CN1656234A - 包囊化核酸扩增反应混合物的微胶囊及其作为反应隔间进行平行反应的用途 - Google Patents

包囊化核酸扩增反应混合物的微胶囊及其作为反应隔间进行平行反应的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对低分子量分子具有高通透性和对高分子量分子无通透性的微胶囊，微胶囊可用来包囊化核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物，微胶囊能提供隔间进行核酸扩增，特别是聚合酶链反应。本发明还涉及用这样的胶囊进行平行的聚合酶链反应，筛选，构建DNA文库和测序。

Description

包囊化核酸扩增反应混合物的微胶囊及其作为 反应隔间进行平行反应的用途
本发明是利用微胶囊的受控通透性来包囊化核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物，并提供一个隔间来进行核酸聚合和/或扩增，特别是聚合酶链反应。在核酸进行聚合和/或扩增期间，特别是聚合酶链反应反应期间，高分子量的核酸产物，特别是聚合酶链反应产物会被积聚在包含了聚合酶和合适的模板的胶囊内层，同时在反应期间低分子量的底物分子，特别是dNTP和/或ddNTP，会从胶囊外面渗入胶囊内部。本发明也描述了将核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物包囊化入微胶囊内和应用这些胶囊来进行多重核酸聚合和/或扩增，特别是聚合酶链反应。所述的胶囊产生了独立的隔间来进行各个分开的核酸聚合和/或扩增反应，特别是聚合酶链反应。此外本发明亦描述如何检测、分离和分析一个包囊化了核酸产物的胶囊，特别是包囊化了聚合酶链反应产物的胶囊。本发明还提供了应用多重核酸聚合和/或扩增的例子，特别是用于分析目的的聚合酶链反应。
在现有技术中，聚合酶链反应是在反应管或微滴定板或在玻璃毛细管里进行。反应管内的反应容量变化为50到200微升，而在微滴定板内则为10到100微升，使用Roche(LightCycler)最新和最先进的PCR cycler，玻璃毛细管里反应容量则小于20微升。利用反应管进行平行的聚合酶链反应被局限于大约48个反应，而用高密度微滴定板为96至少于2000个反应，玻璃毛细管利用仪器亦可进行96个平行反应。但这数目对于进行筛选项目来说仍然太小，例如在合理的时间内进行药物学研究。最新的PCR cycler型号(即Roche LightCycler)好处是它们能进行实时聚合酶链反应，在实时聚合酶链反应中，可知道每一个实时反应所生成的聚合酶链反应混合物和序列的结果。在当前的聚合酶链反应技术至，每个聚合酶链反应是由反应管或板孔或毛细管分开，这些毛细管或板孔是由塑料器皿(PS或PP)或玻璃制成。为进行大量平行的反应，整合密度必须增加并且反应容量必须减少，以当前的技术来增加聚合酶链反应的数量难以有成功的机会。每块标准格式的微滴定板最多已有1539个板孔。此外，装入如此大量的板孔亦成为一个重要的问题。
使用现有技术水平，聚合酶链反应设备每次只有大约48到1539聚合酶链反应能平行的进行。特别的仪器能够处理超过一块的聚合酶链反应微滴定板，从而增加通量，但是，这种增加只能是大约一个数量级而且仪器需要更大的实验室空间。
T.Oberholzer等，在化学及生物(Chemistry & Biology)，2(1995)，677-682已描述在一个脂质体(liposome)里进行聚合酶链反应，但是，脂质体对于聚合酶链反应混合物是非通透性的，所以所有的聚合酶链反应混合物必须在最初存在脂质体中，但这样会大大地局限实际的用途。
所以，本发明的目标是提供一个改进的核酸扩增的过程，特别是，提供一个能够平行进行大量平行核酸扩增的过程。
此目标可根据本发明通过一种核酸扩增过程而实现，其步骤包括：
(a)提供核酸扩增反应混合物，
(b)将所述的反应混合物包囊化入对低分子量分子具有高通透性和对高分子量分子无通透性的胶囊，且由此形成包含反应混合物的成分的胶囊，和
(c)进行至少一个扩增步骤，因而可在一个或更多胶囊之内进行核酸扩增。
本发明描述了一种可实现多达105到1011倍的核酸扩增的方法，特别是平行聚合酶链反应。
本发明基于将核酸扩增反应混合物包囊化在胶囊中，特别是，将聚合酶链反应混合物包囊化入拥有对低分子量分子具有高通透性和对高分子量分子无通透性的微胶囊中，所述胶囊产生了一个隔间来进行各个核酸扩增，特别是，独立的各个聚合酶链反应。在核酸扩增期间，高分子量的核酸扩增产物，特别是聚合酶链反应产物，会被积存在包含了聚合酶、合适的模板和引物的胶囊之中，而低分子量的底物分子，特别是dNTP，会从外面渗入胶囊内部。发明的低分子量的分子的分子量少于2000Da，特别是少于1500Da，而更好是少于1200Da，这包括dNTP、ddNTP和标记的、特别是荧光标记的核苷酸。高分子量的分子的分子量相应大于2000Da，特别是大于2500Da，更好大于3000Da，这些分子包括聚合酶、引物、模板和扩增产物。
