CN1649889A - 制备低聚核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种制备低聚核苷酸的方法。该包括组装连接于固体载体上的低聚核苷酸,其中所述固体载体是通过包括单体聚合的方法制备的,其中所述单体包括连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链用对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基基团保护。
Description
本发明涉及一种制备低聚核苷酸的方法,和其中使用的化合物。
PCT/GB99/02193公开了一系列新型的用作固相有机合成(SPOS)载体的聚合树脂载体。
我们已经发现,通过特定的方法制备的聚合物尤其适合于制备低聚核苷酸。
根据本发明的第一方面,提供一种制备低聚核苷酸的方法,其包括组装连接于载体上的低聚核苷酸,其中所述固体载体是通过包括单体聚合的方法制备的,其中所述单体包括连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链受到对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基基团的保护。
根据本发明,连接到单体上的羟基聚C2-4亚烷基氧链往往选自羟基聚亚乙基氧(HO(CH2CH2O)2-10-),羟基聚亚丙基氧(HO(CH2CH(CH3)O)2-10-)和羟基聚亚丁基氧(HO(CH2CH(C2H5)O)2-10-)链。在本发明的优选实施方案中,羟基聚C2-4亚烷基氧链是羟基聚亚乙基氧。
羟基聚C2-4亚烷基氧链中C2-4亚烷基氧基团的数目可以为2-10,但是优选2-8,更优选3-5。最优选,在羟基聚C2-4亚烷基氧链中有4个C2-4亚烷基氧基团。
在本发明非常优选的实施方案中,羟基聚C2-4亚烷基氧链是羟基四亚乙基氧(HO(CH2CH2O)4-)。
根据本发明,单体的可聚合单元往往选自任选取代的苯乙烯类,丙烯酸酯和丙烯酰胺。在本发明的优选实施方案中,可聚合的单元是任选取代的苯乙烯,任选取代的甲基苯乙烯,任选取代的(甲基)丙烯酸乙酯,任选取代的(甲基)丙烯酸丙酯,或任选取代的N-甲基(甲基)丙烯酰胺。
在本发明非常优选的实施方案中,可聚合的单元是任选取代的苯乙烯或任选取代的甲基苯乙烯。
当可聚合的单元是任选取代的苯乙烯或任选取代的甲基苯乙烯时,苯乙烯的苯环优选任选被1或2个取代基取代,该取代基往往选自甲基,乙基,丙基,氟,氯和溴。
当可聚合的单元是任选取代的苯乙烯或任选取代的甲基苯乙烯时,优选受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链通过苯氧基醚键连接到任选取代的苯乙烯或任选取代的甲基苯乙烯上,即氧原子直接连接到任选取代的苯乙烯或任选取代的甲基苯乙烯的苯环上。
对酸敏感的保护基是在酸条件下不稳定的基团。对酸敏感的保护基包括多芳基甲烷保护基。
多芳基甲烷保护基包括任选取代的二芳基甲烷和任选取代的三芳基甲烷。在一个或多个芳基基团上可以存在任选的取代基,每一个芳基基团可以带有一个或多个取代基。二芳基甲烷也可以任选在两个芳基所连接的碳上被取代,优选任选的取代基是烷基。
芳基是指包含1个环或2个或更多个稠环的芳基基团,所述稠环任选可以包括环烷基,芳基或杂环。芳基基团的实例包括苯基,甲苯基,氟苯基,氯苯基,溴苯基,三氟甲基苯基,茴香基,萘基,呫吨基,吡啶基,嘧啶基,苯硫基,呋喃基,吲哚基,喹啉基和异喹啉基。
优选的芳基基团是任选取代的苯基,任选取代的萘基,和任选取代的呫吨基。
可以取代二芳基甲烷的碳原子的烷基包括含有最高达20个碳原子的直链和支链烷基,特别是1-7个碳原子,优选1-5个碳原子,最优选1或2个碳原子。实例包括甲基,乙基,丙基和异丙基。
当多芳基甲烷被取代时,取代基应该是不对保护基的稳定性或者在酸条件下脱除保护基的能力造成不利影响的基团。任选的取代基包括卤素,氰基,硝基,烃基,氨基,硫醇,酰基,烃基,全卤代烃基,杂环基,烃氧基,聚(氧化烯)氧,单或二烃氨基,烃基硫,酯,碳酸根,酰胺,磺酰基和磺酰胺基,其中烃基通常是如上定义的烷基或芳基。可以存在一个或多个取代基。
多芳基甲烷保护基的实例包括二苯甲基,萘二苯甲基,苯基呫吨基[pixyl],三苯甲基[三苯甲基],二甲氧基苯基苯甲基[二甲氧基三苯甲基],甲氧基苯基-二苯甲基[单甲氧基三苯甲基]和2-氯苯基二苯甲基[2-氯三苯甲基]。
任选取代的三苯甲基基团包括三苯甲基[三苯甲基],二甲氧基苯基苯甲基[二甲氧基三苯甲基],甲氧基苯基-二苯甲基[单甲氧基三苯甲基]和2-氯苯基二苯甲基[2-氯三苯甲基]基团。
在本发明的优选实施方案中,单体是式(1)的化合物:
其中:
R1是任选取代的乙烯基;
R2-4独立地为氢,烃基,卤素或烃氧基;
R5是对酸敏感的保护基;和
n是2-10。
优选,对酸敏感的保护基是多芳基甲烷保护基。更优选,R5是下式的多芳基甲烷保护基:
-CR6R7R8
其中:
R6是氢,任选取代的烷基或任选取代的芳基;以及
R7和R8彼此独立地为任选取代的芳基,或R7和R8是任选取代的芳基,它们可以连接在一起形成任选取代的环。
可以由R6代表的烷基包括含有最高达20个碳原子的直链和支链烷基,特别是1-7个碳原子,优选1-5个碳原子,最优选1或2个碳原子。实例包括甲基,乙基,丙基和异丙基。
可以由R6、R7和R8代表的芳基可以包含1个环或2个或更多的稠环,所述稠环任选可以包括环烷基,芳基或杂环。芳基基团的实例包括苯基,甲苯基,氟苯基,氯苯基,溴苯基,三氟甲基苯基,茴香基,萘基,吡啶基,嘧啶基,苯硫基,呋喃基,吲哚基,喹啉基和异喹啉基。
优选的芳基基团是任选取代的苯基。
当R7和R8是任选取代的芳基且当与它们所连接的碳原子合起来连接成环时,优选所述环是5、6或7元环。当R7和R8是任选取代的芳基且它们连接起来形成任选取代的环时,其实例包括呫吨基。
当R6、R7或R8中的任一个是取代的烷基或取代的芳基时,取代基应该是不对保护基的稳定性或者在酸条件下脱除保护基的能力造成不利影响的基团。任选的取代基包括卤素,氰基,硝基,烃基,氨基,硫醇,酰基,烃基,全卤代烃基,杂环基,烃氧基,聚(氧化烯)氧,单或二烃氨基,烃基硫,酯,碳酸根,酰胺,磺酰基和磺酰胺基,其中烃基通常是烷基、芳基、烷芳基和芳烷基,所述烷基和芳基定义如上。可以存在一个或多个取代基。
最优选,R5是下式的多芳基甲烷保护基:
-CR6R7R8
其中:
R6是任选取代的芳基;和
R7和R8彼此独立地为任选取代的芳基,或R7和R8是任选取代的芳基,它们可以连接在一起形成任选取代的环。
在本发明非常优选的实施方案中,对酸敏感的保护基是任选取代的三苯甲基基团。
