CN1632126A - 季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及树枝状高分子基因载体的制备技术，特别是通过设计新的核分子，合成出活性基团数目是旧核产物三倍的树枝状高分子。其技术方案是利用三羟甲基氨基甲烷，经过简单有机反应后，与季戊四醇－四元酰氯衍生物形成新的核分子季戊四醇－十二元胺。由新核合成出的各代高分子与旧核各代产物相比，表面电荷密度及活性胺端基数目增加了三倍，有利于获得更高的基因转移效率。这类高分子表面富含胺基，能与负电性的DNA结合成纳米超分子复合物，可作为基因载体将质粒DNA转入细胞。细胞转染试验说明，其效率与常用的脂质体基因转移试剂相当，但细胞毒性远小于后者，成本低廉，可大量生产，且该方法可大大缩短反应和纯化时间，提高效率，有很好的应用前景。

Description

季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法

技术领域

本发明涉及树枝状高分子纳米基因载体的制备技术，特别是利用季戊四醇衍生物与三羟甲基氨基甲烷(Tris)-三元酯衍生物反应，生成新的核分子，在此基础上合成出的各代树枝状高分子具有相当于以前旧核各代三倍活性基团数目的树枝状高分子，使低代产物即可具有之前较高代产物的表面电荷密度及活性官能团的数目。本发明产生的树枝状高分子纳米基因载体可用于基因转移，治疗癌症、心血管疾病等。

背景技术

在最近几年对基因疗法的深入研究，人们发现许多基因对肿瘤、心血管疾病、糖尿病等具有显著疗效。但是自从几年前美国临床实验发生死亡事故，全世界对基因疗法的临床实验采取了十分谨慎的态度，所以尽管基因疗法在动物实验中安全有效，临床实验几乎还没有开展。其中一个主要原因是对病毒类基因载体安全性的担心，虽然病毒载体具有非常好的基因转移效率。具有安全性的非病毒基因载体的研究一直是生物材料领域的重点课题。尤其是目前，具有广阔应用前景的基因疗法受阻于基因载体时，对非病毒基因载体的需求变得更加迫切。目前研究表明非病毒载体的基因转移效率已经接近或超过了商品级脂质体。基于高分子材料的非病毒基因载体不仅安全，而且具有大量的活性官能基团易于被修饰的特性，可以通过特定的修饰反应，赋予基因载体细胞间靶向传递的能力。

目前研究的较多的聚合物基因治疗体系主要有阳离子多聚物型载体、非缩聚型聚合物体系、可生物降解的聚合物体系、多复合脂质体体系、热敏感聚合物体系及聚合型胶束体系等。尽管在非病毒载体研究的早期，人们的主要兴趣放在脂质体上，但是近几年来的研究发现，阳离子型的脂质体基因载体，在重复的使用中被发现有很高的细胞毒性，并且，在体内有潜在的抗炎性表现，和淋巴细胞在体内长期培养，脂质体会产生很高的毒性。正因为病毒载体以及阳离子脂质体所存在的局限性，因而，人们对阳离子聚合物作为基因载体的兴趣越来越高。研究得比较多的阳离子型转基因载体有聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)以及以乙二胺为核的聚酰胺-胺树枝状高分子EDA-PAMAM，其中树枝状高分子的应用尤其受到重视。

树枝状高分子(Dendrimer)是近年来引起重视的一类高分子材料，是一类由小分子化合物作为核分子通过逐步反应成为树枝状、结构规整，单一分散，表面富集活性反应官能团以及纳米尺寸大小的高分子材料，可以根据不同的需求来设计其核分子及骨架的结构，因此在各个领域具有潜在的应用能力。最突出的应用表现在用于基因转移载体方面。在正常生理环境下，由于胺端基质子化从而带上正电荷的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM会与带负电的DNA相互作用，形成纳米尺寸的超分子复合物，而树枝状高分子的独特结构，使得它与DNA形成的复合物极易进入细胞，从而将基因转入。如果能对树枝状高分子进行修饰，如连接特定蛋白、受体，携带磁性等，便可以使基因转移具有靶向性。实验中通过控制树枝状高分子与DNA相互作用的配比，控制其与DNA复合物的大小，引入对细胞膜有亲和性的基团，均可显著提高基因转移效率。

