KR20040006197A

KR20040006197A - 유전자 수송체로서의 생체 적합성 혈구 세포

Info

Publication number: KR20040006197A
Application number: KR1020020040190A
Authority: KR
Inventors: 오유경; 변향민; 고정재; 김정목; 박상은
Original assignee: 오유경
Priority date: 2002-07-11
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2004-01-24
Also published as: KR100478791B1

Abstract

본 발명은 유전자를 함유하는 유전자 수송체용 혈구 세포에 관한 것으로, 구체적으로 적혈구 세포 내부로 목적하는 유전자를 봉입하여 체내로 전달된 유전자의 혈중 농도 지속에 효과적인 유전자 수송체에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 함유 혈구세포는 목적하는 유전자를 혈구세포 내부에 함유하여 외부의 분해효소로부터 유전자를 안전하게 보호할 뿐 아니라 천연 생체막 구조를 가지므로 체내에서 매우 안전하고 투여된 유전자의 혈중 농도를 장시간 지속시키는 특징을 가지고 있어 목적하는 유전자의 수송체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유전자 수송체로서의 생체 적합성 혈구 세포{ERYTHROCYTE GHOSTS CONTAINING A DESIRED GENE FOR BIOCOMPATIBLE GENE DELIVERY SYSTEMS}

본 발명은 외래 유전자 DNA를 함유하는 유전자 수송체용 혈구 세포에 관한 것으로, 구체적으로는 적혈구 세포의 세포막에 삼투압 및 전기적인 자극을 주어 형성한 미세공(micropore) 내로 유전자를 도입하고 상기 방법으로 외래 유전자가 도입된 혈구세포를 체내 투여하여 혈중 유전자 지속시간을 증강시키는 용도에 관한 것이다.

유전자 전달 기술분야에서는 비 바이러스성 유전자 전달체로 양이온성 인지질(cationic lipid)을 이용하여 제조된 양이온성 리포솜 (cationic liposome)이나 폴리 라이신 (poly-L-lysine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)들이 중점적으로 연구되고 있다. 이러한 비 바이러스성 유전자 전달체들은 면역 항체 생성 유도능이 단백질에 비하여 매우 낮은 지질이나 고분자를 소재로 사용하여 치료용 유전자의 반복투여가 가능한 장점이 있다. 그러나, 현재 비 바이러스성 수송체의 주요 구성인자로 사용되는 대부분의 양이온성 고분자나 양이온성 지질류는 세포 독성 등으로 생체 내 안전성이 확립되지 않은 문제점이 있다 (Scheule et al.;Hum. Gene Ther., 8, pp689-707,1997). 기존의 비 바이러스성 유전자 전달기술의 문제점으로는 양이온성 인지질 수송체를 사용하여 유전자를 실험동물에 전신 투여시 폐 조직에서의 염증반응이 관찰된 바 있으며 (Yew et al.;Hum. Gene Ther., 10, pp223-234, 1999), 양이온성 리포솜과 유전자의 복합체를 정맥 투여시 여러 가지의 양이온성 인지질의 종류와 관계없이 백혈구감소증(leukopenia), 혈소판감소증 (thrombocytopenia), 혈중 트랜스아미네이즈(transaminase)의 농도 증가 등의 급성 독성이 보고된 바 있다(Tousignant et al.;Hum. Gene Ther., 11, pp2493-2513, 2000).

따라서 양이온성 유전자 수송체를 사용하여 치료효과를 나타내는 정도의 양으로 유전자를 전신 투여했을 때, 가장 큰 한계점 중의 하나로 유전자 수송체의 독성 문제가 제기되므로, 최근 유전자 수송체 분야에서는 세포 독성이 감소된 유전자 수송체의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)의 경우, 그 분자량을 감소시켜 세포독성을 감소시키려는 연구가 최근 발표되었고(Bieber and Elsasser;Biotechniques 30, pp74-81, 2001), 실리카 성분의 미립자를 사용하여 세포독성을 감소시킨 유전자 수송체를 개발하려는 연구도 보고된 바 있으며(Kneuer et al.;Bioconjug. Chem. 11, pp926-932, 2000), 양이온성 잔기(side chain)를 변화시킨 고분자를 새로 합성하여 세포 독성을 감소시키려는 연구도 발표되었다(Putnam et al.;P.N.A.S. U.S.A. 98, pp1200-1205, 2001).

