CN1629283A - 治疗肿瘤和血管再狭窄的微管稳定剂埃坡霉素 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过定向筛选获得，以埃坡霉素D为主要代谢产物而不产生埃坡霉素A和B的新菌株S.cellulosum BGS4，并于2004年8月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCCNO.1206。本发明进一步涉及一种化合物反式－9，10－脱氢埃坡霉素D，这是一种以埃坡霉素D作为起始原料，生产制得的新型埃坡霉素衍生物。本发明还涉及了埃坡霉素类化合物在制备抗增生性疾病的药物组合物，以及在包覆可植入体内的支架中的应用。

Description

治疗肿瘤和血管再狭窄的微管稳定剂埃坡霉素

发明领域

本发明涉及一种通过定向筛选获得，以埃坡霉素D为主要代谢产物而不产生埃坡霉素A和B的新菌株S.cellulosum BGS4。并采用埃坡霉素D作为起始原料，生产制得新型埃坡霉素衍生物，反式-9，10-脱氢埃坡霉素D；本发明还进一步涉及埃坡霉素在制备抗增生性疾病的药物组合物中的应用，以及埃坡霉素类化合物在包覆可植入体内的支架中的应用。

背景技术

埃坡霉素是16元大环内酯化合物。它们首先被G.Hofle及其同事从粘细菌Sorangium cellulosum中分离提取出来，主要成分为埃坡霉素A(EpothiloneA)和B(Epothilone B)(结构式如下所示)，它们在该菌中以2∶1的比例产生，且具有抗真菌的活性(参见K.Gerth等，1996，J.Antibiotics 49：560-563和德国专利DE 4138042)。埃坡霉素A和B后来被认为是一类新型的天然存在的微管解聚抑制剂。尽管在结构上和紫杉醇(Taxol)并不相同，但它们在作为微管聚合和微管稳定剂方面有相似的作用机理(Hofle，G.，等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1567-1569，1996和Bollag，D.M.，等，1995.Cancer Res 55，2325-2333)。在现有治疗肿瘤的具有细胞毒活性的药物中，紫杉醇不但在临床上很重要，而且商业上也很成功。因此埃坡霉素被广泛地认为是继紫杉醇以后可成为又一高效的细胞毒抗癌剂。

埃坡霉素C(Epothilone C)和D(Epothilone D)(结构式如下所示)，即分别为埃坡霉素A和B的12，13-脱氧-配对物，在目前研究的天然产生的埃坡霉素中，埃坡霉素D显示出最低的毒性(Chou等，Proc Natl Acad Sci USA95，15798(1998))，以及对多种癌症和其他不正常细胞增生症的最大疗效(参见Harris等.，1999，Soc.Chim.Ther.25：187)。

      R＝H，epothilone A                              R＝H，epothilone C

      R＝CH₃，epothilone B                            R＝CH₃，epothilone D

然而，在天然菌株S.cellulosum(So ce 90)的发酵物中，埃坡霉素D只作为埃坡霉素复合混合物中的微量成分存在。而实际上为了满足临床治疗的需要，必须具有较经济的发酵方法生产足量的埃坡霉素D，才具有实际的应用及开发价值。另一方面，如果能获得大量的埃坡霉素D，则可利用它生产活性更好的埃坡霉素衍生物。

对埃坡霉素生物合成基因族中的基因进行克隆分析，以及对埃坡霉素的异源表达进行研究，推导出了以下的生物合成途径：首先，由埃坡霉素聚酮化合物合成酶(PKSs)合成埃坡霉素C和D(以2∶1的比例产生)作为中间产物；然后，epoK基因产物-细胞色素P450氧化酶作用于埃坡霉素C和D，而分别形成环氧化产物埃坡霉素A和B。尽管在S.cellulosum中，埃坡霉素C和D先被合成出来，但其产量远远低于埃坡霉素A和B。由于非环氧化形式的埃坡霉素C和D在毒性上远低于埃坡霉素的环氧化配对物，因此埃坡霉素C和D的产量成为有效开发的重要因素。目前，缺乏一个高效生产埃坡霉素D的发酵工艺已经成为将该类化合物开发成更好的抗癌药或其它治疗剂的一大阻碍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够大量生产以埃坡霉素D为主要代谢产物的新菌株Sorangium cellulosum BGS4，并于2004年8月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.1206。。

本发明的另一目的在于提供一种新的埃坡霉素衍生物，反式-9，10-脱氢埃坡霉素D，它是一种具有更好的抑制细胞增生性能的埃坡霉素衍生物。

本发明的又一目的在于提供一种埃坡霉素在制备抗增生性疾病的药物组合物，尤其涉及埃坡霉素化合物的冻干粉制剂在制备口服或非肠胃给药剂型，用于治疗如癌症及其它非癌类的增生性疾病；以及埃坡霉素化合物在包覆可植入体内的支架的药物组合物中的应用。

本发明采用定向突变筛选方法，获得了一种以埃坡霉素D为主要代谢产物的新菌株S.cellulosum BGS4。获得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，在其他条件相同的情况下，该类菌株只产生埃坡霉素C和D作为主要产物，而不产生埃坡霉素A和B。这一变异菌株可通过一次或多次的基因诱变及定向筛选(产物鉴定)而获得。同样也可获得埃坡霉素D的产量远大于埃坡霉素C的诱变菌株。实施例中描述了菌株S.cellulosum BGS4的获得以及用这一菌株生产埃坡霉素D的发酵过程。

