CN1647801A - 一种金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗肿瘤、糖尿病、乙肝、戒毒、抗艾滋病、抗病毒、提高免疫功能，且毒副作用小的口服药物制剂，其含有以金黄色葡萄球菌经培养、除菌、过滤所得的代谢产物原液；或主要含有肠毒素A、B、C1、C2、C3、D和TSST－1中的一种或一种以上活性成分的金黄色葡萄球菌代谢产物，其中肠毒素A、B、C1、C2、C3、D和TSST－1活性成分中至少一种的含量是1～50ng/ml，其他种活性成分的含量是0～50ng/ml。本发明口服制剂对防治肿瘤、糖尿病、乙肝、戒毒、抗艾滋病、抗病毒、提高免疫功能等有很好的疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体地说涉及金黄色葡萄球菌代谢产物口服药物制剂及其应用。
技术背景
金黄色葡萄球菌是自然界广泛存在的致病菌，会产生多种毒素与酶，例如：溶血素、杀白血球素、表皮溶解毒素、肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin，缩写为SE)、毒性休克综合症毒素I(Toxic Shock Syndrome Toxin 1，缩写为TSST-1)、凝固酶、DNA酶、蛋白酶、脂酶、肽酶等。肠毒素是一种可溶性蛋白质，单一的多肽链，含有较多的赖氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸等氨基酸，耐热，经100℃煮沸30分钟不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响，故误食污染肠毒素的食物后，在肠道作用于内脂神经受体，传入中枢，刺激呕吐中枢，引起呕吐，并产生急性胃肠炎症状。肠毒素SE含有A、B、C、D四种血清型(分别缩写为SEA，SEB，SEC，SED)，其中肠毒素SEC又被分为C1、C2及C3三血清型(分别缩写为SEC1，SEC2，SEC3)。
90年代开展了利用金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1、C2、D等作超级抗原用于癌症治疗方面的研究。JP5445161公开了，将葡萄球菌属金色细胞或细菌体粉碎、过滤所得滤液用于防治恶性肿瘤的免疫性增强剂。CN1023567C公开了，金黄色葡萄球菌培养、除菌、过滤所得滤液制得治疗恶性肿瘤的注射液。美国专利6126945和6336845中指出，包括金黄色葡萄球菌肠毒素在内的超抗原有对荷瘤宿主杀灭肿瘤细胞，促进抗肿瘤免疫及治疗癌症的作用。中国专利申请CN1233504A公开了用可产生金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1、C2的菌种培养、除菌、纯化等步骤制备治疗晚期恶性肿瘤的注射液。但至今为止尚未发现将金黄色葡萄球菌代谢产物用于治疗其他疾患或用作口服制剂。
发明内容
为克服已有技术的不足，本发明的目的在于提供用于治疗肿瘤、糖尿病、乙肝、戒毒、抗艾滋病、抗病毒、提高免疫功能，且毒副作用小的口服药物制剂。
本发明人经过深入地大量研究，发现金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)代谢产物作为口服制剂用于用于治疗肿瘤、糖尿病、乙肝、戒毒、抗艾滋病、抗病毒、提高免疫功能，有很好的疗效。
本发明提供一种金黄色葡萄球菌代谢产物口服药物制剂，其含有以金黄色葡萄球菌经培养、除菌、过滤所得的代谢产物原液。所述的培养、除菌、过滤方法可以是常规的、已知的金黄色葡萄球菌培养、除菌、过滤方法。所述的金黄色葡萄球菌可以是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、CGMCC0662。
所述的CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、CGMCC0662金黄色葡萄球菌株可以用常规的培养、除菌、过滤方法制得所述的代谢产物原液。也可以按照包括以下步骤的方法得到所述的代谢产物原液：
(1)将CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、或CGMCC0662的金黄色葡萄球菌株接种于琼脂斜面上，于20～40℃下，进行复苏培养12～72小时，得到复苏种子。所述琼脂斜面可以是常规的复苏培养基。
(2)将所得复苏种子接种于增菌培养基中，20～40℃下培养12～72小时，得到增菌种子。所述增菌培养基可以是常规培养基，也可以含有猪心浸液的猪心培养基。
(3)将增菌种子接种于发酵培养基中，在20～40℃下，pH5～8，0～90％溶氧量条件下发酵18～72小时。所述增菌培养基可以是常规培养基，也可以是含猪心浸液的猪心培养基。所述的接种量可以是1～10％。
(4)将上述步骤所得发酵液除菌过滤，得到金黄色葡萄球菌代谢产物原液，即本发明的口服药物制剂。
所述第(1)步中的复苏培养基可以包括以下组份：0.5～2％酪蛋白胨，0.5％氯化钠，和0.5％琼脂。
所述第(2)和(3)步中所述含有猪心培养基包括以下组成的培养基：0.5～2％蛋白胨，0～10％猪心浸液，0.1～1.0％氯化钠，0.01～0.02％硫酸镁，0.005～0.02％氯化钙，及0.5％琼脂；或是组成为1～20％猪心浸液，0.5～2％蛋白胨，0～0.2％磷酸盐，0.1～1.0％氯化钠，硫胺0.0～0.05％，及5～30％羊肝浸液的培养基。所述蛋白胨可以是常规的蛋白胨，也可以是胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、或酪蛋白胨。所述的猪心浸液可以按常规方法制得，也可以按照以下方法制得：取新鲜猪心洗净，弄碎，加2倍以上水量，例如，加入注射用水2～5倍量，煮沸1～2小时后冷却，于0～8℃，放置14小时以上，以沉淀大分子物质，凝聚脂肪以便除去，过滤，即可。
所述含猪心浸液的猪心培养基可按以下方法制备：取适量胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、或酪蛋白胨与氯化钠，硫胺用水加热溶解。再加入适量所述猪心浸液或猪心浸液和羊肝浸液(按照制备猪心浸液的方法制得)，加入适量水混匀。其他组分的物质可按照常规方法在适当的步骤中加入。用酸调其pH值至3～4，按体积量加入0.5g％活性碳，搅拌煮沸1～2小时，过滤除去活性碳。用碱调所得滤液的pH值至7～9，按体积量加入0.5g％活性炭，再次煮沸0.5～2小时，过滤除去活性碳，所得滤液用酸调pH值至6.0～7.5，高压灭菌，即可。
所述的第(4)步骤所述的除菌过滤可以用常规微孔滤膜来进行。
本发明提供一种金黄色葡萄球菌代谢产物口服药物制剂，其主要含有肠毒素A、B、C1、C2、C3、D和TSST-1的一种或一种以上活性成分的金黄色葡萄球菌代谢产物，其中肠毒素A、B、C1、C2、C3、D和TSST-1活性成分中的至少一种的含量是1～50ng/ml，其他种活性成分的含量是0～50ng/ml。本发明的主要含有肠毒素A、B、C1、C2、C3、D或TSST-1的金黄色葡萄球菌代谢产物口服药物制剂，可以分别由CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、CGMCC0662金黄色葡萄球菌株经培养、除菌、过滤方法制得。
本发明提供一种金黄色葡萄球菌代谢产物口服药物制剂含有肠毒素C2，其中肠毒素C2的含量可以是1～50ng/ml。所述的肠毒素C2可以从金黄色葡萄球菌经培养、除菌、过滤所得的代谢产物原液中分离出的。从所述金黄色葡萄球菌代谢产物原液中分离出肠毒素C2可以按照常规或已知的的方法进行。
所述的肠毒素C2、可以通过用超滤膜包超滤除去金黄色葡萄球菌代谢产物原液中的小分子杂质，采用离子交换树脂吸附和离子交换层析除去杂蛋白，利用分子筛进行进一步纯化的方法分离得到。也可以按照以下方法进行：
将金黄色葡萄球菌代谢产物原液，用超滤膜包超滤除去小分子杂质，用pH5.6～6.8的PB稀释所得滤液，以使所得液电导率小于2000μs/cm，调节所得液的pH值为5.6～6.8，用阳离子交换树脂吸附1～2次。用无机盐溶液洗脱，收集洗脱液。调节所得洗脱液的pH值为5.6～6.8，采用离子交换层析分离，收集含有SEC2的组份。采用分子筛进一步除去杂质，即得SEC2，其纯度可以达到95％以上。
所述滤膜包可以是截流5K～10K分子量的常规滤膜包。所述磷酸缓冲液浓度可以是5mM～50mM。
所述的肠毒素C2的等电点为5.00～7.44，分子量为26000～34000，紫外最大吸收波长为277～278nm，N末端15个氨基酸序列为ESQPDPTPDELHKSS。
本发明提供的一种金黄色葡萄球菌代谢产物口服药物制剂还可以含有药学上可用的辅料。所述的药学上可用的辅料包括：可调节本发明口服药物制剂口味的物质，可稳定有效组分的物质。所述可稳定有效组分的物质可以是在药学上通常用于稳定各有效组分的物质。所述可调节本发明口服药物制剂口味的物质可以是在药学上通常用于调节口服剂口味的物质，例如：甜味剂，该甜味剂可以是通常在药物制备中用做甜味剂的物质，例如：阿司帕坦。在本发明口服药物制剂中所述辅料的含量可以是常规用量，例如所述甜味剂的含量可以是0.05～1％。所述甜味剂包括常规或已知的甜味剂，例如阿司帕坦。所述辅料可以按照常规方法与本发明药物制剂的其他成分混合，除菌过滤后，即得本发明药物制剂。
本发明口服制剂也可以按照常规或已知方法，与药学上可接受的辅料，制备成片剂、胶囊、冻干制剂等其他口服制剂的剂型。所述的辅料可以是通常用于制备口服制剂的常规或已知的辅料。
本发明提供的药物口服制剂可以用于防治肿瘤、糖尿病、乙肝、肺结核、艾滋病、戒毒、抗病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒)、提高免疫功能。
所述的肿瘤包括食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、脑膜瘤、慢粒、膀胱癌等。
本口服液中添加的甜味剂为阿司帕坦，口感好，甜度高，热量低，即适用于普通人群，也适用于糖尿病患者和肥胖病患者。
本发明口服药物制剂在所用剂量下，能增强机体免疫功能，对防治肿瘤、糖尿病、乙肝、肺结核、艾滋病、戒毒、抗病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒)、提高免疫功能，都有很好的疗效，且毒性低微。本发明口服药物制剂具有服用方便，利于贮存，副作用小，成本低廉等特点。可避免注射给药所带来的局部红肿、疼痛、发热、静脉炎等不良反应，以及使用不方便的弊端。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
购买市售金黄色葡萄球菌代谢产物“高聚生”(沈阳协合生物制药股份有限公司生产)为本发明的金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂Y-1。
购买市售金黄色葡萄球菌代谢产物“恩格非”(浙江耀江药业有限公司)为本发明的金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂Y-2。
购买市售金黄色葡萄球菌代谢产物“高士达”(长春高士达生物制药股份有限公司)为本发明的金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂Y-3。
实施例2-4、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)培养基制备：
(i)猪心浸液制备：取新鲜猪心洗净弄碎，加入5倍量注射用水加热至沸保持2小时，于4℃放置14小时，用布氏漏斗抽滤，即得猪心浸液。
(ii)取适量胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、或酪蛋白胨与氯化钠，硫胺用水加热溶解。再加入适量第(i)步所得猪心浸液、羊肝浸液(按照第
