KR20160005781A

KR20160005781A - 하나 이상의 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구를 제조하는 방법 및 이렇게 하여 수득된 적혈구

Info

Publication number: KR20160005781A
Application number: KR1020157035053A
Authority: KR
Inventors: 지오바니 맘브리니; 루카 베나티; 지오바니 카포그로시; 마르코 만도리니
Original assignee: 애리델 에스.피.에이.
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2016-01-15
Also published as: PL2994117T3; PH12015502535A1; ES2950419T3; CA2911976A1; US10849858B2; RU2670070C2; SG11201509252QA; PT2994117T; CR20150604A; PH12015502535B1; SA515370122B1; BR112015028278B1; EP2994117A1; AU2014264205A1; US20160051482A1; WO2014181309A1; BR112015028278A2; AU2014264205B2; RU2015152801A; CN105228596A

Abstract

본 발명은 하나 이상의 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이렇게 수득된 로딩된 적혈구, 및 상기 로딩된 적혈구 군집을 포함하는 약제 조성물 및 이의 치료학적 적용 특히, 모세관확장실조의 치료에서의 적용에 관한 것이다.

Description

하나 이상의 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구를 제조하는 방법 및 이렇게 하여 수득된 적혈구 {PROCESS FOR THE PREPARATION OF ERYTHROCYTES LOADED WITH ONE OR MORE SUBSTANCES OF PHARMACEUTICAL INTEREST AND SO OBTAINED ERYTHROCYTES}

설명

본 발명은 하나 이상의 활성 성분이 로딩된 적혈구를 제조하는 방법, 이렇게 수득된 로딩된 적혈구, 및 상기 로딩된 적혈구를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 적혈구를 포함하는 약제 조성물 및 이의 치료학적 적용 특히, 모세관확장실조의 치료에서의 적용에 관한 것이다.

종래 기술의 언급

적혈구 (erythrocyte)로서 또한, 공지된 적혈구 (red blood cell)는 종래 기술 문헌에서 활성 성분을 수송하고 순환계로 방출시키고/거나 표적 부위로 효율적으로 유도할 수 있는 약물 담체 중에 속한다. 약물 담체로서 적혈구 사용의 이점은 주로, 활성 성분이 수일 또는 수주의 기간 동안 및 어쨌든 리포좀 또는 기타 약물 담체에 의해 매개된 경구용 또는 정맥내 제형 또는 서방형 시스템을 사용하는 경우의 일반적인 케이스보다 훨씬 더 긴 기간 동안 순환계에서 유지될 수 있다는 점에 있다. 게다가, 이들 담체는 일단 활성 성분을 수송하는 이들의 역할을 수행하면, 이들은 간 및 비장에서 천연 적혈구의 제거를 위한 생리학적 경로를 통해 순환계로부터 제거된다.

생물의학 및 임상 목적을 위해 인간 또는 포유동물 적혈구에서 활성 성분 또는 조영제를 캡슐화시키기 위한 많은 공정이 제안되었다.

특히, 특허 EP0882448은 요망되는 약물학적 효과를 수득하기에 충분한 농도로 적혈구 중에 약물을 캡슐화시키는 방법을 처음으로 기술하였다. 상기 언급된 종래 특허에 기술된 공정은 하기와 같이 요약될 수 있는 일련의 작업 단계를 포함한다:

- 적혈구를 팽윤시키는 제 1 단계,

- 팽윤된 적혈구를 세포용해시켜, 관심 활성 성분이 세포내 공간 내부로 횡단되게 하기에 충분히 큰 포어를 상기 적혈구의 막에서 개방시키는 것을 허용하는 제 2 단계,

- 세포용해된 적혈구의 농축 단계

- 적혈구가 활성 성분과 접촉되게 한 후, 적혈구에 활성 성분을 캡쳐링하기 위한 목적으로 적혈구를 폐쇄/재밀봉시키는 캡슐화 단계.

방금 기술된 공정은 활성 성분이 로딩된 적혈구를 수득하고 약물 담체로서 사용하기에 적합하게 하는 것을 가능하게 한다. 최근에는, 적혈구에 약물을 캡슐화시키기 위해 참조하기 위한 가장 효과적인 방법은 전문가 부문에 있어서 상기 기술된 것이다.

그러나, 이러한 방법을 이용하는데 있어서, 상기 명시된 특허 (EP0882448)에서 규정된 작업 조건하에서 세포용해된 적혈구의 농축 단계에서 이들 세포용해된 적혈구는 로딩된 적혈구의 재구성의 후속 단계를 다소 어렵게 할 수 있는 기계적 스트레스로 처리됨이 관찰되었다.