典型的胶囊直径是在50纳米至1000微米的范围以内，优选地是在500纳米至100微米的范围内，而最优选地是在40微米至60微米的范围。胶囊最佳是分散在缓冲液中，即聚合酶链反应缓冲液中(包含核苷酸-dNTP)，当中的密度是大约每毫升有105个到1011个胶囊。使用微胶囊来包囊化核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物就可能在细小的容器中进行大量的平行反应。与现有技术水平比较，微胶囊是用作分开各自的核酸扩增，特别是聚合酶链反应，而不再是用塑料器皿或玻璃做成的反应管和板孔。使用本发明，每次可有高达105到1011个平行的核酸扩增，特别是聚合酶链反应(根据胶囊的大小和密度)，可在一个核酸扩增，特别是聚合酶链反应的进行。其中一个优选的用途是从一个复杂DNA混合物中分离单链的DNA分子，并且筛选，测序，和建造DNA文库。流式细胞仪(Flow cytometry)是一个有效力的方法来分析和分离一些包含核酸扩增产物的胶囊，特别是聚合酶链反应产物的胶囊，当前发明提供了一个方法用作大量的筛选而这些是目前技术未能做到的。
本发明是提及包囊化核酸扩增反应混合物在胶囊中，特别是聚合酶链反应混合物，从而产生了一个隔间来进行核酸扩增，特别是聚合酶链反应。第一步是提供一个核酸扩增混合物，混合物包含所有或一些必需的反应伙伴或成分用作进行核酸扩增混合物。另外的成分是在胶囊形成以后才加入。更好地，聚合酶链反应混合物包括：聚合酶和/或引物和/或模板和/或缓冲液物质和/或各种dNTP和/或增强子(enhancers)和/或DNA探针，更好地，混合形成基质材料的微颗粒材料(即琼脂糖)。基质材料结合聚合酶链反应混合物形成微颗粒(microparticles)(如，通过形成离子化藻酸盐或琼脂糖凝胶)(图1/23)。另一个方法是将反应混合物混合多孔的微颗粒(porous microparticle)作为基质材料。该方法的描述详细的见实施例部分。
第二步是将核酸扩增混合物包囊化。在这步，装有反应伙伴或反应混合物成分的胶囊会被形成。反应混合物不会独自被包囊化，反应混合物首先混合基质材料，然后再将微颗粒包囊化。在这个实施方案中，在进行包囊化过程(encapsulation)之前，将核酸扩增反应混合物成分先混入基质材料。合适的基质材料材料是，例如，多孔的微颗粒、蜡样物质(wax-like substances)，琼脂糖、藻酸盐、多糖、多肽、脂肪酸，脂肪酸盐，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或冰，或其混合物作基质材料。在一个优选的实施方案中，基质材料材料(如，琼脂糖、藻酸盐、微颗粒)混合核酸扩增混合物，然后被包囊化(图1/24)。有很多的方法能够进行包囊化过程，例如，续层生长(layer-by-layer)技术或界面的聚合或空化(cavitation)技术。胶囊的通透性是可被控制的，因此小分子(如dNTP、ddNTP、短的聚合酶链反应(PCR)引物(primers))可通过胶囊的壁渗入胶囊之内，但较大的分子(如，DNA模板、聚合酶链反应引物、聚合酶链反应产物、聚合酶)则无法通过胶囊。
进行续层生长技术的一个基本要求是带电的模板(被包囊化的材料)。琼脂糖和藻酸盐微颗粒是带负电的，所以是一块适合的模板。多孔微颗粒可带有负电或正电表面电荷。利用续层生长的包囊化技术，胶囊的通透性可从聚合电解质(polyelectrolytes)的层数，聚合电解质的物料，聚合电解质的分子量和交联作用(crosslinking)方面来控制。
任意地，在进行包囊化过程之后，基质材料将自胶囊中被溶解或去除(图1/25)，例如，将藻酸盐制成的基质材料放进无钙缓冲液作交换。溶解或去除基质材料是可行的，例如由溶剂溶解，或通过化学方如氧化作用，或在进行聚合酶链反应期间用高温溶解，在聚合酶链反应的温度下，琼脂糖基质材料将被熔化，因此对胶囊之内的分子是高通透性的。
下一步，至少进行一扩增步骤，即聚合酶链反应循环，扩增一个或更多胶囊之内的核酸。在进行扩增步骤之前，先将未包囊化的反应混合物与胶囊分开，如用离心法，过滤法，透析法或用核酸酶()和/或蛋白酶作破坏。微胶囊将被分散在缓冲液中，进行核酸扩增时，特别是聚合酶链反应的实验时，则使用聚合酶链反应缓冲液。将分散在反应管(或微滴定板)的微胶囊放进常规的聚合酶链反应仪(PCR cycler)，按标准的温度作聚合酶链反应的循环。