(i)步方法制得)，加入适量水混匀。用HCl溶液调其pH值分别至3、4、4，按体积量加入0.5％(g/ml)活性碳，搅拌下分别煮沸1、1.5、2小时，过滤除去活性碳。用NaOH溶液分别调所得滤液的pH值至7、8、9，按体积量加入0.5％(g/ml)活性炭，分别再次煮沸1、1.5、2小时，过滤除去活性碳，所得滤液用HCl溶液分别调pH值至6.0、7.0、7.5，高压灭菌，即得有如下组成的猪心培养基：(重量％)
猪心培养基I：10％猪心浸液，1％大豆蛋白胨，0.1％磷酸盐，0.5％氯化钠，硫胺0.01％，及15％羊肝浸液。
猪心培养基II：5％猪心浸液，0.5％胰蛋白胨、0.2％氯化钠，0.05％硫胺，及25％羊肝浸液。
猪心培养基III：20％猪心浸液，2％鱼蛋白胨，0.2％磷酸盐，1.0％氯化钠，及5％羊肝浸液。
(iii)分别将适量以下物质混合均匀，经121℃，30分钟高压灭菌，即得常规培养基I、II、III：(重量％)
I：1％胰蛋白胨，0.1％氯化钠，0.02％硫酸镁，0.005％氯化钙，0.5％琼脂。
II：0.5％大豆蛋白胨，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁，0.01％氯化钙，及0.5％琼脂。
III：2％鱼蛋白胨，1.0％氯化钠，0.01％硫酸镁，0.02％氯化钙，及0.5％琼脂。
(2)合并接种培养、发酵、除菌，制剂的制备
菌种复苏：分别将CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381金黄色葡萄球菌菌株接种在以下组成的琼脂斜面上，20、30、40℃，70、40、12小时，进行复苏培养，得到复苏种子。琼脂I：0.5％酪蛋白胨，0.5％氯化钠，和0.5％琼脂。
琼脂II：1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠，和0.5％琼脂。
琼脂III：2％酪蛋白胨，0.5％氯化钠，和0.5％琼脂。
增菌培养：分别将所得复苏种子接种于猪心培养基I、II、常规培养基I中，分别在20、30、40℃下培养12、56、72小时，得到增菌种子。
扩大培养：分别将增菌种子按2、5、10％的接种量，接种于猪心培养基III、常规培养基I、II中，分别在20、30、40℃下，pH5、6、8，90、50、0％溶氧量条件下分别发酵20、50、70小时。将所得发酵液分别用微孔滤膜除菌过滤，得到金葡菌代谢产物原液，本发明口服制剂Y-4、Y-5、Y-6，其分别活性成份肠毒素C1、C2、C3，3、34、48ng/ml，其他种活性成分的含量分别是SEB、SED、SED，0.5ng/ml、1ng/ml、0.8ng/ml。将所得原液分别加入0.1％、0.5％、1％的阿斯巴坦，即得本发明制剂H-1、H-2、H-3。
实施例5、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(i)取新鲜猪心洗净，弄碎，加入2倍量注射用水于4℃放置14小时，加热至沸保持二小时，用布氏漏斗定量滤纸抽滤，即得猪心浸液。
(ii)取适量酪蛋白胨与氯化钠，用注射用水加热溶解，加入适量第(i)步所得猪心浸液和硫酸镁，加入适量注射用水混匀，得组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁和0.005％氯化钙的增菌培养基。
(iii)在无菌条件下将CGMCC0341菌种，接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基的琼脂斜面上，35℃下，培养20小时。
(iv)在无菌条件下，将复苏种子接种于装有100ml/瓶第(ii)步所得培养基的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(v)配制30升与第(ii)步骤相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％接种量接入第(iv)步骤所得的增菌液；于35℃，调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下，发酵20小时。
(vi)将第(v)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含SEA的金黄色葡萄球菌代谢产物原液本发明的口服药物制剂Y-7，其含主要活性成分SEA 17ng/ml。
实施例6、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施5制得的本发明口服药物制剂Y-7中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，将混合液在无菌条件下分装10ml/支，即得本发明口服药物制剂H-4。
实施例7、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)在无菌条件下将CGMCC0342菌种，接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基琼脂斜面上，于35℃下，培养24小时。
(2)在无菌条件下，将前述步骤所得复苏种子接种于装有150ml/瓶组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁和0.005％氯化钙的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(3)配制30升与第(2)步骤培养基相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％接种量接入第(2)步骤所得的增菌液；于35℃调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下发酵20小时。
(4)将第(3)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含SEB的金黄色葡萄球菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-8，其含有主要活性成分SEB 23ng/ml。
实施例8、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施7制得的本发明制剂Y-8中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌下分装10ml/支，即得本发明的口服药物制剂H-5。
实施例9、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)在无菌条件下将CGMCC0485菌种，接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基琼脂斜面上，于35℃下，培养22小时。
(2)在无菌条件下，将第(1)步骤所得复苏种子接种于装有100-150ml/瓶组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁及0.005％氯化钙培养液的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(3)配制30升与第(2)步骤相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％量接种第(2)步骤所得的增菌种子；于35℃，调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下，发酵20小时。
(4)将第(3)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含SEC1的金黄色葡萄球菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-9，其含有主要活性成分SEC1 27ng/ml。
实施例10、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施9制得的Y-9中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得本发明的口服药物制剂H-6。
实施例11、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)在无菌条件下将CGMCC No.0165菌种接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基琼脂斜面上，于35℃下培养23小时。
(2)在无菌条件下，将复苏种子接种于装有130ml/瓶组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁和0.005％氯化钙培养基的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(3)配制30升与第(2)步骤相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％量接种第(2)步骤所得的增菌种子；于35℃，调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下，发酵20小时。
(4)将第(3)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含SEC2的金黄色葡萄球菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-10，其含有主要活性成分SEC2 21ng/ml。
实施例12、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例11制得的Y-10中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得本发明的口服药物制剂H-7。
实施例13、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
将实施例11所得金黄色葡萄球菌代谢产物原液用8K分子量的超滤器超滤，并用40mM的PB(pH6.2)稀释截留液，使截留液电导率小于2000μs/cm。向截留液中加入724树脂(pH6.210mM的PB平衡)搅拌吸附2次，去除上清液。用0.5％的无机盐溶液洗脱724树脂，保留洗脱液。将洗脱液用8K超滤器脱盐，调pH6.2，用CM-Sepharose(10mM，pH6.2的PB平衡)层析柱，10mM pH6.2的PB和0.25M pH7.0的PB，0.5％无机盐梯度洗脱，收集含有SEC2的组份。将含有SEC2的组份超滤脱盐，调pH6.8，用Sephydex G75柱进一步分离，即得SEC2纯品，加入水配成SEC2浓度为15ng/ml的本发明的口服药物制剂C-1。
实施例14、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例13制得的C-1中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得含有SEC2和阿斯巴坦的本发明的口服药物制剂H-8。
实施例15、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)培养基的制备
猪心浸液制备：取新鲜猪血、去除血块、脂肪、筋膜用2倍新鲜重蒸馏水置冰箱(4℃)14小时，煮沸2小时，趁热用8层纱布粗滤，再用布氏漏斗定量滤纸抽滤，得澄清黄色液体备用。羊肝浸液用同样方法制备。