이런 기존 기술의 입자성 비 바이러스성 수송체들은 세포독성 외에도 수송체들의 입자크기로 인하여 전신 투여시 다량의 유전자들이 단시간 내에 간(liver)이나 세망 내피계(reticuloendothelial system)로 분포되므로(Oh et al.;Gene Ther. 8, pp1587-1592, 2001) 혈중 체류시간이 매우 짧은 문제점이 있다.

혈구 세포 중 적혈구를 이용한 수송체(erythrocyte ghost particle)는 천연 생체막 성분의 혈구 세포입자를 이용한 것으로서, 체내 독성이 없으며 생분해성인 장점이 있다. 혈구세포의 이러한 장점을 이용하여 혈구세포 내부의 물질을 모두 제거한 혈구 세포입자(ghost particle)를 저분자량의 약물을 수송할 수 있는 수송체로서의 가능성이 연구되어 왔다(Grimaldi et al.;Res. Virol.,148,pp177-180, 1997). 적혈구 수송체는 항암제인 독소루비신(doxorubicin) 수송체 (Mishra and Jain;Drug Deliv., 7, pp155-159, 2000), 엔알라프리랏트(enalaprilat)수송체(Tajerzadeh and Hamidie;Drug Dev. Ind. Pharm., 26, pp1247-1257, 2000)로서 보고된 바 있다. 적혈구 수송체의 또 다른 장점은 세포 내에 약물이나 효소를 봉입시키고 다시 혈중으로 전신투여한 경우에도 혈중 체류시간이 다른 입자성 수송체에 비하여 현저히 길다는 것이다. 그러나, 이제까지의 혈구세포 봉입 기술은 모두 분자량 1,000 달톤이하의 저 분자량의 물질에 대하여 적용된 기술로서, 현재 분자량 50만 달톤 이상의 고분자량 물질인 유전자를 혈구세포 내로 봉입하는 기술 및 이를 이용하여 생체내 투여된 유전자의 혈중 지속시간을 조절하려는 기술은 아직 공개된 바 없다.

이에 본 발명자들은 생체 독성이 심각한 비 바이러스성 유전자 수송체의 문제점들을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 당 분야에서 분자량 1,000 달톤 이하의 저분자량 합성 의약품의 수송체로서의 이용가능성이 주로 연구되어 온 혈구세포 입자를 분자량 50만 달톤 이상의 고분자인 유전자의 체내 수송체로 사용하기 위하여 혈구 세포에 단시간의 자극을 주어 형성한 미세공 (micropore) 내부로 유전자를 도입하는 방법을 개발하였으며 상기 방법으로 유전자를 봉입한 혈구세포를 체내에 투여한 결과 유전자의 혈중 농도 지속시간이 현저히 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 체내 투여시 안전하고 혈중 지속시간이 증강되며 핵산 분해효소에 의해 목적 유전자가 분해되는 것을 방지할 수 있는, 외래 유전자가 함유된 생체 적합성 비 바이러스성 유전자 수송체로서의 혈구세포를 제공하는 것이다.

도 1 은 혈구 세포 봉입용 인터루킨-2 유전자와 정량용 내부 표준 유전자의 제작과정이고,

도 2a 는 일정량의 검체를 표준유전자와 함께 정량적 중합효소연쇄반응 (quantitative PCR)을 수행한 다음 전기영동한 젤 사진이고,

도 2b 는 이미지 분석기로 도 2a의 젤 상의 DNA 밴드 밀도를 분석하여 작성한 검량선 그래프이며,

도 3 은 혈구세포 내로 유전자를 봉입하는 방법에 따른 플라스미드 전기 영동 양상이고,

도 4a 는 형광 염료로 표지화되지 않은 유전자가 봉입된 적혈구 세포를 위상차 현미경으로 관찰(×1000)한 사진이고,

도 4b 는 도 4a의 적혈구 세포를 형광현미경으로 관찰(×1000)한 사진이고,

도 4c 는 형광 염료로 표지화된 유전자가 봉입된 적혈구 세포를 위상차 현미경으로 관찰(×1000)한 사진이며,

도 4d 는 도 4c의 형광 염료로 표지화된 유전자를 함유한 적혈구 세포를 형광 현미경으로 관찰(×1000)한 사진이고,

도 5 는 도 2b 에서와 같은 검량선을 이용하여 본 발명의 유전자 함유 혈구 세포와 미봉입 유전자를 각각 마우스에 투여한 경우의 시간에 따른 혈중 농도를 정량적으로 비교한 결과이고,

도 6 은 도 5 의 혈중 농도 곡선에 대하여 농도 곡선하 면적 (area under the curve)을 본 발명의 유전자 함유 혈구 세포와 미봉입 유전자에 대해 각각 계산하여 비교한 결과이고,