적혈구에서 활성 성분을 캡슐화시키기 위한 다양한 공지된 기법 중에서, 특허 EP1773452-B1에 기술된 기법은 환자의 삼투압 취약성 (또는 구형 삼투 저항성 (globular osmotic resistance))이 변화될 때 활성 성분의 캡슐화에 대한 재현성을 획득하기 위해 세포용해액의 유속 변화 및 이들의 삼투성 조절과 같은 공정 변수의 수정을 위해 제공된다.

본 발명의 범위는 적혈구에 관심있는 약제 물질을 캡슐화시키기 위한 개선된 방법을 수득하기 위해 EP 0882448에 기술된 방법으로 달성된 이미 만족스러운 결과를 추가로 개선하는 것이다.

본 발명의 요약

본 출원은 당해 기술의 공지된 문헌의 기술된 동일한 공정과 비교하여 여러 양태에서 개선된 것으로 보이는, 하나 이상의 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

특히, 이러한 방법은 적혈구의 농축 단계가 세포 용해 단계 전에 수행되며, 세포 용해 단계는 약제학적 활성 분자를 적혈구에 캡슐화되게 하는데 필요하다는 점을 특징으로 하는 일련의 작업 단계를 포함한다. 더욱 정확하게는, 이러한 세포용해 단계는 캡슐화될 물질을 포함하는 용액과의 접촉 단계 동안 수행된다.

본 발명의 방법은 출발 적혈구가 적합한 저장액을 사용하여 세포 용해 없이 2개의 후속하는 세포 팽윤 단계로 처리됨을 제공하며; 실제로, 이들 단계는 종래 기술의 동일한 공정에 따른 팽윤 단계 및 세포 용해 단계를 대체한다.

따라서, 본 발명의 주제는 하기 단계를 포함하여, 하나 이상의 약제학적 관심 물질 예컨대, 활성 성분이 로딩된 적혈구를 제조하는 방법이다:

a) 적혈구를 제 1 저장액으로 팽윤시키는 단계,

b) 단계 a)에서 수득된 적혈구를 상기 제 1 저장액보다 더욱 저장성인 제 2 저장액을 사용하여 세포 용해에 도달하지 않으면서 추가로 팽윤시키는 단계,

c) 단계 b)에서 수득된 적혈구를 농축시키는 단계,

d) 이렇게 농축된 적혈구를 하나 이상의 약제학적 관심 물질을 포함하는 세포용해액과 접촉되게 하는 단계, 및 후속하여

e) 상기 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구 군집을 수득하기 위한 밀봉액을 첨가하는 단계.

유익하게는, 본 방법은 단계 (a) 및 (b) 사이에 중간 단계 (a2)로서, 제 1 저장액이 제 2 저장액의 첨가 전에 적어도 부분적으로 제거되는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 방법에 의해 수득 가능한 하나 이상의 활성 성분이 로딩된 적혈구 군집 및 상기 정의된 바와 같이 로딩된 적혈구 군집을 포함하는 약제 조성물이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 방법에 의해 수득된 하나 이상의 활성 성분이 로딩된 적혈구를 포함하는 약제 조성물 및 질병 예를 들어, 모세관확장실조의 치료에 사용하기 위한 상기 적혈구 및 조성물이다.

본 발명은 사전 용혈 유도 없이 단지 팽윤 및 농축 단계로 처리된 적혈구에 활성 성분을 캡슐화시키는 것이 가능하다는 놀라운 발견에 기반한다. 실제로, 포어의 개방 (용혈)은 농축 후 관심 물질을 함유하는 동일한 용액으로 효과적으로 달성될 수 있다. 이러한 새로운 방법은 종래 것보다 훨씬 더욱 효과적이며 천연 적혈구 (공정으로 처리되지 않음)와 매우 유사한 최종 산물 (적어도 하나의 약제학적 활성 물질을 함유하는 적혈구)을 생성시킨다.

