CN1646682A - 从很少活动的颗粒中分选出活动颗粒的方法以及适合该方法的装置 - Google Patents

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Abstract

在微观流体分选装置(10)中从不活动颗粒中分选出活动颗粒，其中使来自分选物流通道(7)的含有活动和不活动颗粒的分选流体物流以非湍流的方式紧邻来自介质物流通道(8)的介质物流流过分选通道(6)，期间流动的活动颗粒跨过相邻流动物流间的界面，进入介质物流中，并在乏活动颗粒分选通道(9)中形成乏活动颗粒分选物流。该分选装置很容易廉价制造并具有许多用途，特别是从不活动精子中分选出活动精子。

Description

从很少活动的颗粒中分选出活动 颗粒的方法以及适合该方法的装置
                  相关申请的交叉引用
本申请要求2002年2月27日提出的美国临时申请顺序号60/359844的权利。
                        发明背景
1、发明领域
本发明涉及从很少活动的颗粒，特别是生物来源的活动和不活动颗粒中分选出活动颗粒的方法，并涉及适合于此的装置。
2、背景技术
从很少活动和/或不活动的颗粒中分离或“分选”出活动颗粒有许多应用，但迄今仍存在技术上的困难。例如，在水供应品的分析中，也许希望将活动的细菌和其他微生物，包括真菌、藻类等从不活动的细菌和微生物中分离出来。从而可对不同物种进行识别和计数。活动的有机体的实例包括诸如C.elegans的有鞭毛的和有纤毛的细菌，以及诸如草履虫和活动的浮游生物的其他微生物。富含活动物种的试样或缺乏活动物种的试样，或这两种试样，都可以独立地进行分析、培养等。
一种特别明显的应用是精子细胞的分选。例如，在玻璃试管内受精的情况下，如果供体的精子数少，特别是如果被不活动的精子、活动性比要求的活精子差的变形精子，以及其他细胞和精液碎片污染，当基本上用活精子进行受精尝试时，成功率将明显提高。例如，特别理想的是避免anueploid精子或DNA断裂的精子。在许多努力中，理想的是能引导后代的性别，例如当希望出生奶牛时。在这种情况下，能基于含有X染色体和Y染色体的精子公知的活动性差异对它们进行分选将是有益的。
来自精子缺乏(低精子数)的供体的精子细胞已预先浓缩，并在某种程度上通过离心分离从具有不同尺寸和/或密度的细胞和碎片中分离。然而，这项技术允许将非配子掺入富精子试样中。然而这些非配子尽管非常少，但它们释放的氧自由基会有害于延续的精子生命力。而且离心分离是一项强力技术，会损坏大部分精子数，特别是在中部和尾部区域。
所谓的“飘浮”技术也是公知的，但分离大部分活精子是富有挑战性的。S.Smith等，FERTIL.STERIL.1995，63，591-97。因此医生频繁地藉助从死精子和碎片中手工分选，以发现活动的和具有特殊形态的精子，这是一种非常耗时的方法。
在生物遗传学(生物技术)中的应用也频繁要求基于颗粒的活动性来分离颗粒。在非生物学应用中，将工作的微型机器人(它们是活动的)从不工作的微型机器人中分离是一种可能的应用。
                        发明概述
活动和不活动或很少活动的颗粒的分选通过这样的方法实现，即建立含有待分选的活动和不活动或很少活动的颗粒的非湍流和优选的层流物流(“分选物流”)，并使该分选物流与第二非湍流和优选的共层流介质物流(“介质物流”)接触，为至少部分富活动颗粒的介质物流提供一个出口物流，并为乏活动颗粒的分选物流提供一个出口物流。活动颗粒的可流动性使它们沿介质与分选物流间的界面进入介质物流中，而不活动或很少活动的颗粒基本上保留在分选物流中。适合用于该方法的装置提供至少一个分选物流入口、至少一个介质物流入口、至少一个分选通道、至少一个乏活动颗粒的分选物流出口，和至少一个富活动颗粒的介质物流出口。该装置优选的是通过微细加工或聚合物注模技术制备的较小装置，并优选包含集成在单个“芯片”上的所有需要的功能。
                      附图简述
图1表示本发明的活动颗粒分选装置的一个简单实施方式；
图2表示在图1装置的分选通道中将活动颗粒与不活动颗粒分选；
图3表示串连分选装置的一个实施方式；
图4表示具有多个介质入口的分选装置的又一个实施方式；
图5表示根据本发明分选装置的又一个实施方式的示意图；
图6表示根据本发明分选装置的又一个实施方式的示意图；
图7表示类似图1的装置的透视图；和
图8表示类似图1的装置在精子分选上的分选效率。
                   优选实施方式详细描述
本发明的描述可通过参照图1和图2进行，图1代表了可用于实现本发明目的的装置的一个相对简单的实施方式，图2表示从不活动颗粒分选出活动颗粒。在这些描述后面，将更具体地解释该装置、其几何形状、流体和流体流动的特性等的其他详细功能。