本发明提供的新的埃坡霉素衍生物，反式-9，10-脱氢埃坡霉素D，它是以埃坡霉素D为起始原料通过化学转化制得的，表现出更好的抑制细胞增生的性能。

本发明的又一目的在于提供一种埃坡霉素在制备抗增生性疾病的药物组合物，以及在包覆可植入体内的支架的药物组合物中的应用。在此提到的埃坡霉素以及之后提到的埃坡霉素是指任何的埃坡霉素或埃坡霉素衍生物，尤其指埃坡霉素D和反式-9，10-脱氢埃坡霉素D及其相关联的化合物。

微管稳定剂埃坡霉素可用于治疗不同种类的增生性疾病，如癌症及其它非癌类的增生性疾病，包括但不限于以下的各种疾病：头部和颈部及肝和胆部的癌症；乳腺癌，卵巢癌，肺癌，脑癌，肠癌，白血病，恶性肿瘤，以及淋巴瘤。可以重复该治疗方法，以根治癌症或者防止癌扩散。

埃坡霉素也能抑制血管生成，从而影响癌的生长。利用这一性质可对癌和与癌有关的疾病进行治疗。此性质也可用于对血管生成抑制剂敏感的其它疾病的治疗，该类疾病包括但不限于与视网膜血管相关的盲症，关节炎，尤其是发炎性关节炎，多发性硬化症，血管再狭窄以及牛皮癣等。另一方面，埃坡霉素可用于治疗以细胞过度增生为特征的非癌类疾病。

埃坡霉素能诱导或抑制细胞凋亡，这是一个对正常发育和生理平衡很重要的正常细胞死亡过程。凋亡信号传导途径的改变可导致许多不同人类疾病的发生。

现代治疗实体肿瘤的典型方法是采取多种手段：外科切除，放射治疗和化疗等。这些都是最普遍的治疗方式，它们还通常联合使用。

化疗需要对病人施用细胞毒药物。使用这类药剂是由于它们具有选择性的细胞毒活性，它们对肿瘤组织的作用比对正常组织的作用高出多倍。如果有目的地把足量的药直接输送到预定的部位，在此情况下，大部分的药都具有治疗作用而只有小部分的药带来了副作用。

本发明的药物组合物包括至少一种埃坡霉素或埃坡霉素前体药(prodrug)和一种药学上可接受的载体或赋形剂，其可以通过非肠胃给药或/和口服剂型的方式给药来治疗癌症。

多重抗药性使常规化疗药对病人不起作用，这种抗药性的产生是因为药物被P-糖蛋白排出细胞外。在治疗癌症以及其它增生性疾病中，埃坡霉素可以单独使用，也可以和其它抗癌药物和治疗手段联合使用；埃坡霉素组合物在用于增强其它化疗剂的药效，以及控制多重抗药性方面非常有用。

埃坡霉素可以和其它的化学治疗剂一起，用于联合治疗癌症以及其它增生疾病，尤其是用于癌症的辅助治疗和/或协同治疗，对于需要此种治疗的哺乳动物(如人类)给予有效剂量的埃坡霉素与至少一种其它抗癌药物形成的组合药剂。例如，可以和埃坡霉素一起用于联合治疗的其它化学治疗剂可选自抗代谢物，如氟尿嘧啶和健泽(Gemcitabine)，或者选自烷化剂如卡铂(Carboplatin)和顺铂(Cisplatin)，或者选自信号传导抑制剂如Iressa，Herceptin和geldanamycins以及它们的衍生物。联合治疗可以采用先后给药方式，也就是先用第一种药剂治疗然后用第二种药剂，或者两种药剂在治疗中同时使用的方式。

本发明提供了对紫杉烷(taxane)类的抗癌药有抗性的患者的治疗方法。本领域的普通技术人员可以推知埃坡霉素化合物的有效剂量。对人类的典型剂量为约0.05-200mg/kg/天。这一剂量通常以单一剂量形式使用，但也可以研制口服剂及肠胃外给药，以多剂量使用。

埃坡霉素化合物难于形成制剂，原因在于它们在水介质中的溶解度较低，并在水溶液中稳定性较差。本发明提供了埃坡霉素在制备抗增生性疾病的药物组合物中的应用，进一步涉及该药物组合物的冻干粉制剂。埃坡霉素制成冻干剂，并于使用前重新加入载体。载体可以为溶剂或者分散介质，例如水，乙醇，丙三醇，聚乙烯乙二醇(PEG)，或其合适的混合物，以及植物油等。比较理想的溶剂为酒精，酒精/水混合物，聚乙烯乙二醇300。

本发明公开了肠胃外给药的埃坡霉素制剂的制备方法，其中埃坡霉素D开始被溶解在体积至少占50％的叔丁醇水溶液的混合物中，然后在优化的条件下冻干。使用时，冻干剂首先用Cremophor，丙烯乙二醇和乙醇的混合物重新溶解，然后用乳酸化的林格氏(Ringer’s)试剂稀释到合适的给药浓度。此外，该冻干粉制剂还可进一步制备成其它注射给药剂型，如粉针剂。

该冻干粉制剂可进一步制备成口服给药剂型。含有该活性化合物的口服药可以制成任何通常使用的口服剂型，包括片剂、胶囊、口腔含片、口服悬浮液或溶液，以及和药学上可接受的中和缓冲剂相结合。本方法中缓冲剂的作用在于暂时中和胃液中的胃酸并因此减少埃坡霉素在病人胃中的降解。