在本发明最优选的实施方案中,单体是式(1a)的化合物:
其中:
R1是任选取代的乙烯基;
R2-4独立地为氢,烃基,卤素或烃氧基;
R5是任选取代的三苯甲基基团;和
n是2-10。
优选,R1是CH=CH2,CH=CHCH3,或C(CH3)=CH2基团。最优选,R1是CH=CH2。
优选,基团R5O-[-C2-4亚烷基-O-]n与R1处于对位。
优选,[-C2-4亚烷基-O-]是[-CH2CH2O-]n,[-CH2CH(CH3)O-]n或[-CH2CH(C2H5)O-]n,最优选[-CH2CH2O-]n。
优选n是2-8,更优选n是3-5,最优选n是4。
优选R2-4全部是氢。
烃基包括烷基,芳基,烷芳基和芳烷基。优选,当R2-4中的任一个是烃基或烃氧基时,该烃基是烷基,最优选C1-4烷基。
任选,在本发明的方法中,含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体可以包括异构体的混合物,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链被任选取代的三苯甲基基团保护。
优选,当异构体的混合物用于本发明的方法时,单体是式(1)或(1a)的化合物。最优选,单体是如下异构体的混合物,其中R5O-[-C2-4亚烷基-O-]n基团和R1占据苯环的异构位置。
单体优选在用于产生交联,形成适用于制备低聚核苷酸的固体载体的条件下聚合。
优选,含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体在交联单体的存在下共聚。
聚合物中的交联程度可以由聚合反应中交联单体的浓度确定。通常,交联单体的重量%在0.1-70重量%范围之内,通常为0.5-20重量%,如1-10重量%,最优选至多5重量%。含有至多20重量%交联单体的聚合物通常是可溶胀的,而含有大于20%交联单体的聚合物通常不可溶胀。
适当的交联单体包括二乙烯基苯(DVB)或多官能的(甲基)丙烯酸酯,如二/三丙烯酸酯或二/三甲基丙烯酸酯如二丙烯酸乙二醇酯,二甲基丙烯酸乙二醇酯,三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,三乙烯基苯或N,N′-双丙烯酰基乙二胺。优选交联单体是DVB。
优选使用0.5-5重量%的DVB。最优选使用1-3重量%的DVB。
在本发明的某些方面,至少5%的交联单体可以与可与有机相混溶的可充当造孔剂或成孔剂(porogen)的化合物结合使用。典型的成孔剂可以包括,但是不局限于,为聚合物的良好溶剂的有机化合物,如有机芳香烃,氯代脂肪族或芳香烃和环状脂族醚,为所得聚合物不良溶剂的有机化合物,如脂族醇,酮,脂肪族烃,脂肪族羧酸和线型聚合物。优选,成孔剂选自甲苯,二甲苯,氯苯,四氢呋喃,二氧六环,2-乙基-1-己醇,2-辛醇,1-癸醇,1-十二烷醇,丙酮,丁酮,正庚烷,正癸烷,1-癸酸和分子量为500-5000000克/摩尔的线性聚苯乙烯。所得聚合物基本上具有不溶胀的性能,通常具有中到大孔性质,通过这种模式,反应物可以形成结合到聚合物上的官能度。
任选,在本发明的方法中,含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体在一种或多种共聚单体的存在下共聚,其中所述共聚单体选自苯乙烯类,例如苯乙烯、羟基苯乙烯、甲氧基苯乙烯、甲基苯乙烯、羟甲基苯乙烯和氯甲基苯乙烯,丙烯酸的酯和(甲基)丙烯酸的酯,例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸羟乙基酯和(甲基)丙烯酸羟丙基酯,以及丙烯酰胺,例如N-甲基丙烯酰胺和N-羟甲基(甲基)丙烯酰胺;其中苯乙烯中的苯环任选被1或2个取代基取代,所述取代基往往选自甲基、乙基、丙基、氟、氯和溴,且其中可以存在于共聚单体中的羟基,尤其是酚羟基任选被保护,并可以随后脱保护。优选,使用的任何共聚单体不含受保护的或未保护的羟基。
在优选的聚合中,含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体在一种或多种交联单体和一种或多种选自苯乙烯类、丙烯酸酯和(甲基)丙烯酸酯或丙烯酰胺的单体存在下共聚合,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链被任选取代的三苯甲基基团保护。
在非常优选的聚合中,含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体在DVB和苯乙烯的存在下共聚,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链被任选取代的三苯甲基基团保护。
当固体载体是通过单体混合物的聚合生成时(其中单体混合物包括含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体和一种或多种选自苯乙烯类、丙烯酸酯与(甲基)丙烯酸酯、或丙烯酰胺的单体),其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链被对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基基团保护,含有连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链的单体,以所存在的单体的总重量计,其重量百分数优选在1-99%范围内,更优选5-80%,最优选15%-70%。
本发明的方法优选通过水性悬浮液聚合进行。单体以液滴(1-1000微米)的形式悬浮在水中。通常要加入稳定剂来防止液滴聚结,例如聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯基吡咯烷酮、聚烯烃氧化物、纤维素衍生物,如羟丙基甲基纤维素或乙基纤维素、硫酸钡、硫酸镁或硫酸钠。对悬浮液通常也要搅拌以保持悬浮状态。
任选,在聚合过程中可以使用有机不与水混溶的溶剂。有机不与水混溶的溶剂可以促进在水性悬浮液聚合中形成液滴,或者可以起到成孔剂的作用。
任选,在水性悬浮液聚合中可以向水相中加入无机盐。无机盐可以通过抑制单体在含水介质中的溶解度来促进液滴的形成。
自由基引发剂优选用于引发聚合。引发剂的类型通常将根据使用的单体进行选择。优选的自由基引发剂的实例包括过氧化苯甲酰,二辛酰基过氧化物,月桂酰过氧化物,2,2′-偶氮二异丁腈和2,2′-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)。