본 발명에 의해 제공된 이점

이러한 새로운 방법에 도입된 작업 변화는 적혈구의 원형질막을 더욱 우수하게 보존하고 또한, 더 높은 농도를 달성 가능하게 하여 훨씬 높은 캡슐화 효율을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 관심 물질의 캡슐화는 공지된 기술 문헌에서 기술된 공정과 비교하여 더욱 우수한 수율로 발생하여 더 많은 양의 치료학적 활성 물질의 캡슐화를 허용한다. 특히, 본 방법의 발명자들은 동일한 수준의 캡슐화된 활성 성분을 달성하기 위해 EP0882448에서 기술된 표준 방법으로 현재 사용된 것보다 현저하게 더 낮은 정량의 출발 활성 성분을 사용하는 것이 본 발명의 방법에서 가능함을 입증하였다. 특히, 실험 부문에서 또한 기술된 바와 같이, 치료제로 처리된 동일한 양의 적혈구로 약 11 mg 이하의 예를 들어, 덱사메타손 소듐 포스페이트를 캡슐화하기 위해, 종래 기술의 방법으로는 약 500 mg의 출발 약물이 필요하며, 본원에 기술된 방법으로는 단지 62.5 mg이 필요하다.

게다가, 본 방법은 개시량의 상기 물질과 비례하여 적혈구에서 정량의 관심 물질의 캡슐화가 재현가능하고 신뢰가능한 것으로 입증되었다: 이들 특징은 다양한 용량의 임상적 사용을 허용하여, 공정 동안 첨가된 활성 성분의 양만을 변화시켜 다양한 임상 용도에 상응하는 용량을 투여하는 것을 가능하게 한다.

증가된 캡슐화 효율은 저분자량의 활성 분자 (예를 들어, 실시예 1에 입증된 바와 같은 덱사메타손 소듐 포스페이트) 뿐만 아니라 고분자량의 분자로 입증되었다. 실시예 5에 보고된 바와 같이, 대략 110 kDa (55 kD의 효모 헥소키나제 - Hk -의 다이머) 또는 대략 60 kDa (티미딘 포스포릴라제)의 분자량을 갖는 단백질이 효과적으로 캡슐화되었다.

작업 단계의 변경된 순서로 인해, 본 발명의 방법에 의해 수득된 로딩된 적혈구 군집과 관련된 생리학적 변수에서 현저한 개선이 또한 획득되었다. 특히, 실시예에서 입증된 바와 같이, 본원에 기술된 방법을 사용하여 로딩된 적혈구는 비처리된 적혈구의 것에 전체적으로 필적하는 평균 세포 용적 및 세포 생존력 (대사)과 같은 변수를 갖는다. 전체적으로, 실험 데이타는 새로운 방법이 종래 기술과 비교하여 출발 적혈구의 세포 크기 및 세포 함량을 더욱 잘 보존할 수 있으며, 따라서 생리학적 관점에서 비처리된 적혈구 군집과 현저하게 더욱 유사한 로딩된 적혈구의 군집을 수득가능하게 함을 입증한다.

본 발명에 따라 또는 종래 기술 (EP0882448)의 유사한 공정으로 로딩된 적혈구 군집에서 수행된 비교 실험은 예를 들어, 적혈구의 평균 세포 용적 (MCV)이 각각 약 86 펨토리터 (본 발명) 및 약 71 펨토리터 (종래 기술)임을 입증하였으며, 여기에서, 비처리된 적혈구의 MCV의 값은 80 내지 97 펨토리터이다. 또한, 본원의 방법으로 처리된 적혈구에서 측정된 평균 미립자 헤모글로빈 (MCH)의 양 및 종래 문헌에 기술된 것은 각각 약 21.2 피코그램 (정상적인 것에 훨씬 근접함) 및 약 14 피코그램 (종래 기술)인 것으로 밝혀졌으며, 비처리된 적혈구에 대한 값은 일반적으로 27.6 내지 33.3으로 다양하다.

본 방법으로 로딩된 적혈구와 비처리된 적혈구 사이의 더욱 우수한 중복은 또한, 관찰된 세포 생존력 (대사) 증가에 의해 확인된다. 특히, 하기에 추가로 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명에 따라 처리된 적혈구의 생존력은 증가된 대사 용량 및 노쇠 마커의 감소된 존재 둘 모두에 있어서 현저하게 더욱 우수하다. 하기에서 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 더 큰 세포 생존력에 대한 데이타 (더 큰 대사 및 더 적은 노쇠 마커)로 인해, 본 발명자들은 본원에 기술된 방법이 실제로 종래 기술의 방법으로 수득된 적혈구와 비교하여 더 긴 반감기를 갖는 로딩된 적혈구의 군집을 생성할 수 있음을 언급할 수 있다. 본 발명과 같이 적혈구의 군집은 종래 기술에 기술된 공정에 따라 로딩된 적혈구에 의해 허용된 것보다 긴 기간 동안 캡슐화된 물질의 수송 및/또는 이들의 방출을 허용한다는 결론에 이른다.