然而，在树枝状高分子的合成中随着分子量的增加，每一代样品的分离和纯化都会变得越来越困难，因为随着表面官能团数目的增多，其分子内和间氢键和范德华作用力都会大大的增加，从而使抽提剩余反应原料的难度变大，后续反应的效果降低，进而影响到下一步接枝的百分率，造成分子结构不规整，形成缺陷。一般在合成出四、五代树枝状高分子以后，每增加一代都需要几个星期的时间。所以，如何能解决树枝状高分子材料的合成及纯化问题，从而大大缩短其制备周期且提高产率是十分必要的。

发明内容

本发明是提供一种树枝状高分子纳米基因转移载体的制备方法。本方法解决了树枝状高分子合成方面的难题，通过季戊四醇衍生物与Tris衍生物进行反应，使末端最终活性基团数目由之前旧核的四个增加到十二个，扩大了三倍。因此，在后续合成的树枝状高分子中，衍生后新核的低代产物将拥有三倍于之前旧核合成产物的表面电荷密度，实验证明第五代产品的基因转移效率达到之前旧核产品第九代的基因转移效率，从而节省了从第五代到第九代的所需的大量合成及后续纯化工作。

本发明的技术方案如下：

这种季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，是采用季戊四醇经过四步反应，生成活泼的季戊四醇-四元酰氯衍生物A；三羟甲基氨基甲烷Tris经过两步反应，产生Tris-三元甲酯衍生物B，其特点：

1)使A与B反应，得到季戊四醇-十二元酯衍生物7；

2)使7在甲醇中与过量的乙二胺反应，酯胺解得到枝状核分子季戊四醇-十二元胺C；

3)以C为核，在甲醇中与丙烯酸甲酯进行Michael加成，得到具有酯端基的半代产物，经提纯后与大大过量的乙二胺进行酯胺解反应，便可得到具有氨端基的整代树枝状高分子；

4)重复3)的操作，最终获得五代树枝状高分子PDA-PAMAM 5.0 G；

5)分别利用硅胶柱和凝胶柱分离半代酯端基和整代氨端基产物，纯化各反应步骤的产物。

这种树枝状高分子纳米材料(PDA-PAMAM 1.0G～5.0G)，是以季戊四醇-十二元胺为核的结构，其中P为季戊四醇Pentaerythritol的首字母，DA为十二胺Dodecamino的缩写，PAMAM为聚酰胺-胺Polyamidoamine的缩写，1.0G为第一代产物，其表面的活性官能团数目为24个氨基/分子；5.0G为第五代产物，其表面的活性官能团数目为384个氨基/分子。

本发明的有益效果：

1.通过设计新的核分子，合成出的各代树枝状高分子PDA-PAMAM与以未衍生修饰的季戊四醇核分子以及经典的以乙二胺为核分子合成出的相应各代树枝状高分子相比，其表面电荷密度及活性氨端基数目增加了三倍，即低代高分子材料PDA-PAMAM即可达到以往经典合成高代高分子材料的表面电荷密度，但其颗粒尺寸却小于后者的高代产物，有利于获得更高的基因转移效率。

2.由于这类树枝状高分子表面富含氨基，所以在生理条件下，氨端基的质子化可以使高聚物带有正电荷，从而能与负电性的DNA分子相互作用，结合成纳米尺寸的超分子复合物，作为基因载体将质粒DNA转移进细胞。实验证明，合成的树枝状高分子纳米材料对细胞进行基因转移的效率与常用的高效商品脂质体基因转移试剂相当，但细胞毒性却远小于后者，具有很好的应用前景。

3.此外，该合成路线可节省以往合成及分离纯化高代树枝状高分子所需要的大量时间，提高生产效率。

附图说明

图1.动态光散射测量PDA-PAMAM 5.0G的分子粒径及其分布结果

图2.PDA-PAMAM 5.0G支化缺陷程度的¹³CNMR表征

图3.PDA-PAMAM 3.0G～5.0G对NIH3T3细胞毒性的评价

图4.不同N/P比值对PDA-PAMAM 3.0G～5.0G转染NIH3T3细胞效率的影响

图5.24孔板每孔不同DNA量对PDA-PAMAM 3.0G～5.0G转染NIH3T3细胞效率的影响

图6.PDA-PAMAM 3.0G～5.0G与其他商用试剂转染效率的比较

具体实施方式

这种季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，是采用季戊四醇经过四步反应，生成活泼的季戊四醇-四元酰氯衍生物A；三羟甲基氨基甲烷Tris经过两步反应，产生Tris-三元甲酯衍生物B，其特点：