按需配药量，称取蛋白胨、氯化钠，用新鲜重蒸馏水加热溶液。按需配药量量取(吸取)猪心浸出液、羊肝浸出液和硫胺。将前面两种的溶液混合，加针剂用新鲜重蒸馏水至所需量。调pH至3加入0.5g％针剂用粉末状优质活性炭，搅拌下煮沸半小时。用布氏漏斗抽滤脱碳。调pH至8，加0.5％针剂用粉末状优质活性炭再次煮沸半小时。抽滤脱碳。调pH至7.0分装500ml(已经清洁液处理，重蒸馏水洗净180℃干烤2小时除热源的)盐水瓶加铝盖轧口。高压15磅30分钟灭菌备用，即得以下组成的培养基：1％胰蛋白胨，0.2％氯化钠，硫胺0.05％，猪心浸液10ml％，羊肝浸液15ml％
(2)合并接种培养、发酵、除菌，制剂的制备
复苏培养：将金黄色葡萄球菌CGMCC No.0165接种于用猪心浸出液配制的营养琼脂斜面(1％酪蛋白胨，2％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.02％硫酸镁，0.01％氯化钙，琼脂0.5％)35℃培养18小时。
取斜面培养适量，均匀磨于1ml脱脂牛奶制成悬液分装入无菌菌种管，每管0.3ml。将装有菌悬液的菌种管置-30℃低温酒精中速冻1小时。将冻结后的菌种管真空干燥约需7小时。密封，真空抽气约10-20分钟，在真空下封口。接种有浓度10亿/ml，比例2ml％，培养在35℃，35小时，调整pH6.5，微孔滤膜0.22μ除菌过滤，即得主要含SEC2的金葡菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-11，其含主要活性成分SEC2 30ng/ml，SED 0.5ng/ml。
实施例16、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例15制得的Y-11中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得本发明的口服药物制剂H-9。
实施例17、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
将实施例15所得金葡菌代谢产物原液用10K分子量的超滤器超滤，并用40mM的PB(pH6.2)稀释截留液，使其电导率小于2000μs/cm。加入724树脂(pH6.2 10mM的PB平衡)搅拌吸附2次，去除上清液。用0.5％的无机盐溶液洗脱724树脂，保留洗脱液。将洗脱液用8K超滤器脱盐，调pH6.2，用CM-Sepharose(10mM，pH6.2的PB平衡)层析柱，10mM pH6.2的PB和0.25M pH7.0的PB，0.5％无机盐梯度洗脱，收集含有SEC2的组份。将含有SEC2的组份超滤脱盐，调pH6.8，用Sephydex G75柱进一步分离，即得SEC2纯品，加水配成15ng/ml，本发明的口服药物制剂C-2。
实施例18、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例17制得的C-2中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得含有SEC2和阿斯巴坦的本发明的口服药物制剂H-10。
实施例19、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)在无菌条件下将CGMCC0381菌种，接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基琼脂斜面上，于35℃下，培养24小时。
(2)在无菌条件下，将复苏种子接种于装有130ml/瓶组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁和0.005％氯化钙培养基的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(3)配制30升与第(2)步骤相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％量接种第(2)步骤所得的增菌种子；于35℃，调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下，发酵20小时。
(4)将第(3)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含SEC3的金黄色葡萄球菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-12，其含有主要活性成分SEC3 30ng/ml。
实施例20、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例19制得的Y-12中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得含有本发明的口服药物制剂H-11。
实施例21、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)在无菌条件下，将CGMCC0780菌种接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基琼脂斜面上，于35℃下，培养21小时。
(2)在无菌条件下，将复苏种子接种于装有140ml/瓶组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁和0.005％氯化钙培养基的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(3)配制30升与第(2)步骤相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％量接种第(2)步骤所得的增菌种子；于35℃，调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下，发酵20小时。
(4)将第(3)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含SED的金黄色葡萄球菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-13，其中含有主要活性成分SED 41ng/ml。
实施例22、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例21制得的Y-13中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得本发明的口服药物制剂H-12。
实施例23、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
(1)在无菌条件下将CGMCC0662菌种，接种在组成为1％酪蛋白胨，0.5％氯化钠和0.5％琼脂的培养基琼脂斜面上，于35℃下，培养21小时。
(2)在无菌条件下，将复苏种子接种于装有110ml/瓶组成为1％酪蛋白胨，5％猪心浸液，0.5％氯化钠，0.01％硫酸镁和0.005％氯化钙培养基的三角摇瓶中，于100rpm，35℃下，振摇培养20小时。
(3)配制30升与第(2)步骤相同的培养液，于40升发酵罐中121℃，20分钟，冷却至35℃后，按5％量接种第(2)步骤所得的增菌液子；于35℃，调溶氧值为90％至10％，及pH7.0±0.5的条件下，发酵20小时。
(4)将第(3)步骤所得液用连续流管式离心机除菌，再用0.22μm微孔滤膜过滤彻底除菌，即得主要含TSST-1的金黄色葡萄球菌代谢产物原液，本发明的口服药物制剂Y-14，其含有主要活性成分TSST-1 11ng/ml。
实施例24、制备金黄色葡萄球菌代谢产物药物口服制剂
于实施例23制得的Y-14中，按0.05％加入阿斯巴坦，混均，无菌分装10ml/支，即得本发明的口服药物制剂H-13。
实施例25、本发明药物口服制剂的抗肿瘤作用和免疫调节作用
对本发明药物制剂Y-1、Y-2、Y-3、Y-7、Y-8、Y-9、Y-11、Y-12、Y-13、Y-14进行了抗肿瘤作用及免疫调节作用的试验，试验选用C57BL/6j小鼠及昆明种小鼠，分别于右腋窝皮下接种Lewis肺癌、H22肝癌两种瘤株，将本发明药物制剂分别以10、25、40ml/kg的剂量，设3个剂量组经口灌胃给药，每天一次连续给药12次，给药结束后处死动物，分别称瘤重、体重，计算抑瘤率等来检测本发明药物制剂的抑瘤作用。结果表明本发明的药物制剂均有抑瘤作用，高剂量组抑瘤率达到或接近40％，低剂量组也有抑瘤作用。
免疫调节作用试验采用单次腹腔注射环磷酰胺造成免疫功能低下的小鼠动物模型。对各给药组各项检测指标进行测定：脾脏重量指数、半数溶血值(HC50)、conA诱导的脾淋巴细胞转化能力测定，NK细胞活性测定，白细胞介素II含量测定，结果表明本发明的药物制剂给药组均明显高于环磷酰胺模型对照组，统计学比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)。其中以中、高剂量组给药后模型小鼠免疫功能的恢复和改善最为明显。
从上述试验结果可知，本发明金黄色葡萄球菌代谢产物药物制剂经口给药有抗肿瘤和增强机体的免疫功能的作用
实施例26
按照实施例11的方法制备本发明口服药物制剂，只是培养温度分别为20℃、30℃、40℃，时间分别为72、55、15小时，制得三种代谢产物原液，本发明制剂Y-15、Y-16、Y-17，分别含主要活性成分SEC213ng/ml、20ng/ml、26ng/ml及SED 0.5ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml。
按实施例13方法分离所得原液得肠毒素C2，只是724树脂平衡pH改为5.6、6.0和6.8，洗脱1次，层析柱改为DEAE分离肠毒素C2，得本发明制剂C-4、5、6。将所得的肠毒素C2C-4、5、6与实施例13得到的肠毒素C2C-1，以ELISA方法识别并定量，同时以SDS-PAGE电泳检测其纯度，电泳检测纯化样品均只见一条带；采用蛋白质紫外扫描检测其纯度，纯化样品分别在278、278、277、278nm处有一个吸收峰；说明所纯化的样品为电泳一纯。经毛细管电泳测定出蛋白质的等电点为5.90～7.44(5.90、7.37、7.42、7.44)，，经飞行质谱测定出蛋白质分子量26000～34000；N末端15个氨基酸序列均为ESQPDPTPDELHKSS。
实施例27、本发明口服药物制剂的免疫调节作用
试验选用体重为18-20g的LACA纯系小鼠，分为免疫功能低下模型组和正常对照组。模型组分为使用高、低剂量的本发明制剂Y-11的二组，不给药对照组，即环磷酰胺组。模型组各组动物单次皮下注射环磷酰胺50mg/Kg(上海华联制药有限公司生产)造成免疫功能低下，SEC2以0.6、2.4μg/kg的剂量，设2个剂量组经口灌胃给予，每天1次给药，连续10次，进行以下各种免疫指标测定。结果如下。
(1)小鼠IL-2含量测定
各组动物给药10天后取眼眶血，经离心取血清。采用放免方法(放免测试药盒由北京东亚免疫技术研究所制)测定各组血清IL-2结果见下表。
表1：本发明制剂对小鼠IL-2含量的影响(n＝10)
组别 IL-2(ng/ml)
正常对照组 10.72±1.44a
高剂量组 8.23±2.01a
低剂量组 4.32±1.18a
环磷酰胺组 2.32±0.8
注：各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01
由表可见，给药10天后，给药组的血清IL-2含量均明显高于不给药的环磷酰胺组，其差异均非常显著(p值均小于0.01)。说明本发明制剂可改善和增加免疫低下模型小鼠产生和释放免疫活性因子。
(2)小鼠NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力测定
无菌取实验小鼠脾脏，制备单个脾细胞悬液，用淋巴细胞分离剂分离出单个细胞，配成1×107/ml细胞浓度，领取YAC-I细胞株，配成2×105/ml，上述细胞悬浮液各取0.1ml，加入96孔板内，37℃孵育4小时，离心，取上清液0.1ml加入基质后，在酶标仪上测定OD值(490nm)计算NK细胞活性(NK细胞活性＝100％×(样品OD值-自然释放孔OD值)/(全释放孔OD值-自然释放孔OD值)。
