KR102041037B1 - 층류 및 주화성 물질을 이용한 정자 분류 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 정자 분류 칩, 상기 정자 분류 칩의 제조 방법, 및 상기 정자 분류 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 정자 분류 칩은 층류현상과, 정자가 화학유도물질을 인식하고 이동하는 주화성을 이용함으로써, 운동성이 뛰어나고 주화성이 우수한 정자를 간편하고도 효율적으로 선별할 수 있게 한다. 상기 정자 분류 칩은 정자 분류의 효율이 높고, 정자의 선별성이 우수하다.

Description

층류 및 주화성 물질을 이용한 정자 분류 칩 {Sperm sorting chip using laminar flow and chemotactic agent}

본 발명은 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 정자 분류 칩, 상기 정자 분류 칩의 제조 방법, 및 상기 정자 분류 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법에 관한 것이다.

불임이란 약 1년 간 정상적인 부부생활을 하였음에도 불구하고 임신이 되지 않는 상태를 말한다. 대부분의 건강한 남녀는 1년 이내에 85~90%는 임신을 하게 되지만, 나머지 10~15%는 임신이 되지 않아 불임증으로 진단된다. 불임 가운데 절반 정도는 정자 형성의 질적 또는 양적인 문제로 말미암은 남성 불임인 것으로 보고되고 있으며, 세계보건기구(World Health Organization; WHO) 통계자료에 의하면 세계 전체 부부의 15%가 불임이고 환경오염, 과로, 스트레스, 지나친 흡연이나 음주 등으로 인해 남성 불임환자가 증가하는 추세이다

건강보험심사 평가원은 지난 2012년부터 2016년 사이 불임 환자의 연평균 증가율이 남성과 여성에서 큰 차이를 보였다고 밝혔다. 남성은 같은 기간 4만 1979명에서 6만 1903명으로 급증해 연 평균 증가율이 약 55%를 나타내었다. 또한 건강보험심사평가원의 조사 자료에 따르면 남성 불임과 관련 진료비도 해가 갈수록 증가하는 추세이다. 이에 남성 불임과 관련된 문제와 해결책에 대한 방안이 대두되고 있는 상황이다.

남성 불임을 진단하기 위해 주로 사용되고 있는 방법은 Y 염색체 상의 유전자 미세결실을 검출하는 유전적 진단법과, 실제 정액을 현미경으로 관찰하여 정자의 수, 활동성, 형태 등을 진단하는 정액진단법이 있다. 정액진단법은 시술 시 대체로 시술자의 주관적인 판단이 개입될 우려가 있고, 유전적 진단법은 진단에 있어 오랜 시간이 걸리고 많은 노동력이 요구되며, 고가의 장비가 필요하여 가격이 비싸다는 단점이 있으며, 시술을 받기 위해 병원을 방문하여야 하므로 개인의 프라이버시 침해가 우려된다. 또한 기존의 불임시술 시에 정자의 농도, 활동성 위주로 정자를 선별하여 시술에 사용하기 때문에 주화성과 같은 또 다른 정자의 질 지표를 판별하여 이용하는 것에 있어 어려움이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 남성 불임치료 시술에 사용할 수 있는 최적의 정자를 선별하기 위한 바이오칩에 관한 연구가 진행되고 있으나, 관련 연구는 단순히 정자의 운동성에 의존하여 정자의 분리 및 농도를 측정하는 것에 제한되고 있으며, 정확한 방향성이 결여된 운동성에만 의존했다는 점과 정자의 질의 평가 요소 중 하나만 진단할 수 있다는 단점이 있다.

정자의 질을 평가하는 기존 방법은 장시간, 고비용, 노동집약적이어서 우수한 정자의 선별에 어려움이 있으므로, 이를 저비용으로 신속하게 간단히 평가할 수 있는 시스템의 개발이 필요하다. 정자의 단순 움직임에만 의존한 정자활동성 연구에는 한계가 있으므로, 정자의 질을 평가하기 위해서는 정자가 난자를 향해서 어떻게 정확한 방향으로 헤엄쳐 가는지에 대한 메커니즘을 통해 정확한 방향성을 가진 정자의 운동성을 평가할 필요가 있다. 기존의 방법들은 정자의 농도, 활동성, 형태의 한 가지 인자만 진단할 수 있어 효율이 떨어지는 문제가 있어, 이들을 동시에 진단할 수 있는 시스템이 필요하다. 기존의 임신은 대체로 남성 정자의 상태 확인 없이 이루어지므로 임신 직전 정자의 질을 확인할 수 있는 시스템이 필요하다.