本发明在过程中的特殊好处是在扩增进行过程中和/或较早期间可以连续或分批(batchwise)方式将核酸扩增反应中的组分、成分、或反应物能选择性进入胶囊。优选地，胶囊的通透性能选择性地允许部分原料渗入胶囊内，譬如各种dNTP。但却限制反应产物或模板向外渗。这允许连续或分批地补充一种或几种原料进入胶囊，进一步充实需要的产物，因而，它的表现是不会被开始的反应物限制。
例如，在扩增期间，会作连续选择性的交换。以续层生长技术包囊化核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物与胶囊外的介质能交换低分子量的反应物，特别是各种dNTP。各种dNTP能容易地渗过胶囊的壁。因而，各种dNTP能加入反应混合物中。胶囊内最理想的核苷酸(dNTP)浓度将能保持一段长时期的不变。核酸扩增或聚合反应，特别是聚合酶链反应因此不被胶囊内的基础单元的材料(例如各种dNTP)所限制。
如果更好地使用荧光标记的各种dNTP，扩增的产物将被标记并且包含扩增产物的胶囊将可容易地被确认。如果使用4种荧光的ddNTP作标记物，聚合作用的产物的3′末端基部将被荧光标记。
例如，分批选择性的交换可在扩增之前或期间发生，当有一个触发的变化从而改变胶囊壁的通透性，成分(constituents)、组分(components)或反应物(reactants)便能转移入胶囊内。胶囊壁的通透性，例如，能被酸碱度值的变化而改变，例如根据酸碱度而膨胀或收缩水凝胶胶囊材料，或改变反应介质的离子强度。在一个较好的过程中，利用续层生长技术将3到6层的巯基化的聚合电解质构建在胶囊上而最外层则是非巯基化的层。有氧气的存在，巯基将形成二硫键，导致聚合电解质层发生交联作用，从而减低通透性，但加入还原剂(reducetive agent)(如DTT)，将二硫键还原至巯基，而增加胶囊的通透性。另外，这项原则能被应用于产生稳定交叉的胶囊来用作进行聚合酶链反应的循环和故意地打开这样的胶囊，例如，释放DNA的产物，从而进行电泳法实验。
在扩增期间，连续选择性地交换和分批的加入反应物程序能被结合，例如当DNA序列由聚合酶链反应扩增，各种dNTP能连续的流入，而被荧光标记的ddNTP则分批的加入，刑成3′末端荧光标记的产物。
优选地，根据发明过程包括进一步的步骤：
(d)检测胶囊内包含的核酸产物。这步可使用例如流式细胞仪或显微镜进行。
在进一步优选的实施方案中，一个或多个构成核酸扩增反应的混合物和/或胶囊材料中载有一个标记物。合适的标记物包括如荧光团、量子小点(quantum)、放射性同位素(radioisotopes)、染料或核磁共振活性同位素(NMR active isotopes)或纳米粒子(nanoparticles)。特别地，选择标记物能将各胶囊编码和/或将不同的反应产物编码。
阳性胶囊，即胶囊装有核酸产物，优选地，从反应混合物中被分开。例如，包含核酸产物的胶囊能从一些物理性的特征如标记物或将DNA染色的染料或测定DNA所吸收的紫外线(UV)而检测，然后从胶囊悬液中分开和分离。核酸产物在所说的胶囊中将被分析或提取作进一步的用途。聚合酶链反应的产物是从很多分开的或一个的胶囊中提取出来。
Oberholzer et al.调查生命的起源和在脂质体内进行聚合酶链反应(Chemistry & Biology，2：677 682，1995)。用脂质体来包囊化核酸扩增反应混合物，然而DNA，引物，染色染料或核苷酸(dNTP)，这些材料无法与外在的介质交换。脂质体中的双分子脂膜(lipid bilayers)不允许带电分子穿过(所有聚合酶链反应的混合物都是带电和/或是大分子)。所以当所各种dNTP用完后，聚合酶链反应将会停止，并且无法区别胶囊内是否含有聚合酶链反应的产物。
本发明是标记起始原料，即使用标记的各种dNTP或被标记的ddNTP来产生被标记的核酸，如被荧光标记的聚合酶链反应产物，将被积存在聚合酶链反应的胶囊中，这样胶囊将可容易地检测，如基于它们的荧光强度，和分离，如基于紫外线(UV)或荧光的检测。
在一个优选的实施方案中，聚合酶链反应只在存有模板和互补的引物的胶囊内进行(图2/22和2b)，而其它的胶囊(图2/21和3)是不会产生出聚合酶链反应的产物。由于在聚合酶链反应实验中，使用了被荧光标记的各种dNTP，因此聚合酶链反应的产物将被荧光分子标记。