기술된 기술적 해법으로 인해, 본 발명은 또한, EP1773452-B1에 기술된 방법의 한계를 극복하게 하고, 각 개별 환자에 대한 공정 변수의 수정 없이 활성 물질의 재현가능한 캡슐화를 수득가능하게 하는데, 왜냐하면 본 공정은 환자 적혈구의 다양한 삼투 취약성 (실시예 7에서 입증된 바와 같음) 및 초기 해마토크리트 (실시예 8에서 입증된 바와 같음) 둘 모두와 무관하기 때문이다.

본 발명의 적혈구에 대해 상기 기술된 유리한 특성, 특히 적혈구 내에 캡슐화된 가장 많은 양의 약물 및 이들의 더 긴 반감기는 상기 적혈구를 다양한 질병 예를 들어, 모세관확장실조의 치료에서 유효하게 한다.

도 1: 도 1은 종래 기술(EP0882448)의 방법과 비교하여 본원에 기술된 방법의 도식 표현이다.
도 2: 도 2는 삼투질 농도를 기반으로 하는 전체 자유 헤모글로빈을 측정함으로써 평가된 2 개체군에 대한 구형 삼투 저항성 (RGO)에 대한 그래프이다. RGO는 또한 50% 용혈 즉, 50%의 자유 헤모글로빈이 관찰되는 삼투질 농도로서 표현된다.
도 3: BO2010A000255에서 기술된 바와 같은 의학 장치와 함께 사용되는 경우 본 발명의 방법의 실행에 적합한 키트의 대표도이다.
도 4: 도의 그래프는 종래 기술 (EP0882448)에서 제시된 절차 (종래 절차) 및 본 발명에 따른 절차 (신규 절차) 둘 모두에 의해 생성된 적혈구로 처리된 모세관확장실조 (02-01, 02-02, 02,05, 02,08)에 걸린 4명의 환자에 대한 동정 연구 (compassionate study)의 결과를 보여준다.

본 발명의 상세한 설명

용어 설명

기술 분야의 일부 전형적인 기술 용어가 하기 설명된다.

본 발명의 목적에 있어서, 용어 "적혈구의 팽윤"은 세포 막 상의 포어의 어떠한 비정상적인 개방 또는 이들의 비가역적인 파괴 현상 없이도 주로 물의 유입에 의해 초래되는 증가된 내압으로 인한 적혈구의 구형 및 부피 증가를 의미한다. 일반적으로, 본 특허에서 이해되는 바와 같은 팽윤은 세포 물질의 유출을 내포하지 않는다.

본 발명의 목적 및 특정 기술 분야에 있어서, 용어 "세포용해" 또는 "용혈" 또는 "부분적 세포용해"는 세포 막 상의 포어의 가역적인 개방으로 인한 세포내 및 세포외 물질의 양 방향으로의 자유로운 통과를 의미한다. 따라서, 세포용해는 일시적이고 가역적인 투과화 현상이며, 세포 막의 완전하고 비가역적인 파괴를 내포하지 않는다.

용어 "세포용해된 적혈구"는 적혈구로서 이의 원형질막이 세포 막의 온전성이 복구되는 방식으로 재폐쇄될 수 있는 포어를 특징으로 하는 적혈구를 나타낸다는 결론에 이른다.

본 설명의 목적에 있어서, 표현 "(재)밀봉액"은 주로 물의 유출을 통해 적혈구의 원형질막에서 포어를 폐쇄시키는데 사용된 용액을 의미한다. 이러한 용액은 상기 포어의 개방으로 인해 적혈구 내부에 약제학적 관심 물질(들)이 캡슐화되게 한다.

본 설명에서, 표현 "로딩된 적혈구"는 다양한 양의 하나 이상의 관심 물질을 캡슐화하는 적혈구 (erythrocyte) (또한, 적혈구 (red blood cell)로 불림)를 의미한다.

본 발명의 목적에 있어서, 용어 "밀봉된 적혈구"는 세포용해된 적혈구와 달리, 비처리된 적혈구의 원형질막 투과성에 필적하는 (중복되는) 원형질막 투과성을 특징으로 하는 적혈구를 나타낸다.

본 발명의 방법을 수행하기 위해, 출발 적혈구는 개체의 혈액 샘플로부터의 적혈구의 수집 및 분리에 의해 수득될 수 있다. 출발 샘플은 바람직하게는, 이들의 응고를 방지하기 위해 항-응고제 예컨대, 헤파린으로 처리된다.