无菌取小鼠脾脏制备单个脾细胞悬浮液。配制成8×106/ml，取0.1ml加入96孔板，另每孔加ConA0.1ml(5μg/ml)37℃培养70小时，弃上清130μl，加入MTT20μl(5μg/ml)，培养2小时，加裂解液80μl，在酶标仪上测定OD值(570nm)。各组实验小鼠NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力变化结果见下表。
表2：本发明制剂对NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力影响
组别 NK细胞活性(％) ConA反应(OD)
正常对照组 15.558±2.469a 0.644±0.088a
高剂量组 15.033±2.195a 0.719±0.185a
低剂量组 11.483±2.702b 0.711±0.155a
环磷酰胺组 9.842±2.852 0.413±0.048
注：n＝12；各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01；b∶p＜0.05
由表可见，单纯注射环磷酰胺组其NK细胞活性(％)和ConA诱导淋巴细胞转化反应能力(OD)均值较正常对照组明显降低。
口服本发明制剂后，各给药组模型小鼠NK细胞活性(％)和ConA诱导淋巴细胞转化反应能力(OD)逐渐升高，于给药10天后其均值明显高于单纯注射环磷酰胺组。统计学分析，除低剂量NK细胞活性与环磷酰胺空白对照组比较p值小于0.05外，其它各给药组与环磷酰胺空白对照组比较差别有非常显著意义(p值均小于0.01)，接近正常组水平。结果表明：本发明制剂可提高或改善免疫功能低下模型小鼠的细胞免疫水平。
(3)小鼠脾脏重量和指数的变化
于停药后24小时脱颈处死试验小鼠，解剖脾脏，称重后分别计算脾重指数(脾重指数＝(小鼠体重(g))/(脾脏重量(mg)))结果见下表。
表3：小鼠脾脏重量和指数变化比较(n＝10)
组别 脾脏重量(g) 脾脏指数(mg/g) P值
正常对照组 0.272±0.05 9.22±2.03 ＜0.01
高剂量组 0.230±0.06 8.97±2.60 ＜0.01
低剂量组 0.210±0.04 7.96±1.69 ＜0.05
环磷酰胺组 0.185±0.02 6.61±0.42 -
注：各组p值均与环磷酰胺组比较。
从表可见，单纯注射环磷酰胺组动物脾脏重量和脾重指数明显小于注射环磷酰胺的给药组，统计学分析：各组脾重指数均值与环磷酰胺空白对照组比较，本发明制剂各给药组差异显著。
(4)小鼠半数溶血值(HC50)
于给药第6天各组动物腹腔注射绵羊红细胞(SRBC)，注射细胞量为2％(v/v)，SRBC悬浮液0.2ml/只，注射后第5天摘眼眶取血，分离血清，按常规方法进行半数溶血值(HC50)测定，用751分光光度计测定HC50。实验结果见下表。
表4：小鼠HC50的变化(n＝10)
组别 HC50 p值
正常对照组 366.66±42.28 ＜0.05
高剂量组 231.49±65.82 ＜0.05
低剂量组 240.72±50.40 ＜0.05
环磷酰胺组 187.07±33.88 -
注：各组p值均与环磷酰胺组比较。
由表可见，给药10天后，各给药组模型小鼠半数溶血值(HC50)均低于正常对照组水平，但各组HC50均值明显高于同期单纯环磷酰胺组，本发明制剂组HC50与环磷酰胺空白对照组比较，p值均小于0.05，差异显著。因此，口服本发明制剂可不同程度的提高或改善免疫功能低下模型小鼠的体液免疫功能。
结果表明本发明制剂具有改善和提高因注射环磷酰胺所致免疫功能低下的作用。经对小鼠脾脏重量、HC50、NK细胞活性、ConA诱导的脾淋巴细转化能力、血清IL-2含量等项指标测定，注射环磷酰胺后经口给予主要有效成分含SEC2的金黄色葡萄球菌滤液的本发明制剂，其上述各免疫指标均明显高于单纯注射环磷酰胺组，统计学分析，差别有显著或非常显著意义(p＜0.05或p＜0.01)，而且有剂量效应关系。
实施例28、本发明口服药物制剂的抗肿瘤作用
取C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种H22、Lewis肺癌及S180三种瘤株后，用本发明制剂Y-11经口给药，以SEC2 0.6、7.8μg/kg的剂量设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察主要含SEC2的本发明制剂经口给药对小鼠移植性肿瘤的抑制作用。结果见下表。
表5：本发明制剂对小鼠肝癌H22的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
对照组 2.36±0.58
高剂量组 1.34±0.34 43.0 ＜0.01
低剂量组 1.87±0.96 25.0 ＞0.05
环磷酰胺 0.74±0.24 69.0 ＜0.01
表6：本发明制剂对小鼠S180的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
P值
X±SD (％)
对照组 2.65±1.02
高剂量组 1.42±0.53 43.2 ＜0.01
低剂量组 1.64±0.51 34.4 ＜0.05
环磷酰胺 0.83±0.25 66.7 ＜0.01
表7：本发明制剂对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
对照组 1.81±0.73
高剂量组 1.11±0.23 40.7 ＜0.01
低剂量组 1.43±0.52 21.0 ＞0.05
环磷酰胺 0.75±0.38 58.6 ＜0.01
结果表明对小鼠H22、Lewis肺癌以及S180均有抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率分别接近或达到40％，低剂量组也观察到抑瘤作用，并且有剂量效应关系。
实施例29、本发明制剂的对流感病毒的抑制作用
在狗肾细胞(MDCK)培养内，采用病毒CPE法检测本发明制剂Y-10、11、16对甲型流感病毒的抑制作用。阳性对照药选用利巴韦林注射液(苏州第六制药厂生产)。流感病毒源自中国微生物菌种保藏中心。
MDCK细胞以40万/ml的浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，分别加入本发明制剂和阳性对照药物，本发明Y-10倍比稀释为1.5μg/ml～0.0468μg/ml，本发明制剂Y-11倍比稀释为0.05μg/ml～0.00156μg/ml，本发明制剂Y-16倍比稀释为25μg/ml～0.78μg/ml，阳性对照药倍比稀释为6000μg/ml～187.5μg/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl。同时设正常细胞对照。置37℃、5％CO2培养5～7天。每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下变化为+，26％-50％变化为++，51％～75％变化为+++，76％～100％变化为++++。用Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TD50)及最大无毒浓度(TD0)。结果表明本发明制剂Y-10、11、16对MDCK细胞的TD0各为0.1875±0μg/ml，0.00625±0μg/ml，25±0μg/ml；TD50各为0.375±0μg/ml，0.0125±0μg/ml，＞25±0μg/ml；阳性对照药物利巴韦林的TD0为3000±0μg/ml，TD50为6000±0μg/ml。
MDCK细胞以40万/ml的浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24至48小时培养至细胞单层，弃掉培养液，加入流感病毒1∶30的稀释液，每孔100μl，33℃吸附3小时，弃掉病毒液，加入本发明制剂Y-10、11、16，选用对细胞的最低无毒浓度(TD0)二倍稀释7个浓度，每浓度3孔，每孔100μl。阳性对照药物选用对细胞的最低无毒浓度(TD0)二倍稀释10个浓度，每浓度3孔，每孔100μl。同时设病毒对照和正常细胞对照，于33℃，5％CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察病毒CPE，至病毒对照细胞病变(CPE)出现“+++～++++”时结束试验，试验重复3次，计算药物半数有效浓度(IC50)、最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)。
表8：本发明制剂在MOCK细胞培养内对流感病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) 治疗指数
本发明制剂Y-10 0.0234±0μg/ml 0.0117±0μg/ml 16
本发明制剂Y-11 0.00078±0μg/ml 0.00039±0μg/ml 16
本发明制剂Y-16 0.78±0μg/ml 0.39±0μg/ml 64
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 256
由表可见，本发明制剂对流感病毒半数有效浓度(IC50)为0.02μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.01μg/ml，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为20μg/ml，最小有效浓度(MIC)为10μg/ml。说明本发明制剂对流感病毒有抑制作用。
实施例30、本发明制剂的对呼吸道合胞病毒的抑制作用
在咽癌上皮细胞(Hep-2)细胞培养内，采用病毒CPE法检测含主要有效成分SEC2的本发明制剂Y-10、11、16对呼吸道合胞病毒的抑制作用。阳性对照药选用利巴韦林注射液。呼吸道合胞病毒源自美国ATCC菌种库。
Hep-2细胞以40万/ml的浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，分别加入本发明制剂和阳性对照药物，观察计算出本发明制剂Y-10、11、16对Hep-2细胞的TD0各为0.1875±0μg/ml，0.003125±0μg/ml，25±0μg/ml；TD50各为0.375±0μg/ml，0.00625±0μg/ml，＞25±0μg/ml；阳性对照药物利巴韦林的TD0为3000±0μg/ml，TD50为6000±0μg/ml。
采用CEP法，Hep-2细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃培养24至48小时培养至细胞单层，弃掉培养液，加入呼吸道合胞病毒
100TCID50的病毒液，每孔100μl，37℃吸附1小时，弃掉病毒液，加入本发明制剂，药物选用对细胞最大无毒浓度(TD0)二倍稀释7个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，阳性对照药物利巴韦林选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)二倍稀释10个浓度，每浓度3孔，每孔100μl。同时设病毒对照和正常细胞对照，于37℃，5％CO2培养5至7天，每24小时在显微镜下观察病毒CPE，至病毒对照细胞病变(CPE)出现“+++～++++”时结束试验，试验重复3次，计算药物半数有效浓度(IC50)、最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)。
表9：本发明制剂在Hep-2细胞培养内对呼吸道合胞病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) 治疗指数