图1的装置以平面示意图，即顶视图形式表示。装置1实施方式由一个活动颗粒分选物流入口2(或起入口作用的活动颗粒供给库)、一个介质物流入口3(或介质库)、一个乏活动颗粒分选物流出口(或库)4，以及一个富活动颗粒物流出口(或库)5组成。在入口2和3与出口4和5之间设置了分选通道6。连接分选通道6和相应入口和出口的是分选物流入口通道7、介质物流入口通道8、乏活动颗粒分选物流出口通道9和富活动颗粒介质物流出口通道10。分选物流通道的宽度必须足够大，使感兴趣的颗粒毫无阻挡地有效通过，两个出口物流也是如此。入口物流和出口物流通常将具有小于分选通道的截面积。相对截面将取决于不同物流的流量和流速。线性流速优选地相似，尽管相对流速仅受到分选物流与介质物流之间发生的混和限制。根据诸如介质和分选物流的粘度、颗粒的活动性，以及存在或不存在与希望的待分选颗粒不同尺寸的颗粒或碎片的许多因素，介质物流的体积可在分选通道的任何截面上小于、基本上等于或大于分选物流的体积。
以下说明书的大部分都是关于精子分选的描述，但同样的原理可应用在其他活动和不活动的颗粒来源上。
在操作中，将精子源引入分选物流入口2中，并使其流向乏活动颗粒分选物流出口9，先通过通道7，然后通过分选通道6，最后到出口通道9。将与待分选精子相容的(即没有危害的)介质供应物流引入介质物流入口3，并使其流过通道8，进入分选通道6，通过通道10，进入富活动颗粒介质出口5。在通道7和8的汇流处，产生了不混和的，优选层流的流动，使得分选物流和介质物流平行通过分选通道。不活动(或很少活动)颗粒往往保留在分选物流中，而活动颗粒无规地运动并进入介质物流。这种无规运动的结果使分选物流变得缺乏活动精子，而介质物流中的活动精子变得日益富足。
本发明可进一步参考图2a、2b和2c大致地描述，它们图解说明了在图1装置的分选通道中，活动精子与不活动精子和其它不活动颗粒分开。在图2a中，示出了分选通道6，从分选物流11和介质物流12的汇流点开始。分选物流11含有活动精子13和不活动精子14，以及其他不活动颗粒，此处称为“圆颗粒”15。注意介质物流的平面尺寸，因此其容积比分选物流大得多。由于精子(以及类似地，其他活动颗粒)在短时间内，在总的液体中假定基本上是无规分布，将需要较大的介质物流容积来包含较大部分的总活动精子13。
在图2b中，活动精子开始在两股物流间无规化，并继续到实现希望的无规化程度。这种无规化程度优选的是使单位容积介质相中活动精子的浓度等于或大于单位容积分选物流中的浓度。注意分选物流和介质物流仍保持为分开的物流，每股物流优选表现出层流，并具有共同边界或界面16。在介质物流中超过由纯无规化确定的量的活动颗粒的较大浓度可通过采用其中活动颗粒的活动性已提高的介质物流，即通过选择粘度低于分选物流的介质物流，或通过包括提高活动精子相对于不活动或很很少活动的精子的活动性的添加剂来实现。
在图2c中，富活动精子的介质物流通过使其转向流入富活动颗粒的通道10中收集，而现在缺乏活动颗粒的分选物流仍继续通过通道9进入出口4。
将乏活动颗粒分选物流从富活动颗粒物流分开的转向接合点17可以是避免流体在该点处实质混和的任何几何形状。接合点17可以定位成例如在该点处提供基本上相同的分选物流入口的出口通道构造(即高度、宽度)。为了使不活动精子对介质物流的污染降至最低，接合点17也可以构造成使小部分介质物流也朝向乏活动颗粒分选物流出口9。在这种情况下，会发生活动精子的适度损失，然而，作为结果也降低了不活动精子进入富活动精子介质物流的可能性。
分选物流的性质并不关键。该分选物流可以是诸如精液的生物学派生流体，或可以清洗、稀释，可以用添加剂、着色剂或荧光染料、粘度改性剂处理，可以缓冲等，只要这种处理不破坏所需出口物流(乏活动颗粒或富活动颗粒)的生命力。如果目的是分离而不是生命力，例如对于细菌试样，对分选物流的潜在改性数就增加。分选物流也可以是预先的乏活动颗粒分选物流或富活动颗粒介质物流。对于微型机器人装置，分选物流液体可以是不破坏该装置功能的任何液体，例如水、醇、酮、二元醇、酯、烃等。对于生物试样，常用水基分选物流。
介质物流可根据应用在分选物流的选择或改性上的相同考虑来选择。在某些情况下，分选物流可以是水，但对于生物体系典型的是采用保持或增强生物活性的物流，例如生理盐水、缓冲盐水、营养肉汤等。在人类精子情况下，优选的介质是HEPES缓冲的人类输卵管流体。
如果可能的话，可选择介质流体和分选流体的性质，以避免由于渗透效应产生的界面混和。例如当分选和介质物流二者的基础流体(例如水)具有基本上相同数量的诸如盐、酸、碱、缓冲液、溶解的有机材料等的可溶性成分时就是这种情况。如果有可能，也可以这样选择流体，以避免由扩散引起的界面混和。然而，完全不存在任何扩散在这方面并不是好事。
相对流体容积可根据活动颗粒在介质相中期望的掺入程度来选择。对于最高的掺入程度，介质容积应比分选流体容积大。然而，也可以采用按比例缩小的介质容积，特别是当进行相继的(系列的)分选时。所用介质流体与分选流体的比例优选为1∶1000-1000∶1，更优选1∶100-100∶1，最优选在1∶10-10∶1范围内。对于典型的应用，介质容积与分选流体容积的比例在1∶1-3∶1范围内。最优选的是介质流体容积大于分选流体容积。
此处所称容积是在分选通道的给定截面处的容积。例如，尺寸为100μm×200μm的长方形分选通道将具有2×104μm2的“横向容积”。该“横向容积”，实际上是截面积，可通过乘以通道长度或其增量转化成真实的容积。这样，前文描述的具有2×104μm2的横向容积的同样的长方形通道在100μm长度上将具有2×106μm3的真实容积。