通常,通过将混合物加热到15℃-160℃,优选50℃-90℃来促进聚合,应当承认,对混合物可以加热到的温度取决于所用的单体和引发剂的类型。
然后,生成的聚合物可以用适当的溶剂如四氢呋喃、甲醇和水洗涤,干燥并通过例如筛网进行微球大小分级。
在用于制备低聚核苷酸时,对酸敏感保护基通过本领域已知的可脱除给定保护基方法从固体载体上脱除,以得到含有游离羟基的交联聚合物。适当的方法,特别是用于脱除任选取代的三苯甲基基团的适当的方法包括,例如,酸水解。通常,可以使用任选取代的乙酸,如二氯或三氟乙酸在诸如二氯甲烷或甲苯的溶剂中的混合物。对于反应条件和试剂的一般性指导,读者可参考John Wiley & Sons于1992年出版的Jerry March编的″高等有机化学″,第4版。适当的时候,也可以使用其他的方法来脱除对酸敏感的保护基,例如可以使用中性条件下的碘除去三苯甲基基团,可以使用光解来除去苯基呫吨基团。
含有游离羟基的交联聚合物通常以微球的形式生成,其尺寸范围为10微米-2000微米。优选,微球大小为50微米-1000微米,最优选75微米-500微米。交联聚合物微球通常通过水性悬浮液聚合法制备,例如参见应用高分子科学杂志,1982,27,133-138,其引入本发明中作为参考。
在从载体上脱除保护基时,所得到的聚合物载体,其羟基官能度优选为0.1-约5,例如最高达4.8meq(毫克当量)羟基每克聚合物,往往是0.5-3.5,通常是1.0-3.3meq每克聚合物,如1.5-3meq每克聚合物。在许多实施方案中,在除去保护基时得到的聚合物载体具有0.5-2meq羟基每克聚合物。
低聚核苷酸的合成可以通过直接将官能团连接到固体载体上进行。但是,在许多实施方案中,优选使用可分裂的连接基通过官能团将低聚核苷酸连接到载体上。这种连接基的实例是本领域众所周知的,并且尤其包括琥珀酰基,草酰基和三苯甲基连接基。
可以通过本发明的方法制备的低聚核苷酸包括低聚脱氧核糖核苷酸,低聚核糖核苷酸和含有脱氧核糖核苷和核糖核苷混合物的低聚核苷酸。低聚核苷酸可以通过一种或多种低聚核苷酸化学领域中已知的改性方法改性,例如核糖核苷片断可以通过在一个或多个2′-位置上存在2′-烷氧基,诸如甲氧基或甲氧基乙氧基而得以改性。脱氧核糖核苷片断可以通过在2′-位置上存在取代基,比如卤素,尤其是氟基团,或者通过存在烯基如烯丙基而得以改性。也可以存在碱性核苷片断。可以存在一个或多个锁定的核苷。在许多实施方案中,低聚核苷酸将呈天然D-异构体的形式。但是,有一些或所有的低聚核苷酸可以全部或部分表示非天然的异构体,例如L-异构体或B-端基异构体。核苷间键可以是天然磷酸酯,或可以存在一种或多种改性的键,例如硫代磷酸酯或氨基磷酸酯键。完全硫代磷酸酯化的或完全氨基磷酸酯化的低聚核苷酸可以制备出来。
低聚核苷酸可以包括一个或多个保护基。这种保护基的实例,和其可以用于保护的位置对本领域技术人员来说是众所周知的,包括三苯甲基,单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基,左旋亚油酰基,异丁酰基,苯甲酰基,甲硅烷基如三烷基甲硅烷基,例如叔丁基二甲基硅烷基,乙酰基和碳酸根,比如BOC,尤其是FMOC。
低聚核苷酸可以包括天然的和/或非天然的核碱,包括腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,尿嘧啶,7-脱氮鸟嘌呤,7-脱氮-8-氮鸟嘌呤,5-丙炔基胞嘧啶,5-丙炔基尿嘧啶,7-脱氮腺嘌呤,7-脱氮-8-氮腺嘌呤,7-脱氮-6-氧嘌呤,6-氧嘌呤,3-脱氮腺苷,2-氧代-5-甲基嘧啶,2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶,2-硫代羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶,4-氧代-5-甲基嘧啶,2-氨基嘌呤,5-氟尿嘧啶,2,6-二氨基嘌呤,8-氨基嘌呤,4-三唑-5-甲基胸腺嘧啶,4-三唑-5-甲基尿嘧啶和次黄嘌呤。
低聚核苷酸可以通过本领域已知的用于将低聚核苷酸组装在固体载体上的方法制备。在许多这种方法中,活性含磷基团与初生低聚核苷酸上的活性部位偶合,形成核苷酸间磷键。适当的方法实例包括膦酸三酯法,氢膦酸酯法,尤其是氨基磷酸酯法。初生的低聚核苷酸通常最初包括核苷,或核苷类似物,其已经优选通过可分裂的连接基连接到固体载体上。在许多实施方案中,初生的低聚核苷酸包括脱氧核糖核苷或核糖核苷,最优选通过3′-位连接到固体载体上。其他连接到固体载体上的方法在本领域中是已知的,并适用于本发明中,包括例如通过核碱连接,通过核糖核苷和脱氧核糖核苷的2′-或5′-位连接。活性部位可以包括游离氨基或硫醇片断,但是优选游离羟基。初生的低聚核苷酸可以连接到具有通过适当的保护基保护的活性部位的固体载体上。因此,在组装到低聚核苷酸上之前要除去保护基。最优选,活性部位是脱氧核糖核苷或核糖核苷的5′-位。
当使用膦酸三酯法时,通常,活化的带保护基的核苷或低聚核苷酸磷酸酯与醇反应形成核苷酸间磷酸二酯键。用于膦酸三酯法的活化剂在本领域中众所周知,包括酰氯,例如磺酰氯。
当使用氢膦酸酯法时,通常,带保护基的核苷或低聚核苷酸氢膦酸酯单酯与包括游离羟基的初生的低聚核苷酸偶合,形成受保护的低聚核苷酸氢膦酸酯二酯。偶合优选在偶合剂的存在下进行。受保护的低聚核苷酸氢膦酸酯二酯可以脱保护,形成包括游离羟基的初生的低聚核苷酸,其之后可以进一步与核苷或低聚核苷酸氢膦酸酯单酯偶合。该方法可以根据需要不断重复,直到组装到所需的序列。所需序列的组装结束时,氢膦酸酯二酯键可以氧化或硫化形成磷酸酯或硫代磷酸酯低聚核苷酸。或者,氧化或硫化可以在每一次偶合之后进行。适合用于氢膦酸酯法的偶合剂和硫化剂在本领域中众所周知,包括在WO99/09041和国际申请PCT/GB02/005177中公开的那些,其在此引入作为参考。
优选的活性含磷基团是氨基磷酸酯基团。有利的是,核苷氨基磷酸酯与初生低聚核苷酸上的游离羟基偶合,优选3′-核苷氨基磷酸酯与游离的5′-核苷羟基偶合。低聚核苷酸优选通过使脱氧脱氧核糖核苷-3′-氨基磷酸酯或核糖核苷-3′-氨基磷酸酯与包括游离5′-羟基的初生的低聚核苷酸偶合制备。但是,应当承认,本发明的方法同样适用于5′-氨基磷酸酯与游离3′-羟基的偶合。
优选的氨基磷酸酯是下式的化合物:
其中,R4是保护基,优选三苯甲基,单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基基团,B是核苷碱,R5表示-H,-F-OR6,-NR7R8,-SR9,或取代或未取代的脂族基,如甲基或烯丙基。PG是磷保护基,通常是用于低聚核苷酸合成的可分裂的磷保护基,优选取代或未取代的脂族基或下式的基团:-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、-OR11、-SR11、-O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、-O-CH2CH2-C6H4-NO2、-S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3或-S-CH2CH2-C6H4-NO2。R6表示-H,取代或未取代的脂族基(例如,甲基,乙基,甲氧基乙基或烯丙基),取代或未取代的芳基,取代或未取代的芳烷基,醇保护基,尤其是对碱不稳定的醇保护基或甲硅烷基保护基,或-(CH2)q-NR12R13。R7和R8各自独立地为-H,取代或未取代的脂族基,或胺保护基。或者,R7和R8与它们所连接的氮一起形成杂环基。R9表示-H,取代或未取代的脂族基,或硫醇保护基。R11表示取代或未取代的脂族基,取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳烷基。R12和R13各自独立地为-H,取代或未取代的芳基,取代或未取代的杂芳基,取代或未取代的脂族基,取代或未取代的芳烷基,取代或未取代的杂芳烷基或胺保护基。或者,R12和R13与和它们连接的氮一起形成杂环基。q是1-约6的整数。各个R16独立地为C1-6烷基,优选异丙基,或基团N(R16)2表示杂环基团。使用的氨基磷酸酯通常是β-氰基乙氧基N,N-二异丙基氨基磷酸酯。
可以存在于优选的氨基磷酸酯中的胺、醇和硫醇保护基对本领域技术人员来说是众所周知的。胺保护基的实例参见Greene等人的著作,″有机合成中的保护基″,1991年,John Wiley & Sons,Inc.,309-405页,其教导全文在此引入作为参考。优选,胺被保护为酰胺或氨基甲酸酯。羟基保护基的实例参见相同的文献,10-142页,其教导全文在此引入作为参考。硫醇保护基的实例参见相同的文献,277-308页,其教导全文在此引入作为参考。可以出现的与R4所表示的保护基不同的保护基优选与R4表示的保护基互不相关。
可以用于本发明方法的活化剂在低聚核苷酸合成领域中是众所周知的。适当的活化剂的实例包括四唑,取代的四唑衍生物,如S-乙基四唑和S-苯基四唑,以及取代的咪唑衍生物如二氰基咪唑。
优选的活化剂包括在杂芳香环中含有4个以下氮原子的芳香杂环化合物的盐,尤其是包括一个或两个氮原子的含有5或6元环的芳香杂环化合物的盐。实例包括吡啶鎓,咪唑鎓盐和苯并咪唑鎓盐,尤其是六氟磷酸盐,四氟硼酸盐,三氟甲磺酸盐,盐酸盐,三氟醋酸盐,二氯乙酸盐,邻-甲磺酸盐,邻-甲苯磺酸盐,溴化物或三氟磺酸盐,如PCT申请WO99/62922中所公开(在此引入作为参考);苯并三唑和其衍生物,尤其是羟基苯并三唑;以及糖精或糖精衍生物,优选以与有机碱形成的盐-复合物的形式使用,特别是糖精的N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶盐。
可以使用的糖精或糖精衍生物优选具有以下通式:
式I中,p是0或1-4的整数。R对于各种情况均为取代基,优选彼此独立地为卤素、取代或未取代的脂族基、-NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、氰基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、-CHO、-COR3、-NHCOR3、取代或未取代的芳烷基、卤代烷基(例如,三氟甲基和三氯甲基)或-SR3。优选,R是卤素,取代或未取代的脂族基,-NR1R2,-OR3,-OC(O)R3,-C(O)OR3或氰基。或者,两个相邻的R基团与其连接的碳原子一起形成6元饱和或不饱和环。优选,形成的六员环是芳香环。R1和R2各自独立地为-H,取代或未取代的脂族基,取代或未取代的芳基,取代或未取代的芳烷基;或与它们所连接的氮一起形成杂环基。R3是取代或未取代的脂族基,取代或未取代的芳基,或取代或未取代的芳烷基。X是O或S。优选X是O。特别优选X是O,p是0。
可以存在的适当的取代基包括芳基,卤代芳基,烷基,卤代烷基(例如三氟甲基和三氯甲基),脂族醚,芳香醚,苄基,取代苄基,卤素,尤其是氯和氟基团,氰基,硝基,-S-(脂族或取代脂族基团)和-S-(芳族或取代芳族)基团。
优选,糖精或糖精衍生物以与有机碱形成的盐复合物的形式使用。
可以与糖精或糖精衍生物形成盐-复合物的有机碱是在pH值=7时有接受质子倾向的有机化合物。优选的有机碱是仲胺,叔胺或氮杂环碱,每个均可以是未取代的或被一个或多个取代基取代。非质子有机碱是在接受质子之前在其化学结构中没有氢键质子的有机碱。非质子有机碱如叔胺和非质子氮杂环化合物优选与本发明中所述的式1化合物结合使用。
这里使用的氮杂环碱,包括在芳香环中具有一个或多个氮原子的杂芳基和在非芳香环体系中具有至少一个氮原子的杂脂环基团。优选,氮杂芳香基碱具有5-或6-元芳香环,其芳香环中有一到三个氮。优选,氮杂脂环化合物是5-或6-元环,通常在环中含有一个或两个氮原子。氮杂环碱的实例包括嘧啶,1-烷基吡唑,特别是1-(C1-4烷基)吡唑、1-芳基吡唑、1-苄基吡唑,吡嗪,N-烷基嘌呤,特别是N-(C1-4烷基)嘌呤、N-芳基嘌呤、N-苄基嘌呤,N-烷基吡咯,特别是N-(C1-4烷基)吡咯、N-芳基吡咯、N-苄基吡咯,吡啶,N-烷基咪唑,特别是N-(C1-4烷基)咪唑、N-芳基咪唑,特别是N-苯基咪唑、N-苄基咪唑,喹啉,异喹啉,喹喔啉,喹唑啉,N-烷基吲哚,特别是N-(C1-4烷基)吲哚、N-芳基吲哚、N-苄基吲哚,N-烷基苯并咪唑,特别是N-(C1-4烷基)苯并咪唑、N-芳基苯并咪唑、N-苄基苯并咪唑,三嗪,噻唑,1-烷基-7-氮杂吲哚,特别是1-(C1-4烷基)-7-氮杂吲哚、1-芳基-7-氮杂吲哚、1-苄基-7-氮杂吲哚,吡咯烷,吗啉,哌啶和哌嗪。特别优选的氮杂环碱是吡啶类,如吡啶和3-甲基吡啶,以及N-(C1-4烷基)咪唑,如N-甲基咪唑。
叔胺是具有连接到三个碳原子上的氮原子的有机碱,往往是连接到三个芳基,通常是苯基,和/或烷基,通常是三个烷基上,包括例如三烷基胺如三甲胺、三乙胺和二异丙基乙胺。另外,叔胺可以是其中氮原子为非质子的氮杂环基团。优选为氮杂环基的叔胺。氮杂环叔胺的实例是N-烷基吡咯烷,N-芳基吡咯烷,N-烷基吡咯,N-芳基吡咯,N-烷基吗啉,N-芳基吗啉,N-烷基哌啶,N-芳基哌啶,N,N-二烷基哌嗪,N,N-二芳基哌嗪,N-烷基-N-芳基-哌嗪,奎宁环,1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。叔胺也可以是氮杂芳香基或氮杂脂环化合物。
