CN1628844A - 以红细胞作为载体延长蛋白质药物的体内半衰期的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用红细胞作为载体延长蛋白质药物在体内的半衰期的方法。此方法不仅可以延长药物在体内的半衰期，还可以降低药物用量，防止药物扩散到血管外，从而降低药品的副作用。本发明还涉及一种蛋白质药物－红细胞复合物，该蛋白质药物以红细胞为载体而被传送至体内。

Description

以红细胞作为载体延长蛋白质药物的体内半衰期的方法

                             技术领域

本发明涉及一种用红细胞作为载体延长蛋白质药物半衰期的方法。

                             背景技术

近年来，由于基因工程的普及应用，蛋白质类药物在临床上(包括心血管疾病的治疗)的应用越来越广。但由于本身理化性质的原因，大多数蛋白质药物不太稳定，在体内的半衰期很短，很多药物需要每天给药。同时，由于消化道中蛋白酶的存在，蛋白质药物很难通过口服给药，连续的滴注给药或持续的注射给病人带来精神和肉体上的双重折磨。因此越来越多的研究机构将精力集中在蛋白质药物的剂型研究上，主要是研究长效药物和口服、喷雾给药等。

目前有关长效药物的研究主要集中在以下几个方面：

1.蛋白质的修饰：主要是PEG修饰和糖基的修饰。其中，PEG化的IFN(干扰素)、G-SCF(粒细胞集落刺激因子)已经研究成功，并且在美国成功上市。而Amgen公司通过改变EPO(红细胞生成素)的糖基化位点增加重组人EPO的唾液酸修饰从而使EPO的半衰期延长了几倍。

2.融合蛋白的方式：研究表明一些小分子蛋白通过与白蛋白、免疫球蛋白Fc段融合的方式增加了蛋白分子量，延长了蛋白在体内的半衰期。

3.剂型的改变：两性酶素的脂质体剂型研究成功给蛋白质药物的研究给了很多启示。研究者用脂质体包埋蛋白质药物，防止蛋白酶的降解和延缓在体内的代谢。此外，还有借用凝胶等物质将药物植入体内，然后药物通过凝胶缓慢的释放。

4.借用机械的方式实现药物的缓慢释放：通过微泵的方式实现药物在体内的缓慢的可控的释放。

红细胞承担着给机体输送氧气的任务，血液中血细胞绝大多数为红细胞，红细胞的体内平均寿命在120天左右，而且红细胞一般局限在血液系统内循环。因此，有人尝试使用红细胞作为药物载体以传送药物。国内对此也有一定的研究。南京鼓楼医院麻醉医师汪小海、骆璇等经过两年的研究，发明了一种优化药物生物效应的新技术——红细胞包蔽吗啡溶液用于病人术后镇痛，即运用自身红细胞作为药物载体，在病人手术麻醉前，抽取其3毫升静脉血，采用高渗法将镇痛药物吗啡包裹于红细胞内，在病人手术完成时，把包蔽吗啡的血液重新输回到病人体内，使得吗啡药物在人体内缓慢释放，从而达到了术后长效镇痛的目的。新的止痛方法，具有较好的安全性并且费用低廉。

但是，以上研究局限于用药物进入红细胞内，然后再缓慢释放，这种技术不大适合蛋白质类药物，因为蛋白质类药物分子量较大，很难进入细胞内部。

近年来，生物技术的发展给众多的心血管疾病患者带来福音，已经上市的溶栓药物尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活物等挽救了许许多多的心肌梗塞及中风病人。但溶栓以后往往会出现出血以及再栓塞等反应。如何防止溶栓后的再栓塞及降低出血反应成为一个十分重要的研究课题。

                             发明内容

如上所述，本领域仍需要一种技术，该技术能将蛋白质药物传送到体内，并能延长该药物的体内半衰期。本发明即能满足这种需求。

因此，本发明的一个目的是提供一种延长蛋白质药物在体内半衰期的方法，该方法采用化学交联或标记后亲和作用的方式将蛋白质药物连接在红细胞表面，从而延长了药物的体内半衰期。