分选流体和介质流体的层流流速优选大致相同，即在1.5∶1-1∶1.5的流速范围内。如果介质流体的层流流速大于分选流体，对于相同的活动颗粒掺和程度，可采用相应小的横向容积的介质流体。流动优选是并流，尽管逆流流动也可以，条件是界面混和不会因此加重而超过有助于期望的分选和介质流体的贫乏/富余程度的程度。
分选流体与介质流体之间的界面优选是基本上不混和的界面。“不混和”指不存在由于两股流体之间过度扰动发生的混和。例如，最理想的是发生平行流、并流、层流流动，以便获得基本上好像“静态”的界面，与表现出波动、流动、涡旋等的界面相反。湍流通常导致物流的部分至全部混和，使活动颗粒的贫乏/富余更低效或甚至完全不可能。当在仅由于分散和渗透作用发生界面混和的地方产生静止状界面或“流线”时，才会发生理论上最佳的活动颗粒的分离。然而，允许沿界面有某些湍流也不会超出本发明的范围。当不能获得期望的分离程度时，湍流就过度了，即使对于多级装置也如此。用雷诺数表达的湍流度在任何情况下都应小于2000，更优选小于100，还更优选小于10，最优选为1或更小。诸如由本说明书实施例描述的高性能装置表现出约0.1的雷诺数。
界面的特性，即其湍流度，可通过分离度评价。然而，湍流也可用许多其他方式评价。例如，在下文描述的PDMS装置中，该装置的透光性使界面本身可例如通过对一种或两种流体着色，并通过界面处颜色的变化观察界面，从而用显微镜观察。通过传统的光学技术，也很容易观察折射率不同的介质之间的界面。分离物流与介质物流的混和程度也可以通过将标记剂(taggant)，即放射性可溶解化合物或不活动颗粒、可视染料或荧光染料等引入一股物流但不引入另一股物流中来监测。开始不含标记剂的物流的出口物流中标记剂的外观提供了湍流类型的，或由扩散或渗透引起的界面混和的证据。希望由于后两种作用而产生某些掺和，但也希望这种掺和相当小。标记剂在未标记的流体中有50％的掺和就基本上构成了完全混和。希望标记剂在未标记物流中的混和小于20％，优选的小于10％，更优选的小于5％，最优选的小于1％。只要雷诺数保持合理的低，湍流度就是满意的。满足以上准则的流动在这里称为“基本上非湍流的流动”。注意并流物流表现出比逆流物流更少的湍流，从而界面混和也更少。
假定流体的流速满足刚才描述的非湍流要求，流速本身可大大变化。分离装置内壁也会产生湍流的可能性，因为它们相对于流体流动是静止的。内壁的作用在采用窄通道时将是最重要的，尤其是紧邻分离物流或介质物流最窄处的内壁。由于感兴趣的装置很小并具有很小的通道，因此优选的线性流速小于10cm/s，优选小于10mm/s。尤其优选的是0.1mm/s-10mm/s之间的流速。线性流速的下限值由不活动颗粒通过布朗运动从分选物流进入介质物流的混和决定。例如，当流速为0时，对于相同的基本流体组分(例如缓冲盐水)，不活动颗粒在介质相中的分配将经过使它们的浓度变成一样所需的时间才能最终完成。流速越高，不活动颗粒的布朗再分配将发生得越少。当界面流动变成湍流时，达到流速的上限，就像高混和程度所表现的那样。
本领域普通技术人员通过对分离进行简单的计算和/或测量，例如通过改变相应的流速和流量，并测定分选物流和介质物流之间颗粒的相对富足和贫乏，可常规地完成对任何给定物流的相对流量、相对流速和绝对流速的确定。
该装置的几何形状可以不同。例如分选通道长度通常是活动颗粒本身在两相之间无规化的速度与流速的函数。例如，在给定流速下，具有有限的活动性的活动颗粒需要较长的分选通道，而在给定分选通道长度下，较少的活动颗粒需要较低的流速。界面表面积也影响该装置的几何形状。例如，一股流体与较大尺寸的通道面紧邻并平行设置，并与其他流体相邻的平坦矩形分选通道将表现出比第一股流体与较小尺寸通道面紧邻并平行设置时的相同通道更快的无规化，因此需要的分选通道长度更短。在后一种情况下，界面面积与前者比较要小得多。
尽管理论上有可能构建宏观尺度的，长度甚至大于10cm的装置，但对于大部分用途而言，分选通道都相当短，在几乎所有情况下都小于2-5cm，对于大部分装置均在100μm-1cm范围内。例如对于精子分选，已证明分选通道长度为5000μm(5mm)就相当满意。在多级装置中，理想的是较短的分选通道长度。
分选通道的截面形状并不关键。可采用方形、矩形、椭圆形、圆形、梯形、三角形或其他截面。为了容易制造，优选的是诸如方形、矩形、三角形、梯形和半圆形或半椭圆形截面的非下切通道。例如当采用平滑铸造或溶液铸造的构造方法时，这些形状是优选的。在通过立体平版印刷技术(“SLA”)构建的情况下，更复杂的形状都很容易建造。当该装置以连续多层铸造，然后通过例如粘合附着在一起时，也可以通过铸造技术提供具有下切通道的复杂形状。然而，通道宽度必须使介质物流和分选物流都能掺入颗粒。例如对于人类精子分选，高度50μm、宽度500μm的大致矩形的通道以证明是满意的。为了对照，人类精子具有直径约2.5μm和长约5μm的头，和约60μm的总长度。
进料通道和出料通道的截面积及尺寸通常都小于分选通道。分选物流入口通道的最小尺寸由分选物流中存在的颗粒尺寸决定。优选的是分选物流通道提供其中预计包含的颗粒尺寸的3到10倍的自由通道。同样的考虑用于介质物流出口通道的尺寸，但介质物流入口通道不必这样考虑。优选的是分选物流入口和出口通道具有类似的尺寸，尽管在某些例子中，例如前文描述的，理想的是出口通道大于入口，从而使部分介质物流掺入分选物流中。对于精子分选，50μm高、100μm宽和5000μm长的矩形分选物流入口通道已证明是满意的。