本发明制剂Y-10 0.0234±0μg/ml 0.0117±0μg/ml 16
本发明制剂Y-11 0.00078±0μg/ml 0.00039±0μg/ml 8
本发明制剂Y-16 0.78±0μg/ml 0.39±0μg/ml 64
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 256
结果表明本发明制剂对呼吸道合胞病毒半数有效浓度(IC50)为0.02μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.01μg/ml，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为20μg/ml，最小有效浓度(MIC)为10μg/ml。说明本发明制剂对呼吸道合胞病毒有抑制作用。
实施例31、本发明口服药物制剂的药理实验
(1)免疫调节作用
按照实施例27方法，试验选用BALB/C和C57BL/6J小鼠，单次皮下注射环磷酰胺造成免疫功能低下动物模型，用本发明制剂Y-9口服给药，以SEC1 0.6、7.8μg/kg的剂量，设2个剂量组经口灌胃给予，每天1次给药，连续12次，进行各种免疫指标测定。
表10：本发明制剂对NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力影响
组别 NK细胞活性(％) ConA反应(OD)
正常对照组 15.30±2.45a 0.64±0.088a
高剂量组 14.58±1.78a 0.69±0.072a
低剂量组 12.15±2.50a 0.70±0.065a
环磷酰胺组 9.80±2.85 0.42±0.048
注：n＝12；各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01
结果表明本发明制剂具有改善和提高免疫功能的作用。经对小鼠胸腺、脾脏重量、HC50、NK细胞活性、血清IL-2含量等项指标测定，注射环磷酰胺后经口给予含主要有效成分SEC1的本发明制剂，各免疫指标均明显高于环磷酰胺组，差别显著或非常显著(p＜0.05或0.01)，且有剂量效应关系。
(2)、抗肿瘤作用
按实施例28方法，采用C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种H22瘤株，用本发明制剂Y-9经口给药，以SEC1 1.2、7.8μg/kg设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察抑瘤率，结果见表11。
表11：本发明制剂对小鼠肝癌H22的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
对照组 2.33±0.40
高剂量组 1.31±0.39 41.3 ＜0.01
低剂量组 1.56±0.85 30.0 ＜0.05
环磷酰胺 0.75±0.25 66.4 ＜0.01
结果表明：对小鼠H22有抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率分别接近或达到41.3％，低剂量组也观察到抑瘤作用，并且有剂量效应关系。
(3)、对流感病毒的抑制作用
按照实施例29的方法检测本发明制剂Y-9对甲型流感病毒的抑制作用，测定计算出最低无毒浓度(TD0)药物半数中毒浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)，结果见表12。
表12：本发明制剂在MDCK细胞培养内对流感病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) TD50 治疗指数
本发明制剂Y-9 0.0234±0μg/ml 0.0117±0μg/ml 0.375μg/ml 16
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 6000μg/ml 256
由表可见，本发明制剂对甲型流感病毒半数有效浓度(IC50)为0.0234μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.0117μg/ml，优于利巴韦林。
从前面的实验结果可看出，含主要有效成分SEC1的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂经口给药能增强机体的免疫功能，对小鼠移植性肿瘤有一定的抑制作用。在MDCK细胞培养内，采用病毒CPE法，以阳性药物利巴韦林为依据，证明本发明制剂对流感病毒有一定的抑制作用。
实施例32、本发明口服药物制剂的药理实验
(1)、免疫调节作用
按照实施例27方法，试验选用BALB/C和C57BL/6J小鼠，单次皮下注射环磷酰胺造成免疫功能低下动物模型，用本发明制剂Y-12口服给药，以SEC3 1、8μg/kg的剂量，设2个剂量组，经口灌胃给予，每天1次给药，连续12次，进行各种免疫指标测定。
表13：本发明制剂对NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力影响
组别 NK细胞活性(％) ConA反应(OD)
正常对照组 15.60±2.34a 0.71±0.081a
高剂量组 13.81±1.82a 0.69±0.071a
低剂量组 11.92±2.10b 0.65±0.063a
环磷酰胺组 9.75±2.78 0.38±0.041
注：n＝12；各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01；b∶p＜0.05
结果表明本发明制剂具有改善和提高因注射环磷酰胺所致免疫功能低下的作用。经对小鼠胸腺、脾脏重量、HC50、NK细胞活性、血清IL-2含量等项指标测定，注射环磷酰胺后经口给予含主要有效成分SEC3的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂，各免疫指标均明显高于单纯注射环磷酰胺组，统计学分析，差别显著或非常显著(p＜0.05或p＜0.01)，且有剂量效应关系。
(2)、抗肿瘤作用
按实施例28方法，取C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种Lewis肺癌种瘤株后，用本发明制剂Y-12(含主要有效成分SEC3的金葡菌原液)经口给药，以SEC3 1.8μg/kg的剂量设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察对小鼠移植性肿瘤的抑制作用，结果见表14。
表14：本发明制剂对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
正常对照组 2.15±0.38
高剂量组 1.24±0.31 42.3 ＜0.01
低剂量组 1.60±0.75 25.6 ＞0.01
环磷酰胺 0.69±0.31 68 ＜0.01
结果表明本发明制剂对小鼠Lewis肺癌有抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率分别接近或达到42.3％，低剂量组也观察到抑瘤作用，并且有剂量效应关系。
(3)、在Hep-2细胞培养内对呼吸道合胞病毒的抑制试验
按照实施例30的方法检测本发明制剂Y-12(含SEC3主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)对呼吸道合胞病毒的抑制作用，测定计算出100TCID50、最大无毒浓度(TD0)、药物半数中毒浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)，结果见表15。结果表明，含SEC3的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂对呼吸道合胞病毒半数有效浓度(IC50)为0.0234μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.0117μg/ml，TD50为0.395μg/ml，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为23.4μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7μg/ml，TD50为6000μg/ml。
表15：本发明制剂在MDCK细胞培养内对合胞病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) TD50 治疗指数
本发明制剂Y-12 0.0234±0μg/ml 0.0117±0μg/ml 0.375μg/ml 16
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 6000μg/ml 256
实验结果显示，含SEC3主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂经口给药能增强机体的免疫功能，对小鼠移植性肿瘤有抑制作用。在Hep-2细胞培养内，采用病毒CPE法，以阳性药物利巴韦林为依据，证明本发明制剂对呼吸道合胞病毒有抑制作用。
实施例33、本发明口服药物制剂的药理实验
(1)、免疫调节作用
按照实施例27方法，试验选用BALB/C和C57BL/6J小鼠，单次皮下注射环磷酰胺造成免疫功能低下动物模型，用本发明制剂Y-7经口给药，以SEA0.6、6μg/kg的剂量，设2个剂量组经口灌胃给予，每天1次给药，连续12次，进行各种免疫指标测定。
表16：本发明制剂对NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力影响
组别 NK细胞活性(％) ConA反应(OD)
正常对照组 14.90±1.98a 0.75±0.095a
高剂量组 12.78±1.60a 0.72±0.085a
低剂量组 10.87±2.05b 0.963±0.053a
环磷酰胺组 9.21±2.56 0.39±0.036
注：n＝12；各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01；b∶p＜0.05
结果表明：本发明制剂具有改善和提高因注射环磷酰胺所致免疫功能低下的作用。经对小鼠NK细胞活性、ConA诱导的脾淋巴细转化能力、血清IL-2含量等项指标测定，结果见表16，结果表明：注射环磷酰胺后经口给予主要有效成分含SEA的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂，各免疫指标均明显高于单纯注射环磷酰胺组，统计学分析，差别有显著或非常显著意义(p＜0.05或p＜0.01)，而且有剂量效应关系。
(2)、抗肿瘤作用：
按实施例28方法，取C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种H22瘤株后，用本发明制剂Y-7(含主要有效成分SEA的金葡菌原液)经口给药，以SEA 0.6、6μg/kg的剂量设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察本发明制剂对小鼠移植性肿瘤的抑制作用，结果见表17。
表17：本发明制剂对小鼠肝癌H22的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
对照组 1.90±0.80
高剂量组 1.21±0.25 36.0 ＜0.01
低剂量组 1.45±0.60 23.7 ＞0.05
环磷酰胺 0.77±0.39 59.5 ＜0.01
结果表明本发明制剂对小鼠H22有抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率达到36％，低剂量组也观察到抑瘤作用，并且有剂量效应关系。