도 7a 는 삼투압 충격만으로 유전자를 봉입한 혈구세포의 사진이고,

도 7b 는 삼투압 충격 및 전기적 충격을 병행하여 유전자를 봉입한 혈구세포의 사진이고,

도 8 은 미봉입 유전자, 혈구세포 봉입 유전자, 혈구세포 만을 각각 투여한 경우의 혈중 유전자 발현량을 정량성 RT-PCR로 측정한 결과이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 혈구 세포 내부에 목적하는 외래 유전자 DNA를 함유한 유전자 수송체로서의 혈구세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈구세포 내부에 목적하는 외래 유전자를 봉입하여 혈중 농도 지속에 효과적인 유전자 수송체를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈구세포 입자 내로 분자량 50만 달톤 이상의 외래 유전자를 함유하는 유전자 수송체로서의 혈구세포 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 외래 유전자를 함유하는 유전자 수송체로서의 혈구세포 제조방법을 설명하면,

유전자를 함유하는 저장액에 혈구세포를 분산시키는 제 1 단계;

이어서 제 1단계의 혈구세포에 초단시간의 전기적 충격을 주어 형성된 미세공 내부로 유전자를 도입하는 제 2 단계;

혈구 세포 분산액의 삼투압을 등장화하고 혈구세포막을 안정화시키는 제 3 단계;

상기 제 3단계에서 혈구 세포내로 봉입된 유전자와 미봉입 유전자를 분리하는 제 4 단계로 구성된 단계들을 포함한다.

본 발명에서는 혈구 세포 내부로 봉입하는 유전자로서 3.5kb (분자량, 약1,155 킬로달톤)의 인터루킨-2 유전자를 이용하였다.

제 1 단계에서 혈구 세포 내부로 봉입하는 유전자로서는, 발현시 치료효과를 나타내는 인터루킨-2, 인터루킨-12 등의 사이토카인 유전자, 항-HIV-유전자 등의 항 감염질환 유전자, 란테스(RANTES) 등의 케모카인(chemokine) 유전자, H19 및 p53 등의 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), p21 등의 세포 주기 관여 유전자 또는 flk-1 등의 혈관신생 억제 유전자(angiogenesis inhibitor)가 사용될 수 있다.

또한 제 1 단계에서 혈구 세포로는 마우스, 랫트, 토끼, 양, 사람의 혈액으로부터 분리한 적혈구 세포가 사용될 수 있다.

제 2 단계에서 단시간 내에 전기적 충격으로 유전자를 도입하는 방법으로는 일렉트로포레이션(electroporation)방법이 사용될 수 있다.

제 3 단계에서는 고장액의 염화나트륨을 가하여 등장상태로 용액의 삼투압을 조절해 주는 기술을 사용하였으며, 삼투압을 조절해주는 물질로는 염화나트륨 이외에도 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 수크로즈(sucrose), 프룩토즈(fructose) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 실시예로서 사이토카인 유전자인 인터루킨-2 유전자를 적혈구 세포에 봉입 제조하였다.

혈구세포내부로 거대 분자량의 유전자를 봉입하는 과정에서, 저장액에 혈구세포를 분산하여 삼투압 충격 및 전기적 충격을 모두 병용하여 수행한 경우의 유전자 봉입 정도가 삼투압 충격 단계만을 수행한 경우와 전기적 충격 단계만을 수행한경우보다 효율적인 것으로 관찰되었다(도 3 참조).

또한 혈구 세포 내부로 유전자가 실질적으로 봉입되었는지를 가시적으로 확인하기 위하여 유전자를 형광 표지화(Alexa Fluor 546 kit™, Molecular Probe사, 미국)하고, 표지화된 유전자를 비표지화된 유전자와 혼합하여 제 1 단계에서 제 4단계까지를 모두 수행하고 형광 현미경하에서 유전자의 존재를 관찰하였다. 그 결과 혈구세포 내에 존재하는 형광유전자를 확인하였다 (도 4a, 4b, 4c 및 4d 참조).

적혈구 세포에 유전자를 봉입하는 과정에서 삼투압 충격만을 가한 경우와 저장액 중에서의 전기적 충격을 모두 거친 경우의 혈구 세포의 모양은 위상차 현미경으로 관찰한 바 서로 큰 차이를 나타내지 않았다(도 7a, 7b 참조).

또한, 본 발명은 상기 혈구세포 입자 내에 목적하는 외래 유전자를 봉입하여 혈중 유전자 발현 지속에 효과적인 유전자 수송체를 제공한다 (도 8 참조).