不同入口和出口通道的长度并不关键。优选的是至少入口通道具有一定的基本长度，以促使在分选物流和介质物流通道的汇合点之前形成层流物流。一般而言，高粘度流体所需通道长度不象低粘度流体那么长。在某些情况下，入口通道可以完全省去，即分选物流入口(或储罐)和/或介质物流入口(或储罐)可直接指向分选通道。然而对于大部分用途而言，为了利用分选装置的结构，优选的是采用入口通道。对于例如下文描述的精子分选装置，约3mm长的入口通道已证明是满意的。
分选和介质物流的汇合的接点18(图1)优选地构建成能促使流体物流的光滑融合但不过分混和。因此该接点一般是较小的锐角。分选物流入口通道与分选通道间的夹角和介质物流入口通道与分选通道间的夹角可以相同或不同，即该装置不必对称。同样的考虑用于分选物流与介质物流分离，或相互“转换”处的接点17。然而优选的是分选物流入口通道、分选通道和分选物流出口通道基本上是直线，以提供分选物流中不活动颗粒的尽可能小的扰动。
分选装置结构的材料可以是任何合适的材料，且该装置的制造可涉及任何制造方法。例如，该装置可通过玻璃、二氧化硅、硅、金属的蚀刻，或通过聚合物的溶液蚀刻等进行化学微细加工。该装置也可通过公知的立体平版印刷技术单独制造。该装置可通过可注模聚合物，例如硅橡胶、热塑性聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙稀、聚偏二氯乙稀、聚酰胺、聚酯等的注模获得。
目前优选的是通过提供一种负性的“靠模”，并用该靠模铸造可浇铸材料来铸造该分选装置。优选的可浇铸材料是聚合物，包括环氧树脂、可固化聚氨酯弹性体、聚合物溶液，即丙烯酸酯聚合物在二氯甲烷或其他溶剂中的溶液，和由于成本原因，优选可固化聚有机硅氧烷，最优选主要带有甲基的聚有机硅氧烷，例如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)。可固化PDMS聚合物是公知的，可从许多途径获得。可采用可加成固化和可缩合固化的体系，还有过氧化物固化的体系。所有这些PDMS聚合物都带有少部分的反应性基团，这些基团在固化期间反应形成交联和/或引起链伸长。单部(RTV-1)和双部(RTV-2)体系都可利用。当主要是生物颗粒活动性时，优选的是可加成固化体系。
在许多例子中，理想的是透明的装置。这种装置可由玻璃或透明聚合物制成。PDMS聚合物很适合于透明装置。采用略具弹性的聚合物的一个好处是它很容易与模具脱开，并有提供下切通道的潜力，而这对于硬而脆的材料一般是不可能的。通过模压硅聚合物制造微观流体装置的方法是公知的。参见例如D.C.Duffy等的“Rapid Prototyping ofMicrofluidic Systems in Poly(dimethisiloxane)”，ANALYTICAL，CHEMISTRY  70，4974-4984(1998)。还参见J.R.Anderson等的ANALYTICAL，CHEMISTRY  72，3158-64(2000)；和M.A.Under等的SCIENCE 288，113-16(2000)。
该装置的通道和储罐内壁的性质可根据该装置的应用和其中想用的流体选择。例如，内壁可以是疏水或亲水的，或某部分装置可以是疏水的，而其他部分是亲水的。此外，可用生物相容的或生物活性的涂料处理或衍生内壁，对内壁表面改性，或提供化学官能度。对于精子分选，用牛血清白蛋白(BSA)涂覆通道在改善通道中液体的流动，并使通道内壁对细胞的非特定吸收最小方面已证明是有益的。
流体可通过任何合适的方法送入装置的入口或入口通道。流体可从例如注射器中，从与入口通道连接或粘连的微管等供给。在优选的装置中，分选物流入口和介质物流入口是能保持和供应必要量的液体的“on-chip”储罐形式。这些储罐可通过注射器、移液管等充注。
流体流动可通过任何合适方法建立。例如，可利用适于抽吸少量液体的外部微型泵。微型泵也可在装置本身中提供，由热梯度、磁场和/或电场、施加压力等驱动。所有这些装置都是本领域普通技术人员公知的。被动驱动抽吸系统和微观流体通道的整合已由B.H.Weigl等在PROCEEDINGS OF MICROTAS 2000，Enshede，荷兰，pp.299-302(2000)中提出。
然而优选的流体流动通过重力流泵、通过毛细管作用或通过这些方法的结合建立。简单的重力流泵由对于该装置是外部的或内部的流体储罐组成，这些储罐含有比对应的装置出口更高液位(在引力方面)的流体。这种重力泵有一个缺点，就是静压头随着储罐中液体的高度降低而变化，从而使流速变化。对于许多装置，希望有相对恒定和不脉动的流速。
为了获得恒定流速，可采用已公布的PCT申请No.WO03/008102 A1(2002年1月18日)中公开的重力驱动泵，此处参考引用该文件。在这种装置中，采用水平的储罐，其中的流体水平流动，通过表面张力和液体与储罐壁间的毛细力，避免储罐中的垂直塌陷。由于液面高度保持恒定，静压头就不会改变。