仲胺是含有连接到单个氢和两个碳原子上的氮的有机碱。通常,氮原子连接到两个烷基或芳基上或成为氮杂环基团的一部分。仲胺化合物的实例包括二乙胺和二异丙胺。
特别优选的有机碱包括吡啶,3-甲基吡啶和N-甲基咪唑。
本发明方法所使用的方法可以原样按照通常使用氨基磷酸酯化学进行低聚核苷酸固相合成的工艺步骤,包括硫化、氧化和封端阶段。
当使用硫化剂时,优选硫化剂是有机硫化剂。
有机硫化剂的实例包括3H-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(也称为″Beaucage剂″),二苯甲酰基四硫化物,苯基乙酰基二硫化物,N,N,N′,N′-二硫化四乙基秋兰姆,元素硫和3-氨基-[1,2,4]-二噻唑-5-硫酮(参见美国专利6,096,881,其全部教导在此引入作为参考)。
用于使用上述试剂进行低聚核苷酸硫化的典型的反应条件可以参见Beaucage等人在四面体(1993),49:6123中的文章,其在此引入作为参考。
优选的硫化剂是苍耳烷氢化物,3-氨基-[1,2,4]-二噻唑-5-硫酮和苯基乙酰基二硫化物。
低聚核苷酸的硫化可以通过,例如使用3-氨基-[1,2,4]-二噻唑-5-硫酮在有机溶剂,如吡啶/乙腈(1∶9)混合物或吡啶中的溶液进行,其中该溶液的浓度为约0.05M-约0.2M。
可以使用的氧化剂的实例包括碘和过氧化物,如叔丁基过氧化氢。
希望的低聚核苷酸可以通过例如以下顺序的步骤制备,所述步骤包括使受保护的,通常是5′-受保护的核苷氨基磷酸酯与游离羟基偶合,将偶合步骤中形成的受保护的亚磷酸三酯氧化或硫化,形成磷酸酯或硫代磷酸酯低聚核苷酸,从低聚核苷酸上脱除保护基,并重复这一循环直到组装到所需的序列。低聚核苷酸可以从固体载体上分裂下来,任何残余的保护基,如核碱和磷保护基可以使用本领域已知的条件除去。
本发明的方法优选在导致固体载体溶胀的溶剂存在下进行。应当承认,溶剂的性质应当根据所使用固体载体的性质来选择。适当的溶剂的实例在本领域中众所周知,尤其包括乙腈,二甲基甲酰胺,N-甲基吡咯烷酮,二氯甲烷,THF和吡啶。
本发明的方法可以在宽范围的适当的反应器中进行,其包括,例如,反应塔、搅拌容器和固定床反应器。
本发明的方法使低聚核苷酸的合成能够比使用备选的羟基亚烷基氧衍生的固体载体的方法效率更高。
根据本发明的再一方面,提供一种具有下式的物质组合物:
Ps-Z-Q
其中:
Ps表示通过包括单体聚合的方法得到的聚合物,其中所述单体包括连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链受到对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基基团的保护;
Z表示单键或可分裂的连接基;和
Q表示H,保护基,核苷或低聚核苷酸,条件是当Z表示单键时,Q不是H。
可以由Ps表示的聚合物如上所述。
应当承认,当Z表示可分裂的连接基时,所述可分裂的连接基连接到聚(亚烷基氧)链的末端原子上,并且类似地,当Z表示单键时,基团Q连接到聚(亚烷基氧)链的末端原子上。这一原子最通常是氧原子,尽管当聚合物被衍生时,它可以是不同的原子,例如氮原子。
Z优选是式-Y2-L-Y3基团,其中Y2表示单键,-C(O)-,-C(O)NR17-或-C(O)O-,Y3表示单键,-C(O)-,-C(O)NR17-,-NR17-C(O)-,-C(O)O-,-O-C(O)-,-NR17-或-O-,L是桥连基,优选取代或未取代的脂族基或取代或未取代的芳基,通常包括多达6个碳原子。更优选,L是C2-4亚烷基,特别是亚乙基。R17是-H,取代或未取代的脂族基,如C1-4烷基,特别是甲基,或取代或未取代的芳基,特别是苯基。最优选,Z是式-CO-CH2CH2-CO-O-基团。
可以由Q表示的保护基应当根据Z的性质选择,包括胺和羟基保护基,优选对酸敏感的羟基保护基,特别是任选取代的三苯甲基基团,如单和二甲氧基三苯甲基基团。
可以由Q表示的核苷和低聚核苷酸如上所述,优选核糖核苷和脱氧核糖核苷,包括碱性核苷。核苷或低聚核苷酸可以通过本领域已知的不同位置连接到载体上。优选,通过核糖核苷或脱氧核糖核苷片断的5′-或3′-位,最优选通过3′-位连接。
用于脂族基、芳基、芳烷基、杂芳基、氮杂芳香基和杂脂环基基团的适当的任选取代基包括芳基,卤代芳基,烷基,卤代烷基(例如三氟甲基和三氯甲基),脂族醚,芳香醚,苄基,取代苄基,卤素,特别是氯和氟,氰基,硝基,-S-(脂族或取代的脂族基)以及-S-(芳族或取代的芳族)。
优选的物质组合物是下式的化合物:
其中,Ps如上所述,Rx是对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基,特别是二甲氧基三苯甲基,Ry是H、F、烯丙基、OMe、OCH2CH2OMe、或通过对碱不稳定的保护基或甲硅烷基-保护基保护的羟基,B是H、受保护的腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶片断或任选受保护的胸腺嘧啶、尿嘧啶或次黄嘌呤片断。
本发明的物质组合物可以通过使用本领域已知的用于把可分裂的连接基和核苷连接到聚合物载体上的方法制备,以形成用于根据本发明的第一方面制备低聚核苷酸的方法的聚合物。
现在将通过以下实施例来描述本发明,但本发明不受到这些实施例的限定。
实施例1-三苯甲基-四亚乙基二醇氧苯乙烯的制备
阶段1
将四甘醇(174克,0.9摩尔)置于装有温度计和回流冷凝器的三颈圆底烧瓶中。把吡啶(11立方厘米,0.135摩尔)加入到搅拌的混合物中。将三苯基甲基氯化物(25克,0.09摩尔)溶于甲苯(30立方厘米)中并把该溶液慢慢加入到混合物中。将混合物加热到50℃,在此温度下保持1小时。
将混合物冷却,并向烧瓶中加入甲苯(200立方厘米)。溶液用水(500立方厘米)萃取。水相用甲苯反萃取(2×100立方厘米)。合并有机层,并用水洗涤(2×100立方厘米),经硫酸镁干燥并过滤。减压蒸发除去甲苯,得到浅黄色油状物(产量38.5克,以三苯甲基计收率98%)。
阶段2
将单(三苯甲基)四甘醇(30克,0.069摩尔),4-甲苯磺酰氯(14.4克,0.076摩尔)和干燥的四氢呋喃(THF,50立方厘米)置于装有温度计和回流冷凝器的三颈圆底烧瓶中。将烧瓶置于干冰浴中,允许混合物冷却到约-20℃。在1小时内滴加KOH(25.2克,0.45摩尔)的水(100立方厘米)溶液,同时将温度保持在<0℃。加料之后将反应混合物搅拌1小时,同时使溶液升温至环境温度。