(3)、对流感病毒的抑制作用
按实施例29的方法检测本发明制剂Y-7(含SEA主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)对甲型流感病毒的抑制作用，测定计算出最低无毒浓度(TD0)药物半数中毒浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)，结果见表18。
表18：本发明制剂在MDCK细胞培养内对流感病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) TD50 治疗指数
本发明制剂Y-13 0.0234±0μg/ml 0.0117±0μg/ml 0.375μg/ml 32
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 6000μg/ml 256
结果表明，本发明制剂(含SEA的金黄色葡萄球菌原液)对甲型流感病毒半数有效浓度(IC50)为0.0117μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.00585μg/ml，TD50为0.1875，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为23.4μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7μg/ml，TD50为6000μg/ml。说明本发明制剂对流感病毒有抑制作用。
实验结果显示，本发明制剂(含SEA主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药能增强机体的免疫功能，对小鼠移植性肿瘤有抑制作用。
在MDCK细胞培养内，采用病毒CPE法，以阳性药物利巴韦林为依据，证明本发明制剂对流感病毒有抑制作用。
实施例34、本发明口服药物制剂的药理实验
(1)、免疫调节作用：
按照实施例27方法，试验选用BALB/C和C57BL/6J小鼠，单次皮下注射环磷酰胺造成免疫功能低下动物模型，用本发明制剂Y-8经口给药，以SEB 2、12μg/kg的剂量，设2个剂量组，经口灌胃给予，每天1次给药，连续12次，进行各种免疫指标测定。
表19：本发明制剂对NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力影响
组别 NK细胞活性(％) ConA反应(OD)
正常对照组 15.60±2.15a 0.85±0.10a
高剂量组 13.80±1.98a 0.81±0.09a
低剂量组 11.25±2.25b 0.53±0.078b
环磷酰胺组 10.05±2.65 0.41±0.029
注：n＝12；各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01；b∶p＜0.05
结果表明：本发明制剂具有改善和提高因注射环磷酰胺所致免疫功能低下的作用。经对小鼠NK细胞活性、血清IL-2含量等项指标测定，结果见表19，结果表明：注射环磷酰胺后经口给予含SEB主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂，各免疫指标均明显高于单纯注射环磷酰胺组，统计学分析，差别有显著或非常显著意义(p＜0.05或p＜0.01)，而且有剂量效应关系。
(2)、抗肿瘤作用
按照实施例28方法，取C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种H22瘤株后，用本发明制剂Y-8(含SEB主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药，以SEB2、12μg/kg的剂量，设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察本发明制剂对小鼠移植性肿瘤的抑制作用，结果见表20。
表20：本发明制剂对小鼠肝癌H22的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
对照组 1.95±0.91
高剂量组 1.28±0.31 34.1 ＜0.05
低剂量组 1.52±0.56 22.1 ＞0.05
环磷酰胺 0.92±0.41 52.8 ＜0.01
结果表明：本发明制剂(含SEB的金黄色葡萄球菌原液)对小鼠H22有抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率为34.1％，低剂量组也观察到一定的抑瘤作用，并且有剂量效应关系。
(3)、在Hep-2细胞培养内对呼吸道合胞病毒的抑制试验
按实施例30的方法检测本发明制剂Y-8(含SEB主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)对呼吸道合胞病毒的抑制作用，测定计算出100TCID50、最大无毒浓度(TD0)、药物半数中毒浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)，结果见表21。
表21：本发明制剂在Hep-2细胞培养内对呼吸道合胞病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) TD50 治疗指数
本发明制剂Y-8 0.0468±0μg/ml 0.0234±0μg/ml 0.75μg/ml 16
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 6000μg/ml 256
结果表明：本发明制剂(含SEB主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)对呼吸道合胞病毒半数有效浓度(IC50)为0.0468μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.0234μg/ml，TD50为0.75μg/ml，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为23.4μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7μg/ml，TD50为6000μg/ml。
实验结果显示，本发明制剂(含SEB主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药能增强机体的免疫功能，对小鼠移植性肿瘤有一定的抑制作用。在Hep-2细胞培养内，采用病毒CPE法，以阳性药物利巴韦林为依据，证明本发明制剂对呼吸道合胞病毒有抑制作用。
实施例35、本发明口服药物制剂的药理实验
(1)、免疫调节作用：
按照实施例27方法，试验选用BALB/C和C57BL/6J小鼠，单次皮下注射环磷酰胺造成免疫功能低下动物模型，用本发明制剂Y-13经口给药，以SED1.5、15μg/kg的剂量，设2个剂量组经口灌胃给予，每天1次给药，连续12次，进行各种免疫指标测定。
结果表明本发明制剂具有改善和提高因注射环磷酰胺所致免疫功能低下的作用。经对小鼠NK细胞活性、血清IL-2含量等项指标测定，注射环磷酰胺后经口给予含SED主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液的本发明制剂，各免疫指标均明显高于单纯注射环磷酰胺组，统计学分析，差别有显著或非常显著意义(p＜0.05或p＜0.01)，而且有剂量效应关系。
(2)、抗肿瘤作用
按照实施例28方法，取C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种Lewis肺癌瘤株后，用本发明制剂Y-13(含SED主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药，以SED 1.5、15μg/kg的剂量设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察本发明制剂对小鼠移植性肿瘤的抑制作用，结果见表22。
表22：本发明制剂对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
正常对照组 2.18±0.99
高剂量组 1.25±0.47 39.1 ＜0.01
低剂量组 1.60±0.59 24.4 ＞0.05
环磷酰胺 0.98±0.38 58.8 ＜0.01
结果表明本发明制剂对小鼠Lewis肺癌有抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率分别接近或达到39.1％，低剂量组也观察到抑瘤作用，并且有剂量效应关系。
(3)对流感病毒的抑制作用
按照实施例29的方法检测本发明制剂Y-13(含SED主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)对甲型流感病毒的抑制作用，测定计算出最低无毒浓度(TD0)药物半数中毒浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)，结果见表23。
表23：本发明制剂在MDCK细胞培养内对流感病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) TD50 治疗指数
本发明制剂Y-9 0.0234±0μg/ml 0.0117±0μg/ml 0.75μg/ml 32
利巴韦林 23.4±0μg/ml 11.7±0μg/ml 6000μg/ml 256
结果表明，本发明制剂(含SED的金黄色葡萄球菌原液)对甲型流感病毒的半数有效浓度(IC50)为0.046μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.023μg/ml，TD50为0.75μg/ml，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为23μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7μg/ml，TD50为6000μg/ml。
由上述实验结果可知，本发明制剂(含SED主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药能增强机体的免疫功能，对小鼠移植性肿瘤有一定的抑制作用。在MDCK细胞培养内，采用病毒CPE法，以阳性药物利巴韦林为依据，证明本发明制剂对流感病毒有抑制作用。
实施例36、本发明口服药物制剂的药理实验
(1)、免疫调节作用：
按照实施例27方法，试验选用BALB/C和C57BL/6J小鼠，单次皮下注射环磷酰胺加造成免疫功能低下动物模型，用本发明制剂Y-14经口给药，以TSST 0.5、5μg/kg的剂量，设2个剂量组经口灌胃给予，每天1次给药，连续12次，进行各种免疫指标测定。
表24：本发明制剂对NK细胞活性和ConA诱导淋巴细胞转化能力影响
组别 NK细胞活性(％) ConA反应(OD)
正常对照组 15.80±2.21a 0.97±0.21a
高剂量组 13.90±1.98a 0.81±0.09a
低剂量组 11.20±1.57b 0.75±0.06a
环磷酰胺组 9.87±1.23 0.42±0.03
注：n＝12；各组p值与环磷酰胺组比较a∶p＜0.01；b∶p＜0.05
结果表明本发明制剂具有改善和提高因注射环磷酰胺所致免疫功能低下的作用。经对小鼠NK细胞活性、血清IL-2含量等项指标测定，结果见表24，结果表明：注射环磷酰胺后经口给予本发明制剂(含TSST主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)，各免疫指标均明显高于单纯注射环磷酰胺组，统计学分析，差别有显著或非常显著意义(p＜0.05或p＜0.01)，而且有剂量效应关系。