也可通过毛细力诱导流动。在这种情况下，与相关的入口通道或储罐中的毛细力比较，在对应的出口通道或储罐中的液体将表现出更高的对于其通道或储罐壁的毛细力。这种毛细力差异可通过多种方法产生。例如，出口和入口通道或储罐的内壁可具有不同的疏水性或亲水性。作为选择和优选的是使出口通道或储罐的截面积更小，从而表现出更大的毛细力。
最优选的是采用起到恒定流速重力驱动泵作用，也表现出入口与出口间毛细力的差异的集成的机载(on-board)储罐。这种装置中的流动可在该装置充满液体时，或当截止阀或塞子打开时马上开始，或可以最初由入口与出口间的压差，例如通过向出口短暂施加吸力辅助开始。
可用许多方式连接多级装置进行复杂的分离，以增强生产率，提高分离率(分选效率)或它们的任何结合。此外，可采用多级分选物流和/或介质物流。当采用多级分选或介质物流时，分选物流可以相同或不同，介质物流也可以相同或不同。
为了提高效率，例如诸如图1中表示的一个装置的乏活动颗粒分选物流出口可与第二装置的分选入口连接，该第二装置也具有介质供应。作为这种与两股介质物流顺次接触的结果，分选物流将进一步缺乏活动颗粒。可将来自两个装置的富活动颗粒流结合。以这种方式采用几个连续级能实际上回收100％的活动颗粒。优选的是当采用多级装置时，它们在具有集中连接通道的同一结构上制成。这种装置的一种示意性地示于图3中。
在图3中，串连构造的两级活动颗粒分选器由通过分选物流通道21与第一分选通道22连接的单个分选流体储罐20构成。第一级还由第一介质供应储罐23、介质物流通道24、富活动颗粒第一介质通道25和富活动颗粒第一介质储罐26组成。乏活动颗粒分选出口物流从第一级流过连接通道27，作为第二级分选通道28的分选物流入口。第二介质储罐29通过介质入口通道30向第二级分选通道提供介质。进一步缺乏活动颗粒的分选流体离开该装置，通过通道31进入乏活动颗粒分选物流储罐32中，同时富活动颗粒介质流体的第二股流体离开分选通道，通过介质出口通道33进入储罐34。两个富活动颗粒介质储罐26、34可非必须地通过带阀门的通道连接到公共的出口通道或储罐，或可以人工排空，例如用注射器或移液管，如果需要，可将它们的内容物混和。
另外的装置示于图4、5和6。在图4的装置中，两个介质供应储罐41向装置40提供介质流体，富活动颗粒介质收集在两个介质出口储罐42中。单个分选流体储罐提供来自分选流体储罐43的含有活动和不活动颗粒的流体，而乏活动颗粒分选流体在穿过分选通道44后收集在分选流体出口储罐45中。在这种情况下，中心分选物流46的两侧与介质物流47相接。
图5和6是依靠改变不同流动路径的连接来改善分选方法的一个或几个方面的多级装置的示意图。在这两个附图中，双线代表分选通道。图5的装置不仅能从不活动颗粒分选出活动颗粒，还能分选成不同活动性的部分，并具有三个分选通道。图6的装置将单个分选通道的出口分裂成几部分，离分选物流最远的出口包含更高比例的最高活动性的颗粒。可见本装置能简单地或很复杂地构造。装置也可以按平行、串连平行或其他模式运行。平行方法对于分选较大的试样，或测量与不同介质流体比较的分选效率等是理想的。当在单个装置中进行测量时，这种比较在统计学上更准确。
尽管此处的大部分描述均指活动颗粒从不活动颗粒的分离，本发明的方法和装置也适于分离不同活动性的活动颗粒。最活动的颗粒将以高于很少活动性颗粒的速度进入介质物流。在分选通道中的停留时间的选择优选地应使大部分活动颗粒在总流体中呈现出无规的或近乎无规的分布。然而与从完全不活动颗粒分离出活动颗粒的情况相反，此时可忍受多余的分选通道长度，且不活动颗粒在介质物流中的分布基本上仅仅是由于布朗运动和湍流等的影响，当分离活动颗粒和很少活动颗粒时，很少活动颗粒在足够时间后也能呈现出不规则分布。分选通道长度必须向下调节到使这种现象不会发生。介质物流将富含活动颗粒和很少活动颗粒，但应相应地更多富含较大活动性的颗粒。第一介质物流(起到下一级的分选物流的作用)的多级连续处理将导致不同活动颗粒间更高的分解度。分选物流的第二级和又一级分选以及它们以类似方式进行的随后处理将提高产率。
实施例1
用前文提及的D.C.Duffy等描述的柔软平版印刷技术，由DowCorning SYLGARD 184可固化硅树脂制备微观流体精子分选装置。将可固化的PDMS在具有要求的作为突起的储罐和通道特征的靠模上铸造。将该铸件PDMS分选装置进行等离子体氧化，用玻璃盖板密封该铸件的开口通道侧。用来自Sigma的、溶解在来自InvitrogenCorporation的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％牛血清白蛋白馏分V涂覆通道和储罐。整个装置约6mm厚，不包括盖板，比美国便士硬币略厚。该装置的透视图示于图7。
在图7中，PDMS铸件是透明的，仅示出储罐和通道。盖板与装置的底面粘结。标记号与图1相同。通道截面为矩形，通道高度为50μm，而储罐为大致半圆形。入口储罐2和3均约3mm高，而出口储罐约2mm高。入口和出口通道7、8、9、10约5000μm长。精子入口通道7和乏活动精子出口通道9的宽度为100μm，而介质入口通道8和出口通道10的宽度约300μm。分选通道6具有500μm的宽度和5000μm的长度。
