CN101850228B - 一种具有免疫隔离性能的微胶囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有免疫隔离性能的微胶囊的制备方法,在复凝聚法制备的海藻酸钙-壳聚糖微胶囊的基础上,分别与海藻酸钠溶液及壳聚糖溶液通过层层交替自组装的方法,精确控制微囊膜的孔径,使其可以通过牛血清白蛋白(BSA),但不能通过免疫球蛋白IgG,从而制备出具有免疫隔离性能的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。
Description
技术领域
本发明涉及微胶囊的制备,具体地说是一种具有免疫隔离性能的微胶囊的制备方法。
背景技术
细胞移植是治疗某些脏器功能完全丧失的疾病的唯一有效措施。但是供体来源严重缺失和免疫排斥反应,限制了细胞移植技术的发展。解决免疫排斥难题的有效途径之一,是以微胶囊作为免疫隔离装置,采用微囊化技术对异体活性组织或细胞进行包封,将移植物与宿主隔离。微胶囊的免疫隔离性能是微胶囊应用于细胞移植的必要条件。理想的用于细胞移植的微胶囊必须允许囊外小分子量物质(细胞生存所需营养物如血清白蛋白、生长因子、葡萄糖和氧气等)和囊内小分子产物(如细胞分泌物胰岛素、代谢产物和二氧化碳等)自由进出微胶囊,而将大分子免疫物质(如免疫球蛋白、补体等)或免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞等)阻隔在微胶囊外,从而避免了囊内细胞或组织被机体免疫系统攻击并杀死。因为免疫球蛋白比免疫细胞小,而IgG又是免疫球蛋白中最小的分子,故研究者[Anal.Biochem.1996,242:104-111,Adv.Drug.Deliv.Rev.2000,42:29-64,Biotechnol.Prog.2002,18:401-403]认为,对IgG的隔离性能是检测微胶囊是否具有免疫隔离性能的最可靠而直接的指标,理想的用于细胞移植的微胶囊应能够阻止微囊外分子量大于等于IgG分子进入微胶囊内,同时,允许细胞生存必需的营养物质自由通过微胶囊,常用的代表营养物质的模型蛋白是分子量在66kDa的牛血清白蛋白(BSA)。
由天然多糖海藻酸钠(简写为NaAlg或Alg,由α-L-甘露糖醛酸与β-D-古罗糖醛酸依靠1,4-糖苷键连接而成)、壳聚糖[化学名为聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖]经复凝聚反应而制成的具有核壳结构的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊(以下简称ACA微胶囊),具有无毒、免疫原性低及制备条件温和等优点[化学进展,2008,20(1):126-139],是比较理想的组织细胞移植用微胶囊。但根据现有文献报道,由海藻酸钠、壳聚糖仅通过复凝聚反应而制成的ACA微胶囊均不能隔离IgG,即不具有免疫隔离性能[Biomaterials.1999,20(8):773-83]。
发明内容
本发明针对上述问题,提出在复凝聚法制备的海藻酸钙-壳聚糖微胶囊的基础上,分别与海藻酸钠溶液及壳聚糖溶液进行层层交替自组装,通过精确控制微囊膜的孔径,使其可以通过牛血清白蛋白(BSA),但不能通过免疫球蛋白IgG,从而制备出具有免疫隔离性能的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
参考文献[中华器官移植杂志,2003,24(2):86-88]的方法,制备出包埋有动物细胞的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,在此基础上,分别与海藻酸钠溶液及壳聚糖溶液进行层层交替自组装,通过精确控制微囊膜的孔径,使其可以通过牛血清白蛋白(BSA),允许分子量小于BSA的营养物质通透,保证细胞生长代谢需求,但不能通过免疫球蛋白IgG,从而制备出具有免疫隔离性能的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。
参与层层交替自组装的海藻酸钠溶液的配制方法是:海藻酸钠溶于0.3-0.9%NaCl[通常可为0.4-0.85%(w/v)]溶液中,海藻酸钠浓度为0.05-0.5%(w/v),反应温度在10-40℃,通常为室温,反应时间在1-20分钟。采用低浓度的海藻酸钠溶液,是由于自组装反应的反应速度随溶液浓度增高而加快,而海藻酸钠又是一种高分子材料(分子量在40-2000kDa),因此,高浓度溶液会导致大量海藻酸钠分子在瞬间完成自组装反应,但海藻酸钠分子上残留很多未参与自组装反应的片段堆积在膜表面,从而影响微胶囊膜表面的光滑度。因此,本专利提出采用低浓度的海藻酸钠溶液能够大大降低自组装的反应速度,使得参与反应的海藻酸钠分子有足够时间使分子上各单体均参与自组装反应,减少在膜表面的堆积,并通过控制反应时间来调整参与自组装反应的反应量,一方面通过控制反应量来调整膜孔径,另一方面可以提高微胶囊表面的光滑度。