该溶液用二乙醚(3×150立方厘米)萃取。醚层经硫酸镁干燥,过滤并减压蒸发。固体用甲醇洗涤并真空干燥(产量34.3克,收率85%)。
阶段3
将NaOMe(0.55克,10.2毫摩尔)溶于最低量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中并加入到包含有4-乙酰氧基苯乙烯(1.3立方厘米,8.5毫摩尔)的圆底烧瓶中。将该溶液在环境温度下搅拌45分钟,然后加入单(三苯甲基)四甘醇的甲苯磺酰衍生物(5克,8.5毫摩尔)的DMF溶液。使得反应在室温下继续过夜。
减压蒸发除去DMF。将残余的油溶于乙酸异丙酯中并用水萃取。合并有机层,经硫酸镁干燥并过滤。减压蒸发除去溶剂,留下的浅黄色油状物,在静置时结晶(产量3.5克,收率77%)。
实施例2-10升规模的三苯甲基-四亚乙基二醇氧苯乙烯的制备
阶段1
将四甘醇(4188克,21.5摩尔)在氮保护气氛下加入到10升装有机械搅拌器并在60rpm下搅拌的容器中。向容器中加入吡啶(544克,6.9摩尔)并将混合物加热到50℃。把三苯甲基氯化物(1000克,3.6摩尔)在N2下溶于甲苯(3000毫升)中并慢慢地加入到保温在低于60℃的二醇中。将温度在50℃保持2小时,然后冷却到室温。加入2升甲苯,并用6升去离子水萃取混合物,水相用5升甲苯萃取。合并的有机萃取物用2×4升去离子水洗涤,经500克硫酸钠干燥,减压除去溶剂,得到1230克(以三苯甲基计74%的收率)浅黄色油状物,纯度94.3%(通过NMR检测)。
阶段2
将单(三苯甲基)四甘醇(1766.4克,3.8摩尔)与3升THF一起加入到10升容器中,并在搅拌下冷却到-12℃。将对甲苯磺酰氯(945克,5摩尔)加入到二醇/THF混合物中。在1小时内,向保温在低于-5℃的溶液中加入KOH(880克,15.7摩尔)的去离子水(3升)溶液。加料结束后,将容器升温到25℃,并保持12小时。分离各相,下部的水层用2×2.5升THF洗涤,合并有机层,减压除去溶剂。在7.5升醋酸异丙酯中的橙色/棕色油先用10升水萃取,然后用5×2升水萃取,经硫酸镁(500克)干燥,除去溶剂,得到1837克(78.0%)产物,粘性橙色油,纯度95.3%(通过NMR检测)。
阶段3
将去离子水(1.5升)和THF(2.1升)加入到10升容器中并在100rpm下开始搅拌。将容器冷却到-12℃,慢慢地加入氢氧化钾(535克,9.5摩尔)。将处于THF(1升)中的乙酰氧基苯乙烯(575毫升,3.7摩尔)在冷却的同时加入到容器中,加料时间约30分钟。将容器加热到30℃,并保持1小时,然后冷却到20℃。把处于1050毫升THF中的阶段2的产物(1800克,2.9摩尔)在15分钟内加入到反应器中,然后将混合物在60℃加热40小时。把反应冷却,分离各相,有机层用2×2升8M的氢氧化钾水溶液洗涤。减压除去溶剂,并将残余物溶于甲苯(5升)中,先用3×2升去离子水洗涤,然后用2×2升1M的氢氧化钠水溶液洗涤,最后2×3升去离子水洗涤。有机层经硫酸钠(500克)干燥,减压除去溶剂,得到1471克(75%)产物,橙色油,通过NMR检测纯度为79.7%。
实施例3-聚合物的合成和随后的脱保护
将部分水解的聚(乙烯醇)(Airvol 540,34.9克,2.5wt%的水溶液)和氯化钠(31.2克)加料到包含有去离子水(1181毫升)并装有机械搅拌器的2升圆柱形有挡扳的反应器中。将阶段3的产物(79.7%,87.2克)、苯乙烯(59.1克)、二乙烯基苯(80%,1.4克)和月桂酰过氧化物的混合物加入到反应器中并在400rpm下搅拌。20分钟后,把搅拌器速率降低到300rpm,并在50分钟内用水浴加热到80℃。16小时后,将反应混合物冷却,转移到50微米的布袋过滤器中,并用去离子水(5×1升)洗涤。然后,将聚合物微球用THF(4×1升)和二氯甲烷(DCM,2×1升)洗涤,并在5升包含有二氯甲烷(1800毫升)、三氟乙酸(128克)和三乙基硅烷(51.5克)混合物的法兰烧瓶/顶搅拌器中,在室温和氮保护下搅拌4小时。然后,对产物用二氯甲烷(4×1升)和己烷(5×1升)洗涤,之后在真空烘箱中干燥到恒重,得到78克白色聚合物微球,羟基负载为0.97毫摩尔/克。
实施例4-5′-DMTrOABz-3′-丁二酸酯与聚合物的偶合
将通过实施例3的方法制备的聚合物(0.51克,0.357毫摩尔)加入到50毫升装有小磁子的圆底烧瓶中。把5′-DMTrOABz-3′-丁二酸酯(1.28克,4当量)和羟基苯并三唑(HOBT,0.29克,6当量)溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP,大约5毫升)中,并向该溶液中加入二异丙基碳二酰亚胺(DIC,0.19克,4.2当量)。将DIC加入大约两分钟之后,向该溶液中加入二异丙基乙胺(0.19克,4.1当量)。将整个溶液旋动并快速加入到含有树脂的烧瓶中。被DIC污染的玻璃仪器和设备在2M氢氧化钠的浴液中去除污染。
将烧瓶封堵,并把混合物慢慢搅拌大约70小时。将红色/棕色混合物转移到烧结漏斗中并吸滤,树脂用NMP(3×约20毫升)洗涤。通过加入乙酸酐(0.29克,8当量)和二甲基氨基吡啶(DMAP,0.02克,0.5当量)的NMP(约30毫升)溶液并保持1小时来将任何残余的游离羟基封端,将氮气向上鼓泡通过树脂床来提供搅拌。排出反应物,树脂用DMF(5×10毫升)、DCM(5×10毫升)洗涤,最后用乙醚(3×20毫升)坍塌(collapse)。树脂用氮气流鼓气,并在真空烘箱中在室温下干燥过夜。用过的反应物溶液用NaOH溶液处理去除污染。
产物重量:0.739克
实施例5-5′-HOABz-3′-丁二酸酯-聚合物的制备
将实施例4制备的5′-DMTrOABz-3-丁二酸酯-聚合物(0.739克)加入到固相反应器中,该固相反应器包括适合于在氮保护气氛下操作的装有隔膜进口和Rotaflo支管的带夹套烧结反应器。氮气进口和出口都装有充满自动指示P2O5的在线干燥管。5′-DMTrOABz-3-丁二酸酯-聚合物用DCM(约10毫升)洗涤。反应器夹套用流体循环器冷却到0℃。使处于DCM(60毫升)中的3%v/v的二氯乙酸(DCA)在吸力下通过树脂床。微球上显示出红色,但是并不快速扩散到溶液中。微球也浮在溶液的顶部。只要所有的酸溶液都通过反应器,则先用DMF(5×约5毫升),然后用DCM(5×约5毫升)对树脂进行洗涤。洗涤树脂是通过使氮气向上流动通过树脂床并加入溶剂,之后用真空代替氮气以将树脂排干实现的。
通过使向上流动的氮气通过树脂床,把3%v/v的DCA在DCM(15毫升)中的溶液加入到反应器中。此时立即显示出深红色。1分钟后,将氮气流换成真空,排出酸溶液。将另一份30毫升的3%酸溶液在吸力下通过树脂。通过鼓以氮气使第三等分量15毫升的3%酸溶液在树脂中保留1分钟,之后用吸力排出。树脂用DMF(5×约5毫升)和DCM(5×约5毫升)洗涤。