(2)、抗肿瘤作用
按照实施例28方法，取C57BL/6J系小鼠以及昆明种小白鼠，于右腋窝皮下分别接种H22瘤株后，用本发明制剂Y-14(含TSST主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药，以TSST 0.5、5μg/kg的剂量设2个剂量组，经口灌胃给予，连续10次，观察本发明制剂对小鼠移植性肿瘤的抑制作用，结果见表25。
表25：本发明制剂对小鼠肝癌H22的抑制作用
瘤重(g) 抑制率
组别
p值
X±SD (％)
对照组 2.11±0.87
高剂量组 1.19±0.43 43.6 ＜0.01
低剂量组 1.51±0.48 28.4 ＞0.05
环磷酰胺 0.88±0.35 58.3 ＜0.01
结果表明：本发明制剂对小鼠H22有一定的抑瘤作用，其高剂量组抑瘤率分别接近或达到43.6％，低剂量组也观察到一定的抑瘤作用，并且有一定的剂量效应关系。
(3)、在Hep-2细胞培养内对呼吸道合胞病毒的抑制试验
按照实施例30的方法检测本发明制剂Y-14(含TSST主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)对呼吸道合胞病毒的抑制作用，测定计算出100TCID50、最大无毒浓度(TD0)、药物半数中毒浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)。结果见表26。
表26：本发明制剂在Hep-2细胞培养内对呼吸道合胞病毒的抑制作用
药物 半数有效浓度(IC50) 最小有效浓度(MIC) TD50 治疗指数
本发明制剂Y-8 0.0585±0μg/ml 0.011±0μg/ml 0.375μg/ml 64
利巴韦林 23.0±0μg/ml 11.7±0μg/ml 6000μg/ml 256
结果表明：本发明制剂(含TSST的金黄色葡萄球菌原液)对呼吸道合胞病毒的半数有效浓度(IC50)为0.02μg/ml，最小有效浓度(MIC)为0.01μg/ml，利巴韦林半数有效浓度(IC50)为20μg/ml，最小有效浓度(MIC)为10μg/ml。
由上述实验结果可知，本发明制剂(含TSST主要有效成分的金黄色葡萄球菌原液)经口给药能增强机体的免疫功能，对小鼠移植性肿瘤有一定的抑制作用。在Hep-2细胞培养内，采用病毒CPE法，以阳性药物利巴韦林为依据，证明本发明制剂对呼吸道合胞病毒有抑制作用。
实施例37、本发明口服药物制剂对NK细胞活性及T淋巴细胞增殖的影响
(1)对NK细胞活性的影响
试验选用体重20～24g的C57BL/6J小鼠，无菌取脾，制备单个脾淋巴细胞，分离T淋巴细胞分别进行NK细胞活性及T淋巴细胞增殖测定。NK细胞活性测定采用YAC-I为靶细胞，采用乳酸脱氢酶法进行NK细胞活性测定。以Hank’s为对照组。使用本发明制剂Y-16。剂量为SEC2 30ng/ml，SEC215ng/ml，SEC2 7.5ng/ml。结果见下表。NK细胞活性＝100％×(反应孔OD值-自然孔OD值)/(最大释放孔OD值-自然释放孔OD值)
表27：SEC2对小鼠NK细胞活性的影响
剂量(ng/ml) NK(％)
X±SD
对照组(hank’s) 8.1±1.3
30 23.5±3.5**
15 22.5±2.5**
7.5 16.7±1.9**
注：**表示与hank’s对照组比较p值＜0.01
结果以三次试验数据进行统计，结果表明本发明制剂的SEC2在7.5～30ng/ml时，可使小鼠NK细胞活性明显增强，与对照组比较，差别有非常显著意义(p＜0.01)，并有剂量效应关系。
(2)含SEC2主要有效成份的本发明制剂对T淋巴细胞增殖的影响
试验选用体重20～24g的C57BL/6J小鼠，无菌取脾，按常规方法制备脾淋巴细胞悬液，离心，弃上清，加入Tris-NH4Cl去除红细胞后，以Hank’s液洗涤细胞2次计数。根据计数用RPMI1640(含10％小牛血清)重悬细胞，调整细胞浓度为8-10×106个/ml将此细胞悬液加到96孔培养板中，每孔100μl，同时加入本发明制剂Y-11，每孔100μl，SEC2剂量设置为13ng/ml、6.5ng/ml、3.25ng/ml，用Hank’s液稀释，对照组加入Hank’s，阳性对照用ConA，浓度为10μg/ml，均设3个复孔，于37℃，5％CO2饱和湿度下培养3～4天，然后加入MTT PBS溶液(5mg/ml)10μl，继续培养4小时后弃上清，加入DMSO 200μl，充分振摇溶解，于酶标仪上540nm或570nm处测吸光值(A值)，以吸光值表示增殖程度。结果见下表。
表28：本发明口服药物制剂对小鼠T淋巴细胞增殖的影响
剂量(ng/ml) A值(
X±SD) p值
对照组(hank’s) 0.118±0.004 -
13 0.184±0.012 ＜0.01
6.5 0.158±0.007 ＜0.01
3.25 0.144±0.011 ＜0.05
ConA(10μg/ml) 0.188±0.011 ＜0.001
注：*p值表示与hank’s对照组比较。
结果表明含SEC2的本发明制剂在SEC2 3.25-13ng/ml时，可使小鼠T淋巴细胞增殖明显增强，与对照组比较，差别有非常显著意义，(p＜0.001)并有剂量效应关系。
实施例38、本发明口服药物制剂对抗流感病毒的临床试验
使用本发明H-9、H-6、H-5、H-4口服药物制剂对流行性感冒患者进行了临床试验。流行性感冒患者24例，年龄15-65岁，均有典型感冒症状，如头痛，咽喉肿痛，咳嗽，有低热或无发热症状。病例分配：每种发明制剂各6例患者。给药方法：每日早晚各一支，分别含本发明药物制剂H-9、H-6、H-5、H-4，剂量分别为30ng/ml、27ng/ml、23ng/ml、17ng/ml，7天为一个疗程。
疗效观察，患者自觉头痛，咽喉肿痛症状明显改善。治疗中未发现任何毒副反应。
实施例39、本发明口服药物制剂对肺结核的临床试用
利用本发明口服药物制剂H-9、H-6、H-5、H-4对复治菌阳肺结核90例患者进行的治疗。患者随机分A组(治疗组)和B组(对照组)各45例。A组男25例，女20例，年龄15至60岁，平均年龄37.5岁。浸润型肺结核37例，慢性纤维空洞型肺结核8例；B组浸润型肺结核37例，慢性纤维空洞型肺结核11例。A组合并胸膜炎5例，B组合并胸膜炎3例。A组和B组患者均采用3KRZ/6HRE化疗方案，A组加用本发明口服药物制剂H-9、H-6、H-5、H-4。病例分组：H-9：20例，H-6：5例，H-5：12例，H-4：8例。每日2次，每次1支，本发明药物制剂的含量为：H-9：30ng/ml，H-6：27ng/ml，H-5：23ng/ml，H-4：17ng/ml。用药前后观察肝肾功能、血尿常规和胸片、痰结核菌(涂片法)。结果见下表。
表29：A、B两组病灶和痰菌变化
第一月 第二月 第六月
观察项目
A组 B组 A组 B组 A组 B组
明显吸收 22 8 28 16 38 22
一般吸收 12 6 10 8 5 12
好转率 76％ 31％ 84％ 53％ 96％ 76％
X2 17.86 10.16 7.28
p值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01
痰结核菌阴转 12 11 33 20 42 28
阴转率 27％ 24％ 73％ 44％ 93％ 62％
X2 0.058 7.76 12.6
p值 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01
由表可见，治疗后，A组患者使用本发明药物制剂2个月后，其每月病变好转和痰菌阴转均较对照组明显提高，并且使用安全，严重不良反应。经统计学X2检验，p＜0.01，有显著性统计学意义。说明本发明药物制剂在提高复治肺结核病人的免疫功能方面疗效显著。
实施例40、本发明口服药物制剂对胃溃疡、胃癌等不同患者的临床试验
利用本发明口服药物制剂H-9、H-6、H-5、H-4对胃溃疡、胃癌等不同患者125人进行的治疗，其中男性58人，女性66人，年龄11-79岁，平均年龄57.96岁。一般疾病44例：胃溃疡(18例)，结肠炎(2例)，神经衰弱(6例)，肾炎(1例)，脾亢(2例)，粒细胞减少症(7例)，苯中毒(2例)，支气管炎(2例)，贫血(4例)；肿瘤81例：食道癌(16例)、胃癌(28例)、肝癌(1例)、结肠癌(16例)、乳腺癌(4例)、肺癌(10例)、宫颈癌(2例)、脑膜瘤(2例)、慢性粒细胞性白血病(2例)。药物为本发明制剂H-9、H-6、H-5、H-4，病例分组：H-9：55例，H-6：18例，H-5：28例，H-4：24例。每日早晚各一支，本发明药物制剂的含量为：H-9：30ng/ml，H-6：27ng/ml，H-5：23ng/ml及H-4：17ng/ml，30天为一个疗程，一般疾病一个疗程，肿瘤患者连续服用3个疗程。
表30：本发明药物制剂疗效观察指标和结果
类别 服药前 服药后 p值
lg G 6790mg/L 9400mg/L ＜0.01
淋巴细胞转化率 49％ 61％ ＜0.01
NK细胞活性 14％ 21％ ＜0.01
CEA 22ng/ml 15ng/ml ＜0.01
肿瘤标记物 AFP + -
HeG 1800IU/日 920IU/日 ＜0.01
白细胞 3400/cmm 6700/cmm ＜0.01
血小板 7.8万 12.7万 ＜0.01
患者自觉症状，如疼痛、失眠、食欲不振等均有明显改善。肿瘤病人KARNOFSKY健康状况的总评分从45分增加到60分。在治疗过程中未发现任何毒副反应。本发明制剂对癌症患者还有很好的提升白血球的作用。
实施例41、本发明口服药物制剂对糖尿病的临床试验
利用本发明口服药物制剂H-9、H-6、H-5、H-4对40例糖尿病者进行治疗，其中男22例，女18例，病程1-40年，5年以上者21例，占52.5％；均经内分泌专科根据临床症状、空腹血糖、胰岛功能、发病年龄等，确诊为I型糖尿病患者。在保持原有药物剂量不变的情况下，加服本发明含H-9、H-6、H-5、H-4的药物制剂。病例分组：H-9：14例，H-6：6例，H-5：10例，H-4：10例。用量均为2支/日，本发明药物制剂的含量为：H-9：30ng/ml，H-6：27ng/ml，H-5：23ng/ml，H-4：17ng/ml，30日为一疗程。观察指标包括临床症状：口渴多饮、多尿、多食及乏力、体重减轻等症状的改善，空腹血糖检测，尿糖检测，HbA1C(糖基化血红蛋白)测定。
经过1个月加服本发明药物制剂的治疗，40例患者自觉症状均有不同程度的好转。其中尿糖阳性者29例，治疗后均有好转，其中11例转阴。治疗后血糖和HbA1c均明显下降：血糖下降95％；治疗后较治疗前下降(均值)3.47mmol/L(30.89％)，p＜0.001；HbA1c下降3.55，(37.7％)，p＜0.001。
空腹胰岛素和C肽均有明显增加：40例中有4例同时使用胰岛素(2例为I型糖尿病)，故胰岛素只测定36例，治疗后均值增加3.19mIU/L，增加了治前胰岛素的51.3％，p＜0.01；40例C肽均值增加0.35ng/ml，增加了治前C肽的24.0％，p＜0.05；均有显著意义(见下表)。
表31：治疗前后胰岛素(mIU/L)、C肽(ng/ml)测定结果
治后均值 治前均值 下降均值(％) p值
胰岛素(36例) 6.22±3.88 9.41±4.68 3.19(51.3％) ＜0.01
C肽(40例) 1.46±0.78 1.81±0.75 0.35(24.0％ ＜0.05
T细胞亚群：40例治疗后CD3和CD4均值有明显增加，分别较治疗前增加13.2％和17.4％，而CD8较治疗前减少19.4％，CD4/CD8比值由治疗前的偏低，治疗后转为正常水平。4项指标p值均＜0.01，有非常显著的意义(见下表)。
表32：治疗前后T细胞亚群均值变化
治疗前 治疗后 均值增减(％) p值
CD3 49.6±8.08 56.15±10.3 +6.55(13.2％) ＜0.01