本发明所述的蛋白质药物指直接在血液系统中起作用的蛋白质，包括但不限于水蛭素、尿激酶、链激酶、尿激酶原、蝮蛇抗栓酶等药物。本发明的蛋白质药物优选溶栓药物和抗凝药物，如：尿激酶原、链激酶、水蛭素等。其中，水蛭素是迄今为止发现的最强有力的凝血酶抑制剂，还有很强的抗血栓作用，对多种实验性血栓模型有阻抑作用。其中对凝血酶或内毒素所致的弥散性血管内微血栓形成作用最强。其次，对静脉阻塞所致的颈静脉血栓也有较强的抗血栓作用。此外，水蛭素对血管内膜损伤及旁路循环的动脉血栓形成、化学损伤所致的冠脉血栓形成以及电流刺激所致的冠脉血栓的产生、实验性冠脉血栓经链激酶溶栓再通后血栓性再阻塞的发生有明显阻抑作用。重组水蛭素的抗凝效力与其在血液中的浓度相关。水蛭素在体内不降解，在组织中无沉积，摄入后主要分布于细胞外的空间，经肾小球过滤，以活性组分的形式通过肾脏排出体外，经对鼠、家兔和狗的静脉注射发现，重组水蛭素半衰期为1小时左右。因此，要更好地发挥水蛭素的预防血栓作用，延长其半衰期是必要的。

本发明所述的化学交联作用包括使用化学交联剂，较佳是作用条件温和的双交联剂，在体外通过化学反应将红细胞与蛋白质偶联成复合物。所述化学交联剂优选异型双功能交联剂，选自但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、N-羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)-苯甲酸酯(SMB)等。

SPDP可以通过分子中的活泼酯成分与氨基反应，同时引入巯基，然后通过巯基交换反应或巯基加成反应与另一分子交联，同类的交联剂还有N-羟基琥珀酰亚胺基-(4-α-甲基-α-(2-砒啶基二硫代甲基)-苯甲酸酯(SMPT)、N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丁酸酯(SPDB)，通过在二硫键的α位引入阻性基团如甲基，增加交联物的稳定性。

N-羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯的活泼酯成分和α位活泼卤素可以分别与蛋白分子的巯基及氨基反应，实现分子间的交联，形成的硫醚键在血浆中十分稳定。

SMB的N-羟基琥珀酰亚胺基可以和蛋白的氨基反应，引入马来酰亚胺基，然后马来酰亚胺基与另一含有游历巯基的分子如红细胞上的蛋白通过巯基对双键的加成反应连接起来。

本发明所述的标记后亲和作用包括在红细胞和蛋白质上分别作分子标记，利用标记物之间或标记物与同一分子作用使红细胞与蛋白质形成复合物。具体而言，标记后亲和作用涉及生物素、亲和素和/或链霉亲和素的使用。

生物素又称辅酶R或维生素H，在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应。生物素分子量244.31，分子式C₁₀H₁₆O₃N₂S，有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C₂上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS-biotin)和生物素对硝基酚酯(pBNP)。

亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白；等电点10-10.5，含糖约10％，分子量为68kDa。亲和素由四个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲和素与生物素之间具有非常强的亲和力，其亲和常数高达10¹⁵mol^-1，比抗原抗体结合的亲和常数(10^5-11mol^-1)至少高10万倍，因此二者能快速结合，具有高度特异性和稳定性。

链霉亲和素(SA)是链霉菌(Streptomyces avidinii)在培养过程中分泌的一种蛋白质产物。SA的分子量为65kD，由4条序列相同的肽链组成。链霉亲和素与生物素的亲和常数亦为10¹⁵mol^-1。SA的每条肽链含159个氨基酸残基，等电点为6.0，不带任何糖基。SA在检测应用中出现的非特异中结合远低于亲和素。而且SA在大肠杆菌中已获得高效表达。

生物素与亲和素(或链霉亲和素)在分析系统中已广泛应用，主要优点有：(1)亲和素和生物素之间非常强的亲合力；(2)可以将生物素连接到许多探针或配体上，而不改变它们的生物活性和生理特性；(3)存在许多商品化的生物素化试剂以及含亲和素的探针。