본 발명에서는 상기와 같이 제조된 혈구세포 입자를 유전자 수송체로 사용하기 하여, 혈구세포 입자로 투여된 유전자의 생체 내 혈중 지속시간을 유전자 단독으로 투여된 경우와 정량적으로 비교해보았다.

인터루킨-2 유전자를 혈구세포 내로 봉입시킨 것과 봉입시키지 않은 것을 실험용 생쥐의 꼬리 혈관 (tail vein)에 정맥주사하고 혈중 농도 변화를 시간별로 측정한 결과, 미봉입상태로 투여한 유전자는 투여 후 20분 이내에 혈중농도가 급감한 반면, 혈구세포에 봉입한 유전자를 투여한 결과 혈중 체류 시간이 현저히 증가되어 혈중 농도가 유지되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

도 6의 혈중 농도 곡선에 대하여 사다리꼴구적계산법(trapezoidal rule)을사용하여 혈중 농도 곡선하 면적을 계산한 결과, 혈구세포를 이용하여 투여한 경우의 혈중 농도 곡선하 면적이 미봉입 유전자로 투여한 경우의 혈중 농도 곡선하 면적보다 26배 높아, 혈구세포내로 봉입한 유전자의 경우에 혈중 농도가 높게 지속될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서는 바람직한 실시예로서 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 유전자를 목적 유전자로 사용하여 상기 혈구세포 입자 내로 봉입하였다.

본 발명의 혈구세포 입자를 유전자 수송체로 사용하는 경우에는 천연 생체막 성분의 입자를 사용하는 것이므로 기존에 사용되고 있는 바이러스성 수송체 및 비바이러스성 수송체에서 지적되고 있는 체내 안전성의 문제를 해소할 수 있을 뿐 아니라, 혈중 체류시간이 긴 혈구 세포의 특징을 가지고 있기 때문에 기존의 비 바이러스성 수송체에서 한계점으로 지적된 짧은 혈중 체류시간의 단점을 보완시킬 수 있다. 또한, 혈구세포 입자 내부에 목적하는 유전자를 함유하여 이를 체내로 수송하므로 체내 투여된 유전자가 유전자 분해효소에 의하여 신속히 분해되는 현상을 방지하고 수송된 유전자의 안정성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 혈구세포입자 봉입용 유전자 및 정량용 돌연변이 플라스미드의 제작

우선 혈구 세포 내부로 봉입될 유전자로 인터루킨-2 (interleukin-2, IL-2)유전자를 얻기 위하여, IL-2 유전자의 529 염기쌍(bp) DNA 단편 (포항공과대학교, 성영철 박사)을 pVAX 발현 벡터(Invitrogen사, 미국)의 다중 클로닝 부위 (multicloning site) 내 NheI/BamHI 제한효소 부위에 삽입하여 플라스미드 pVAX/IL-2를 제작한 후 (도 1 참조), 이를 대장균 (Escherichia coli) DH5α에 형질전환하여 IL-2를 발현하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 퀴아젠 메가 프렙 키트 (Qiagen Mega Prep kit, Qiagen사)를 이용하여 상기 형질전환 대장균으로부터 pVAX/IL-2 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하였다.

인터루킨-2 유전자를 정량하기 위한 내부 표준 유전자 돌연변이 플라스미드(mutant plasmid)를 제작하기 위하여, pVAX/IL-2를 NheI과 HindⅢ로 잘라낸 후 173 bp가 소실된 IL-2의 유전자 조각 (fragment)을 얻은 다음, 이를 원 pVAX 벡터 내로 다시 삽입하여 pVAXdmIL-2를 제작하였다(도 1 참조).

실시예 2. 유전자 농도 측정을 위한 검량선의 작성

검체 중에 존재하는 유전자의 농도를 경쟁 및 정량적 중합 효소 연쇄반응(competitive and quantitative PCR) 방법으로 정량적인 측정을 하기 위하여, 실시예 1에서 분리·정제된 여러 가지의 기지의 농도의 pVAXdmIL-2를 일정량의 미지의 농도의 pVAXmIL-2와 같이 혼합하고 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응의 프라이머로서는 pVAX 벡터의 염기서열 668-689번 및 786-808번 부위를 각각 특이적으로 인식하는 서열번호 1로 기재되는 센스 프라이머와 서열번호 2로 기재되는 안티센스 프라이머를 이용하였다. 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 유전자의 증폭은 94℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃에서 40초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 33회 반복 실시한 후 72℃에서 5분간 추가로 반응시켰다. 이로부터 증폭된 중합 효소 연쇄반응 산물을 2% 아가로오즈 젤(agarose gel) 상에서 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 pVAXmIL-2 벡터는 약 669 bp 위치에서 DNA 밴드가 검출되고 pVAXdmIL-2 벡터는 496 bp 위치에서 DNA 밴드가 검출되었으며(도 2a 참조), 내부 표준 물질 (internal standard, IS)로 사용된 돌연변이 유전자의 기지 농도의 로그값을 x축으로 하고 내부 표준물질 돌연변이 유전자와 인터루킨-2 유전자의 밴드 밀도 비율의 로그값을 y 축으로 표시한 로그-로그 플랏트(log-log plot)에서 직선성의 검량선이 작성되었다 (도 2b 참조).