선택적으로, 본 발명에 따른 치료제로 처리되기 전에, 적혈구는 분리되고, 오염물 예컨대, 혈장, 혈소판, 림프구 등이 존재하지 않거나 단지 무시할 정도의 농도로만 존재하는 출발 적혈구 군집을 수득하기 위해 염수액으로 1회 이상 세척 처리될 수 있다.

단계 (a):

상기 나타낸 바와 같이, 본 방법은 적혈구 군집이 제 1 저장액의 사용을 통해 초기에 팽윤되는 단계 a)를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 제 1 저장액은 230 내지 150 mOsm/kg의 삼투질농도, 예를 들어, 180 mOsm/kg의 바람직한 삼투질농도를 갖는다. 어떤 경우에도, 제 1 용액의 삼투질농도 및 용적은, 이러한 제 1 용액과의 접촉이 적혈구의 삼투질농도를 250 내지 200 mOsm/kg 범위에 도달하게 하는 것이다. 특히, 제 1 저장액은 예를 들어, 5 용적의 염수액 및 3 용적의 멸균된 증류수를 혼합함으로써 수득될 수 있다. 비제한적 예로서, 단계 (a)는 실온에서 약 5분의 시간 동안 약 3 내지 7% 농도 (헤마토크리트)의 약 300 mL의 제 1 용액 중에 적혈구를 유지시킴으로써 달성될 수 있다.

단계 a) 후에 선택적으로, 제 1 저장액을 팽윤된 적혈구로부터 적어도 부분적으로 제거하기 위한 단계가 올 수 있다. 이러한 제거는 예를 들어, 처리된 적혈구의 완만한 원심분리 및 상청액의 분리에 의해 수행될 수 있다.

단계 (b):

이어서, 상기 기술된 바와 같이 수득된 팽윤된 적혈구는 제 2 저장액의 사용을 통해 추가로 팽윤 처리된다 (단계 b). 제 2 용액은 제 1 용액보다 더욱 저장성임을 특징으로 한다. 제 2 용액의 긴장성은 적혈구의 추가의 팽윤을 초래하나, 이들의 세포용해를 야기시켜 결국에는 세포내 물질의 유출을 초래하지 않는 방식으로 선택된다. 저장성 조건은 후속 적혈구 농축 단계의 관점에서 과도한 세포 유약성 유도를 회피하는 방식으로 조절된다. 제 2 저장액의 삼투질농도 값은 실험실에서 실험에 의해 측정되고 공정에서 일정하다. 제 2 용액의 삼투질 농도는 적혈구의 팽윤 상태를 유도하나, 이들의 표면 상의 포어를 개방으로 이어져서 세포 내용물의 초기 유출 및 적혈구의 과도한 유약성을 초래하지 않게 하는 농도이다.

제 2 저장액은 80 내지 170 mOsm/kg 범위의 삼투질농도를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 제 2 용액의 삼투질농도는 약 120 mOsm/kg이다. 어떠한 경우에도, 제 2 용액의 삼투질농도 및 용적은, 이러한 제 2 용액과의 접촉이 적혈구의 삼투질농도를 200 내지 170 mOsm/kg의 범위에 도달하게 하는 것이다.

특히, 제 2 저장액은 예를 들어, 5 용적의 염수액을 7 용적의 멸균 증류수와 혼합함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 단계 (b)는 실온에서 약 5분의 시간 동안 약 8 내지 15%의 농도 (헤마토크리트)의 약 64 mL의 제 2 용액에서 적혈구를 유지함으로써 수행될 수 있다.

단계 (c):

상기 단계 a) 및 b)로부터의 발생한 팽윤 적혈구는 이어서 농축 단계 c)로 처리된다. 예를 들어, 혈액여과, 원심분리 또는 투석과 같은 적혈구 샘플의 농축에 적합한 임의의 공지된 기법이 팽윤 적혈구를 농축하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 농축은 혈액여과에 의해 수행된다.

특히, 혈액여과에서, 당해 기술의 전문가에게 공지된 임의의 혈액농축물 필터 (또는 심지어 투석액 필터)는 현탁 용적을 감소시키고 따라서 팽윤 적혈구를 농축시키기 위해 세포 부분이 현탁되어 있는 지질로부터 세포 부분을 분리하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 혈액농축 필터의 부피가 적을수록 (예를 들어, 신생아 또는 소아용 크기), 도달될 수 있는 혈액농축의 수준이 더 높다.