生物素标记蛋白目前已得到广泛的应用，生物素标记的抗体被广泛地应用于诊断及蛋白检测，生物素标记相对比较温和，可以保留原蛋白的生物活性。亲和素及链霉亲和素标记蛋白也有很多的应用，比如亲和素及链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶及碱性磷酸酯酶已经在检测中广泛应用。

生物素标记红细胞的方法相对比较成熟。Magnani M.等(Biotechnol.Appl.Biochem.，20：335-345，1994)用NHS-Biotin(与红细胞膜蛋白的氨基结合)和生物素酰肼(biotin hydrazide，可引起红细胞膜的酰基氧化)使红细胞生物素化。通过比较发现，用NHS-Biotin进行标记具有更高的体外恢复率(＞90％)，并在循环中24小时不受损害。相反，生物素酰肼标记的细胞恢复率仅为5-30％，24小时内几乎消失。由于NHS-Biotin是脂溶性物质，只能用脂类物质来溶解，从而不可避免地带来了在标记过程中脂类物质对红细胞及动物体的毒副作用。在体外标记实验中，常用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)来作为溶剂。DMF的毒性通过测量清洗标记红细胞后的上清液中DMF的浓度来确定。Hoffmann-Fezer等(Ann.Hematol.74：231-238，1997)用气相色谱法测得上清液中DMF浓度远远低于由生理毒性动力模型计算的工作场所暴露在10ppmDMF气体中的剂量，因此，用DMF溶解NHS-Biotin标记红细胞并经过清洗后，再将红细胞注入动物体内，不会发生危险。在体内标记实验中，常用DMSO和DMA(二甲基乙酰胺)，虽然DMSO的毒性被描述过(狗LD₅₀＝2.5g/kg)，但它与DMA相比毒性较低，而且作为NHS-Biotin的溶剂效果更好。在实验中，通常给动物注射硫酸阿托品来抵消DMSO的潜在的副作用。Suzuki等(Blood，70(3)：791-795，1987)发现将NHS-Biotin与红细胞共同孵育会引起红细胞的棘化，在用琥珀酰化的BSA(succinylated BSA)处理后，阻止了红细胞的形变，使之保持与对照红细胞相同的形态。Cavill等(Br.J.Haematol.70：491-493，1988)用NHS-LC-biotin和⁵¹Cr标记，测量19人的红细胞体积，发现两种标记之间没有差异。将红细胞同时标记上NHS-Biotin和¹⁴C，并用¹⁴C标记对照红细胞，在一定时间间隔内监外周血中生物素标记和¹⁴C标记的红细胞的百分数，发现两种标记的红细胞具有相同的生存能力。Russo等(Biotechnol.Appl.Biochem.，20：335-345，1994)用流式细胞计证明了标记红细胞具有正常的生存周期。

在本发明的一个实施例中，用生物素分别标记红细胞和水蛭素，然后用链霉亲和素将两者连在一起，形成红细胞与水蛭素的复合物。

在本发明的另一实施例中，先用生物素标记红细胞，然后用化学交联的方法将链霉亲和素与水蛭素连接，然后通过生物素与链霉亲和素的亲和作用使两者形成复合物。此复合物中，每个红细胞表面将有几千到上万个水蛭素分子。

本发明还提供了将尿激酶原连接于红细胞表面的实施例，用生物素标记尿激酶原与红细胞，然后通过链霉亲和素将二者连接在一起，得到尿激酶与红细胞的复合物。

本发明的另一目的是提供一种蛋白质药物-红细胞复合物，其中，复合物中的蛋白质通过化学交联作用或标记后亲和作用的方法连接于红细胞上。所述化学交联作用包括使用化学交联剂，较佳是作用条件温和的双交联剂，在体外通过化学反应将红细胞与蛋白质偶联成复合物。所述化学交联剂优选异型双功能交联剂，选自但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-砒啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、N-羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)-苯甲酸酯(SMB)等。所述标记后亲和作用包括在红细胞和蛋白质上分别作分子标记，利用标记物之间或标记物与同一分子作用使红细胞与蛋白质形成复合物。具体是通过生物素、亲和素和/或链霉亲和素之间的相互作用，使它们所比较的蛋白质药物和/或红细胞相连。