抗酸剂，例如铝和镁的氢氧化物、碳酸盐、硅酸盐、磷酸盐都能在服用埃坡霉素时以及服用前后用于中和胃酸。埃坡霉素和中和缓冲剂的组合既可作为固体口服剂型或可作为液体口服剂。在服药前，用合适的溶剂或共溶剂溶解埃坡霉素和缓冲成分，以形成溶液或悬浮液。由此所具有的生物活性物质利用率应至少为20％，最好是不低于50％。

埃坡霉素也可以采用其它制备低水溶性药物如紫杉醇的制剂方法制得。例如，埃坡霉素可以和维生素E和/或PEG化的维生素E(PEG1000-琥珀酸维生素E)衍生物形成乳剂(参见文献WO00/71163和US6458373B1)。通常，先将埃坡霉素溶于乙醇，然后加入维生素E和/或PEG化的维生素E衍生物形成治疗剂溶液。将乙醇除去，然后形成前体乳剂或者加入含表面活性剂(稳定剂)的水溶液来形成前体乳剂。用于静脉内注射时，可将前体乳剂分散形成均匀的乳剂。用于作口服药剂，前体乳剂一般置于凝胶胶囊中。较强水溶性埃坡霉素药物的制剂方法也可以通过直接PEG化的埃坡霉素(PEGylated埃坡霉素)；或通过埃坡霉素上的羟基(如7-OH)直接共价结合溶于水的氨基酸多聚体，如聚谷氨酸(poly-l-glutamic acid)。聚谷氨酸的分子量可优选25KD至50KD，每个聚谷氨酸的分子可结合5至25个埃坡霉素分子，以增加化合物在水介质中的溶解度，以及达到药物在体内持续释放和增强在体内的半衰期的目的，同时也可改善药物毒性、疗效和药物动力学等方面的特性。

本发明的埃坡霉素药物组合物的应用，另一方面还涉及该药物组合物用于包被可植入性医疗装置，特别是包被动脉或静脉血管支架，如气囊膨胀支架(balloon-expandable stents)。埃坡霉素用于包覆支架(类似于线-网管的装置)以终止血管内壁细胞生长，从而防止血管再狭窄或动脉的再阻塞。

因为动脉受损后的SMC表型增生类似于肿瘤细胞的生长，因此抗癌药物可用于防止新内膜(neointimal)平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)的生长。抗细胞增生剂包覆的支架能在长时间内释放足够浓度的该抑制剂，以阻止内膜和基质的生长并进入到内腔，从而减少血管再狭窄。当用于治疗再狭窄时，较为理想的情况是将该化合物用于治疗血管成形术后发生的再狭窄。当用于治疗血管成形术后发生的再狭窄时，埃坡霉素在术前、术中或术后使用，或在上述不同时机结合给药均可。

一方面，本发明提供了一种药物输送方法，该方法采用最小的入侵性技术，例如导管插入或经套管针，将一个药物包被的可植入性装置放置到身体的特定位置例如肿瘤或创伤处，使药物持续释放到这些特定位置。这种装置可以包括一载体基质和在该基质上的包覆物。其上的包覆物包括至少一层含有一种或多种药用的多聚体材料。包覆物的作用在于控制治疗剂的释放。药用聚合体层可以包含亲水性/疏水性多聚体成分。聚合包覆物可选自聚合羧酸，纤维聚合物，白明胶，聚氨酯，聚丙烯酸酯，聚胺类，聚乙烯醇，聚乙烯氧化物，聚酯，聚乙烯丙三醇和多聚糖等。尤其是从例如聚氨酯分散物(BAYHYDROL等)和丙烯酸乳液分散剂等聚合分散物制备而得的包覆物可与本发明的化合物一起应用。

此处描述的药物可用于已经被聚合物包覆的支架。通过将支架浸入包含有药物的溶液中，或用含有药物的溶液喷涂充分的时间(例如5分钟)以达到有效抑制平滑肌细胞增生的量，以抑制血管再狭窄；然后将包覆的支架干燥，最好通过风干一段时间(例如30分钟)达到干燥。药物覆盖的支架然后可通过球囊导管输送至冠状血管处。

本发明还涉及药用装置的多层包覆，其既作为生物相容的表面，也作为药物传输工具。由于这些包覆物能用在对高处理温度敏感的装置上，因此它们特别有优势，并且它们也可作为将治疗剂输送到身体内特定靶区域的传输介质。在这一方面，本发明公开了液态的双成分生物相容的包覆物的应用。进一步地，因为生物活性表面以共价键与第一层包覆物的多聚体连接，因此该包覆层永久地连接在基质上。于是，生物活性表面具有持久的生物相容性，而第一包覆层允许治疗剂，例如抗SMC增生剂被释放，其作用在于通过减少血栓形成或SMC增生，从而减少或阻止内置管术后的再狭窄。

在一种方式中采用多层包覆组合物，具生物活性的组合物可形成一个第二层包被。提供的包覆组合物能赋予基质生物相容性，并在体内将单层或多层包覆药释放并输送出去。这一包覆组合包括含有有机酸官能团聚合物的分散液或乳液，以及能与聚合物的有机酸官能团反应的过量的聚合交联剂。药物本身基本上与聚合物或与交联剂不起反应，只不过分散在分散液或乳液中。将第一层包覆物干燥，使其与基质表面结合，其中未反应的多功能交联剂仍存在于第一层交联包覆物中。之后在已干燥的第一层包覆物上涂敷第二层包覆物，使基质上形成连续的生物活性表面包覆层，第二层包覆可为液态生物活性剂的溶液或分散剂，或是化学修饰过的含有有机酸官能团或金属盐的功能等同物。