혈액농축은 바람직하게는, 15 내지 35분의 다양한 시간 동안 실온에서 수행된다. 일반적으로, 단계 c)의 말기에서 수득된 적혈구의 농도 (헤모크리트)는 30% 초과, 예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%이다. 이러한 농축 단계에서, 적혈구 현탁액의 삼투질농도는 이전 단계 b)에서 사용된 제 2 저장액과의 접촉 후 달성된 삼투질농도와 비교하여 단지 몇 단위의 mOsm/kg만 변화되는 것으로서 거의 일정하다.

농축 단계가 팽윤되나, 근본적으로 그들의 구조는 온전한 즉, 세포용해되지 않은 적혈구에서 수행되기 때문에, 본원에 기술된 공정은 약물 담체로서 더 이상 효과적으로 사용될 수 없는 지점까지 비가역적으로 손상된 적혈구를 수득할 위험을 현저하게 감소시킨다. 실제로, 본 공정의 최적의 목적은 출발 군집의 생리학적 특징에 가능한 가까운 특징을 가지며, 장기간 동안 유효한 방식으로 담체의 역할을 여전히 수행할 수 있는 로딩되고 "재구성된" 적혈구 군집을 수득하는 것이다.

단계 (d):

이렇게 농축된 적혈구는 이어서 하나 이상의 약제학적 관심 물질을 포함하는 세포용해 저장액과 접착되게 한다 (단계 d). 이러한 용액의 특징은 적혈구의 삼투질농도를 이들의 일시적인 세포용해를 초래하는 지점 즉, 세포막의 포어의 가역적인 개방 지점으로 저하시키는 것이다. 활성 성분을 함유하는 용액은 예를 들어, 낮은 삼투질농도를 갖는 수용액일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 세포용해액의 삼투질농도는 10 내지 100 mOsm/kg의 범위이다. 어떠한 경우에도, 세포용해액의 삼투질농도 및 부피는, 세포용해액과의 접촉이 적혈구의 삼투질농도를 150 내지 110 mOsm/kg의 범위에 도달하게 하는 것이다.

이러한 용액은 저장성이라는 것 이외에, 캡슐화될 관심 물질(들)을 함유한다. 따라서, 적혈구의 원형질막의 투과화는 세포 내부에서 이들의 확산에 이로울 것이다.

예를 들어, 단계 (d)는 30-65% 농도 (헤마토크리트)의 적혈구를 실온에서 약 10분의 시간 동안 활성 물질을 함유하는 세포용해액과의 접촉을 유지시킴으로써 수행될 수 있다.

단계 (e):

적혈구 내부에 관심 분자(들)를 캡슐화시키기 위해, 밀봉액을 사용하여 생리학적 조건에 가능한 가깝도록 처리된 적혈구의 변수를 복구한다. 밀봉액은 300 내지 5000 mOsm/kg 범위의 삼투질농도를 갖는 고장액이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 사용된 밀봉액은 포스페이트-이노신-글루코스-피루베이트-아데닌 (PIGPA)의 용액이다. 따라서, 예를 들어, 증류수 및 적혈구에 의해 사용되는 미네랄 및 기타 영양분으로 구성된 임의의 고장액과 유사한 폐쇄 효과를 수득하는 것이 가능하다. 그러나, PIGPA 고장액은, 세포가 세포 대사 기능은 물론 손실 내용물의 일부를 복구하는 것을 돕는 영양분을 포함하기 때문에 바람직하다. 이와 관련하여, 포어의 재밀봉이 유리하며, 정상적인 막 구조가 재복구 (재-어닐링)된다.

예를 들어, 밀봉액은 바람직하게는, 하기 조성을 갖는다: 33 mM NaH₂PO₄, 1.606 M KCl, 0.194 M NaCl, 0.1 M 이노신, 5 mM 아데닌, 20 mM ATP, 0.1 M 글루코스, 0.1 M 피루베이트, 및 4 mM MgCl₂. 예를 들어, 약 3 mL의 밀봉액이 약 15-40% 농도 (헤마토크리트)의 약 35 내지 55 mL 용적의 세포용해된 적혈구에 사용될 수 있다. 특히, 밀봉액의 적혈구와의 접촉은 예를 들어, 약 30분 동안 바람직하게는, 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 이러한 스테이지에서, 적혈구 현탁액은 생리학적 수준과 적어도 동일하거나 이보다 큰 삼투질농도가 된다. 37℃의 온도는 필수적이지는 않으나, 이는 세포 내부에서 대사 과정의 신속하고 최적의 회복에 기여한다.