실험예 1. 혈구세포내부로의 유전자 봉입 방법 비교

본 발명의 혈구 세포를 유전자 수송체로 사용하기 위하여 혈구세포 내에 목적하는 유전자를 효율적으로 봉입하는 조건 비교 실험을 수행하여, 저장액 하에서 삼투압 충격 및 전기적 충격을 동시에 가하여 유전자 봉입을 수행한 경우에 보다 많은 양의 유전자를 봉입시킴을 확인하였다.

우선, 혈구 세포 내부로 삽투압 충격만을 주어 유전자를 봉입시킨 경우와, 전기적 충격만으로 유전자를 봉입시킨 경우, 그리고 저장액 하에서 삼투압 충격 및 전기적 충격을 동시에 단시간 가하여 유전자를 봉입시킨 경우를 비교하였다.

삼투압 충격만을 사용하는 경우의 방법으로는 ICR 마우스(국제 실험 동물 센터, 한국)의 혈액에서 적혈구 세포를 분리하고 인산 완충용액(phosphate bufferedsaline)으로 3회 수세(washing)한 다음, 삼투압이 낮은 저장성 용해 완충액(hypotonic lysing buffer, 5 mM NaH₂PO₄.H₂0, 5 mM Na₂HPO₄.7H₂0, 5 mM MgCl₂.6H₂0)에 혈구세포와 실시예 1의 IL-2 유전자를 포함하고 있는 pVAXmIL-2 플라스미드 DNA를 각각 0.5㎎/㎖, 2 ㎎/㎖ 농도로 가하고 얼음 위에서 10분간 반응을 진행한 다음, 삼투압을 290 mOsm로 증가시키는 염화나트륨 성분의 재봉입 완충용액(resealing buffer, NaCl 4.5 %)을 적량 가하여 37℃에서 30분간 둔 후, 3회 수세하여 IL-2 유전자가 봉입된 혈구세포를 분리하였다.

혈구 세포에 전기적 충격만을 가하여 유전자를 봉입한 경우에는 ICR 마우스의 혈액에서 적혈구 세포를 분리한 다음 3회 수세하고, 2 ㎎/㎖ 농도의 IL-2 유전자와 혈구세포를 큐벳(0.2 cm electrode gap, BioRad사)에 넣어, 일렉트로포레이터(electroporator. Gene Pulser II, BioRad사)로 전기자극(조건; 0.1 내지 0.5 voltage, 0.25 capacity)을 가하였다. 전기자극 과정이 끝난 다음 세포를 수회 수세하여 유전자가 봉입된 혈구세포를 분리하였다.

혈구 세포에 삼투압 충격 및 전기적 충격을 모두 가하여 유전자를 봉입한 경우에는 ICR마우스의 혈액에서 적혈구 세포를 분리한 다음 3회 수세하고, 삼투압이 낮은 저장성 용해 완충액(5 mM NaH₂PO₄.H₂0, 5 mM Na₂HPO₄.7H₂0, 5 mM MgCl₂.6H₂0)내에 IL-2 유전자(2㎎/㎖)와 혈구세포를 가하고 큐벳에 넣어, 일렉트로포레이터로 전기 자극(조건; 0.3 voltage, 0.25 capacity)을 가하였다. 전기 충격이 끝난 다음 염화나트륨을 첨가하여 용액을 등장화 한 다음 37℃에서 1시간 방치하여 세포막을안정화시킨 다음, 수회 원심분리기 (10,000 rpm, 5분)로 수세하여 유전자가 봉입된 혈구세포를 분리하였다.