1)使A与B反应，得到季戊四醇-十二元酯衍生物7；

2)使7在甲醇中与过量的乙二胺反应，酯胺解得到枝状核分子季戊四醇-十二元胺C；

3)以C为核，在甲醇中与丙烯酸甲酯进行Michael加成，得到具有酯端基的半代产物，经提纯后与大大过量的乙二胺进行酯胺解反应，便可得到具有氨端基的整代树枝状高分子；

4)重复3)的操作，最终获得五代树枝状高分子PDA-PAMAM 5.0 G；

5)分别利用硅胶柱和凝胶柱分离半代酯端基和整代氨端基产物，纯化各反应步骤的产物。

季戊四醇经过四步反应生成活泼的季戊四醇-四元酰氯衍生物的反应是：

三羟甲基氨基甲烷Tris经过两步反应产生Tris-三元甲酯衍生物的反应是：

上述1)可使核分子的末端基团由以前的四个扩大为12个，1)的反应是：

通过2)可使新的核分子末端的基团由酯基转换为更加活泼的氨基，便于后续的接枝反应，2)的反应是：

与文献中报道的以乙二胺为核的经典PAMAM支状高分子EDA-PAMAM相比较，所合成的PDA-PAMAM 5.0 G的表面电荷密度和活性官能团数目(384个氨基/分子)，相当于EDA-PAMAM的第七代产物(256个氨基/分子)和第八代产物(512个氨基/分子)之间，但是PDA-PAMAM 5.0 G的颗粒尺寸要小于后两者，而且通过结构表征手段证明PDA-PAMAM 5.0 G的结构完整度达到了95％，即可能由于支化反应未完全而造成的缺陷度仅为5％。

第五代树枝状高分子PDA-PAMAM 5.0 G可用于基因转移，转染细胞为NIH 3T3，基因质粒为表达绿色荧光蛋白的逆转录基因质粒pMSCV-GFP，在一定浓度的甘油存在下，48小时后计数呈绿色荧光的细胞，基因转移效率为24％，与常用的高效商用脂质体转移试剂效率相当。

作为基因转移载体可应用于：非病毒基因载体，安全、低毒，经过特定修饰，可获得靶向基因投递功能，用于基因治疗癌症、心血管疾病。

合成方法可为其他树枝状高分子的合成提供技术参考，本发明产生的树枝状高分子纳米基因载体可用于进行基因转移研究。

纯化后的各代树枝状高分子均经过红外光谱，核磁共振等鉴定其化学结构，其中由于不同代数的产物具有相同的末端官能团和类似的骨架结构，所以其IR谱结果相似，¹HNMR谱则显示出在一定范围内各自不同的差异：IR(KBr压片)：1420-1400(C-N伸缩振动)，1710-1680(-CO-伸缩振动)，3100-3500(-CO-NH-伸缩振动)。：¹HNMR(CDCl₃)δ2.36-2.47(t，-CH₂-CO-)，2.62(s，＞NCH₂CH₂N＜)，2.76-2.84(t，＞NCH₂-)，2.62-2.78(t，-CH₂-NH₂)，3.24-3.31(t，-CH₂-NH-)，7.72-7.94(t，-NH-CO-)。

其分子量及分子粒径分布则分别经由GPC(结果见表1)和动态光散射(结果见图1)测定。从表1和图1的结果我们可以看出，本发明获得的3.0G～5.0G的PDA-PAMAM分子量均呈单分散分布，并且其最终产物PDA-PAMAM 5.0G的直径约为7nm，粒径分布单分散，是结构规整的产物。

我们还利用¹³CNMR给出了高分子分支骨架缺失的情况(结果见图2)。由图2所示，可以从理想支化度产物和缺陷支化度产物的各标记峰的峰高比例得出，本发明得到的第五代产物的骨架完整程度为95％，即末端由于空间位阻造成的缺损率为5％，结果令人满意。