参与层层交替自组装的壳聚糖溶液的配制方法是:壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,壳聚糖浓度为0.01-0.5%[通常可为0.05-0.5%(w/v)],反应温度在10-40℃,通常为室温,反应时间在1-20分钟。采用低浓度的壳聚糖溶液的理由与采用低浓度海藻酸钠的理由一样,通过降低自组装的反应速度,使得参与反应的壳聚糖分子有足够时间使分子上各单体均参与自组装反应,减少在膜表面的堆积,并通过控制反应时间来调整参与自组装反应的反应量,一方面通过控制反应量来调整膜孔径,另一方面可以提高微胶囊表面的光滑度。同时,由于壳聚糖材料成本高于海藻酸钠,尤其用于细胞移植用的壳聚糖材料都需要经过纯化、改性等预处理过程,导致壳聚糖材料价格较高。而在本专利应用过程中,由于浓度大大降低,导致投料量明显减少,大大降低了工艺成本。
参与层层交替自组装的壳聚糖材料的脱乙酰度90-98%,分子量为1-12万。要求上述壳聚糖材料是因为高脱乙酰度的壳聚糖溶液能提供更多的自组装反应位点,提高反应效率,节省材料用量,降低成本。另外,由于高分子量的壳聚糖分子在自组装反应过程中,仅部分片段参与反应,大部分没参与反应的片段堆积在膜表面,影响膜的光滑度,且会导致自组装的壳聚糖整层剥脱。因此,本专利选用低分子量区间的壳聚糖分能充分参与自组装反应,提高膜的光滑度和完整性,同时,通过控制分子量及其分布,可以有效控制膜孔径,实现微胶囊膜阻隔IgG的同时,允许BSA通透。
层层交替自组装最后反应的溶液必须是海藻酸钠溶液。层层交替自组装过程中,各层之间需要生理盐水洗涤。
本发明的有益效果是:
1、本发明所用的海藻酸钙凝胶微球与壳聚糖溶液及海藻酸钠溶液层层交替自组装的方法反应条件温和,有利于移植物的活性保存。
2、本发明利用层层交替自组装技术制备的ACA微胶囊可将分子量大于IgG的大分子免疫物质隔离在微胶囊外,使ACA微胶囊用于细胞移植时使囊内细胞或组织免受机体免疫系统攻击并杀死。同时,允许分子量小于BSA的营养物质通透,保证细胞生长代谢需求。
附图说明
图1为实施例1中通过层层交替自组装技术制备的具有免疫隔离性能的ACA微胶囊的显微镜照片。
图2为实施例1中通过层层交替自组装技术制备的具有免疫隔离性能的ACA微胶囊浸于FITC-IgG溶液中6小时后得激光共聚焦照片。
图3为实施例1中通过层层交替自组装技术制备的具有免疫隔离性能的ACA微胶囊浸于FITC-IgG溶液后囊内的FITC-IgG荧光强度随时间的变化曲线。囊内荧光强度为零,且随时间无变化。
图4为实施例1中FITC-BSA由囊外向囊内的扩散曲线。
图5为比较例1中经复凝聚反应制成的ACA微胶囊浸于FITC-IgG溶液中6小时后得激光共聚焦照片。
图6为比较例1中复凝聚反应制成的ACA微胶囊浸于FITC-IgG溶液后囊内的FITC-IgG荧光强度随时间的变化曲线。囊内荧光强度随时间逐渐增大。
具体实施方式
将海藻酸钙凝胶微球转入壳聚糖溶液进行壳聚糖在海藻酸钙凝胶微球内的自组装成膜,生理盐水洗涤之后转入海藻酸钠溶液进行海藻酸钠的自组装成膜,生理盐水洗涤后再次进行壳聚糖、海藻酸钠的自组装,生理盐水洗涤后即生成具有免疫隔离性能的ACA微胶囊。
实施例1
1、参考文献[中华器官移植杂志,2003,24(2)::86-88]的方法,制备出包埋有胰岛细胞的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,将微胶囊浸入浓度0.05%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应20分钟。
2、用生理盐水洗涤后将步骤1中的微胶囊浸入浓度为0.05%(w/v)、分子量10万、脱乙酰度95%、pH6.0的壳聚糖溶液中,反应20分钟。
3、生理盐水洗涤后,再浸入浓度0.05%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应20分钟。
4、生理盐水洗涤并保存于生理盐水中(图1)。
5、取约300-500个微胶囊于载玻片上,吸干表面水分,滴加0.5mL浓度为2.0mg·mL-1的FITC荧光标记蛋白溶液(微囊与蛋白溶液的体积比约为1∶50)。避光条件下用激光共聚焦扫描显微镜对微胶囊和蛋白溶液进行每隔10min间隔的连续扫描(图2),可得微胶囊内的固定区域的平均荧光强度的时间变化曲线。制备的微胶囊可隔离IgG(图3),并允许BSA扩散入微胶囊(图4)。
实施例2
1、参考文献[中华器官移植杂志,2003,24(2)::86-88]的方法,制备出包埋有肝细胞HepG2的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,将微胶囊浸入浓度0.1%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应10分钟。
2、用生理盐水洗涤后将步骤1中的微胶囊浸入浓度为0.2%(w/v)、分子量6万、脱乙酰度95%、pH6.5的壳聚糖溶液中,反应10分钟。
3、生理盐水洗涤后,再浸入浓度0.1%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应10分钟。
4、生理盐水洗涤并保存于生理盐水中。
