CN108524922A - 一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞及其制备方法。该方法包括以下步骤：（1）以红细胞为载体，采用低渗‑重封闭法包载葡萄糖氧化酶；（2）将步骤（1）得到的载酶红细胞用Triton X‑100处理，改善红细胞膜渗透性；（3）载酶红细胞的固化。该载酶红细胞能有效降解血清中的葡萄糖。

Description

一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于降血糖药物领域，具体涉及一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞及其制备方法。
技术背景
据国际糖尿病联盟2011年统计，全球糖尿病患病人数为3.66亿，预计2030年将达到5.52亿。在我国，成人糖尿病的患病率为9.7%，患者总数已超过9000万人，成为世界第一糖尿病大国。其中，1型糖尿病，原名胰岛素依赖型糖尿病，多发生在儿童和青少年，体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，必须用胰岛素治疗才能获得满意疗效，否则将危及生命。但是胰岛素价格昂贵，且长期注射胰岛素会给病人带来极大的痛苦，因此需要寻找新的方法控制血糖。
葡萄糖氧化酶（GOD）在有氧条件下，能专一性地催化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD不仅用于食品工业、纺织漂染等行业，而且在生物燃料、葡萄糖生物传感器等新兴领域也有广泛的应用。红细胞是体内重要的氧气载体，能为葡萄糖的氧化提供充足的反应底物；红细胞细胞器少，已有研究将其作为药物、酶的载体用作疾病治疗。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞及其制备方法。该方法以红细胞为载体，利用低渗-重封闭法包载葡萄糖氧化酶，再用Trition X-100红细胞进行预处理，改善细胞膜的通透性，并用戊二醛对红细胞进行固化。所得载酶红细胞能有效降解血清中的葡萄糖。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）以红细胞为载体，采用低渗-重封闭法包载葡萄糖氧化酶；
（2）将步骤（1）得到的载酶红细胞用Triton X-100处理，改善红细胞膜渗透性；
（3）载酶红细胞的固化。
步骤（1）具体为：
a. 葡萄糖氧化酶溶液的制备：将葡萄糖氧化酶粉末溶解在缓冲液中，配成葡萄糖氧化酶溶液；
b. 葡萄糖氧化酶的包载：将红细胞与葡萄糖氧化酶溶液混合在低渗缓冲液中，反应3分钟；
c. 载酶红细胞的重封闭：用高浓度的PBS缓冲液迅速将混合溶液浓度调节为等渗；
d. 用1×PBS洗涤5次以除去未包封的葡萄糖氧化酶，获得载酶红细胞。
步骤a 所配制的葡萄糖氧化酶溶液其浓度为40 mg/mL。
步骤b所述的低渗缓冲液为0.2×PBS，pH为7.4。
步骤b中红细胞、葡萄糖氧化酶溶液和低渗缓冲液的体积比为1:2:7。
步骤c中所述的高浓度的PBS缓冲液为20×PBS缓冲液。
步骤（2）具体为：将载酶红细胞与含有0.19 mM Trition X-100 的1×PBS混合，缓慢震荡后，离心，用1×PBS缓冲液清洗红细胞5-8次，离心得渗透性改良的红细胞，于4℃保存。
步骤（3）具体为：载酶红细胞用0.1wt%戊二醛溶液处理3分钟后，PBS缓冲溶液清洗3遍。
一种如上所述的制备方法制得的载酶红细胞。
一种如上所述的载酶红细胞在制备用于降解血清中葡萄糖的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明突破胰岛素降低血糖的局限，将生产生活中广泛使用的葡萄糖氧化酶作为功能酶，以红细胞作为载体，制成载酶红细胞，达到直接分解血清中的葡萄糖的目的；同时，红细胞细胞器少，是良好的药物、酶的载体；红细胞作为体内氧气的运输体能为葡萄糖的氧化提供必需的氧气；且红细胞来源于血液，能够很大程度上减小免疫排斥，本发明将为血糖的控制提供新的思路。
附图说明
图1为本发明载酶红细胞的制备流程图；
图2为本发明载酶红细胞降解血清中葡萄糖的原理图；
图3为本发明载酶红细胞降解血清中葡萄糖的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本发明胰岛素控释药物的具体制备过程如下：
1.红细胞包载葡萄糖氧化酶