정자의 주화성 유도를 위해서, 이와 관련된 화학유도물질을 분비한다고 알려진 난구세포(cumulus cell)를 칩 내부에서 배양한 종래의 연구결과가 있었으나, 동물 유래 난구세포를 이용했다는 점에 있어 한계가 있다. 또한 인간 유래 난구세포를 연구에 이용하는 것은 획득과 그 사용에 있어 윤리적 문제가 발생할 수 있다는 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 정자 분류 칩은 PDMS 등의 재질로 제조된 칩 내부로 정자를 주입하기 위한 정자 주입 채널, 상기 칩 내부에 형성되어 있는 미세 채널 및 상기 정자 주입 채널로부터 미세 채널을 따라 이동한 정자가 수집되는 포집구가 존재하고 상기 포집구에는 정자의 주화성을 유도하는 화학유도물질이 존재한다. 화학유도물질은 인간 특이적으로 작용하는 합성된 프로게스테론(progesterone), 아난다마이드(anandamide)를 사용하였다. 상기의 화학유도물질은 인간 정자의 선별에 이용될 수 있으며, 인간 유래 난구세포를 실험에 사용하지 않아도 되므로 관련된 문제에 있어 자유롭다.

본 발명자들은 미세유체 흐름을 이용하여 1차적으로 운동성이 좋은 정자를 분리한 뒤, 주화성 유도물질에 특이적으로 반응하여 이동하는 정자를 분석하여 활동성과 주화성을 동시에 지닌 우수한 정자를 신속하고 간단히 선별할 수 있는 정자 분류 칩을 발명하였으며, 이를 이용해 운동성 및 주화성이 뛰어난 우수한 정자를 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 정자 분류 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 정자 분류 칩의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 정자 분류 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 정자 분류 칩을 이용하여 선별된 정자를 이용하여 보조생식술을 시술하며 시술의 성공률을 높이는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명은 미세유체의 층류현상과 여성 생식기관에서 분비하는 주화성 유도물질에 의한 정자 활성 메커니즘을 응용하여, 운동성(sperm motility)과 주화성(chemotaxis)이 동시에 뛰어난 정자의 선별/포집 방법을 제안하며, in vitro 환경에서 생체모방 구조 및 물질을 이용하여 간편하고 신속하게 우수한 정자만을 분류해내기 위한 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 정자 주입 채널; 배지 주입 채널; 상기 정자 주입 채널 및 배지 주입 채널과 연결된 주 채널; 및 상기 주 채널과 운동성 정자 채널로 연결된 주화성 정자 선별부를 포함하며, 상기 주화성 정자 선별부는 둘 이상의 정자 배출구를 포함하고, 상기 정자 배출구 중 하나가 정자를 유도하는 화학유도물질이 위치하는 정자 포집구로 선택되며, 상기 정자 주입 채널 및 배지 주입 채널 각각으로부터 유동하는 미세유체 흐름이 상기 주 채널에서 합류하여 층류현상을 일으키는 것을 특징으로 하는, 운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 정자 분류 칩을 제공한다.

본 발명은 정자의 능동적인 움직임에 의해 미세유체 생체모방 칩 내에서 질적으로 우수한 정자를 선별하기 위한 것으로서, 본 발명에 따른 정자 분류 칩은 칩 내부의 층류 현상을 극복하며, 화학유도물질을 인지하여 정자가 이동하는 운동성 및 주화성이 뛰어난 정자가 효율적으로 선별되도록 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 정자 분류 칩은 미세유체 및 생체모방 구조에 기반한 시스템으로서, 일례로 상기 생체모방 미세유체 칩은 실린지 펌프를 이용하여 주입할 수 있게 배지와 정자 샘플이 주입되는 주입 채널이 형성되어 있으며, 주입되는 정자가 이동할 수 있도록 칩의 하부에 형성된 미세유체 채널 및 화학유도물질을 이용하여 정자를 분류하는 주화성 정자 선별부가 형성되어 있다.