精液试样根据Review Board学会的批准从受到不育性评价的男性获得。分选测试用洗净的精液试样进行。按所列顺序将60μL处理介质加入介质入口储罐中，将50μL洗净的精液试样加入试样入口储罐，将2μL介质加入每个出口储罐中。在计算精子分选产率时要考虑这些稀释因素。活动精子数由Makler Counting Chamber(Sefi-MedicalInstruments，海法，以色列)确定。为了目测一般相当于不活动精子的膜损坏的精子，将3μL propidium iodide(Molecular Probes，www.probes.com，60mM溶解在处理介质中)在分选前加入精子试样中。用Texas Red过滤器组件(577nm激发，620nm发射)观察来自染色细胞的红荧光。用带有CCD照相机(Hamamatsu 0RCA-100，www.hamamatsu.com)的倒装显微镜(NIKON TE 300，www.nikon-usa.com)捕获图像并记录运动。
该分选装置使用这样一种分选体系，其中不活动精子沿其初始流线流动，并从一个出口流出，而活动精子能偏离其初始流线，并通过不同的出口流出。该分选机理涉及用于“H过滤器”中的“过滤”机理，其中快速扩散的小分子通过与扩散得更慢的较大分子和颗粒不同的出口流出。这两种装置的差别在于本发明的分选装置利用了细胞的主动运动，而H过滤器则利用颗粒的被动扩散。这种分选是可能的，因为在小通道中，多股层流物流可相互平行流动，而在物流间的界面处没有湍流混和。该分选装置中的精子试样和介质流动的典型雷诺数在0.1的量级。约60μm长的不活动人类精子和相同量级放大尺寸的不活动颗粒缓慢扩散(D＝1.5×10-13m2/s；690秒扩散10μm)，并保持在其初始流线中。相反，活动的人类精子在20℃下以大于20μm/s的速度漂浮。这种快速活动性使活动精子本身，而不是不活动精子在数秒内无规地分布在宽度500μm的通道中。该分选装置特别设计成使精子在主分离通道中有20秒的停留时间。位于该分离通道端部的分叉能有效地仅收集偏离其初始入口物流的活动精子。
所描述的分选装置在为实际制造和使用而设计的单个芯片上集中了精子分选必须的所有功能，例如入口/出口、流体储罐、泵、动力源、分选通道等。本实施方式的一个关键设计特征是一组四个水平定向的流体储罐，它们也起到试样入口/出口和流体抽取体系的作用。这些储罐的方向、几何形状和尺寸设计成能平衡重力和表面张力，并提供能在长时间内产生稳定的流速的抽取体系，而与储罐中流体的容积无关。这与流速随着入口储罐中流体容积的减少而随时间降低的传统重力驱动抽取体系形成了对比。储罐直径应选择成足够小，使表面张力能避免液体溢出水平方向的储罐，但大到足以承载足够量的试样(几十到几百微升)，并能方便试样引入和回收。这种力平衡使储罐水平排列而不会使其中的液体溢出。水平储罐的依次排列保持入口和出口储罐中流体之间的高度差相同(入口和出口储罐顶之间1.0mm的高度差)，而与储罐中存在的流体容积无关，即使储罐中流体的量变化也保持恒定的水压。
这里描述的被动驱动抽取体系的独特之处在于，它用水平方向的储罐克服了传统重力驱动抽取中压力随着储罐中液体量的减少而降低的问题。此外，该泵的结构比其他机械或非机械抽取体系简单的多，使得很容易制造并将泵集成在一个小的、集中的装置中。最后，用重力和表面张力作为驱动力消除了对诸如电池的供电的需要，提供了总体上小尺寸的分选装置。考虑到重力、表面张力和通道阻力，将分选装置设计成在主分选通道中提供稳定的精子流速和约20秒的停留时间。更具体地，该装置设计成使流体储罐的流动阻力比微观流体通道的阻力低10倍以上，从而可以忽略。这样，通道的阻力，计算值为2.8×1012kg/(s/m4)，就约等于体系的总阻力。由于要求0.008μL/s的体观流速来实现希望的20秒停留时间，且总阻力为2.8×1017kg/(s/m4)，驱动流体所需净压降为23N/m2。为了实现这种希望的压降，我们这样设计储罐的尺寸，使毛细力(3.0mm直径的入口储罐对2.0mm直径的出口储罐)为13N/m2，由于静压(1.0mm高差)产生的该分选装置的微观流体通道的压降为9.8N/m2。为了计算毛细力，假设接触角为0度(水在BSA涂覆的PDMS上的接触角很小)，洗净的精液试样的表面张力假定为约0.040N/m(小于水由于诸如蛋白质的“杂质”而产生的表面张力)，且洗净的精液试样的粘度与水的粘度接近。对于1％BSA溶液中稀释颗粒悬浮液观察到的0.008μL/s的体观流速约等于计算流速。实际精子试样有时由于较大的表观粘度而具有较低的流速。精子试样物流较低的流速将导致产率的轻微降低，但并不影响分选的精子出口处回收精子的纯度。