在本发明中，分散液或乳液中用于第一层包覆物的含有有机酸官能团的聚合物的选择取决于被包覆基体的性质。第一层包覆组合物中的聚合物可以为均聚物或共聚物，例如乙烯单体单元，聚氨酯环氧树脂以及它们之间的任意组合等。不过，第一层包覆组合物中的聚合物最好包括含有有机酸官能团的聚氨酯，聚丙烯酸酯，以及聚甲基丙烯酸酯等，特别是含有内部乳化剂，例如羧酸或磷酸等乳化了的亲水聚氨酯。第一层包覆物中聚合物的浓度约为1～40wt％。第一层包覆物还包括一种或多种多官能交联剂，其可与有机酸官能团发生反应。优先选择的多官能交联剂包括多官能氮丙啶，以及多官能炭化二亚胺。在本发明中，其他可使用的交联剂包括例如Zeneca resins出售的商品名为NeoCryl CX100的制剂。第一层包覆组合物中交联剂的浓度范围占固体成分的0.5～20wt％，理想的干燥温度范围为约15℃～35℃。在许多情况下，室温干燥12小时就可以了。本发明的治疗剂应为埃坡霉素D或其功能等同物，包括同族物、类似物及其衍生物等。在这一实施方式中，埃坡霉素D或其功能等同物分散在第一包覆层中。一旦进入体内，埃坡霉素D从第一包覆层可控制地逐渐释放到周围的环境中，作为SMC抑制剂阻止或减少新内膜在基质表面生长。这种药物包覆支架通过球囊导管可传输到冠状血管中。

本发明使用的第二层包覆物的生物活性物质可以是含有机酸官能团的多聚糖。本发明优先考虑的多聚糖生物活性试剂为糖胺聚糖(GAGs)。GAGs带有大量负电荷，非常适合通过交联剂上过量的、未反应的官能团，以共价键的形式与第一层包覆物连接。GAGs生物活性试剂最好优选肝素或其功能等同物。第一和第二包覆层干燥后，通过过剩的未反应的多官能交联剂使生物活性剂的有机酸官能团和聚合物之间形成共价键连接。详见实施例的叙述。

附图说明

图1为S.cellulosum BGS4中埃坡霉素的产生

图2A为实施例2中从BGS4培养物XAD洗脱液获得的产品的HPLC色谱图.

图2B为埃坡霉素D的质谱图.

图3为埃坡霉素D的¹H-NMR图

图4埃坡霉素D和紫杉醇对裸鼠人非小细胞肺癌模型的疗效

具体实施方式

实施例1

通过基因诱变和定向筛选的方法，得到含有一个失活epoK基因的S.cellulosum的突变菌株BGS4。

所用的S.cellulosum菌株So ce 90是从德国微生物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms)得到，保藏号为DMS6773。

将含DMS6773菌株的安瓿转移到装有10ml G52培养基的50-ml的锥形烧瓶中，并在30℃，180rpm搅拌条件下培养6天。将5ml的培养物转移到50ml G52培养基的250-ml锥形烧瓶中，在30℃，180rpm搅拌条件下培养3天。G52培养基包含0.2％酵母提取物，低盐(BioSpringer，Maison Alfort，France)；0.1％ MgSO₄.7H₂O；0.1％ CaCl₂.2H₂O；0.2％脱脂大豆粉Soyamine50T(Lucas Meyer，Hamburg，Germany)；0.8％土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Switzerland)；0.2％脱水葡萄糖；1ml/L的EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/L)；用KOH调节PH值到7.4(其中的百分数是质量百分含量，下同)。

将0.1ml的上述培养物铺到含有琼脂培养基S42的几个有盖培养皿上。S42培养基包含0.05％胰化蛋白胨，0.15％ MgSO₄.7H₂O，1.2％ HEPES和1.2％琼脂，用KOH调节PH值到7.4。高压灭菌后，在每升S42培养基中加入如下物质：10ml的过滤灭菌了的10％ CaCl₂.2H₂O，1ml的6％K₂HPO₄，1ml的EDTA-Fe/亚硫酸氢钠溶液，8ml的40％过滤灭菌了的葡萄糖，10ml的5％硫酸胺和35ml的高压灭菌过的Spent培养基。然后将该平皿曝露在UV光下(最大射线范围为250-300nm)，在500μ瓦/cm²下维持90-120秒。然后在30℃培养6-9天，直到获得1-2mm大的单独的菌落。通过扇形塑料环，将100-150个菌落分别移到含有S42琼脂的有盖培养皿上(每个平皿4部分)，在30℃培养7天。用塑料环将在琼脂上长成的约1cm²菌落转移到含有10ml G52培养基的50-ml锥形烧瓶中，在30℃，180rpm搅拌条件下培养7天。将5ml的培养物转移到含有50ml G52培养基的250-ml锥形烧瓶中，在30℃，180rpm搅拌条件下培养3天。将10ml的培养物转移到50ml 23B3培养基中，在30℃，180rpm搅拌条件下培养7天。23B3培养基包括：0.2％葡萄糖；2％土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Switzerland)酵母提取物；1.6％脱脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，Hamburg，Germany)；1ml/L的EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/L)；0.5％HEPES(Fluka，Buchs，Switzerland)；2％聚苯乙烯XAD-16(Rohm & Haas)；用NaOH调节PH值到7.8。