在聚合酶链反应的循环期间，发生聚合酶链反应的胶囊(″阳性胶囊″)内荧光强度会不断增加。另一方式是把报告染料(reporter dyes)插入聚合酶链反应产物，当些染料(如，溴化乙啶，SYBR Green I)插入双链的DNA内(即聚合酶链反应的产物)将增强荧光的程度。核酸扩增产物的序列资料，特别是聚合酶链反应的产物，能由使用杂交探针获得(如，Tag Man system或分子信号)。
通过流式细胞仪的分选步骤，阳性胶囊能从大量胶囊中被检测和分离，现代的流式细胞仪能每秒以高准确性地分析70 000个微颗粒。微胶囊的悬液约有109个胶囊大约需要4个小时来分析，现代仪器更装备多色分析功能，这个方法能辨认出编码的胶囊或在复杂的混合物中跟踪单一的胶囊。因此流式细胞仪能提供一个作高效能的大量筛选方法。
另一个本发明的实施方案中，包囊化核酸扩增反应混合物的微胶囊，特别是聚合酶链反应的混合物被固定在二维的表面上。各个胶囊位置能由摄像机确定，用激光将固定的胶囊照亮从而提供能量，将各个胶囊加热至合适的聚合酶链反应的循环温度。
激光在表面上扫描(如，使用可移动的电子性反射镜(mirror)和镜片(optic))并且找出单一胶囊或有些表面的位置。不同的聚合酶链反应温度曲线图适用于单一的胶囊或特定的表面，胶囊的温度是受控于激光的能量和照明的时间，胶囊壁混合染料能增加激光能量的吸收，另外染料更可用作找出胶囊的位置。使用了被荧光标记的各种dNTP，胶囊内的聚合酶链反应产物的增加就能从荧光的强度作在线式测定，这允许对各个胶囊进行实时(real time)的聚合酶链反应。利用实时测定荧光强度的增加和连续应用不同的聚合酶链反应温度曲线图来拟出每个胶囊的合适聚合酶链反应温度曲线图，使用智能反馈环路(feedback loop)能选择优化的温度曲线图和拟出最大效能的扩增或特异性(specificity)。
根据发明在过程中，核酸扩增的反应就是聚合酶链反应。在这种情况下过程优选地包括的步骤：
(i)提供聚合酶链反应混合物，包括聚合酶和/或各种dNTP和/或缓冲液的物质和/或增强子和/或引物和/或模板和/或DNA探针和/或基质材料的材料，
(ii)将所述的聚合酶链反应混合物包囊化入对低分子量分子具有高通透性和对高分子量分子无通透性的微胶囊，由此制成包含了反应混合物的成分的胶囊，和
(iii)在聚合酶链反应的温度循环下，进行至少一次核酸扩增，由此在一个或更多胶囊之内进行核酸扩增。
本发明进一步涉及一种胶囊，其包囊化核酸聚合作用和/或扩增的反应混合物，特别是聚合酶链反应的反应混合物和/或核酸扩增的产物，特别是聚合酶链反应的产物。这些胶囊有利地用作各种各样的用途，除了作为反应隔间(reaction compartment)进行平行核酸扩增和/或聚合反应，它们还能应用于分析和/或筛选核酸或人工合成的核酸衍生物，产生核酸文库，核酸测序，用于生物鉴定(bioassays)或实时聚合酶链反应。
本发明的另一实施方案中，包囊化核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物的微胶囊内可用作建造一个基因组文库(genomic DNAlibrary)，包括如下步骤：
(i)分离基因组的脱氧核糖核酸(genomic DNA)，
(ii)用限制性内切酶将基因组DNA进行部分消化产生有粘性末端(如与Sau3.A)的大约500到50kb的片段，
(iii)然后由杂交作用和连接作用，使用已知的DNA将基因组的DNA的片段的两个末端延长，以产生重组的DNA，(例如利用BamHI核酸酶将λphage的脱氧核糖核酸(DNA)做成粘性末端以互补于基因组的DNA的片段。将λphage的中间部分切除(＝可替代的部分)。将λphage的DNA片段和基因组的DNA的片段杂交。将片段连接来产生重组的DNA，
(iv)准备聚合酶链反应混合物，其包含作为模板的重组的DNA和一对用作互补于某个区域来作扩增基因组的DNA的片段的引物，
(v)将前述的混合物包囊化入微胶囊，使得每个胶囊统计性地携带一个拷贝，和
(vi)进行核酸扩增。
在另一本发明的实施方案中，包囊化核酸扩增反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物的微胶囊可用于构建一个cDNA文库，其包括如下步骤：
(i)将mRNA分离，
(ii)将poly(T)寡核苷酸和mRNA杂交，
(iii)用逆转录酶来延长poly(T)的引物，
(iv)用碱将mRNA水解，从而产生单链的cDNA，
(v)用末端转移酶将寡核苷酸的尾部，如poly(G)，加入3′末端，
(vi)准备聚合酶链反应混合物，用cDNA作为模板和一对能将编码区域用聚合酶链反应扩增的引物，如，poly(T)和poly(C)，
(vii)将所述的混合物包囊化，使得每个胶囊统计性地携带一个拷贝，和
(viii)进行核酸扩增。