본 발명에서, 상기 "주 채널"은 정자 주입 채널과 배지 주입 채널의 두 미세유체 채널을 흐르는 유체가 합류하여 그 내부에서 층류현상이 일어나도록 하는 채널을 의미한다.

본 발명의 배지 주입 채널은 경사를 이루어 주 채널에 연결되어 있으며 정자 주입 채널은 수평으로 주 채널과 연결되어 있을 수 있고, 정자주입 채널과 배지 주입 채널이 연장되어 만나 주 채널을 이루는 것일 수 있다. 배지 주입 채널과 정자 주입 채널에서의 액체의 흐름이 주 채널에서 만나 미세유체 칩 내부에서 층류현상이 일어나는 것을 특징으로 한다.

상기 "층류현상"은, 미세 채널에 존재하는 2개 이상의 얇은 층을 가진 유체 흐름이, 상기 흐름 간의 계면에서 혼합을 일으키지 않고 서로 평행하게 이동하는 것을 의미한다. 이러한 층류현상을 이용하면, 비운동성 정자는 느리게 확산되므로 기존의 유체흐름라인에서 벗어나지 못하고 흐름을 따라 이동하며, 운동성 정자는 보다 신속히 이동하므로 기존의 유체 흐름을 이겨내고 이탈하여 상이한 유출구로 이동하므로, 운동성이 뛰어난 정자를 선별할 수 있다.

일례로, 본 발명의 도 4 및 도 7 내지 9와 관련된 실시예에 따르면, 주 채널 내에서 층류가 형성되며 운동성이 뛰어난 정자들은 층류를 극복하여 운동성 정자 채널로 이동하는 것을 확인할 수 있다.

본 발명에서, 상기 "정자 주입 채널"은 정자 시료 주입구로부터 정자가 주 채널로 주입될 수 있도록 연결된 채널을 의미한다. 정자 주입 채널을 통해서는 정액샘플을 Ham's F10배지와 1:3의 비율로 혼합한 샘플 혹은 전처리 과정을 거친 정자가 들어있는 Ham's F10배지와 PVP(polyvinylpyrrolidone) 용액이 적당한 비율로 희석된 혼합 샘플이 주입될 수 있다. 바람직하게는 정액이 주입될 수 있으나, 정액과 유사한 점도를 나타내거나 정자의 보존 및 수송 등을 위해 사용되는 유체라면 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자 주입 채널은 주 채널과 평행할 수 있다.

본 발명에서, 상기 "배지 주입 채널"은 배지 주입구로부터 정자가 포함되지 않는 배지가 주 채널로 주입될 수 있도록 주 채널과 연결된 채널을 의미한다. 상기 배지는 정자를 포함하지 않는 유체로서, 정액과 유사한 점도를 나타내거나 정자의 보존 및 수송 등을 위해 사용되는 유체일 수 있다. 구체적으로, 정자 주입 채널로 주입되는 유체에서 정자가 포함되지 않은 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지로서 HAM's F10 배지, HEPES 배지, HTF 배지 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

배지 주입 채널은 주 채널과 예각을 이루며 연결되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지 주입 채널은 주 채널과 30도 내지 45도의 각을 이루며 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 "주화성 정자 선별부"는 주 채널로부터 운동성 정자 채널을 통해 진입한 정자들 중, 화학유도물질을 향한 주화성이 뛰어난 정자를 선별하기 위한 구조를 의미하는 것으로서, 둘 이상의 정자 배출구를 포함하고, 상기 정자 배출구 중 하나가 화학유도물질이 위치하는 정자 포집구로 선택되어, 주화성이 뛰어난 정자를 포집할 수 있도록 한다.

본 발명의 주화성 정자 선별부는 예를 들어, 미세유체채널 주 채널 상단부에 운동성 정자 채널을 통해 연장되어 연결되어 있으며, 구조의 상단부 양 끝에 두 개의 정자 배출구가 형성되어 있는 것을 특징으로 하며, 이때 정자를 유도하기 위한 화학유도물질은 두 개의 배출구 중 한쪽에만 구비되어 있도록 한다.

상기 주화성 정자 선별부 내에서, 주화성이 뛰어난 정자는 화학유도물질이 존재하는 정자 포집구를 향하여 이동하게 되므로, 주화성이 뛰어난 정자를 선별할 수 있다.