이상과 같이 다양한 방법으로 유전자가 봉입된 혈구세포에서 IL-2 유전자를 추출하기 위하여 혈구세포 100㎕를 1㎖의 증류수에 분산시키고 100℃에서 가열하여 혈구세포막을 파괴한 다음 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 각 봉입방법에 따라 봉입된 유전자의 양을 상층액 중으로 방출되어 수득된 유전자의 농도로서 비교하고, 또한 혈구세포 내로 봉입된 유전자가 원래의 크기를 유지되는지 확인하기 위하여, 분리한 유전자를 1% 아가로오즈 젤에 전기영동하고 형광물질인 브롬화에티디움(EtBr)로 염색하여 3.5Kb의 유전자 크기를 확인하였다 (도 3 참조). 시료 1은 0.5㎎/㎖의 유전자를 삼투압충격만으로 혈구세포내로 봉입한 경우의 플라스미드 DNA 이고, 시료 2는 2㎎/㎖의 유전자를 삼투압충격만으로 혈구세포내로 봉입한 경우의 플라스미드 DNA 이고, 시료 3은 2㎎/㎖의 유전자를 전기적 충격만으로 혈구세포내로 봉입한 경우의 플라스미드 DNA 이며, 시료 4는 2㎎/㎖의 유전자를 삼투압 충격 및 전기적 충격을 가하여 혈구세포내로 봉입한 경우의 플라스미드 DNA 전기영동 양상으로, 시료 4의 경우 적혈구 내로 봉입되어 수득된 DNA 양이 가장 높은 것으로 나타났으며, 도 3의 시료 1, 시료 2, 시료 3 및 시료 4에서 보는 바와 같이 pVAXmIL-2의 플라스미드 DNA가 파괴되지 않고 크기가 원래대로 유지됨을 확인하였다.

도 3 에서 나타나는 것처럼 혈구세포 내부로의 유전자의 봉입율을 증강시키는 방법으로 삼투압 충격만을 이용하거나 전기적 충격만을 단독으로 각각 사용하는것보다 두 방법을 같이 병용하는 기술을 이용한 경우, 소량의 유전자를 가지고도 보다 높은 양의 유전자를 효율적으로 봉입시킬 수 있었다.

실험예 2. 혈구 세포내로 봉입된 유전자의 존재 확인

혈구세포 내부로의 유전자 봉입을 가시적으로 확인하기 위하여, DNA를 형광물질표지 후 삼투압충격과 전기적 충격을 가하여 혈구 세포내로 도입한 다음, 유전자가 봉입된 것을 확인하였다.

1차적으로 IL-2 유전자를 함유하고 있는 pVAXmIL-2플라스미드 DNA를 DNA형광표지키트(ARES Alexa Fluor 546 DNA labeling kit, Molecular Probe사, 미국)를 사용하여 형광물질로 표지하였고, 알렉사 플루어 546 염료(Alexa Fluor 546 dye)로 형광 표지화된 유전자는 DNA 정제 분리용 컬럼 (Qiaquick PCR purification kit column, Qiagen사, 미국)을 이용하여 미 반응된 형광 물질로부터 분리 정제하였다. 형광 염료로 표지화된 IL-2 유전자를 표지화되지 않은 IL-2 유전자에 1:1000의 비율로 혼합 사용하여 삼투압 충격과 전기적 충격 병용 방법으로 혈구세포 내부에 봉입하고, 형광 현미경(Nikon H-III, Nikon사, 일본)으로 알렉사 플루어 546 염료(Alexa Fluor 546 dye)의 흡수(excitation, 555 nm) 및 여기(emission, 570 nm) 파장에 적합한 필터조합에서 1000배 확대 배율로 혈구세포 내 유전자의 봉입을 관찰하였다(도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d 참조).

그 결과, 형광 염료로 표지화되지 않은 유전자가 봉입된 혈구세포는 형광을 나타내지 않았으나(도 4b 참조), 형광 염료로 표지화된 유전자를 함유한 혈구세포는 형광을 나타내어(도 4d 참조), 본 방법으로 고분자량의 유전자를 혈구세포내부로 도입시키는 것이 가능함을 확인하였다.