在另一实施方案的发明，核酸产物，特别是聚合酶链反应产物，用凝胶过滤色谱技术来平行的分析多个胶囊，其步骤包括：
(i)将填充了核酸产物胶囊包埋在一层稀薄的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中，
(ii)通过化学或物理方法，使得胶囊壁对核酸产物具通透性，使得核酸由胶囊中释放，
(iii)提供电压进行凝胶电泳，
(iv)检测从各个胶囊产生的带型，和
(v)由装了DNA ladder的胶囊制作标准来计算出DNA片段的长度。
在本发明的另一实施方案中，包囊化了核酸反应混合物，特别是聚合酶链反应混合物的微胶囊被用于DNA或基因组的DNA或cDNA的测序，包括的步骤：
(i)进行所述构建DNA文库的步骤(i)至(v)或进行所述构建cDNA文库的步骤(i)至(vii)，以产生长度大约500bp的DNA片段，但使用一对引物，而其中的一个引物的数量要超出另一个，如比率2∶1到1000∶1。
(ii)进行聚合酶链反应直到最低浓度的引物被用完，
(iii)在微胶囊悬液中加入分别标记了4种荧光的ddNTP，其与dNTP的浓度比为大约1/500，如1/100到1/1000，并以多余的引物进行延长，
(iv)进行所述用凝胶电泳来分析核酸胶囊内容的步骤(i)到(iii)，
(v)用与四种染料对应的波长来检测从各个胶囊产生的带型，和
(vi)计算出DNA的片段(DNA fragments)和整个基因组的序列。
除所述的产生DNA文库、电泳和测序的程序之外，还可有以下的改进。产生DNA或基因组文库：可由不同的核酸酶作消化作用来产生出粘性末端，以便用双链DNA尾来延长dsDNA的末端。如使用BamHI核酸酶来在5′-G^GATC-NNN-3′//3′-NNN-CTAG^G-5′切开，然后造出粘性末端序列为5′GATC NNN 3′，能由杂交作用和连结作用来伸展有粘性末端5′-GATC-Nn-3′(N＝CGAT，n＝1-25)的dsDNA。这个做法将产生出相同序列的3′-端的DNA分子。一个引物在进行聚合酶链反应中可用来扩增两条链。
进行电泳的分析：如前所述，核酸产物能被从微胶囊释放出来，例如，用二硫键连接的胶囊。在凝胶电泳的实验中，各个胶囊需要至少有50微米×5厘米的凝胶区域，一张A4大小的凝胶大约可进行24000个凝胶电泳的实验，大约有107个碱基序列的资料。而质粒，病毒和细菌染色体(bacterium chromosome)则大约需要1张A4大小的凝胶，但是人类的基因组含3×109bp大约需要250张A4大小的凝胶，而一条人的染色体则需要6张凝胶。如根据发明的过程则有潜力在大约1天内完成基因组的测序。
进行测序：为进行DNA文库测序，DNA的片段首先要在它们的3′末端有两个不同的序列，这通过与质粒进行杂交作用和连结作用而实现。这允许不同的引物杂交在3′末端。使用一种过剩的引物将编码链或非编码链的其中一股制成具有荧光标记的3′末端的片段。为此，加入两种引物的比例为1∶2到1∶1000，聚合酶链反应可进行直到低浓度的引物用完。然后，在有ddNTP的情况下，过量的引物将被延长。这方法能在过量的正向或反向的引物下进行。进行两个实验，一个使用过量的正向引物而另一个使向过量的反向引物，得出两组互补序列的资料。用与聚合酶链反应温度循环相似的形式，能重复多次延长过量的引物。
进一步，发明包括用来生产本发明的胶囊或进行本发明的方法所用的试剂盒(kit)，其中包含至少一种进行所述方法所必需的起始原料。
本发明进一步在以下图和实施例中说明。
附图说明
图1显示制备包囊化聚合酶链反应混合物的胶囊的过程。反应混合物(图1/21)包括各种dNTP和/或缓冲液物质和/或增强子和/或引物和/或模板和/或聚合酶。反应混合物在包囊化入胶囊内之前先混入基质材料(图1/22)产生混入了反应混合物的基质材料微颗粒(图1/23)。使用续层生长技术来进行包囊化过程(图1/24)。最终，将基质材料从胶囊中除去，而包囊化的反应混合物保留在胶囊中(图1/25)。
图2显示包囊化了聚合酶链反应混合物的胶囊的的应用。胶囊包含了模板和/或引物(图2/21-3)。聚合酶链反应只发生在包含了互补的模板和引物的胶囊(图2/2 2b)。胶囊不包含模板或包含非互补的模板和引物无法产生聚合酶链反应产物(图2/21b和3b)。包含了聚合酶链反应产物的胶囊由例如荧光或紫外光鉴别和分离(图2/22c)。聚合酶链反应产物和模板从单个胶囊中被提取作进一步研究(图2/22d)。
图3表示，聚合酶链反应能够成功地进行在琼脂糖的基质材料中。条带：1＝Ladder(100bp)，2＝阳性对照，3＝阴性对照，4＝阳性对照+0.1％琼脂糖，5＝阳性对照+0.2％琼脂糖，6＝阳性对照+0.5％琼脂糖，7＝阳性对照+0.6％琼脂糖，8＝阳性对照+0.7％琼脂糖，9＝阳性对照+0.8％琼脂糖，10＝阳性对照+1.0％琼脂糖，所有实验环境加入了浓度为1.5mM的镁。