                   表1.PDA-PAMAM末端基数量和分子量及其分布

代数   末端伯氨基数目    数均分子量    重均分子量    分子量分布

       (mol)             M_n           M_w           M_w/M_n

3      96                21356         23706         1.11

4      192               43244         50163         1.16

5      384               87020         97462         1.12

细胞毒性是评价高分子基因载体的重要指标，采用MTT方法测定聚酰胺-胺树枝状高分子对NIH 3T3细胞的毒性作用，试验结果表明，该树枝状聚合物显示出良好的细胞相容性，其对细胞的毒性远小于商用阳离子型转染试剂PLL，PEI和脂质体(结果见图3)。且当DNA与树枝状高分子按最佳比例形成复合物时，第5代的PDA-PAMAM与DNA形成的复合物粒径在200-300nm之间，方便细胞的摄入吸收。

利用本发明的第五代产物，向NIH 3T3细胞中转移绿色荧光蛋白基因质粒pMSCV-GFP。本发明产物与DNA形成复合物，在24孔板中使用无血清的DMEM培养基，添加一定浓度的甘油，转染NIH 3T3细胞4小时，换成完全培养基，继续培养48小时以后，在荧光显微镜下记录表达绿色荧光蛋白GFP的阳性细胞数，与该孔板中正常细胞总数相比，得出基因转染效率。在此条件下取得的基因转移效率为24％。

实施例1：

40.8g的季戊四醇溶于50ml水中，加入2g氢氧化钾作为催化剂，与滴加的63.6g丙烯腈在45℃反应7个小时，然后再在室温反应24小时，产物用盐酸中和至中性，分出油层，减压蒸除溶剂和剩余的反应原料，得到无色稠状的季戊四醇-四元睛衍生物83g，产率95％。四元睛在干HCl气的存在下醇解为浅黄色油状的四元甲酯，产率85％，四元甲酯于8N氢氧化钠溶液在70℃水解反应4个小时，得到的四元酸为白色沉淀，产率76％，将四元酸溶于二氯甲烷，与过量的二氯亚砜回流反应一个小时，生成活泼的四元酰氯，产率62％。36.3g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)与67.5g丙烯腈以氢氧化钾作为催化剂，于二氧六环中25℃反应24小时，得到浅黄色油状物Tris-三元睛衍生物，产率90％，三元睛在上述相同条件下醇解为三元甲酯，为浅黄色油状物，产率80％。Tris三元甲酯衍生物与季戊四醇四元酰氯衍生物在无水甲醇中反应得到季戊四醇-十二元酯，为黄色油状物，产率96％，然后在甲醇中与大大过量的乙二胺反应，得到淡黄色稠状的季戊四醇-十二元胺，产率99％。

实施例2：

38.4g季戊四醇-十二元胺溶于甲醇中，与过量5倍的丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，减压蒸去溶剂和剩余的原料，得到0.5代树枝状高分子，为深黄色油状物，产率99％，半代产物经硅胶柱洗脱分离提纯后，在甲醇中与大大过量的乙二胺进行酯胺解反应，减压除去溶剂和剩余原料后得到1.0代树枝状高分子，为浅黄色稠状物，产率99％，产物经凝胶柱过滤分离后，进行结构表征和分子量测试。重复相同的操作步骤，可以获得不同半、整代的纯化树枝状高分子PDA-PAMAM。

实施例3：

利用本发明的三代至五代产物介导pMSCV-GFP基因转染NIH3T3细胞，考察了质粒DNA和树枝状高分子复合的比例，即树枝状高分子末端伯氨基数目与DNA分子磷酸根的数目比(N/P比)对转染实验的影响。通过研究以不同N/P比(1∶1，3∶1，5∶1，10∶1，15∶1，20∶1)形成的DNA和PDA-PAMAM dendrimer复合物转染细胞的结果我们发现，当N/P比为10∶1，DNA转染常规使用量1μg时，第五代的PDA-PAMAM dendrimer对NIH3T3细胞转染效果最好，达到20％，结果见图4。

实施例4：

在获取了DNA和PDA-PAMAM dendrimer复合物最佳配比的基础上，我们还研究了每孔(24孔板培养细胞)加入的DNA量(0.3μg，0.5μg，1μg，1.5μg，2μg，2.5μg)对转染效率的影响。结果证明，当以N/P比10∶1形成复合物，每孔DNA量为2μg时，第五代的PDA-PAMAM dendrimer对NIH3T3细胞转染效果最好，为24％，结果见图5。相比较于常规使用量的DNA，转染效率提高了20％(与实施例3比较)。