본 발명의 도 5를 참조하면, 주화성 정자 선별부 내에서 주화성이 뛰어난 정자는 아난다마이드 등의 화학유도물질이 위치하는 정자 포집구를 향하여 이동하고, 그렇지 못한 정자는 다른 정자 배출구로 배출된다.

정자의 주화성은 정자의 품질을 나타내는 마커 중에 하나로 알려져 있으며, 정자의 주화성이 우수할수록 보다 활동적인 움직임이 가능하며 이는 정자의 수정능 획득에 중요한 역할을 한다(Reviews of Reproduction. 1999, 4, 56-66 및 PLoS One. 2011, 6(12), e28359).

본 발명에서는 화학유도물질을 통해 정자의 주화성이 나타나게 하여, 우수한주화성을 나타내는 정자를 선별할 수 있다. 상기 화학유도물질의 주화성이 매우 강하거나 매우 약할 경우 대부분의 정자가 주화되거나 또는 주화되지 않도록 하여, 우수한 주화성을 나타내는 정자를 선별하기 어려울 수 있다. 이에, 화학유도물질이 나타내는 주화성의 정도를 세밀하게 설정하는 것이 중요하다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 화학유도물질로서 프로게스테론, 아난다마이드 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.

상기 "프로게스테론"은 동물 등의 난소 안에 있는 황체에서 분비되는 여성 호르몬의 일종으로서, 에스트로겐과 함께 생식주기를 조절하는 역할을 하며, 벤젠 고리를 가지고 있는 스테로이드 호르몬이다.

또한, 상기 "아난다마이드"는 N-아라키도노일에탄올아민(N-arachidonoylethanolamine, AEA)으로도 알려져 있는 아라키돈산의 유도체이다. 아난다마이드는 Hv1으로 알려진 정자 내부 채널의 양성자 방출을 적절하게 제어함으로써 정자의 움직임 및 활동성을 조절하는 물질이다.

본 발명의 일 실시예에서는 프로게스테론 단독, 아난다마이드 단독 혹은 상기 프로게스테론과 상기 아난다마이드를 혼합한 화학유도물질 후보군으로 선정하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기 화학유도물질은 프로게스테론 및 아난다마이드가 2:1 내지 1:2의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 비율로 혼합될 경우에 실제 난자가 나타내는 정자 유도 특성과 유사한 정도로 정자가 유도되어 우수한 주화성을 나타내는 정자를 선별하기에 적합하다.

구체적으로, 상기 화학유도물질은 10 pM 내지 1 μM의 농도로 주입될 수 있고, 바람직하게는 프로게스테론은 10 pM 내지 1 nM의 농도로 주입될 수 있고, 아난다마이드는 1 nM 내지 1 μM의 농도로 주입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일례로, 상기 화학유도물질은 정자 포집구에 고체화시킨 젤을 형성하여 확산을 통해 주입할 수도 있다. 상기 젤은 1%의 염화칼슘과 4%의 알긴산을 1:2 내지 1:5의 비율, 구체적으로 1:2 내지 1:4, 보다 구체적으로 1:2.5 내지 1:3.5의 비율로 섞어 만들어 주며, 이 때 화학유도물질을 상기 젤에 포함시켜 준다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자 분류 칩의 재질은 투명한 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 정자 분류 칩의 재질은 PDMS, 유리 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 미세유체 칩의 재료는 시료가 움직이는 것을 육안으로 볼 수 있고 필요시 정자를 현미경으로 관찰할 수 있도록 투명한 재질인 것이 바람직하다. 특별히 제한되지는 않으나, 투명한 재질 중에서도 투명 고분자 또는 유리가 더욱 바람직하다. 투명 고분자 중에서도 PDMS(polydimethylsiloxane) 고분자는 본 발명의 재료에 적합하다. PDMS의 장점은 화학적으로 안정하며 낮은 표면 에너지(21.6 mJ/m²)값을 가지고 있어 다른 물질과 반응하지 않고 쉽게 분리된다는 것이다. 또한 가스를 쉽게 통과시키며 열에 안정(~186℃)하다. 또한, 생물 친화적이기 때문에 세포에 해를 주지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 주 채널은 층류 현상을 극복할 수 있는 운동성을 가진 정자만이 상기 주화성 정자 선별부로 이동할 수 있도록 하는 것일 수 있다.