图4展示由琼脂糖产生的微颗粒(直径大约50μm)。4a)相差显微图片显示琼脂糖微球(microbeads)的形态。4b)荧光显微图片(FITC-过滤器)显示以FITC标记的PAH制备的微胶囊微球。4c)荧光显微图片(乙啶(Ethidium)过滤器)显示微球内部的dsDNA被溴化乙啶染色。
图5显示了(PAH/PSS)6包囊化的琼脂糖微球(直径大约50μm)在聚合酶链反应温度循环的情况下(0.5分钟在95度、1分钟在60度和2分钟在72度)的稳定性。5a到5d)显微图片显示包囊化的珠在1个，5个，20个和30个循环以后的形态。5e)稳定的胶囊的百分比对聚合酶链反应的周期作图。
实施例
材料：聚阳离子，聚烯丙基氯化铵(poly(allylamine hydrochloride)，PAH)，Mw 15,000，和聚阴离子，聚苯乙烯磺酸钠(poly(sodium4-styrenesulfonate，PSS)，Mw 70,000购自Aldrich。藻酸钠购自(Manugel)Alginate Industry GmbH。聚合酶链反应试剂和聚合酶购自Promega。引物和模板购自synthetic genetics。
实施例1：制备包囊化聚合酶链反应混合物的胶囊
DNA模板稀释液(1ml的1xPCR缓冲液)稀释DNA模板至每毫升含有的模板密度在103到1012之间。将Taq DNA(25U/ml)，0.8μM引物(或被荧光标记的引物)和200μg/ml BSA加入模板溶液中。
A)使用多孔的微颗粒：将100μL含有103个到1012个多孔微颗粒悬液(直径由0.5到10μm，孔径大小由0.5到200nm)与前述的溶液混合。将此混合物过夜培育允许聚合酶链反应混合物渗入微粒的孔(一些物料也许会吸附在微粒表面)。利用离心机将多孔微粒由微粒悬液中分离。被分离的多孔微粒立刻用高分子电解质在微颗粒包埋(5mg PAH在1mL1xPCR缓冲液)。然后用离心机去除剩余而不被吸附的高分子电解质，随后以1xPCR缓冲液作三个周期洗涤多孔微颗粒上多余的高分子电解质。然后，加入1mL带有相反电荷的高分子电解质(5mg PSS在1mL 1xPCR缓冲液)在微颗粒的表面形成连贯层。重复上述的离心，洗涤和随后吸附带有相反电荷的高分子电解质步骤，直到形成所期望的层数。
B)使用基质材料：
I)藻酸盐：在前述的模板溶液中加入60mg藻酸钠。将此混合溶液转移入分散器。使用分散器产生气溶胶，并将其喷洒在2％氯化钙溶液中。经过10分钟的培育，藻酸盐微颗粒用离心机从微粒悬液中分离。步骤如实施例(1A)所述，但涂层缓冲液中增加0.5％氯化钙，将表面附带有负电的藻酸盐微颗粒以高分子电解质包被。在最后的步骤中，使用无钙而含高钠的缓冲液将固相的藻酸盐微颗粒核心溶解。胶囊经过同双功能(homo-bis-functional)交联剂的处理来增加胶囊壁的稳定性。
II)琼脂糖：在前述的模板溶液中加入1％低熔化性(low melting)的琼脂糖(熔点40℃)并加温至45℃。将100μL上述的混合物加入到2mL加温至45℃的油中。混合物被乳化，形成直径大约50μm成乳化液小滴。乳化液小滴倾倒在10mL4℃的PAH溶液中(5mg/mL)并且搅动数分钟(1到20分钟)直到形成琼脂糖微颗粒。使用离心机(1200g，10分钟)将琼脂糖微颗粒分离。乳化液的油相被去除，而且分离的琼脂糖微颗粒以冷的缓冲液洗涤。将这些珠以多层PSS和PAH连续包被。
实施例2：进行聚合酶链反应温度循环和鉴别包含聚合酶链反应产物的胶囊
将含有103个到1012个多孔微粒的悬液稀释于9份聚合酶链反应缓冲液中，缓冲液中包含2mM氯化镁，0.2mM核苷酸(dNTP)(荧光标记的)，1xTaq缓冲液。使用常规的PCR cycler，聚合酶链反应温度循环在微试管(每试管50-200μL)或在微滴定板(每板孔10-100μL)中进行。聚合酶链反应温度循环的温度设置如下：最初变性为90℃ 300秒，(变性为92℃60秒；退火为50℃ 60秒；延伸为65℃ 60秒)×15至35个循环。
使用能够进行荧光检测和细胞分选的流式细胞仪鉴别和分离包含了聚合酶链反应产物的胶囊。对包含了聚合酶链反应产物的胶囊悬液作进行一步分析。例如：悬液的容量是1mL和包含了1000个胶囊。悬液被稀释至每毫升含有750个胶囊，按照每孔10μL将悬液被分配在一块有1536板孔的微滴定板(Greiner)的板孔内，统计学上每板孔内的胶囊密度大约在0.5个胶囊(统计学上每板孔内不超过1个胶囊的机会率是能够达到的)。在胶囊破坏后(加入大约100μL 1M NaOH，培育1分钟，加入同样容量1M HCL)，源于模板的一条单链的聚合酶链反应产物存在于各个板孔内。包含DNA的板孔(荧光被标记的DNA产物)容易由荧光分光光度计鉴别。
