
[0124] Descreve um método de tratamento e/ou profilático de HPV em que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptideos sintéticos tal como descritos no presente pedido ou uma composição farmacêutica tal como descrita no presente pedido.
[0125] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a título de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.
[0126] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente ivenção, equivalentes aos peptideos sintéticos, composições ou usos aqui descritos, sem se distanciar do escopo da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1- Peptideo sintético mimético a proteína LI do HPV caracterizado pelo fato de que compreende uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N- 01, SEQ ID N- 02, SEQ ID N° 03, SEQ ID N° 04, SEQ ID N° 05 e SEQ ID N- 06, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade ou similaridade com umas das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N³ 01, SEQ ID N- 02, SEQ ID N° 03, SEQ ID N° 04 , SEQ ID N° 05 e SEQ ID N- 06.
2- Peptideo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de diagnóstico do HPV.
3- Peptideo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou profilaxia de HPV.
4- Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos peptídeos sintéticos tal como descritos na reivindicação 1, e pelo menos um veículo, carreador, adjuvante e/ou composto farmacêuticamente aceitável.
5- Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato de que é uma vacina.
6- Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende uma solução de hidróxido de alumínio como adjuvante.
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) 7- Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento e/ou profilaxia do HPV.
8- Uso de ao menos um dos peptideos sintéticos tal como descritos na reivindicação 1 ou da composição farmacêutica tal como descrita em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição imunogênica ou vacina para uso no tratamento e/ou profilaxia do HPV.
9- Uso de ao menos um dos peptideos sintéticos tal como descritos na reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que é em um método de diagnóstico do HPV.
10- Método de diagnóstico de HPV caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: preparar a amostra biológica, em que a amostra biológica é preferencialmente um fluido corporal;
- colocar a amostra em contato com ao menos um dos peptideos sintetizados tal como definidos na reivindicação 1; e
- ler o resultado.
11- Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido método pode ser usado como um ensaio de ELISA ou como um ensaio de detecção eletroquimica.
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) 12- Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação
11, caracterizado pelo fato de que o ensaio de detecção eletroquímica compreende:
- preparação de um bioeletrodo em que compreende a incorporação ou imobilização de ao menos um dos peptideos sintéticos tal como definidos na reivindicação 1 em um eletrodo;
- preparação do bioeletrodo, com o peptido incorporado ou imobilizado, para receber a amostra biológica; preparação para leitura do conjunto bioeletrodo, peptideo sintético imobilizado e amostra biológica;
- leitura do resultado.
13- Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação
12, caracterizado pelo fato de que o eletrodo é um eletrodo selecionado do grupo que consiste de: eletrodo de grafite, de ouro, de platina, de carbono vítreo, de pasta de carbono, eletrodo com material polimérico e eletrodo modificado.
14- Método de diagnóstico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda eletrodos auxiliares e/ou de referência, particularmente em que tais eletrodos são selecionados do grupo que consiste de: eletrodo de grafite, de ouro, de platina, de carbono vítreo, de pasta de carbono, eletrodo com material polimérico e eletrodo modificado, mais particularmente em que o eletrodo é um eletrodo de platina modificado compreendendo uma placa de platina e prata/cloreto de prata.
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) 15- Sistema de diagnóstico de HPV por detecção eletroquímica, caracterizado pelo fato de que compreende um bioeletrodo em que compreende ao menos um eletrodo e ao menos um dos peptideos sintéticos tal como definidos na reivindicação 1.
16- Sistema de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o eletrodo é um eletrodo selecionado do grupo que consiste de: eletrodo de grafite, de ouro, de platina, de carbono vítreo, de pasta de carbono, eletrodo com material polimérico e eletrodo modificado, em que o mesmo compreende ao menos um dos peptideos sintéticos tal como definidos na reivindicação 1 incoporados ou imobilizados na sua superfície.
17- Sistema de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que ainda compreende eletrodos auxiliares e/ou de referência, particularmente em que tais eletrodos são selecionados do grupo que consiste de: eletrodo de grafite, de ouro, de platina, de carbono vítreo, de pasta de carbono, eletrodo com material polimérico e eletrodo modificado, mais particularmente em que o eletrodo é um eletrodo de platina modificado compreendendo uma placa de platina e prata/cloreto de prata.
18- Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um potenciostato para leitura do resultado.
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) 19- Método de tratamento e/ou profilático de HPV, caracterizada pelo fato de que compreende administrar em um indivíduo uma dose farmaceuticamente efetiva de pelo menos um dos peptídeos sintéticos tal como descritona reivindicação 1 ou uma composição farmacêutica tal como descrita em qualquer uma das reivindicações 4 a 7.
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
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