실험예 3. 혈구세포에 봉입된 형태로 투여된 유전자의 혈중 농도 변화

ICR 마우스의 꼬리 혈관(tail vein)내에 혈구세포로 봉입된 IL-2 유전자와 미봉입된 IL-2 유전자를 각각 동일한 양으로 50㎍ 씩 투여하였다. 시간에 따라 30 ㎕의 혈액을 모세관(capillary tube)을 사용하여 채혈하고 혈청을 얻은 다음, 공지의 방법 (Zerbini et al.,J. Med. Virol.59:239-244, 1999)에 따라 100℃ 온도에서 끓여 혈액 중에 존재하는 유전자 분해효소를 불활성화한 다음, 1㎕의 검체를 각각 다른 농도의 1㎕의 pVAXdmIL-2와 같이 혼합한 다음 실시예 2에서 기재된 조건하에서 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응의 산물을 2% 아가로오즈 젤 상에서 분리한 다음 이미지 분석기(Vilber Lourmat, 프랑스)를 이용하여 젤 상에서의 DNA 밴드의 밀도(density)를 측정하고 실시예 2에서와 같은 방법으로 검량선을 작성하였다. 검량선에 기초하여 검량선의 X-축 절편과 만나는 점을 계산하여 검체 중 pVAXmIL-2의 농도를 정량적으로 계산하여 유전자의 혈중 농도 변화를 측정하였다.

이 결과로 혈구세포 내부에 봉입된 형태로 IL-2 유전자가 투여된 경우, 혈중 체류시간이 현저히 증가되어 투여 후 150분 이후에도 혈중 농도가 0.01 ng/㎖이상으로 유지됨을 확인하였으며, 미봉입된 상태로 투여된 유전자의 경우에는 투여 후 20분 이내에 혈중 농도가 0.01ng/㎖ 이하로 급감하여, 혈구세포내로 봉입된 유전가가 미봉입상태인 유전자보다 혈중 체류 시간이 현저히 증가하는 것이 관찰되었다(도 5 참조).

미봉입 상태의 유전자와 혈구 세포 내부로 봉입된 상태로 투여된 유전자의 혈중 농도 곡선하 면적(area under the curve : AUC)을 사다리꼴 구적 계산법(Trapezoidal method, Gibaldi and Perier,Pharmacokinetics, Dekker, 2nd Ed., 1982)을 이용하여 계산하였고, 그 결과, 미봉입 상태로 투여된 유전자의 경우 혈중 농도 곡선하 면적이 993 ± 645 ng/㎖·분이었으며, 혈구세포를 이용하여 투여한 경우의 혈중 농도 곡선하 면적은 26091 ± 4405 ng/㎖·분으로서 미봉입된 상태로 투여된 경우의 유전자 보다 26배 정도 높은 것을 확인하였다(도 6 참조). 이로 혈구세포내로 봉입한 유전자의 경우에 미봉입된 유전자보다 혈중 농도가 높게 지속될 수 있음을 확인하였다.

실험예 4. 제조 방법에 따른 혈구 세포 입자의 형태 비교

실험예 1에서와 같이 혈구 세포에 삼투압 충격만을 주어 유전자를 봉입한 경우와 삼투압 충격 및 전기적 충격을 주어 유전자를 봉입한 경우의 혈구세포의 형태를 관찰하였다(도 7a 및 도 7b 참조). 삼투압 충격을 이용한 유전자의 봉입 방법에서는 마우스의 혈액에서 적혈구 세포를 분리하고 3회 수세한 다음 삼투압이 낮은 저장성 용해 완충액(5 mM NaH₂PO₄.H₂0, 5 mM Na₂HPO₄.7H₂0, 5 mM MgCl₂.6H₂0) 내에 유전자와 혈구세포를 가하고 얼음 위에서 10분간 반응을 진행한 다음, 삼투압을 290mOsm로 증가시키는 염화나트륨 성분의 재봉합 완충액을 가하여 37℃에서 30분간 둔 후, 3회 수세하여 유전자가 봉입된 혈구세포를 분리하였다.

혈구 세포에 삼투압 충격 및 전기적 충격을 모두 가하여 유전자를 봉입한 경우에는 1차적으로 마우스의 혈액에서 적혈구 세포를 분리한 다음 3회 수세하고 삼투압이 낮은 저장성 용해 완충액 내에 유전자(2 ㎎/㎖)와 혈구세포를 가하고 큐벳(0.2 cm electrode gap, BioRad사)에 넣어 일렉트로포레이터(Gene Pulser II, BioRad사)로 전기 자극(조건; 0.3 voltage, 0.25 capacity)을 가하였다. 전기적 충격이 끝난 다음 염화나트륨을 첨가하여 용액을 등장화 한 후, 37℃에서 1시간 방치하여 세포막을 안정화시킨 다음 수회 원심분리기(10,000 rpm, 5분)로 수세하여 유전자가 봉입된 혈구세포를 분리하였다. 삼투압 충격만을 가하여 제조된 혈구세포의 모양과 삼투압 충격 및 전기적 충격이 병용된 후 제조된 유전자 함유 혈구 세포의 모양은 위상차 현미경하에서 그 형태(morphology)가 그대로 보존되는 것을 관찰하였다 (도 7a 및 7b 참조).