实施例3：在核酸分析和筛选中的应用
A)从一个复杂的DNA混合物中分离一目标DNA分子：
将DNA分子(～1010分子)的复杂的混合物进行稀释，然后与上述的聚合酶链反应混合物一同被包囊化，产生大约1020个悬浮胶囊。据统计，每个胶囊中应存在0.5至1个分子。在包囊化过程之前，将一对设计为用作扩增目标序列的引物加入模板溶液内(0.8μM)。进行聚合酶链反应并将包含聚合酶链反应产物的胶囊分离，这已在实施例2描述。包含聚合酶链反应产物的阳性胶囊中也含有目标DNA分子(最少一拷贝)，包含至少一拷贝目标DNA的单个阳性胶囊可用作进一步的分析。经过聚合酶链反应，胶囊可被破坏，在分离出来的目标DNA上可辨别其他的目标序列。

Claims (39)

1.一种核酸扩增方法，包括如下步骤：
(a)提供核酸扩增反应混合物，
(b)利用对低分子量分子具有高通透性和对高分子量分子无通透性的胶囊来包囊化所述反应混合物，和由此形成包含所述反应混合物的成分的胶囊，和
(c)进行至少一扩增和/或聚合步骤，和由此在一个或更多的所述胶囊之内进行核酸扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括步骤：
(d)检测包含核酸产物的胶囊。
3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括步骤：
(e)自不包含核酸产物的胶囊中分离包含核酸产物的胶囊。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，进一步包括步骤：
(f)分析或提取所述核酸产物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中将核酸扩增反应混合物混入基质材料中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述基质材料选自多孔的微颗粒、蜡样物质、琼脂糖、藻酸盐、多糖、多肽、脂肪酸、脂肪酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或冰、或其混合物。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述混入基质材料的核酸扩增反应混合物通过续层生长技术、聚合技术和/或空化技术而进行包囊化。
(删除此权利要求：根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中将所述核酸扩增反应混合物溶解于液体并通过形成脂质体进行包囊化)
8.根据权利要求5到7中任一项所述的方法，其中通过化学方法或通过物理方法如加热，用溶剂将所述基质材料溶解和/或从胶囊中溶解和/或除去。
9.根据权利要求5到7中任一项所述的方法，其中所述基质材料在温度循环中被熔化。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中形成的胶囊的直径在50纳米至1000微米的范围，优选的直径在40微米至60微米的范围。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过触发胶囊壁通透性的改变将所述核酸扩增反应混合物的成分和/或反应物转移入胶囊内。
12.根据权利要求11所述的方法，其中通过pH的变化或离子强度的变化或胶囊交联的变化，触发胶囊壁通透性的改变。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中控制胶囊的通透性以允许核酸扩增反应原料选择性地渗透入胶囊内，而限制胶囊内的核酸扩增反应产物和/或模板和/或引物向外渗透。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将非包囊化的核酸扩增反应混合物的化合物在核酸扩增步骤之前与胶囊分离或由酶破坏。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸扩增反应混合物和/或胶囊材料的一或多种成分携带标记物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记物选自荧光团、量子小点、放射性同位素、染料、纳米粒子或NMR活性同位素。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述标记物使得能够对各个胶囊进行编码。