（1） 将葡萄糖氧化酶粉末溶解在0.2×PBS缓冲液中，配成浓度为40 mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液；
（2）葡萄糖氧化酶的包载：将红细胞与葡萄糖氧化酶溶液混合在低渗缓冲溶液（0.2×PBS）中，反应3分钟；
（3）载酶红细胞的重封闭：用20×PBS缓冲液迅速将混合溶液浓度调节至等渗；
（4）用1×PBS洗涤5次洗去以除去未包封的葡萄糖氧化酶，获得所述载酶红细胞。
2．改善膜通透性
将红细胞与含有0.19mM Triton X-100 的1×PBS混合，反应3分钟后离心，用PBS缓冲液清洗6次，离心后得到渗透性改良的红细胞，4℃保存。
3. 载酶红细胞的固化过程
载酶红细胞用0.1wt%戊二醛溶液处理3分钟后，再用PBS缓冲溶液清洗3遍。
4. 结果
4.1 实验设计示意图
图1所示为红细胞载入葡萄糖氧化酶的示意图。以红细胞为载体，采用低渗-重封闭的方法载入葡萄糖氧化酶，并用Triton X-100改善膜的通透性，最后用戊二醛对载酶红细胞进行固化；
图2所示为载酶红细胞降解血清中葡萄糖的原理图。葡萄糖进入红细胞，在葡萄糖酶的催化下被分解为葡萄糖酸和H2O2（葡萄糖+O2+H2O = 葡萄糖酸+ H2O2）；
图3所示为载酶红细胞分解血清中葡萄糖的效果图；
4.2 血清中葡萄糖降解结果
配置含有葡萄糖的血清，37℃孵育半小时后备用。取载酶红细胞两份，标记为A、B，一管加入超纯水使红细胞涨破，一管加入等量PBS。另取单纯PBS作为对照，标记为C，将三管同时至于37 ºC孵育半小时。之后，将血清分别与载酶红细胞、涨破后的载酶红细胞和PBS混合，37 ºC孵育并检测血清中葡萄糖浓度。
如图3所示，与对照组（C）相比，A组（未涨破）和B组（涨破）均能降低血清中葡萄糖的含量，将高血糖水平（25mM）降低至正常范围（3.9mM~6.1mM）,且两者效果相近。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）以红细胞为载体，采用低渗-重封闭法包载葡萄糖氧化酶；
（2）将步骤（1）得到的载酶红细胞用Triton X-100处理，改善红细胞膜渗透性；
（3）载酶红细胞的固化。
2.根据权利要求1所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）具体为：
a. 葡萄糖氧化酶溶液的制备：将葡萄糖氧化酶粉末溶解在缓冲液中，配成葡萄糖氧化酶溶液；
b. 葡萄糖氧化酶的包载：将红细胞与葡萄糖氧化酶溶液混合在低渗缓冲液中，反应3分钟；
c. 载酶红细胞的重封闭：用高浓度的PBS缓冲液迅速将混合溶液浓度调节为等渗；
d. 用1×PBS洗涤5次以除去未包封的葡萄糖氧化酶，获得载酶红细胞。
3.根据权利要求2所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤a 所配制的葡萄糖氧化酶溶液其浓度为40 mg/mL。
4.根据权利要求2所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤b所述的低渗缓冲液为0.2×PBS，pH为7.4。
5.根据权利要求2所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤b中红细胞、葡萄糖氧化酶溶液和低渗缓冲液的体积比为1:2:7。
6.根据权利要求2所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤c中所述的高浓度的PBS缓冲液为20×PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）具体为：将载酶红细胞与含有0.19 mM Trition X-100 的1×PBS混合，缓慢震荡后，离心，用1×PBS缓冲液清洗红细胞5-8次，离心得渗透性改良的红细胞，于4℃保存。
8.根据权利要求1所述的可用于降解血清中葡萄糖的载酶红细胞的制备方法，其特征在于：步骤（3）具体为：载酶红细胞用0.1wt%戊二醛溶液处理3分钟后，PBS缓冲溶液清洗3遍。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的载酶红细胞。
10.一种如权利要求9所述的载酶红细胞在制备用于降解血清中葡萄糖的药物中的应用。
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