该分选装置的精子分选效率通过三种方法评价：(i)通过相衬显微术跟踪通道中活动精子的运动，(ii)通过荧光显微术跟踪通道中propidium iodide(PI)染色细胞的运动，(iii)用Makler CountingChamber(一种基于网格的精子计数装置)测定入口和出口储罐中活动精子与不活动精子的数量(图8)。精子跟踪试验表明活动精子如何能游出其初始流线的过程。PI将诸如死细胞的膜损坏细胞染色，从而使不活动精子对红色荧光表现出高亮和可视，而活动精子保持未染色。图8中的棒图比较了分选前后活动精子的百分数。无阴影的棒代表初始精子试样，而实心棒代表富活动颗粒介质物流。分选后活动精子的纯度接近100％，与分选前活动精子纯度无关。定义为活动精子出口储罐中的活动精子数与精子试样入口储罐中活动精子总数之比的产率(39％、42％、43％)相当于或大于用诸如直接漂浮、从离心精子片漂浮或密度梯度分离的传统分选方法处理的精子的回收率(0.8-50％)。还观察到精子形态(与成功受孕相关的另一个重要的特征)在用该装置分选后也得到改善(Strict Sperm Morphology：分选前9.5±1.1％正常，分选后22.4±3.3％正常)。Kruger Strict Sperm Morphology是一组准则或标准，从而使精子必须在特定测量范围内(头部宽度和长度、尾部长度、精虫头粒形成一定比例的精子头部)和缺乏异常性(例如尖头、圆头、卷曲的尾部)。
从以上可见，该活动颗粒分选装置很小、容易制造、操作简单且高效。在以下权利要求中，除非另外指出，术语“a”和“an”指“一个或一个以上”。
尽管已说明和描述了本发明的实施方式，但这些实施方式并没有说明和描述本发明所有可能的形式。而且说明书中使用的词汇是描述性而非限定性词汇，当然可以作出各种变化而不脱离本发明的精神和范围。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.从很少活动和/或不活动颗粒分选活动颗粒的方法，包括
a)提供包含活动颗粒和至少一种很少活动颗粒或不活动颗粒的分选流体；
b)提供将富含活动颗粒的介质流体；
c)使分选装置的分选通道中的所述分选流体的物流与所述介质流体的物流接触，所述分选流体物流与所述介质流体物流之间在所述分选通道中有非湍流界面，
从而使活动颗粒借助它们自己的力量离开分选流体物流并进入介质流体物流，形成乏活动颗粒分选流体物流和富活动颗粒介质流体物流，和
d)将乏活动颗粒分选流体出口物流与富活动颗粒介质流体出口物流分开。
2.权利要求1的方法，其中所述活动颗粒包含活动精子，且所述很少活动和不活动颗粒包含比所述活动性的精子或无活动性的精子的活动性差的精子。
3.权利要求1的方法，其中所述分选流体在分选流体储罐中提供，而所述介质流体在介质流体储罐中提供。
4.权利要求1的方法，其中所述介质流体和所述分选流体按相同的方向并以基本上相同的流速流动。
5.权利要求1的方法，其中所述分选流体物流和所述介质流体物流在所述分选通道中表现出层流流动。
6.权利要求1的方法，其中所述分选通道中所述介质流体物流的横向容积大于所述分选流体物流的横向容积。
7.权利要求1的方法，其中所述乏活动颗粒分选流体出口物流包含指向具有分选通道的第二装置的分选流体入口物流，并重复步骤a)至d)，从而使活动颗粒进一步进入所述第二装置的介质物流，并进一步减少所述分选流体中的活动颗粒。
8.权利要求1的方法，其中所述活动的、很少活动的和不活动的颗粒是精子颗粒，且所述富活动颗粒介质出口物流中活动颗粒的纯度高于分选流体中活动精子的纯度，而且至少为80％，所述百分数基于所述富活动颗粒介质出口物流中活动精子数与所述富活动颗粒出口物流中的总精子数的比较。
9.权利要求1的方法，其中所述活动颗粒包含活动的微生物，而所述不活动颗粒包含不活动的微生物。
10.适合在权利要求1的方法中使用的活动颗粒分选装置，包括：
a)具有第一端和第二端的分选通道；
b)分选流体储罐；
c)与所述分选流体储罐和所述分选通道的所述第一端流体连通的分选流体入口；
d)与所述分选通道的所述第一端连通的介质流体入口；
e)与所述分选通道的所述第二端流体连通的乏活动颗粒分选流体出口；
f)富活动颗粒介质出口储罐；和
g)与所述分选通道的所述第二端和所述富活动颗粒介质出口储罐流体连通的富活动颗粒介质流体出口，
其中所述分选流体储罐和所述富活动颗粒出口储罐一起包含重力驱动泵，使流体流过所述分选通道。
11.权利要求10的分选装置，其中所述分选通道的所述第一端由分选物流入口和介质物流入口汇合形成，所述分选通道的所述第二端终止于乏活动颗粒分选物流出口与富活动颗粒介质物流出口的分叉处。
12.权利要求10的分选装置，其中所述分选流体入口包含分选流体入口通道，所述介质流体入口包含介质流体入口通道，所述乏活动颗粒分选流体出口包含乏活动颗粒分选流体出口通道，且所述富活动颗粒出口包含富活动颗粒出口通道。
13.权利要求12的分选装置，其中每个所述入口通道和所述出口通道分别与所述装置内部的流体储罐连通。
14.一种活动颗粒分选装置，包含权利要求10的装置，其中所述乏活动颗粒分选物流出口起到权利要求10的第二分选装置的分选物流入口的作用，或其中所述富活动颗粒介质物流出口起到权利要求10的第二分选装置的分选物流入口的作用。
15.在单一集成结构中构建的一组权利要求10的分选装置。
16.权利要求15的一组分选装置，其中至少两个所述分选装置是串连连接的。
17.权利要求10的分选装置，其由聚合物铸成。
18.权利要求13的分选装置，其中所述装置包含含有介质流体储罐、介质流体入口通道、介质通道、富活动颗粒介质流体出口和富活动颗粒介质流体储罐的第二泵抽系统，从而使介质流体由于至少一种重力或毛细力而从所述介质流体储罐流向所述富活动颗粒介质流体储罐。