为此，本发明提供了一个优选的蛋白质药物-红细胞复合物，具体为由生物素标记的红细胞通过链霉亲和素与生物素标记的水蛭素连接而形成的水蛭素-红细胞复合物。

本发明还提供另一优选的蛋白质药物-红细胞复合物，具体为由生物素标记的红细胞与链霉亲和素标记的水蛭素通过生物素与链霉亲和素之间的连接而形成的复合物。

在又一实施例中，本发明还提供了尿激酶原-红细胞复合物和链激酶-红细胞复合物。

本发明的一个优点是，通过使蛋白质药物与红细胞连接，延缓了该药物被肾小球滤过，从而延长了药物在体内的作用时间。同时通过红细胞将药物限制在血管内作用，降低药物在其他组织中的分布，不仅可以防止药物在其他组织中的副反应，而且可以通过降低药物的表观分布体积来减少药物的用量，从而降低药物的副反应。

本发明的水蛭素-红细胞复合物与单独的水蛭素相比，在保留了与单独的水蛭素相当的强抗凝、抗栓效果的同时，大大延长了体内半衰期。由于一个红细胞上可以标记有几千到上万个生物素，然后与几千到上万个链霉亲和素结合，而每个链霉亲和素有4个生物素结合位点，即还有3个空余的位点与生物素化的水蛭素结合。因此，实际形成的复合物中，每个红细胞上最终连接有几万个水蛭素。

将尿激酶、链激酶、水蛭素等药物连接于红细胞表面，也获得了类似的效果。即，所形成的蛋白质药物-红细胞复合物，其作用时间得到延长，药物剂量减少，而且防止了药物进入血管外、引起出血的危险。

本发明的另一优点是，使用本发明的蛋白质药物-红细胞复合物(包括水蛭素、EPO、G-CSF等药物与红细胞形成的复合物)可以避免药物的每天注射，既减轻了病人的痛苦，还可以增加一些新的临床应用。

以下以实施例的方式进一步阐述本发明。但是，并不能认为本发明限制于以下的优选实施例。

                           具体实施方式

实施例1  水蛭素与红细胞复合物的制备

1.1 红细胞的生物素标记

抽取全血，加肝素抗凝，然后离心收集红细胞，用pH 7.4磷酸缓冲液(PBS，125mM NaCl+20mM PB)洗涤三次，按10％红血球容积悬浮于PBS-G(PBS+5mMglucose)。将NHS-biotin按200mg/ml溶解于90％的DMSO中，然后按每毫升红细胞加0.055mg的NHS-biotin混匀，37℃保温1小时，然后用PBS洗涤三次，得到标记好的红细胞。

1.2 水蛭素的生物素标记

用DMF将NHS-Biotin配成1mg/ml溶液，然后用0.1M，pH 9.0NaHCO₃将水蛭素稀释成1mg/ml。将NHS-Biotin与水蛭素按重量比1∶7左右混合，室温搅拌下反应4小时，装入透析袋，对0.05M pH 7.2 PBS在4℃透析过夜，去除未反应的NHS-biotin。

1.3 水蛭素-红细胞复合物的制备

先将生物素化的水蛭素与链霉亲和素按摩尔数比1∶1混合，室温搅拌下反应30分钟，然后加入生物素化的红细胞，轻轻摇动反应30分钟，离心收集红细胞-水蛭素复合物。

1.4 水蛭素比活性的测定

水蛭素的测活方法为水蛭素抗凝血酶法：100μL含水蛭素的溶液中，加入0.2ml 0.5％纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中，混匀后，在室温下逐滴加入标准凝血酶溶液(100NIH-U/ml)，每次5μL，边加边震荡，然后放置，如果纤维蛋白原在1分钟内凝固，即滴定完毕，由消耗的凝血酶量计算出水蛭素的活性。然后将活性除以水蛭素的蛋白量得到水蛭素的比活。