적혈구 내에 단독으로 또는 조합되어 캡슐화되는 약제학적 관심 물질은 요구되는 특정 치료 요건에 따라 공지된 것들로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 약제학적 관심 화합물은 하기 군으로부터 선택된다: 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질로부터 선택된 활성 성분; 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체로부터 선택된 활성 성분; 호르몬, 면역억제제, 악성 세포 성장의 억제제, 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 항-레트로바이러스 및 비-스테로이드 항-염증제, 사이토킨, 독소, 백신화 작용을 지는 물질로부터 선택된 활성 성분; 진단용 조영제; 금속을 함유하는 나노입자, 자성 나노입자, 초상자성 나노입자 (SPIO), 및 나노입자-활성 분자 복합체로부터 선택된 입자 또는 나노입자.

예를 들어, 물질은 6-메르캅토푸린, 플루다라빈 포스페이트, 포스포릴화된 아지도티미딘, 디데옥시시토신, 디데옥시이노신, 글루타티온, 비스포스포네이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 베타메타손, 베타메타손 소듐 포스페이트, 티미딘 포스포릴라제, 페닐알라닌 암모니아 분해효소, 인도시아닌 그린, 및 초상자성 입자로부터 선택될 수 있다. 바람직한 활성 물질은 텍사메타손 및 베타 덱사메타손, 또한 포스페이트 형태의 덱사메타손 및 베타 덱사메타손, 및 데플라자코르트 (deflazacort)인 반면, 가장 바람직한 활성 물질은 덱사메타손 소듐 포스페이트이다. 본 발명의 일 구체예에서, 활성 성분은 또한, 전구-약물, 즉 생활성 성분의 전구체를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 이러한 전구-약물는 덱사메타손 소듐 포스페이트 (또는 덱사메타손 21-포스페이트)일 수 있으며, 이는 일단 적혈구 내에 캡슐화되어 환자에 투여되면, 내인성 활성화 (탈포스포릴화)의 메카니즘을 통해 덱사메타손으로 불리는 활성 항-염증 약물로 전환된다. 대안적으로, 전구-약물에서 약물로의 전환은 내인성 활성화 메카니즘이 존재하지 않는 경우 동일한 적혈구 내의 적절한 활성인자의 공동-투여에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 기술된 공정에 의해 수득가능한 하나 이상의 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구 군집이다.

이미 지적한 바와 같이, 본 발명의 공정으로 수득된 적혈구 군집은 문헌에 기술된 방법으로 수득된 동일한 군집과 비교하여 더 큰 세포 생존력 (대사 및 생존)을 보여준다. 특히, 본 발명에 따라 처리된 적혈구의 세포 반감기는 아넥신 V 검정으로 측정된 포스파티딜세린의 백분율로 평가되는 경우 천연 적혈구의 것과 매우 유사하다. 아넥신 V 검정은 실험실 기술사에 의해 실험실 실습으로 수행되며 이미 문헌에 기술되어 있다 (Canonico B. et al. 2010). 따라서, 추가의 상세한 내용은 본원에서 제공하지 않겠다. 상기 검정은 원형질막의 외면 상에 포스파티딜세린을 발현하는 적혈구의 백분율을 측정하며, 이의 존재는 천연 제거 메카니즘을 통한 가속화된 세포 노화 및 손상의 지표이다. 일반적으로, 포스파티딜세린이 노출된 적혈구는 식세포작용의 대상이며, 외막 상에 이러한 단백질을 갖지 않는 적혈구보다 더욱 신속하게 혈류로부터 제거된다. 포스파티딜세린이 노출된 적혈구의 백분율이 더 낮을수록, 인간 몸체내에 순환되는 적혈구의 반감기가 더 높아질 것으로 예측된다는 결론에 이른다. 증가된 반감기는 의약의 더 긴 방출 시간 또는 혈류에서의 더 긴 수송 시간에 반영된다. 본 발명의 방법으로 로딩된 적혈구 군집에서, 포스파티딜세린 노출의 평균 백분율은 10% 미만 예를 들어, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%로 관찰되는 반면, 다른 방법으로 처리된 적혈구 상의 포스파티딜세린 노출의 상응하는 값은 20-40%를 초과할 수 있다. 이들 결과는, 본 발명의 방법이 담체 적혈구로서, 거의 천연의 예측가능한 반감기를 가지며, 대부분의 일반적인 약물학적 요구를 충족시키기에 충분히 긴 기간 동안 캡슐화된 물질을 혈류에서 수송하고/거나 방출하는 담체 적혈구를 수득하게 함을 입증한다.