实施例5：

树枝状高分子和DNA所形成的复合物粒径的大小是影响细胞摄取复合物和复合物在细胞内转运的重要因素。为了能够达到通过降低DNA和PDA-PAMAM dendrimer复合物粒径以提高的转染效率的目的，我们在转染用的无血清DMEM培养基中添加了有利于分散复合物粒径的甘油助剂，并考察了不同浓度的甘油助剂(2％，4％，6％，8％，10％)对高聚物转染效率的影响。结果发现，在培养基中添加10％浓度的甘油助剂会使得PDA-PAMAMdendrimer的转染效率大大提高，从之前第五代PDA-PAMAM dendrimer 8％的转染效率到现在的24％，提高了3倍。

实施例6：

在获得最佳转染条件的基础上，将PDA-PAMAM dendrimer 3.0G～5.0G同一系列商用的转染试剂，包括脂质体lipofectamine 2000、fugene 6、以及阳离子高分子聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)等进行了比较(结果见图6)，结果显示PDA-PAMAM 5.0G转染效率为24％，均高于其他类型的转染试剂，且和转染效率为27％的Lipofectamine 2000在效果上无显著性差别。

Claims (7)

1.一种季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，采用：季戊四醇经过四步反应，生成活泼的季戊四醇-四元酰氯衍生物(A)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)经过两步反应，产生Tris-三元甲酯衍生物(B)，其特征在于：

1)使A与B反应，得到季戊四醇-十二元酯衍生物7；

2)使7在甲醇中与过量的乙二胺反应，酯胺解得到枝状核分子季戊四醇-十二元胺(C)；

3)以C为核，在甲醇中与丙烯酸甲酯进行Michael加成，得到具有酯端基的半代产物，经提纯后与大大过量的乙二胺进行酯胺解反应，便可得到具有胺端基的整代树枝状高分子；

4)重复3)的操作，最终获得五代树枝状高分子PDA-PAMAM5.0G；

5)分别利用硅胶柱和凝胶柱分离半代酯端基和整代胺端基产物，纯化各反应步骤的产物。

2.根据权利要求1所述的季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，其特征在于：

季戊四醇经过四步反应生成活泼的季戊四醇-四元酰氯衍生物，反应是：

三羟甲基氨基甲烷Tris经过两步反应产生Tris-三元甲酯衍生物，反应是：

3.根据权利要求1所述的季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，其特征在于：通过1)可使核分子的末端基团由以前的四个扩大为12个，1)反应是：

4.根据权利要求1所述的季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，其特征在于：通过2)可使新的核分子末端的基团由酯基转换为更加活泼的胺基，便于后续的接枝反应，2)反应是：

5.根据权利要求4所述的季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子基因载体的合成方法，其特征在于：第五代产物PDA-PAMAM5.0G与文献中报道的以乙二胺为核的经典PAMAM支状高分子EDA-PAMAM相比较，所合成的PDA-PAMAM5.0G的表面电荷密度和活性官能团数目384个胺基/分子，相当于EDA-PAMAM的第七代产物256个胺基/分子和第八代产物512个胺基/分子之间，但是PDA-PAMAM5.0G的颗粒尺寸要小于后两者，而且通过结构表征手段证明PDA-PAMAM5.0G的结构完整度达到了95％，即可能由于支化反应未完全而造成的缺陷度仅为5％。

6.一种根据权利要求4所述的第五代树枝状高分子PDA-PAMAM5.0G的应用，其特征在于：它可用于基因转移，转染细胞为NIH3T3，基因质粒为表达绿色荧光蛋白的逆转录基因质粒pMSCV-GFP，在一定浓度的甘油存在下，48小时后计数呈绿色荧光的细胞，基因转移效率为24％，与常用的高效商用脂质体转移试剂效率相当。

7.根据权利要求4所述的第五代树枝状高分子PDA-PAMAM5.0G的应用，其特征在于：它可以应用于非病毒基因载体，安全、低毒，经过特定修饰，可获得靶向基因投递功能，用于基因治疗癌症、心血管疾病。