使用下列方法测定培养物中形成的埃坡霉素C和D：50ml的培养物用尼龙筛(150μm孔径)过滤，用少量水冲洗保留在筛上的XAD-16，然后与滤膜一并放入到50ml离心管中。将10ml异丙醇加入试管中。在180rpm下摇动密封好的试管达1小时，以溶解与树脂结合的埃坡霉素。接下来，离心分离1.5ml的液体，将约0.8ml的上清液用移液管转移到HPLC试管中。样品的HPLC分析结果如下所述。HPLC分析决定了哪一个培养物中含有最高含量的埃坡霉素C和D。在上述相应菌落的部分平皿上(平皿同时在4℃存放)，用塑料环将约1cm²琼脂区域的细胞转移到10ml G52培养基中，在30℃，180rpm搅拌条件下培养7天。将5ml的培养物转移到250-ml锥形烧瓶中的50ml G52培养基中，在30℃，180rpm搅拌条件下培养3天。第一次基因突变获得了含有epoK突变的菌株，并且只产生了埃坡霉素C和D。进一步的筛选和突变能够获得埃坡霉素D产量提高的菌株，也就是与埃坡霉素C相比，埃坡霉素D的产量更高。在第二，第三次的诱变中，方法与前述的第一次诱变相同，在后一步骤中选用前一步基因诱变中最好的菌落。

将一个突变筛选的菌株命名为BGS4，并于2004年8月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNO.1206，该菌株只产生埃坡霉素C和D为主要产物而不产生埃坡霉素A和B。图1揭示了BGS4中埃坡霉素C和D的产生。

菌株BGS4的培养和形态学描述：该菌株可以在纤维素作为唯一碳源，并且KNO₃作为唯一氮源的培养条件下生长，例如，在ST2矿物盐琼脂上的滤纸上生长(0.1％ KNO₃；0.1％ MgSO₄.7H₂O；0.1％ CaCl₂.2H₂O；0.1％ K₂HPO₄；0.01％ MnSO₄.7H₂O；0.02％ FeCl₃；0.002％酵母提取物；标准微量元素溶液；1％琼脂)。在这种培养基上，形成了暗微红-褐色到黑色-褐色子实体(fruitingbodies)。该生长杆菌(vegetative bacilli)具有Sorangium菌种典型的形状(相当的紧密度，在相差显微镜下，可观察到暗的，带有宽的圆末端的圆柱状的杆菌，平均为3-6um长和1um厚)。

实施例2从突变菌株S.cellulosum BGS4中生产埃坡霉素D

主要培养基1B12：马铃薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Swizerland)2％，脱脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，Hamburg，Germany)1.1％，EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/l)1ml，用KOH调节PH到7.8。

维持种子培养物：从液氮中取出1ml的冷冻细胞库接种到10ml的G52中，并在30℃，180rpm，25mm位移的条件下培养3天。将5ml种子培养物加入45ml的G52中生长3天，然后将此50ml的培养物加入450ml的G52中生长3天。以后每3-4天，以10％接种量将50ml种子培养物接种到450ml的G52中，以进行连续的种子培养。

20L中间种子培养物：将含有18L G52培养物培养基在30L的发酵罐中用2L前种子培养液接种，并持续培养3-4天，条件为：30℃，250rpm，0.5L空气/L/分钟，过压为0.5bars，不控制PH值。加入10ml硅树脂消泡剂(Tegosipon，Goldschidt AG，Essen)，以防止泡沫形成。

100L主要发酵培养物：100L发酵罐加入60L的1B12培养基及2％XAD-16后进行灭菌，接种15L中间种子培养物。发酵培养6-7天，条件为：30℃，200rpm，0.5L空气/L/分钟，过压为0.5bars，用H₂SO₄控制PH值为7.6+/-0.5。

产品分析：从发酵罐中取出50ml含聚苯乙烯树脂AmberliteXAD-16(Rohm+Haas，Frankfurt，Germany)的样品。用150μm的尼龙筛过滤树脂，用少量水洗涤后，将滤液合并到15ml的Nunc管中。加入10ml甲醇并在室温下摇动30分钟。取2ml离心后的上清液用于HPLC分析。样品注射通过4.6×10mm的保护柱(guard column)中(Inertsil，ODS-3，5μm)，然后以从35％到100％乙腈的梯度，以1ml/min的流速，在UV250nm下10分钟内通过一个长分离柱(4.6×150mm，Inertsil，ODS-3，5μm)。埃坡霉素D在9.9分钟时洗脱出来，埃坡霉素C在9.1分钟时洗脱出来(而埃坡霉素A和B应分别在6.5分钟和7.3分钟时洗脱出来)。