CD4 31.1±6.20 36.52±7.7 +5.42(17.4％) ＜0.001
CD8 30.6±4.67 24.65±3.85 -5.95(-19.4％) ＜0.001
CD4/CD8 1.04±0.28 1.50±0.32 -0.46(-44.2％) ＜0.001
上述结果说明本发明制剂对于初患和长期患此症状的患者效果同样明显。因此可见，本发明药物制剂可用于防治糖尿病。
实施例42、本发明口服药物制剂对乙肝病毒的临床试验
利用本发明口服药物制剂H-9对10例慢性乙肝病毒性肝炎患者进行治疗，其中男性6例，女性4例，年龄16-50岁。10例病人自发现HBSAg(+)迄今已达5-10年，从未接受抗病毒治疗，诊断符合慢性乙型病毒肝炎。给药量：1支×2次/日，每支10ml，本发明药物制剂的含量为：H-9：30ng/ml，45日为一疗程。观察肝、肾功能，全血计数，HBVM，HBV-DNA(PCR法)，CD4 +，CD8 +以及干扰素(INF)水平检测。
全试验过程检测3次(1周、4周、8周)。结果表明，对肝功能及HBV的作用：口服检品后，除少数病人应用初期ALT轻度升高外，多数病人下降，疗程结束时均接近正常水平。10例病人中，HBeAg和HBV-DNA同时转阴2例(26％)，HBeAg和HBV-DNA自阴转1例(10％)，即HBeAg和HBV-DNA阴转率分别为30％。
表33：本发明口服制剂对CD4 +/CD8 +及诱生IFN的作用
| 病例 | CD4 + | CD8 + | CD4 +/CD8 + | IFN(pg/ml) | ||||||||
| 0WK | 4WK | 8WK | 0WK | 4WK | 8WK | 0WK | 4WK | 8WK | 0WK | 4WK | 8WK | |
| 12345678910 | NDND40DN40DN423443DN | 37364142452744334829 | 42394645503044354830 | NDND30ND28ND263024ND | 25.5262828282526312526 | 26262628242424292325 | NDND1.30ND1.40ND1.611.131.79ND | 1.451.381.461.501.601.081.691.061.921.11 | 1.601.501.771.602.081.251.831.202.081.20 | 0000000000 | 50020000000 | 70050070005001000 |
注：正常值：CD4 +42±6，CD8 +24±5，CD4 +/CD8 +≥1.7。
对CD4 +/CD8 +及诱生IFN的作用：治疗后，CD4 +均明显升高；CD8 +变化不大，或略有下降；CD4 +/CD8 +值逐渐升高；IFN水平升高的有5例，由0升至50-700ng，升高者中有4例发生HbeAg和/或HBV-DNA转阴；且此几例病人CD4 +/CD8 +值接近或高于正常值，且检测出内源性干扰素，说明本发明药物制剂确能在激活T细胞同时，诱导产生细胞因子，达到杀伤靶细胞的目的。在试验过程中，未发现副作用。由上可见，使用本发明口服药物制剂可以改善病人的细胞免疫功能，可用于防治乙肝病。
实施例43、本发明口服药物制剂对艾滋病的临床试验
利用本发明口服药物制剂H-9对10例艾滋病患者进行治疗。男性7人，女性3人，年龄25-54岁，平均年龄33岁，病程6-8年。给药量：1支×2次/日，每支10ml，每ml含H-9：30ng，疗程6个月。对治疗前与治疗后1、3、6个月的临床症状观察。对患者的体征、肝、肾及血等26项指标以及CD4 +T细胞、病毒载量等项指标进行的检测。
经临床治疗3-6个月后，患者临床症状有明显改善，主要临床症状如乏力、体重下降，食欲均有明显改善，大部分患者的食欲及体重增加，乏力症状缓解，体症中治疗前有3例患者合并口腔霉菌感染，2例患者合并皮疹、治疗3个月后明显改善，提示该药能改善HIV/AIDS患者的临床症状及体征。免疫指标测定中，治疗后CD4 +T细胞上升，CD4 +/CD8 +比值提高，说明该药确有改善患者免疫功能的作用。
实施例44、本发明口服药物制剂对治疗戒毒的临床试验
使用本发明药物制剂H-9、H-6、H-5、H-4对40例海洛因瘾者进行治疗。海洛因瘾80例，随机分为2组，加服口服液组(A组)40例，病例分配：H-9：15例，H-6：6例，H-5：11例，H-4：8例。未加服口服液组(B组)40例。男58例，女22例，年龄23±5岁(16-38岁)吸毒年限：23±l0个月(4-78个月)。吸毒量：0.58±0.42克/日(0.1-1克/日)。吸毒方式：共80例。烫吸44例，静注36例，戒毒次数：平均5次(0-10次以上)。
治疗方法：两组均用盐酸二氢埃托啡十丁丙诺啡方案(HMB方案)第l-3日盐酸二氢埃托啡400-800μg，第4-6日美沙酮20-30mg/日，第7-l0日丁丙诺啡0.3-1.2mg。
A组(加服口服液)每日3支，每次10ml，本发明药物制剂的含量分别为：H-9：30ng/ml，H-6：27ng/ml，H-5：23ng/ml，H-4：17ng/ml，连服8-10日，个别病例服用20-30日，B组(对照组)仅脱瘾治疗。结果见下表。
表34：两组治疗前后戒断症状记分比较
A组 B组
治疗日期
例 记分 例 记分 t值
治疗前 40 24.5±5 40 26±5
治疗后第一日 40 10.6±6 40 11±5 ＞0.05
第二日 40 8.4±5 40 8±4.5 ＞0.05
第三日 40 4±4.5 40 5±2.8 ＞0.05
第四日 40 2.3±0.8** 40 4.5±3 ＜0.05
第五日 40 2.3±0.68** 40 4±2.5 ＜0.05
第六日 40 1±0.25** 40 4±2.5 ＜0.05
第七日 40 0.4±0.4** 40 3.2±2 ＜0.05
第八日 40 0.2±0.2** 40 2.5±2 ＜0.05
T检验：A组与B组相比，A组戒断症状明显缓解且满意，不少吸毒者口服本发明制剂后能镇静，食欲增加，出汗怕冷减少，精神恢复；全身软弱无力、心悸胸闷、烦躁不安减少；安静入睡有改善，统计学比较p＜0.05或p＜0.01，渴求感亦明显减少。其中4例服用20-30日后无瘾，睡眠食欲皆有改善。
实施例45、本发明口服药物制剂的急性毒性试验
试验采用经口灌胃给药途径测定本发明Y11的浓缩液对小鼠的急性毒性。经测定，该药物经口给药对小鼠未见死亡和异常改变，其最大给药量为500μg/kg。
实施例46、本发明口服药物制剂的长期毒性试验
取体重为90±1g的Wistar大白鼠90只，随机分为三组，二组分别将本发明提供的Y11金黄色葡萄球菌口服液的浓缩液经口投药给大白鼠，另一组为对照组给予等量的生理盐水，连续给药6个月。于给药后3、6月及停药后4周检测血液学、血液生化指标，停药后24小时及4周各组分别处10只动物，取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃等脏器称重，观察及病理检查。
在试验期间大鼠活动正常，生长良好，毛发光亮，尿便正常，无一死亡。给药期间，各组大鼠体重变化无差异，各组大鼠的体重，脏器湿重均无显著差异。血液学、血液生化学各项指标无明显差异。主要脏器肉眼及组织形态学检查各给药组与对照组比较无明显差异，本发明制剂属安全性较好的药物。
实施例47、以常规方法对本发明口服制剂进行致突变和生殖毒性研究
1、遗传毒性试验：
(1)Ames试验：结果为阴性。
(2)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：未见本发明口服制剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核产生影响。
(3)小鼠精子畸形试验：未见本发明口服制剂对小鼠精子畸形产生影响。
(4)小鼠睾丸染色体畸变试验：未见本发明口服制剂对小鼠睾丸染色体畸变产生影响。
2、大鼠传统致畸试验：
大鼠传统致畸试验结果表明本发明制剂无致畸作用。
Claims (10)
1，一种药物口服制剂，其含有以金黄色葡萄球菌经培养、除菌、过滤所得的代谢产物原液。
2，如权利要求1所述的药物口服制剂，其特征在于所述的金黄色葡萄球菌是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、或CGMCC0662。
3，如权利要求1所述的药物口服制剂，其特征在于主要含有肠毒素A、B、C1、C2、C3、D和TSST-1中的一种或一种以上活性成分的金黄色葡萄球菌代谢产物，其中肠毒素A、B、C1、C2、C3、D和TSST-1活性成分中至少一种的含量是1～50ng/ml，其他种活性成分的含量是0～50ng/ml。
4，一种药物口服制剂，其含有肠毒素C2。
5，一种药物口服制剂，其含有(1)由CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、或CGMCC0662菌株经培养、除菌、过滤所得的代谢产物原液，或由所述代谢产物原液分离出的肠毒素C2；和(2)、0.05～1重％的阿司帕坦。
6，如权利要求2或5所述的药物口服制剂，其特征在于所述的金黄色葡萄球菌的代谢产物原液是按照包括以下步骤的方法制得：
(1)将CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCC0165、CGMCC0381、CGMCC0780、或CGMCC0662的金黄色葡萄球菌株接种于琼脂斜面上，于20～40℃下，进行复苏培养12～72小时，得到复苏种子；所述琼脂斜面是常规或已知的复苏培养基；
(2)将所得复苏种子接种于增菌培养基中，20～40℃下培养12～72小时，得到增菌种子；所述增菌培养基是常规或已知培养基，或是含有猪心浸液的猪心培养基；
(3)将增菌种子接种于发酵培养基中，在20～40℃下，pH 5～8，0～90％溶氧量条件下发酵18～72小时；所述发酵培养基是常规或已知培养基，或是所述含猪心浸液的猪心培养基；
(4)将上述步骤所得发酵液除菌过滤，得到金黄色葡萄球菌代谢产物原液，即本发明的口服药物制剂；
所述猪心培养基是组成为：0.5～2％蛋白胨，0～10％猪心浸液，0.1～1.0％氯化钠，0.01～0.02％硫酸镁，0.005～0.02％氯化钙，及0.5％琼脂的培养基；或是组成为1～20％猪心浸液，0.5～2％蛋白胨，0～0.2％磷酸盐，0.1～1.0％氯化钠，硫胺0.0～0.05％，及5～30％羊肝浸液的培养基；所述蛋白胨是常规的蛋白胨，或是胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、或酪蛋白胨。
7，如权利要求4所述的药物口服制剂，其特征在于肠毒素C2、含量为1～50ng/ml，按照以下方法得到：
将金黄色葡萄球菌代谢产物原液，用滤膜包超滤除去小分子杂质，用pH 5.6～6.8的PB稀释所得滤液，用阳离子交换树脂吸附；用无机盐溶液洗脱，收集洗脱液；调节所得洗脱液的pH值为5.6～6.8，采用离子交换层析分离，收集含有SEC2；采用分子筛进一步除去杂质，即得SEC2。
8，如权利要求1、2、3、4、6、或7所述的药物口服制剂，其特征在于还含有包括常规或已知的甜味剂或阿司帕坦在内的甜味剂、为使所述药物口服制剂制备成不同常规或已知剂型而使用的常规或已知辅料、或其他在常规或已知药物口服制剂中使用的药学上可接受的常规或已知的辅料；所述剂型包括片剂、胶囊或其他常规口服制剂的剂型。
9，一种权利要求1、4、或5中所述的药物口服制剂用于制备防治肿瘤、糖尿病、乙肝、肺结核、艾滋病、戒毒、抗病毒、胃溃疡、提高免疫功能的药物中的用途。
10，如权利要求9所述的药物口服制剂用于制备防治肿瘤药物中的用途，其特征在于所述的肿瘤包括食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、脑膜瘤、慢粒、膀胱癌。
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