실험예 5. 투여 형태에 따른 유전자의 발현 지속시간 비교

ICR 마우스(국제 동물 실험 센터, 한국)에 100 ㎍의 pVAXmIL-2 유전자를 미봉입 상태 및 혈구 세포에 봉입된 상태로 각각 투여하고, 시간에 따라 마우스 꼬리 혈관(tail vein)에서 100 ㎕를 채혈하여 트라이졸(Trizol^TM, GibcoBRL사, 미국)을 이용하여 RNA를 추출하고, 인터루킨-2 정량용 합성 RNA (미국 샌디에고 소재 캘리포니아 주립대학교, 카그노프(Kagnoff) 교수)를 사용하여, 정량성 RT-PCR을 수행하여 혈중에 발현된 인터루킨-2의 mRNA 농도를 측정하였다. 또한 대조군으로서 1 ㎖의 혈액으로 제조된 혈구세포만을 투여한 경우의 인터루킨-2의 mRNA 농도도 측정하였다.

혈구세포 만을 투여한 경우 인터루킨-2의 유전자 발현은 투여후 1일째 미량 발현이 관찰되었으나 3일 이후부터는 더 이상 발현이 관찰되지 않았다. 미봉입 유전자를 투여한 경우에는 투여 후 1일과 3일 째에 인터루킨-2의 mRNA 발현이 관찰되었으나 5일 이후부터는 발현이 관찰되지 않았다. 반면, 혈구세포에 봉입된 형태로 인터루킨-2 유전자를 투여한 경우에는 미봉입 유전자를 투여한 경우에 비하여 현저히 많은 양의 인터루킨-2가 발현되었으며 발현지속시간 또한 9일 까지 지속되는 것을 확인하였다 (도 8 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 혈구세포 입자는 목적하는 유전자를 입자의 내부에 함유하여 외부의 유전자 분해효소로부터 유전자를 안전하게 보호할 뿐 아니라 천연 생체막 성분으로 구성되어 체내에서 매우 안전하고 혈중 체류시간이 연장되어 혈액관련 유전질환이나 기존의 비 바이러스성 입자들이 주로 분포되는 세망내피계 이외의 장기로 목적하는 유전자를 수송하려는 경우에 유전자의 수송체로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

혈구 세포 내부에 목적하는 외래 유전자를 함유하는 유전자 수송체.
제 1항에 있어서, 혈구 세포는 마우스, 랫트, 토끼, 양, 사람의 혈액으로부터 분리한 적혈구 세포인 것을 특징으로 하는 유전자 수송체.
제 1항에 있어서, 혈구 세포는 분자량 50만 달톤 이상의 외래 유전자 DNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 수송체.
제 1항에 있어서, 외래 유전자는 면역 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 수송체.
제 3항에 있어서, 면역 관련 유전자는 싸이토카인 유전자 IL-2 및 IL-12, 항감염질환유전자 항-HIV 유전자, 케모카인 (chemokine) 유전자 RANTES, 종양 억제유전자 (tumor suppressor gene) H19 및 p53, 세포 주기 관여 유전자 p21 및 혈관신생 억제 유전자 (angiogenesis inhibitor) flk-1로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 수송체.
목적하는 외래 유전자를 함유하는 저장액에 혈구세포를 분산시켜 삼투압 충격을 가한 다음, 혈구세포에 초단시간의 전기적 충격을 주어 형성된 미세공 내부로 유전자를 도입한 후, 혈구 세포 분산액의 삼투압을 등장화하고 혈구세포막을 안정화시키고, 혈구 세포 내로 봉입된 유전자와 미봉입 유전자를 분리하여 얻어지는 것을 특징으로 하여 외래 유전자의 봉입 효율을 증진시킴을 특징으로 하는 유전자 수송체로서의 혈구세포 제조방법.
제 6항에 있어서, 혈구 세포는 마우스, 랫트, 토끼, 양, 사람의 혈액으로부터 분리한 적혈구 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항에 있어서, 면역 관련 유전자는 싸이토카인 유전자 IL-2 및 IL-12, 항감염질환유전자인 항-HIV 유전자, 케모카인 (chemokine) 유전자 RANTES, 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene) H19 및 p53, 세포 주기 관여 유전자 p21 및 혈관신생 억제 유전자 (angiogenesis inhibitor) flk-1로 구성된 면역 관련 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항에 있어서, 삼투압 조절제는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼륨, 수크로즈(sucrose), 프룩토즈(fructose)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.