18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过标记物的物理性特征或通过测定DNA所吸收的紫外线或通过以染料对DNA进行染色来检测含有核酸产物的胶囊，并将其从胶囊悬液中分开和分离。
19.根据前述权利要求中任一项的方法，用于对核酸或人造的核酸衍生物进行分析和/或筛选。
20.根据前述权利要求中任一项的方法，用于产生核酸文库。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，用于进行生物鉴定。
22.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述核酸扩增反应是聚合酶链反应。
23.根据权利要求22所述的方法，其包括以下步骤：
(i)提供PCR反应混合物，包括聚合酶和/或各种dNTP和/或缓冲液物质和/或增强子和/或引物和/或模板和/或DNA探针和/或基质材料，
(ii)包囊化所述的聚合酶链反应混合物，和由此形成包含所述反应混合物的成分的胶囊，和
(iii)进行包括聚合酶链反应的温度循环的至少一次的扩增步骤，和由此在一个或更多胶囊之内进行核酸扩增。
24.根据权利要求11-13或22-23中任一项所述的方法，其中利用触发胶囊壁通透性的改变将模板和/或一种或更多引物转移入胶囊内。
25.根据权利要求11-13或22-24中任一项所述的方法，其中控制胶囊的通透性以便在聚合酶链反应温度循环期间允许dNTP和/或ddNTP和/或小引物选择性地渗入胶囊，而限制聚合酶、聚合酶链反应产物、模板和大引物向外渗透。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中将所述胶囊分散在聚合酶链反应缓冲液中。
27.根据权利要求26所述的方法，其中聚合酶链反应缓冲液中包含嵌入性染料，例如溴化乙啶和/或SYBR Green I。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中使用热循环仪在反应管、微滴定板或玻璃毛细管中进行所述胶囊悬液的温度循环。
29.根据前述权利要求中任一项的方法，其中的dNTP和/或ddNTP和/或引物和/或模板和/或DNA探针和/或胶囊材料携带标记物。
30.根据专利要15-16或29中任一项所述的方法，其中所述的标记物使得能够对引物和/或模板和/或其混合物进行编码。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中在包囊化的聚合酶链反应混合物中加入其他的酶例如逆转录酶和/或核酸酶和/或连接酶。
32.对根据权利要求1-31中任一项所述的方法获得的胶囊内的核酸成分进行测序的方法，其包括以下步骤：
(i)在一种引物过量的情况下进行聚合酶链反应直到较低浓度的引物被用尽，
(ii)按照与dNTP之比为1∶100到1∶1000加入4种荧光颜色标记的ddNTP，并是所述过量的引物延伸，和
(iii)利用凝胶电泳分析各个胶囊内的核酸胶囊成分。
33.对根据权利要求1-31中任一项所述的方法获得的胶囊内的核酸成分进行分析的方法，其包括以下步骤：
(i)将胶囊埋置在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中，
(ii)通过化学方法或物理方法从胶囊中释放核酸，
(iii)施加电压进行凝胶电泳，和
(iv)检测各个胶囊产生的带型。
34.一种胶囊，其包囊化根据权利要求1-31中任一项所述的方法获得的核酸扩增反应混合物和/或核酸扩增产物。
35.根据权利要求34所述的胶囊，其包囊化聚合酶链反应混合物和/或聚合酶链反应产物。
36.根据权利要求34或35所述的胶囊在分析和/或筛选核酸或核酸的人造衍生物、在构建核酸文库、进行核酸测序、在生物鉴定和/或在实时聚合酶链反应中的用途。
37.根据权利要求34或35所述的胶囊作为平行核酸扩增反应的反应隔间的用途。
38.根据权利要求37所述的用途，用作平行聚合酶链反应的反应隔间。
39.一种试剂盒，其用于制备前述权利要求中任一项所述的胶囊和/或用于进行前述权利要求中任一项所述的方法和/或用于前述权利要求中任一项所述的胶囊的用途，所述试剂盒含有聚合酶和/或各种dNTP和/或ddNTP和/或缓冲液物质和/或增强子和/或引物和/或模板和/或DNA探针和/或基质材料和/或胶囊材料和/或标记物和/或塑料器皿和/或用户手册。
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