정자의 운동성은 자궁경관 점액 통과, 여성 생식관 내 이동과, 방사관 및 투명대의 통과 등을 위해 필요한 능력으로서, 정자의 품질 및 임신가능성을 평가하는 데 있어서 중요한 지표의 하나이다(J. Proteome Res. 2014, 13, 5670-5684 및 Fertility and Sterility, Vol.85, No.3, March 2006). 따라서 정자의 운동성을 평가함으로써 우수한 정자를 효율적으로 선택할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자 분류 칩은 상기 주 채널이 평행하게 연장되어 연결된 비운동성 정자 배출 채널을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 비운동성 정자 배출구는 미세유체채널 주 채널 하단에 연장되어 연결되며 운동성이 떨어지는 정자가 배출되어 포집될 수 있도록 한다.

본 발명의 도 9에 도시된 바와 같이, 적색 원으로 표시된 운동성이 뛰어난 정자는 주 채널 상단부에 연결된 운동성 정자 채널로 진입하는 반면, 그렇지 못한 정자는 주 채널 하단부에 연결된 비운동성 정자 배출 채널로 이동할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 배지 주입 채널은 상기 주 채널의 일측 상단부에 연결되고, 상기 정자 주입 채널은 상기 주 채널의 일측 하단부에 연결되며, 상기 운동성 정자 채널은 상기 주 채널의 타측 상단부에 연결되는 것일 수 있다.

일례로, 층류현상이 발생하는 주 채널 내부에서, 정자는 층류의 일측 계면 하단부로 공급되고, 배지는 계면 상단부를 흐른다. 이때 주화성 물질이 위치하는 주화성 정자 선별부는 운동성 정자 채널에 의하여 층류의 타측 상단부와 연결되어 있다. 따라서 계면 하단부 일측으로 공급되는 정자들 중 운동성 및 주화성을 갖춘 정자는 계면 하단부로부터 계면 상단부를 거쳐 운동성 정자 채널에 진입할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자 주입 채널과 상기 배지 주입 채널의 폭이 서로 다른 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 배지 주입 채널의 폭은 0.3 mm 내지 1.5 mm이며, 상기 정자 주입 채널의 폭은 0.1 mm 내지 0.5 mm이고, 상기 주 채널의 폭은 0.5 mm 내지 2.5 mm인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자 분류 칩의 배지 주입 채널로 주입되는 유체와, 정자 주입 채널로 주입되는 유체의 속도의 비율은 1.1:0.8 내지 1.2:0.8인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 주화성 정자 선별부는 자궁 모방구조를 가질 수 있다. 즉, 상기 "자궁 모방구조"는 실제 자궁과 유사한 길이 및 폭을 갖는 챔버와 양쪽에 실제 자궁의 나팔관에 상응하는 채널이 연결된 형태를 가질 수 있다. 상기 나팔관에 상응하는 채널의 끝에는 주화성 정자를 선별하기 위한 정자 배출구가 연결될 수 있다.

자궁 모방구조를 갖는 본 발명의 주화성 정자 선별부가 도 1 및 도 5 등에 도시된다. 상기 자궁 모방구조는 정자 배출구와, 화학유도물질이 존재하는 정자 포집구를 포함한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 정자 분류 칩의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 정자 분류 칩은 미세유체 채널이 형성된 칩 및 슬라이드를 접착하여 제조될 수 있다.

일례로서 도 3에 미세유체 채널 칩과 유리 슬라이드가 접착되어 제조된 정자 분류 칩이 도시된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 정자 분류 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 실시형태는 일례로, 상기의 정자 분류 칩을 준비하는 단계; 정자 주입 채널에 운동성 정자와 비운동성 정자를 포함하는 정자 시료를 주입하는 단계; 배지 주입 채널에 정자용 배지를 주입하는 단계; 상기 정자 시료의 정자 중, 주 채널 및 주화성 정자 선별부를 통과하여, 정자 포집구에 수집된 정자를 운동성과 주화성이 우수한 정자로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 정자는 인간의 정자인 것이거나, 또는 인간이 아닌 동물의 정자일 수 있다.