从100L发酵培养物中分离代谢产物：用过滤器收集XAD。用水洗涤后，加入30L甲醇并搅拌30分钟洗脱。通过蒸发器浓缩洗脱液并除去甲醇，用EtOAc抽提余下的水相3次。提取物在旋转蒸发器中浓缩至干，然后溶解于500ml甲醇中，用折叠的过滤器滤去不溶物。将溶液加入Sephadex LH20柱中并用甲醇洗脱。将含有代谢物的提馏部分浓缩至干并再次溶解在50％的甲醇中，并装载在C18反相色谱柱上(55×4.8cm，Bakerbond，40μm)，该色谱柱预先被3体积50％的甲醇溶液平衡过(装载流速平均为100ml/分钟)。并依次用0.5L 50％，1.1L 55％，1.3L 60％，0.5L 65％的甲醇(流速为100mL/分钟)洗脱装载柱。馏分用UV监测仪在250nm监测。将产品库稀释至40％，用泵打入70ml的C18反相色谱柱上(9×10cm)，流速平均为360ml/分钟。用0.1L 40％的甲醇洗涤，并用350ml 100％的乙醇洗脱装载柱。用旋转蒸发器将洗脱液蒸发至干。(4)在10ml丙酮中重悬浮固体，用Whatman 2号滤纸过滤除去不溶物。在丙酮滤液中加入0.2g脱色碳。搅拌该混合物达1小时，然后用Whatman 50号滤纸过滤。合并滤液并旋转蒸发至干燥。埃坡霉素D馏分的结晶条件为：在良好的搅拌下，在大口杯中以15ml 100％的甲醇重悬浮干燥物，并缓缓加入7.7ml水(于66％时达到饱和)。必要时加入少量(1mg)晶种以促进晶体的形成。

图2A为从BGS4培养物XAD洗脱液获得的产品的HPLC色谱图。图2B为埃坡霉素D的质谱图。埃坡霉素D的¹H NMR(400MHz)的数据见图3，以QNP zaxis梯度探测头装备的Bruker DRX400分光计在300K下CDCl₃溶液环境下测得的。CDCl₃溶液的化学变化是指¹H谱中的δ7.26。埃坡霉素D：HRESITOFMS m/z；C₂₇H₄₂NO₅S计算值：492.2778；[M+H]⁺492.2775。

实施例3使用埃坡霉素D作为起始原料合成反式9，10-脱氢埃坡霉素D衍生物(VIII)

反应路线1

反应路线2

反应路线3

通过埃坡霉素D降解生产甲基酮I是已知的。Baeyer-Villiger氧化产生了乙酸酯II，其经过水解和氧化后又能产生醛III。通过已知的方法形成不饱和的醛IV，其随后可转化为烯丙基乙酸酯V。通过丙烯基乙酸酯V和乙烯基铜VI的烷基化反应，继而通过内酯环化(macrolactonization)反应，制备得到新型的化合物9，10-脱氢埃坡霉素D(VIII)，其中，该乙烯基铜VI是从相应的乙烯碘(反应路线3)而制得的。

9，10-脱氢埃坡霉素D：HRESITOFMS m/z；C₂₇H₄₀NO₅S计算值：490.2622；[M+H]⁺490.2631。¹H-NMR选择信号：delta＝5.59(ddd，H-10)，5.54(dd，H-9)，5.18(ddd，H-13)，2.98(dd，H-11a)，2.61(dd，H-11b)，2.53(m，H-8)，1.23(d，3H-25)。

实施例4组合物和制剂

冻干粉制剂的制备：9.86g埃坡霉素D被润湿并部分溶解于预先冷却至5℃，用作USP注射液的600ml 9∶1(V∶V)的叔丁醇和水的混合溶剂中。当药物粉末完全湿润后，再加入预冷至5℃的用于注射用的600ml 1∶9的叔丁醇和水的混合溶剂，得到最后比例为1∶1的混合物溶液，溶解在避光条件下进行。上述形成的溶液在-16℃下经过48小时迅速冻干(优选约200毫托)，然后在15℃高真空下经过48小时进一步干燥(优选150毫托)，冻干剂在无菌条件下包装在30ml避光小瓶中，每瓶中含有50mg的药物。

肠胃外给药剂型，如粉针剂的制备：使用时，冻干剂用封装在不同小瓶中的5.5ml的Cremophor EL，丙烯乙二醇和脱水酒精USP的混合液(20∶30∶50(体积比))重新溶解，以使最后药物的浓度达到10mg/ml。通过轻轻旋转小瓶进行溶解，在静脉注射前，通过每毫升药物加入用于注射的19ml乳酸化的Ringer’s试剂(每100ml，LR包含氯化钠USP 0.6g，乳酸钠0.31g，氯化钾USP 0.03g，以及二水氯化钙USP 0.02g)，将药溶液稀释达到最终浓度为0.5mg/ml。此稀释后的药溶液可通过输液在一到六小时输入设定的剂量。

该药物可通过口服、经静脉注射，或两种途径合并给药。用溶剂制备口服液代表了另一种方便的口服剂型。一个合适的化合物口服液(约2mg/ml，强度)可用PEG∶乙醇∶磷酸缓冲盐(1M，PH8.0)的混合溶剂(55∶15∶30)(体积比)制备而得。

较高水溶性埃坡霉素前体药物的制备：通过埃坡霉素上的羟基直接共价结合溶于水的聚氨基酸多聚体，如聚谷氨酸(poly-l-glutamic acid)。将0.35g聚谷氨酸(分子量为34K)溶于水中。用0.2M HCl将溶液pH调到2。收集沉淀，并用蒸馏水透析，然后冻干，得到0.29g的聚谷氨酸。在聚谷氨酸(75mg，重复单元FW 170，0.44mmol)的DMF(1.5ml)溶液中加入20mg的埃坡霉素D、15mg的二环己基碳化二亚胺和微量的二甲基氨基吡啶。反应在室温下进行4小时或者通过薄层层析来判断反应的完成。反应混合物倒入氯仿中，收集沉淀，真空干燥，得到大约65mg的聚谷氨酸偶联的埃坡霉素D。改变反应中埃坡霉素D和聚谷氨酸的重量比，可得到含有不同浓度埃坡霉素D的聚合偶联物。每个聚谷氨酸的分子可结合5至25个埃坡霉素分子。埃坡霉素前体药物可加入含表面活性剂(稳定剂)的水溶液来形成前体溶液用于静脉内注射。用于作口服药剂，埃坡霉素前体药物可一般置于凝胶胶囊中。