19.权利要求18的分选装置，其中流体既由于重力也由于毛细力而流动。
20.权利要求10的装置，其中所述分选通道基本上是矩形，具有约60-150μm的高度和约100-800μm的宽度，长度约500-10000μm，其中所述分选入口包含基本上与所述分选通道的高度相同、宽度较窄为50-500μm的分选入口通道，且其中所述介质入口包含一个或多个高度与所述分选通道基本相同、总宽度大于所述分选入口通道宽度并小于所述分选通道宽度的介质入口通道，其中总宽度是当有一个以上入口通道时每个介质入口通道宽度之和。

Claims (21)

1.从很少活动和/或不活动颗粒分选活动颗粒的方法，包括
a)提供包含活动颗粒和至少一种很少活动颗粒或不活动颗粒的分选流体；
b)提供将富含活动颗粒的介质流体；
c)使分选装置的分选通道中的所述分选流体的物流与所述介质流体的物流接触，所述分选流体物流与所述介质流体物流之间在所述分选通道中有非湍流界面，
从而使活动颗粒离开分选流体物流并进入介质流体物流，形成乏活动颗粒分选流体物流和富活动颗粒介质流体物流，和
d)将乏活动颗粒分选流体出口物流与富活动颗粒介质流体出口物流分开。
2.权利要求1的方法，其中所述活动颗粒包含活动精子，且所述很少活动和不活动颗粒包含比所述活动性的精子或无活动性的精子的活动性差的精子。
3.权利要求1的方法，其中所述分选流体在分选流体储罐中提供，而所述介质流体在介质流体储罐中提供。
4.权利要求1的方法，其中所述介质流体和所述分选流体按相同的方向并以基本上相同的流速流动。
5.权利要求1的方法，其中所述分选流体物流和所述介质流体物流在所述分选通道中表现出层流流动。
6.权利要求1的方法，其中所述分选通道中所述介质流体物流的横向容积大于所述分选流体物流的横向容积。
7.权利要求1的方法，其中所述乏活动颗粒分选流体出口物流包含指向具有分选通道的第二装置的分选流体入口物流，并重复步骤a)至d)，从而使活动颗粒进一步进入所述第二装置的介质物流，并进一步减少所述分选流体中的活动颗粒。
8.权利要求1的方法，其中所述活动的、很少活动的和不活动的颗粒是精子颗粒，且所述富活动颗粒介质出口物流中活动颗粒的纯度高于分选流体中活动精子的纯度，而且至少为80％，所述百分数基于所述富活动颗粒介质出口物流中活动精子数与所述富活动颗粒出口物流中的总精子数的比较。
9.权利要求1的方法，其中所述活动颗粒包含活动的微生物，而所述不活动颗粒包含不活动的微生物。
10.适合在权利要求1的方法中使用的活动颗粒分选装置，包括：
a)具有第一端和第二端的分选通道；
b)与所述分选通道的所述第一端流体连通的分选流体入口；
c)与所述分选通道的所述第一端连通的介质流体入口；
d)与所述分选通道的所述第二端流体连通的乏活动颗粒分选流体出口；和
e)与所述分选通道的所述第二端流体连通的富活动颗粒介质流体出口。
11.权利要求10的分选装置，其中所述分选通道的所述第一端由分选物流入口和介质物流入口汇合形成，所述分选通道的所述第二端终止于乏活动颗粒分选物流出口与富活动颗粒介质物流出口的分叉处。
12.权利要求10的分选装置，其中所述分选流体入口包含分选流体入口通道，所述介质流体入口包含介质流体入口通道，所述乏活动颗粒分选流体出口包含乏活动颗粒分选流体出口通道，且所述富活动颗粒出口包含富活动颗粒出口通道。
13.权利要求12的分选装置，其中每个所述入口通道和所述出口通道分别与所述装置内部的流体储罐连通。
14.一种活动颗粒分选装置，包含权利要求10的装置，其中所述乏活动颗粒分选物流出口起到权利要求10的第二分选装置的分选物流入口的作用，或其中所述富活动颗粒介质物流出口起到权利要求10的第二分选装置的分选物流入口的作用。
15.在单一集成结构中构建的一组权利要求10的分选装置。
16.权利要求15的一组分选装置，其中至少两个所述分选装置是串连连接的。
17.权利要求10的分选装置，其由聚合物铸成。
18.权利要求13的分选装置，其中所述装置包含含有分选流体储罐、分选流体入口通道、分选通道、乏活动颗粒分选流体出口和乏活动颗粒分选流体储罐的第一泵抽系统，从而使分选流体由于至少一种重力或毛细力而从所述分选流体储罐流向所述乏活动颗粒分选流体储罐。
19.权利要求13的分选装置，其中所述装置包含含有介质流体储罐、介质流体入口通道、介质通道、富活动颗粒介质流体出口和富活动颗粒介质流体储罐的第二泵抽系统，从而使介质流体由于至少一种重力或毛细力而从所述介质流体储罐流向所述富活动颗粒介质流体储罐。
20.权利要求19的分选装置，其中流体既由于重力也由于毛细力而流动。
21.权利要求10的装置，其中所述分选通道基本上是矩形，具有约60-150μm的高度和约100-800μm的宽度，长度约500-10000μm，其中所述分选入口包含基本上与所述分选通道的高度相同、宽度较窄为50-500μm的分选入口通道，且其中所述介质入口包含一个或多个高度与所述分选通道基本相同、总宽度大于所述分选入口通道宽度并小于所述分选通道宽度的介质入口通道，其中总宽度是当有一个以上入口通道时每个介质入口通道宽度之和。
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