如前段所述进行另外的″保留-冲洗-保留″处理,当树脂被洗涤之后,通过用乙醚(3×约10毫升)洗涤使其坍塌。
对滤液进行HPLC分析,正如在预测是否存在A核苷已经发生脱嘌呤作用时预测到的,没有表明存在有N-苯甲酰基腺嘌呤。
实施例6-GTACA低聚核苷酸的合成
采用氨基磷酸酯化学,使用以下偶合和脱三苯甲基条件来实现这一合成。使用通用的5′-二甲氧基三甲苯基脱氧核糖核苷-3′-β-氰基乙氧基-N,N-二异丙基氨基磷酸酯。
偶合
在偶合反应中,对于所有的″无水″步骤(即从预先偶合的洗涤一直到并包括硫化)来说,使用的DMF均是商品无水DMF(购自Aldrich),根据需要,其在4分子筛上,以大约100毫升的批量干燥过夜。这样得到的DMF,其水分含量为5-50ppm(Karl-Fischer法),而最初供应的原料为约150ppm。在这些步骤中,溶液的排出是通过在反应器的顶部,通过Rotaflo支管施加N2气正压,同时从烧结过滤器的底部施加吸力来实现的。最初在这一系列反应中使用的载体是在以上实施例5中制备的5′-HOABz-3′丁二酸酯-聚合物。
以下详细说明这一系列中的第一偶合和脱三苯甲基作用(dCbzamidite+5′-HOABz-3′-丁二酸酯-聚合物)。以相同的方式使用相同编号的相应氨基磷酸酯反应物的等价物(dAbz,dT和dGibu amidites)完成随后的偶合和脱三苯甲基作用。
将5′-HOABz-3′-丁二酸酯-聚合物(0.320毫摩尔)加入到固相反应器中,该固相反应器装有隔膜进口和Rotaflo支管,并适合于在氮保护气氛下操作。氮气进口和出口都装有充满自动指示P2O5的在线干燥管。树脂用无水DMF(3×约5毫升)和无水DCM(2×约5毫升)洗涤。将amidite(0.67克,0.8毫摩尔,2.5当量)与MeCN(2×10毫升)共沸干燥,并溶于无水DCM(约3毫升)中。通过国际专利申请WO03/004512的方法制备的糖精甲基咪唑盐(SMI,0.21克,0.8毫摩尔,2.5当量)加入到装有隔膜的烘干管瓶中,并溶于无水DMF(约0.5毫升)和无水DCM(约2.5毫升)中。然后,把amidite和SMI溶液以所述顺序,通过隔膜进口加入到预先溶胀的树脂中。
在保持用N2气对混合物温和鼓泡2小时之后,加入无水甲醇(约2毫升)。大约5分钟之后,将溶液从反应器中排出,树脂用无水DMF(3×约5毫升)和无水吡啶(2×约5毫升)洗涤。对用过的反应物溶液进行HPLC分析,估算在反应结束时残余的活性amidite的量。
将苍耳烷氢化物(0.12克,0.8毫摩尔,2.5当量)在无水吡啶(约4毫升)中的溶液加入到树脂中,并在温和的N2鼓泡下保持1小时,随后排出溶液。从反应器中除去上部物质,树脂用一组DMF(5×约5毫升)和DCM(5×约5毫升)洗涤,然后用封端A溶液(5∶3∶2的MeCN∶Py∶NMI,2×约5毫升)洗涤。然后把封端A溶液(2.5毫升)和封端B溶液(4∶1的MeCN∶Ac20,2.5毫升)加入到反应器中,混合物保持1小时。
排出用过的封端溶液,然后对树脂先用DMF(5×约5毫升)和DCM(5×约5毫升)洗涤,最后用乙醚(3×约5毫升)洗涤。之后将树脂留滞过夜,随后脱除三苯甲基。
脱三苯甲基
在脱三苯甲基之前,将反应器夹套冷却到0℃,树脂用DCM洗涤/预溶胀。3%(v/v)的DCA在DCM中(″酸溶液″)用来使树脂脱除三苯甲基。对于每一个脱三苯甲基循环来说,使用的酸溶液体积以被假定为连接到树脂上的每毫摩尔DMT167毫升为基准。
酸溶液(12毫升)在搅拌下与树脂共存1分钟,期间通过来自于烧结过滤器下方的氮气进行搅拌。通过吸力排出鲜红色的溶液,并使另外25毫升的酸溶液通过树脂床。第三份12毫升等分量的酸溶液与树脂共存1分钟,之后排出。树脂用DMF(5×约5毫升)和DCM(5×约5毫升)洗涤。
这一酸处理/洗涤循环再重复一次。最后的DCM洗涤之后,通过用乙醚(3×约5毫升)洗涤使树脂坍塌。
4个偶合步骤的平均偶合收率通过三苯甲基分析计算为97.5%。
Claims (13)
1.一种制备低聚核苷酸的方法,其包括组装连接于固体载体上的低聚核苷酸,其中所述固体载体是通过包括单体聚合的方法制备的,其中所述单体包括连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链用对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基基团保护。
2.根据权利要求1的方法,其中固体载体是通过包括下式(1)单体聚合的方法制备的:
其中:
R1是任选取代的乙烯基;
R2-4独立地为氢,烃基,卤素或烃氧基;
R5是任选取代的三苯甲基基团;和
n是2-10。
3.根据权利要求2的方法,其中R1与式R5-O-[C2-4亚烷基-O]-基团处于对位,R1是未取代的乙烯基,R2-4各自为H,C2-4亚烷基基团是-CH2CH2-,以及n是4。
4.根据在前权利要求任一项的方法,其中聚合在产生交联的条件下进行。
5.根据在前权利要求任一项的方法,其中低聚核苷酸通过氨基磷酸酯法组装。
6.根据在前权利要求任一项的方法,其中低聚核苷酸通过可分裂的连接基连接到固体载体上。
7.根据权利要求6的方法,其中可分裂的连接基是琥珀酰基,草酰基或三苯甲基连接基。
8.根据在前权利要求任一项的方法,还包括将低聚核苷酸与固体载体分裂开。
9.根据权利要求8的方法,其中低聚核苷酸在从固体载体上分裂下来之前,之间或之后脱保护。
10.具有下式物质的组合物:
Ps-Z-Q
其中:
Ps表示通过包括单体聚合的方法得到的聚合物,其中所述单体包括连接到可聚合单元上的受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链,其中受保护的羟基聚C2-4亚烷基氧链包含2-10个C2-4亚烷基氧基团,且其中羟基聚C2-4亚烷基氧链受到对酸敏感的保护基,优选任选取代的三苯甲基基团的保护;
Z表示单键或可分裂的连接基;和
Q表示H,保护基,核苷或低聚核苷酸,条件是当Z表示单键时,Q不是H。
11.根据权利要求10的物质组合物,其中Z是式-Y2-L-Y3基团,其中Y2表示单键,-C(O)-,-C(O)NR17-或-C(O)O-,Y3表示单键,-C(O)-,-C(O)NR17-,-NR17-C(O)-,-C(O)O-,-O-C(O)-,-NR17-或-O-,R17是-H,取代或未取代的脂族基或取代或未取代的芳基,L是桥连基。
12.根据权利要求11的物质组合物,其中L是C2-4亚烷基。