5、按照实例1步骤5操作,考察微胶囊的免疫隔离性能,结果表明,FITC-IgG在囊内荧光强度为零,且随时间无变化,说明该条件制备的微胶囊具有免疫隔离性能,且允许FITC-BSA扩散入微胶囊。
实施例3
1、参考文献[中华器官移植杂志,2003,24(2)::86-88]的方法,制备出包埋有胚胎干细胞的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,将微胶囊浸入浓度0.1%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应10分钟。
2、用生理盐水洗涤后将步骤1中的微胶囊浸入浓度为0.2%(w/v)、分子量2万、脱乙酰度98%、pH6.8的壳聚糖溶液中,反应5分钟。
3、生理盐水洗涤后,再浸入浓度0.1%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应10分钟。
4、生理盐水洗涤后重复步骤2。
5、生理盐水洗涤后重复步骤3。
6、生理盐水洗涤并保存于生理盐水中。
7、按照实例1步骤5操作,考察微胶囊的免疫隔离性能,结果表明,FITC-IgG在囊内荧光强度为零,且随时间无变化,说明该条件制备的微胶囊具有免疫隔离性能,且允许FITC-BSA扩散入微胶囊。
比较例1:经复凝聚反应制备的ACA微胶囊
1、参考文献[中华器官移植杂志,2003,24(2)::86-88]的方法,将包埋有肝细胞HepG2的海藻酸钙凝胶微球与壳聚糖溶液复凝聚反应,制备成海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。
2、按照实例1步骤5操作,考察微胶囊的免疫隔离性能,结果可得微胶囊在FITC-IgG溶液中6小时,囊内呈现明显的荧光(图5),囊内的固定区域的平均荧光强度的随时间增大(图6)。说明制备的ACA微胶囊不能隔离IgG。
比较例2:
1、参考文献[中华器官移植杂志,2003,24(2)::86-88]的方法,制备出包埋有肝细胞HepG2的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊,将微胶囊浸入浓度0.1%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应10分钟。
2、用生理盐水洗涤后将步骤1中的微胶囊浸入浓度为0.2%(w/v)、分子量20万、脱乙酰度95%、pH6.5的壳聚糖溶液中,反应10分钟。
3、生理盐水洗涤后,再浸入浓度0.1%(w/v)的海藻酸钠溶液中,反应10分钟。
4、生理盐水洗涤并保存于生理盐水中。
5、按照实例1步骤5操作,考察微胶囊的免疫隔离性能,结果表明,FITC-IgG在囊内荧光强度随时间不断增大,说明该条件制备的微胶囊不能隔离IgG。
Claims (3)
1.一种具有免疫隔离性能的微胶囊的制备方法,其特征在于:在复凝聚法制备的包埋有细胞的海藻酸钙-壳聚糖微胶囊的基础上,分别与海藻酸钠溶液及壳聚糖溶液通过层层交替自组装的方法,精确控制微囊膜的孔径,使其可以通过牛血清白蛋白BSA,但不能通过免疫球蛋白IgG,从而制备出具有免疫隔离性能的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊;
具体操作过程为,
1)将包埋有细胞的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊浸入海藻酸钠溶液中,反应1-20分钟,反应温度在10-40℃,取出,用生理盐水洗涤;
海藻酸钠溶液的配制方法是:海藻酸钠溶于0.3-0.9% w/v NaCl溶液中,海藻酸钠浓度为0.05-0.5% w/v;
2)将步骤1)中的微胶囊浸入壳聚糖溶液中,反应1-20分钟,反应温度在10-40℃,取出,用生理盐水洗涤;
壳聚糖溶液的配制方法是:壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,壳聚糖浓度为0.01-0.5%;
3)交替重复步骤1)和步骤2)的过程0-5次;
4)层层交替自组装最后反应的溶液必须是海藻酸钠溶液,即层层交替自组装的最外层为海藻酸钠层;因此再重复步骤1)的过程,得成品,生理盐水洗涤并保存于生理盐水中。
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:参与层层交替自组装的海藻酸钠溶液的配制方法是:海藻酸钠溶于0.4-0.85% w/vNaCl溶液中,海藻酸钠浓度为0.05-0.5% w/v。
3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
参与层层交替自组装的壳聚糖溶液的配制方法是:壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液,壳聚糖浓度为0.05-0.5% w/v,壳聚糖材料的脱乙酰度90-98%,分子量为1-12万。
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