其它埃坡霉素化合物或其衍生物均可采用和上述类似的步骤制得各种口服或注射剂型。

实施例5多层包覆支架的组合物

在搅拌条件下将以下的成分陆续添加到玻璃大口杯中，直到完全混合，制得第一层包覆物：NeoRez R981，280ml；0.5％Fluorad FC-129储存溶液(将1ml Fluora FC-129在100ml的水中稀释制得)，10ml；34％NH₄OH，4ml；NeoCryl CX100，20ml；20％的埃坡霉素D在N-甲基-pyrrolidone(NMP)中的储存液，20ml。NeoRez R981(来自Zeneca Resins)是聚酯基的，含有羧酸官能团的酯质亲水性的聚氨酯，其由三乙胺稳定，在25℃下具有32％的固体含量，且pH值为7.5-9.0，其中还包括作为共同溶剂的5.3％NMP。添加的NeoCryl CX100(来自Zeneca Resins)作为交联剂。加入Fluorad FC-129(来自3M)作为匀染剂.氢氧化铵用于调节溶液的PH值。第二层包覆物是通过以下的方法制备而得：加入合适量的肝磷脂到300ml的水中，持续搅拌几个小时，得到1.2％的肝素溶液(Abbott)。

用第一层包覆组合物均匀喷射不锈钢支架，进行包覆，然后在空气中干燥30分钟。重复上述步骤直到达到必要的包覆厚度。在干燥后的第一包覆层表面喷涂第二包覆组合物，在空气中干燥过夜。然后将包覆后的支架在50℃的真空中放置3小时。得到的包覆层具有可控释放的埃坡霉素D，并在表面上有共价键连接的肝素。

实施例6生物活性的测定

体外抗癌活性：体外的抗癌活性通过对具多重抗药性(MDR)和药物敏感癌细胞施用埃坡霉素D来测试。该化合物抑制癌细胞生长的能力通过硫罗丹明B(SRB)试验(参见Skehan等，Natl.Cancer Inst.82：1107-1112(1990))进行测定，并计算出半数抑制浓度(IC50)。体外抗癌活性的测定在三十多种不同的肿瘤细胞株中进行。这些细胞的来源包括头颈肿瘤，肝胆肿瘤，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，脑癌，皮肤癌，前列腺癌，白血病以及淋巴瘤等。其中12个肿瘤细胞株具有MDR特性(见下表)。埃坡霉素D对所有这些细胞的IC50都小于100nM，而绝大部分小于10nM，表明它不但对一般非耐药性肿瘤细胞，而且对多重耐药性的肿瘤细胞具有强大的抗生长活性。这与紫杉醇形成了鲜明的对照。紫杉醇对具多重耐药性的肿瘤细胞系不表现活性，这表明了埃坡霉素D优于紫杉醇。实验结果也表明9，10-脱氢埃坡霉素D是具有更好的抑制细胞增生性能的埃坡霉素D衍生物。

在体外，埃坡霉素D与健泽联合使用对非小细胞肺癌细胞系A549和H460产生协同细胞毒作用，使得这种联合使用产生了比两者加和更强的细胞杀伤作用。为了观察到这种协同作用，这两种药剂必须以特定的顺序给药。先用埃坡霉素D处理细胞，然后再加健泽，即可观察到这种协同作用。埃坡霉素D还能与其它一些抗癌药产生协同效应。

体内抗癌活性：

埃坡霉素D的体内抗肿瘤活性试验在生长有人类非—小细胞(non-smallcell)肺癌A549的无胸腺裸鼠模型中进行。裸鼠皮下植入A549癌细胞(0.2ml，1×107/鼠)10天，直到肿瘤大小接近20mm³后，通过尾静脉隔天输液注射埃坡霉素D5天(Q2Dx5)。通过测量肿瘤的体积测定其疗效。

如图4所示，在疗程结束时，显示埃坡霉素D对治疗该肿瘤特别有效。而与此相反，紫杉醇只显示出部分抑制作用。试验中这一显著的差别，加上上述体外细胞生长抑制试验得到的结果，说明了埃坡霉素D比其他传统的抗癌药物具有更好的疗效。

埃坡霉素D的体内抗肿瘤活性也在生长有人类直肠癌HCT-15的无胸腺裸鼠模型中进行了试验。通过尾静脉每天推注埃坡霉素D，连续注射10天。此模型对紫杉醇具耐药性。结果显示，紫杉醇确实对这一肿瘤无疗效，只有3％的抑制率，而埃坡霉素D的抑制率高达79％，说明埃坡霉素D不但有很好的疗效，而且能克服肿瘤的耐药性。