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CN113248352A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-13 | 湖南华腾制药有限公司 | 一种固相合成七甘醇单甲醚的方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BE755158A (fr) * | 1969-08-22 | 1971-02-22 | Rhodiaceta | Compositions thermoplastiques antistatiques |
DE3500180A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-07-10 | Ernst Prof. Dr. 7400 Tübingen Bayer | Pfropfcopolymerisate aus vernetzten polymeren und polyoxyethylen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
US4814514A (en) * | 1986-05-07 | 1989-03-21 | Dai-Ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd. | Surface active compounds having a polymerizable moiety |
JPH06260383A (ja) * | 1993-03-03 | 1994-09-16 | Nikon Corp | 露光方法 |
US5614010A (en) | 1994-03-14 | 1997-03-25 | Clearwater, Inc. | Hydrocarbon gels useful in formation fracturing |
US5466758A (en) | 1994-04-13 | 1995-11-14 | Yoon-Sik; Lee | Process for preparing polystyrenes having β hydroxy group and polyglycol-grafted polystyrenes thereof |
US5696248A (en) * | 1994-06-15 | 1997-12-09 | Hoechst Aktiengesellschaft | 3'-modified oligonucleotide derivatives |
KR19990064332A (ko) * | 1995-10-19 | 1999-07-26 | 래리 더블유. 스미스, 코크란 아담 | 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법 |
GB2325234B (en) * | 1996-01-23 | 2000-03-01 | Argonaut Technologies Inc | Graft copolymers formed via a 1,3-dioxyprop-2-yl linkage and their uses |
US5869696A (en) * | 1996-04-22 | 1999-02-09 | Beckman Instruments, Inc. | Universal solid supports and methods for their use |
US6096881A (en) * | 1997-05-30 | 2000-08-01 | Hybridon, Inc. | Sulfur transfer reagents for oligonucleotide synthesis |
GB9717158D0 (en) | 1997-08-13 | 1997-10-22 | King S College London | Solution synthesis of oligonucleotides and their phosphorothioate analogues |
US6274725B1 (en) * | 1998-06-02 | 2001-08-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Activators for oligonucleotide synthesis |
GB9814876D0 (en) * | 1998-07-10 | 1998-09-09 | Zeneca Ltd | Polymer |
WO2000059855A1 (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-12 | Esperion Therapeutics, Inc. | Ether compounds, compositions, and uses thereof |
JP2001064297A (ja) * | 1999-06-25 | 2001-03-13 | Sankyo Co Ltd | 新規ビシクロヌクレオシド誘導体 |
US6147200A (en) * | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
WO2001026692A1 (en) | 1999-10-08 | 2001-04-19 | Shearwater Corporation | Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation |
JP2004508379A (ja) * | 2000-09-07 | 2004-03-18 | アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチド合成用のシントン |
WO2003045969A1 (en) | 2001-11-21 | 2003-06-05 | Avecia Biotechnology Inc. | Coupling reagent for h-phosphonate chemistry |
GB0209539D0 (en) * | 2002-04-26 | 2002-06-05 | Avecia Ltd | Monomer Polymer and process |
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