用上述方法测定未标记的水蛭素、生物素化的水蛭素及水蛭素-红细胞复合物中水蛭素的比活，发现标记后比活略有降低，但仍保持绝大部分抗凝血酶活性。

实施例2  水蛭素与红细胞复合物的制备

2.1 红细胞的生物素标记

同实施例1的步骤1.1。

2.2 水蛭素的链霉亲和素标记

将冻于的水蛭素溶解在含有1.25％戊二醛的0.1M pH 6.8PB缓冲液中，终浓度为10mg/ml，室温作用过夜；装入透析袋，对0.05M pH 7.2PBS在4℃透析12小时；取出透析物，每毫升水蛭素溶液加入15mg链霉亲和素和0.5ml 1M pH 9.5Na₂CO₃，置4℃结合24小时；加入50ul 0.2M赖氨酸室温2小时终止反应；装入透析袋，对0.05M pH 7.2PBS在4℃透析过夜。离心去除大分子聚合物，得到链霉亲和素标记的水蛭素。

2.3 水蛭素-红细胞复合物的形成

将生物素化的红细胞与链霉亲和素标记的水蛭素(按每个生物素化红细胞结合10000个链霉亲和素标记的水蛭素计算)进行混合，在室温下轻轻摇动反应30分钟，离心收集红细胞-水蛭素复合物。

2.4 水蛭素的比活性测定

测定方法参照1.4。结果发现链霉亲和素标记的水蛭素及与红细胞形成的复合物仍具有与未标记的水蛭素可比的抗凝血酶活性。

实施例3  水蛭素-红细胞复合物与单独的水蛭素的体内半衰期比较

取新西兰家兔30只，分成六组，分别静脉注射水蛭素或水蛭素-红细胞复合物，剂量(按水蛭素的蛋白重量计算)分高(0.4毫克/公斤)、中(0.2毫克/公斤)、低(0.1毫克/公斤)三组，然后在注射后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时取血，然后用夹心ELISA检测水蛭素浓度。所得数据用P87软件计算T1/2(α相不计算，只计算β相)。结果表明，水蛭素与红细胞融合后半衰期大大延长。

实施例4  尿激酶原-红细胞复合物的制备

方法参照实施例1，但是使用尿激酶原替换水蛭素，制得尿激酶原-红细胞复合物。测得所制得的尿激酶原-红细胞复合物中的尿激酶原仍保持绝大部分抗凝血酶活性。按照实施例3所述的方法测试本实施例的尿激酶原-红细胞复合物，结果表明，尿激酶原与红细胞融合后其半衰期大大延长。

实施例5  链激酶-红细胞复合物的制备

方法参照实施例1，但使用链激酶替换水蛭素，制得链激酶-红细胞复合物。测得所制得的链激酶-红细胞复合物中的链激酶仍保持绝大部分抗凝血酶活性。按照实施例3所述的方法测试本实施例的链激酶-红细胞复合物，结果表明，链激酶与红细胞融合后其半衰期大大延长。

Claims (10)

1.一种延长蛋白质药物体内半衰期的方法，其特征在于，该方法包括，采用化学交联作用或标记后亲和作用的方法将所述蛋白质药物连接于红细胞表面，形成蛋白质药物-红细胞复合物。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述化学交联作用包括：使用化学交联剂在体外通过化学反应将红细胞与蛋白质偶联成复合物。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述标记后亲和作用包括：在红细胞和蛋白质上分别作分子标记，利用标记物之间或标记物与同一分子作用使红细胞与蛋白质形成复合物。

4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述标记物选自生物素和亲和素或链霉亲和素。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质药物选自水蛭素、尿激酶、链激酶、尿激酶原和蝮蛇抗栓酶。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白质药物是水蛭素。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：用生物素分别标记红细胞和水蛭素，用链霉亲和素将标记的红细胞与标记的水蛭素连在一起，形成红细胞-水蛭素复合物。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：用生物素标记红细胞，用化学交联的方法将链霉亲和素与水蛭素连接，然后通过生物素与链霉亲和素的亲和作用使两者形成复合物。

9.一种蛋白质药物-红细胞复合物，其特征在于，该复合物中的蛋白质药物通过化学交联作用或标记后亲和作用的方法连接于红细胞上。

10.如权利要求9所述的蛋白质药物-红细胞复合物，其特征在于，所述蛋白质药物-红细胞复合物为生物素或链霉亲和素标记的水蛭素、尿激酶、链激酶、尿激酶原或蝮蛇抗栓酶与生物素标记的红细胞形成的蛋白质药物-红细胞复合物。