상기 "동물"은 축산업에 이용되는 가축을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 상기 동물은 소, 말, 개 또는 돼지인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 특정 실시양태가 인간 정자의 분류에 기준을 두고 서술되더라도, 이들 실시양태가 인간 정자에만 한정되지는 않으며, 필요에 따라 축산업에서 동물 정자의 분류에 이용하여 보다 우수한 품종의 개체를 얻는 목적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기의 정자 분류 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법을 거쳐 최종적으로 선별된, 운동성이 좋고 주화성이 뛰어난 정자는 일련의 물리적, 생화학적 분석 과정을 거쳐 추가적인 정자 특성의 검증에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 정자 분류 칩은 층류현상과, 정자가 화학유도물질을 인식하고 이동하는 주화성을 이용함으로써, 운동성이 뛰어나고 주화성이 우수한 정자를 간편하고도 효율적으로 선별할 수 있게 한다. 상기 정자 분류 칩은 정자 분류의 효율이 높고, 정자의 선별성이 우수하다.

이러한 본 발명은 우수한 정자의 효율적인 선택을 해야 하는 세포 내 정자 직접 주입법(ICSI, intracellular sperm injection), 또는 체외수정(IVF, in vitro fertilization) 시술에 필요한 정자 분류에 매우 적합하다. 또한 운동성이 뛰어나고 주화성이 우수한 정자를 시술에 사용해야 하는 인공수정(IUI, intrauterine insemination)에도 사용하기 적합하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 정자 분류 칩의 평면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 정자 분류 칩의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 정자 분류 칩에 사용되는 미세유체 칩과 유리 슬라이드를 접착한 모식도의 사시도이다.
도 4는 층류가 형성된 주 채널 내부에서 운동성이 없는 정자와 운동성이 뛰어난 정자들이 흐름을 따라 이동하는 모습을 나타낸 모식도이다.
도 5는 자궁 모방 구조인 주화성 정자 선별부 내부에서 주화성이 뛰어난 정자가 아난다마이드가 주입된 포집구의 방향을 인식하고 이동하는 모습을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 인간 정자의 현미경 사진이다.
도 7은 층류현상이 발생한 주 채널의 도입부이며, 층류현상의 하단부는 층류를 극복하지 못한 운동성이 좋지 못한 정자들과 백혈구가 흐름을 따라 이동하며, 층류현상의 상단부는 운동성이 뛰어난 정자들이 층류를 극복하여 흐름을 따라 이동한다. 층류현상을 극복한 정자들은 적색의 원으로 표기하였다.
도 8은 층류현상이 발생한 주 채널의 중간부이며 상기 채널의 도입부와 유사한 흐름을 보인다. 층류현상을 극복한 정자들은 적색의 원으로 표기하였다.
도 9는 층류현상이 발생한 주채널의 말단부이며, 상단부는 주화성 정자 선별부로 연결되어 있다. 층류현상을 극복한 정자들은 적색의 원으로 표기하였다.
도 10은 주화성 정자 선별부로 연결되는 운동성 정자 채널 내에서 이동하는 정자들을 나타낸다.
도 11 및 도 12는 각각 주화성 정자 선별부 및 정자 포집구 근방에서 화학유도물질을 인식하고 이동하는 정자를 나타낸 현미경 사진이다. 화학유도물질을 인식하는 주화성이 뛰어난 정자 중 일부를 적색의 원으로 표기하였다.

이하 본 발명을 실시 예 및 실험 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예 및 실험 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명의 실시양태가 기재되었지만, 이들 실시양태가 본 발명의 모든 가능한 형태를 기재하지는 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 제한하려기보다는 설명을 위한 용어이며, 본 발명의 취지와 범주에서 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예 1. 본 발명의 정자 분류 칩의 제조

본 발명의 정자 분류 칩을 제조하기 위한 공정의 일 실시 예를 아래에 기술한다.