埃坡霉素D对癌细胞系的活性
						细胞系	细胞来源	IC50(nM)	细胞系	细胞来源	IC50(nM)
MCF-7	人类乳腺癌	10	AU565	人类乳腺癌	5
						SF-268	人类神经胶质瘤	11	MES-SA	人类子宫癌	8
NCI-H460	人类肺癌	8	PC-3	人类前列腺癌	10
						SK-OV-3	人类卵巢癌	5	DU145	人类前列腺癌	8
NCI-H292	人类肺癌	1	THP-1	人类白血病	5
						A549	人类肺癌	2	CCRF-CEM	人类白血病	4
KB	人类表皮癌	4	K562	人类白血病	7
						A431	人类表皮癌	2	HL60	人类白血病	7
HepG2	人类肝癌	3	B16	小鼠黑素瘤	14
						SK-BR3	人类乳腺癌	9	C6	大鼠神经胶质瘤	12
HCT-15	人类结肠癌	90	P388	小鼠白血病	8
						埃坡霉素D对抗癌药物抗性的癌细胞系的活性
NCI/ADR-Res	人类乳腺癌	8	CEM/T1	人类白血病	3
						LS1034	人类结肠癌	1	CEM/C2	人类白血病	7
LS513	人类结肠癌	3	HL60/MX2	人类白血病	6
						MES-SA/MX2	人类子宫癌	3	P338/ADR	小鼠白血病	40
CEM/V1	人类白血病	12	AT3B- 1	大鼠前列腺癌	10
						CEM/V2	人类白血病	6	MLLB-2	大鼠前列腺癌	98
反式-9，10-脱氢埃坡霉素D对癌细胞系的活性
						CCRF-CEM	人类白血病	1	CEM/V1	人类白血病	5
CEM/T1	人类白血病	1	MCF-7	人类乳腺癌	3

由上表可以看出，对于同样四种癌细胞系，反式9，10-脱氢埃坡霉素D比埃坡霉素D表现出更强的抑癌活性。

埃坡霉素D的作用机理

用细胞水平(cell-based)的微管蛋白聚合试验测定其作用机理。试验中，在37℃下，用1μm的每一种化合物对培养于35mm培养皿中的VSMC或NCI/ADR-RES(简称ADR)细胞处理1小时。用2ml不含Ca和Mg的PBS洗涤细胞两遍，在室温下用300μL的裂解液(20Mm Tris，PH6.8，1Mm MgCl2，2mM EDTA，1％Triton X-100，加上蛋白酶抑制剂)处理细胞5-10分钟而使细胞裂解。将裂解液转移到1.5ml的Eppendorf管中。室温下，裂解液在18000g离心12分钟。将含有可溶性或未聚合的微管蛋白的上清液与含不溶性或聚合的微管蛋白的粒状沉淀分离，并转移到新管中。然后用300μL的裂解液重新悬浮粒状沉淀。通过SDS-PAGE和用β-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析每个样品，然后用NIH Image计算机程序分析印迹上β-微管蛋白量的相对变化。这种变化通过P/S比值表达于下表。其中P代表聚合了的微管蛋白，S代表未聚合的微管蛋白。P/S比值越大，则促微管蛋白聚合的能力就越强。埃坡霉素D，在血管平滑肌细胞系VSMC和在MDR癌细胞系NIH/ADR-RES内都促进了微管蛋白的聚合。但紫杉醇只对VSMC细胞起作用，而对MDR癌细胞系NIH/ADR-RES几乎没有作用。这一结果说明了通过利用这一作用机制，埃坡霉素D不但可用于治疗癌症(特别是MDR癌症)，而且也可用来防止血管再狭窄。

埃坡霉素D和紫杉醇在细胞中的促微管蛋白聚合作用

细胞	无药对照	埃坡霉素D	紫杉醇
				VSMC	0.3	5	4
NIH/ADR-RES	0.3	6	0.5

        表中的数字为P/S值。

抑制血管平滑肌细胞生长(VSMC)的体外活性：

人类和鼠类的VSMC细胞用埃坡霉素D处理，以测定这一化合物对这些细胞生长的抑制效应。其作用能力的大小由IC50值表达出来。埃坡霉素D抗人类VSMC的IC50值为10nM，抗鼠类VSMC的IC50值为15nM，这说明了埃坡霉素D对血管内平滑肌细胞的生长有很强的抑制作用。这一结果和我们使用埃坡霉素D及其衍生物包覆支架以防止血管再狭窄的构想是相吻合的。

Claims (13)

1.一种生产以埃坡霉素D为主要代谢产物的新菌株Sorangium cellulosumBGS4，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.1206。

2.一种新型的埃坡霉素化合物，该化合物是反式-9，10-脱氢埃坡霉素D。

3.权利要求2所述的化合物在制备抗增生性疾病的药物组合物中的应用。

4.根据权利要求3所述的化合物的应用，其特征在于该化合物在包覆可植入体内的支架的药物组合物中的应用。

5.根据权利要求3所述的化合物的应用，其特征在于所述的药物组合物是有效剂量的反式-9，10-脱氢埃坡霉素D与至少一种其它抗癌药物形成的组合药剂。

6.埃坡霉素类化合物在制备抗增生性疾病的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的增生性疾病包括结肠肿瘤，泌尿生殖系肿瘤，表皮肿瘤，肺部肿瘤，胸部肿瘤和肝胆肿瘤。

8.根据权利要求7所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的增生性疾病为对紫杉烷类的抗癌剂有抗性的肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，表皮性的头颈肿瘤和肝癌。

9.根据权利要求6所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的药物组合物是有效剂量的埃坡霉素与至少一种其它抗癌药物形成的组合药剂。

10.根据权利要求9所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的抗癌药物选自抗代谢物氟尿嘧啶和健泽，烷化剂卡铂和顺铂，以及信号传导抑制剂Iressa，Herceptin和geldanamycins。

11.根据权利要求6所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的药物组合物制剂为口服给药剂型。

12.根据权利要求6所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的制剂为注射给药剂型。

13.根据权利要求6所述的埃坡霉素的应用，其特征在于所述的埃坡霉素在包覆可植入体内的支架的药物组合物中的应用。

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