먼저, 본 발명에 따른 미세 채널구조를 AutoCAD 2017 프로그램에 의해 고안한 후, 고안된 디자인을 패터닝 하고 실리콘 웨이퍼 위에 네거티브 포토레지스트인 SU-8을 스핀코팅 한 뒤, 패턴된 포토마스크를 사용한 공정을 통해 주형을 제작하였다. 그리고 액체 상태의 PDMS와 경화(curing) 용액을 10:1의 비율로 섞어 상기 SU-8 주형에 붓고 80℃에서 8시간 동안 열처리를 가해 굳힌 뒤 주형으로부터 분리해 내었다. 분리된 PDMS를 칩의 크기에 따라 자른 뒤 펀치를 이용하여 배지 주입구와 정자 배출구의 위치에 따라 각기 다른 크기로 구멍을 뚫었다. 그런 다음, 상기 주형된 칩과 유리 슬라이드를 플라즈마 산화 처리하여 유리 슬라이드를 바이오칩의 하부면에 접착시켰다. 이와 같이 접착되어 제조된 본 발명의 정자 분류 칩이 도 3에 도시된다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 정자 분류 칩의 유리 슬라이드의 사이즈는 76 mmХ52 mmХ1.2 mm이고, PDMS는 50 mmХ40 mmХ5 mm이다. 또한 칩의 좌측부에 배지 주입구 및 정자 주입구가 있으며 상기 주입구로부터 연장된 미세채널이 칩의 중앙부에 위치하는 주 채널에 연결되어 있으며, 채널 우측 하단부는 비운동성 정자배출구로 연장되며, 채널 우측 상단부는 자궁 모방 구조로 연장된다. 채널의 우측 상하단부에는 각각 정자 배출구가 연결되어 있다. 주입구의 직경은 1.2 mm이고, 정자 배출구의 직경은 8.0 mm이다. 또한 배지주입채널의 길이는 10 mm, 폭은 0.9 mm이고 정자주입채널의 길이는 10 mm, 폭은 0.3 mm이며, 주 채널의 길이는 10 mm, 폭은 1.5 mm이다. PDMS의 크기와 채널의 길이 및 폭은 제한되지 않으며 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 선에서 다양한 변형이 가능하다.

실시예 2. 본 발명의 정자 분류 칩의 작동

이러한 본 발명의 정자 분류 칩은 아래와 같은 과정에 의해 작동될 수 있다.

먼저 실린지 펌프를 이용하여 배지주입구를 통해 칩 내부에 HAM's F10 배지를 주입한다. 채널 내부에 배지가 모두 찰 때까지 배지를 주입하여 준다.

그 후, 정액 샘플을 HAM's F10 배지와 1:3 비율로 섞어 희석시켜 준 다음 실린지 펌프를 이용하여 정자 주입 채널의 주입구를 통해 칩 내부로 샘플을 주입하여 준다. 동시에, 또 다른 실린지 펌프를 이용하여 배지 주입 채널의 주입구를 통해 HAM's F10 배지를 주입하여 층류 현상이 칩 내부에서 일어날 수 있도록 해 준다. 이 때 배지 주입 속도와 정액 샘플 주입 속도의 비율은 분당 1.1μL:0.8μL이며, 주입속도는 분당 1μL다.

주입속도의 비율은, 본 실험을 진행하기 전 여러 가지 조건 실험을 통해 층류 현상이 칩 내부에서 잘 구현될 수 있는 조건으로 선택하였다. 본 조건은 제한되지 않으며, 칩 내부의 소수성 처리 정도나 채널의 크기 및 폭에 따라 다양한 비율 조건 설정이 가능하다.

정자 분류 칩을 광학현미경 위에 배치한 다음 상기의 실험 과정을 진행하며, 영상촬영을 통해 정자의 움직임을 모니터링함으로써 운동성이 뛰어난 정자의 이동을 관찰할 수 있다. 정자의 움직임을 관찰하여 획득한 사진이 도 7 내지 12에 나타난다.

미세유체 채널 내의 층류 현상을 극복한 운동성이 뛰어난 정자는 미세유체 채널 우측 상단부로 연결되는 자궁 모방 구조를 따라 이동하게 된다. 이 때, 자궁 모방 구조의 상단부 양 끝에 존재하는 정자 배출구의 한 방향에 화학유도물질을 주입한다. 화학유도물질은 배출구 내의 배지에 주입한다. 상기 화학유도물질은 고체화시킨 젤을 이용한 확산을 통해 주입할 수도 있다.

화학유도물질로는 프로게스테론만 이용한 실험군, 아난다마이드만 이용한 실험군, 프로게스테론과 아난다마이드를 1:1의 비율로 섞어 이용한 실험군 및 화학유도물질을 포함하지 않은 증류수를 이용한 대조군으로 나누어 실험을 진행하였다. 화학유도물질의 종류는 아난다마이드와 프로게스테론에만 한정되지 않으며 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 선에서 다양한 비율의 사용 및 조합이 가능하다.

상기 선정된 프로게스테론과 아난다마이드를 1 μM 농도에서부터 시작하여 10배씩 단계적으로 희석과정을 거쳐 1 nM 농도까지 희석하여 각각의 농도에서 정자의 주화성이 유도되는지 관찰하였다.

도 7 내지 도 9에 나타난 바와 같이, 주 채널에서 발생하는 층류현상을 극복할 수 있는 우수한 운동성을 가진 정자가 운동성 정자 채널로 진입함으로써 선별되고, 이어서 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 우수한 주화성을 가져 화학유도물질을 인식할 수 있는 정자가 정자 포집구로 이동함으로써 선별되는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

1 : 배지 주입구
2 : 정자 시료 주입구
3 : 주 채널
4 : 비운동성 정자 배출구
5 : 주화성 정자 선별부
6 : 정자 포집구
7 : 정자 분류 칩

Claims (20)

1. 정자 주입 채널; 배지 주입 채널; 상기 정자 주입 채널 및 배지 주입 채널과 연결된 주 채널; 및 상기 주 채널과 운동성 정자 채널로 연결된 주화성 정자 선별부를 포함하며,
   상기 주화성 정자 선별부는 둘 이상의 정자 배출구를 포함하고, 상기 정자 배출구 중 하나가 정자를 유도하는 화학유도물질이 위치하는 정자 포집구로 선택되며,
   상기 주화성 정자 선별부는 자궁 모방 구조이며,
   상기 정자 주입 채널 및 배지 주입 채널 각각으로부터 유동하는 미세유체 흐름이 상기 주 채널에서 합류하여 층류현상을 일으키는 것이며,
   상기 화학유도물질은 프로게스테론 및 아난다마이드가 1:1 내지 1:2 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는,
   운동성 및 주화성이 우수한 정자를 선별하기 위한 정자 분류 칩.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 정자 주입 채널은 주 채널과 평행하며, 배지 주입 채널은 주 채널과 예각을 이루며 연결되는 것인, 정자 분류 칩.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 배지 주입 채널은 주 채널과 30도 내지 45도의 각을 이루며 연결되는 것인, 정자 분류 칩.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 화학유도물질은 10 pM 내지 1 μM의 농도로 주입되는 것인, 정자분류 칩.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 정자 분류 칩의 재질은 투명한 것인, 정자 분류 칩.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 정자 분류 칩의 재질은 PDMS, 유리 또는 이들의 조합인 것인, 정자 분류 칩.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 주 채널은 층류 현상을 극복할 수 있는 운동성을 가진 정자만이 상기 주화성 정자 선별부로 이동할 수 있도록 하는 것인, 정자 분류 칩.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 주 채널이 평행하게 연장되어 연결된 비운동성 정자 배출 채널을 추가로 포함하는 것인, 정자 분류 칩.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 배지 주입 채널은 상기 주 채널의 일측 상단부에 연결되고, 상기 정자 주입 채널은 상기 주 채널의 일측 하단부에 연결되며, 상기 운동성 정자 채널은 상기 주 채널의 타측 상단부에 연결되는 것인, 정자 분류 칩.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 정자 주입 채널과 상기 배지 주입 채널의 폭이 서로 다른 것인, 정자 분류 칩.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 배지 주입 채널의 폭은 0.3 mm 내지 1.5 mm이며, 상기 정자 주입 채널의 폭은 0.1 mm 내지 0.5 mm이고, 상기 주 채널의 폭은 0.5 mm 내지 2.5 mm인 것인, 정자 분류 칩.
    
14. 제1항에 있어서, 상기 정자 분류 칩의 배지 주입 채널로 주입되는 유체와, 정자 주입 채널로 주입되는 유체의 속도의 비율은 1.1:0.8 내지 1.2:0.8인 것인, 정자 분류 칩.
    
15. 삭제
16. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항의 정자 분류 칩의 제조 방법.
    
17. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항의 정자 분류 칩을 이용하여 정자를 선별하는 방법.
    
18. 제17항에 있어서, 상기 정자는 인간의 정자인 것인, 정자를 선별하는 방법.
    
19. 제17항에 있어서, 상기 정자는 인간이 아닌 동물의 정자인 것인, 정자를 선별하는 방법.
    
20. 제19항에 있어서, 상기 동물은 소, 말, 개 또는 돼지인 것인, 정자를 선별하는 방법.
    

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