본원에 기술된 적혈구 군집의 탁월한 생존력이 또한, 수득된 적혈구의 대사 용량의 평가에 의해 확인된다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 바와 같은 대사 용량의 평가는 세포의 생존에 필요한 생화학적 기능을 보존하는 세포의 능력의 지표이다. 적혈구는 이의 에너지 생산이 근본적으로 당분해의 생화학적 과정을 기반으로 하는 세포이며, 이러한 당분해에서 락테이트가 최종 산물이다. 매 10⁶ 적혈구에 대해 생성된 락테이트의 평균 양이 0.100 nmol/h보다 큰 즉, 천연 적혈구의 것과 매우 유사함이 본 출원의 목적을 이루는 적혈구 군집에 있어서 입증되었다.

본 출원의 목적을 이루는 적혈구 군집과 관련하여, 상기 기술된 생화학/분자 특징은, 이러한 군집이 종래 기술의 문헌에서 기술된 적혈구 군집보다 활성 성분에 대한 담체로서 더욱 효율적으로 사용될 수 있음을 나타내는데, 왜냐하면 이는 더 큰 생존력 및 예측가능한 더 긴 반감기를 특징으로 하기 때문이다.

본 발명의 추가의 목적은 본 발명에 따라 수득된 로딩된 적혈구 및 약물학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물이다.

본원에 기술된 조성물은 관심있는 약물학적 표적 부위에 도달하기에 적합하며 적혈구의 투여에 적합한 조성물이다. 따라서, 생리학적 용액, 그러나 또한 예를 들어, 수성 현탁액 (글루코스 포함) 또는 종래 기술에 기술된 바와 같이 제형화된 것들 중의 바람직하게는, 비경구 투여를 위한 조성물이 있다. 비제한적 예로서, 보존제, 안정화제, 당 및 미네랄 등과 통합된 물 또는 완충제가 약물학적으로 허용되는 부형제로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 저장을 위해 동결건조된 형태로 존재할 수 있으며 사용 전 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다.

본 출원의 방법은 다양한 용액의 조작 및 흐름, 삼투질농도 및 부피의 제어와 함께 혈액여과에 적합한 임의의 공지된 장치로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 장치 및 공정은 적합한 프로그램을 기반으로, 예를 들어, 레드 셀 로더 (Red Cell Loader)로 불리는 의학 전기 장치를 사용함으로써 자동으로 작동된다.

종래의 이탈리아 특허 출원 BO2010A000255에 기술된 장비와 함께 사용될, 청구범위에 따른 방법을 수행하기 위한 키트의 예는 도 3에 도시되어 있다. 키트는 하기 번호 매긴 구조적 요소를 함유한다:

(1) 저장액 1를 위한 스파이크 커넥터 (spike connector)

(2) 저장액 2를 위한 스파이크 커넥터

(3) 2-리터 백의 주입가능한 염수액 (세척)을 위한 스파이크 커넥터

(4) 폐기물 백을 위한 커넥터

(5) 50 mL의 환자 혈액 주입을 위한 Luer 커넥터 (50 mL 주사기)

(6) 최종 수집 백

(7) 폐기물 백

(8) 수송 백

(9) 레드 셀 로더로 펌핑시키기 위한 커넥터 (기계의 오른쪽 측면, 표준 폴 사이드 (stand pole side))

(10) 저장소 (한외여과용)

(11) 혈액농축 필터

(12) 용기 (혈액 분리 및 세척을 위한 라탐 볼 (Latham bowl))

(13) 천공가능한 지점 (약물 및 PIGPA 밀봉액을 유입을 위한).

활성 성분의 적합한 캡슐화가능한 의약에 의한 치료를 필요로 하는 임의의 유형의 질환은 본 발명의 적혈구로 유리하게 치료될 수 있다. 상기 질환의 예는 덱사메타손 바람직하게는, 덱사메타손 소듐 포스페이트로 치료된 모세관확장실조 (AT)이다.

L'AT는 1:40,000 / 1:300,000의 발생률을 갖는 ATM 유전자의 돌연변이에 의해 초래된 희귀 유전자 상염색체열성 병태이다. AT는 점진적 운동실조 (운동 혼란)을 초래하는 소뇌의 점진적 신경-변성을 초래한다. 이는 대략 2세에 분명히 드러날 수 있으며, 이의 변성은 매우 빨라 일반적으로, 대략 10대에는 휠체어에 의지하게 된다. 주요 신경학적 증상은 소뇌 구음장애, 측정이상증, 및 눈 움직임의 부조화가 있으며 이에 대한 추체외로 증상 예컨대, 무도병 및 운동완만이 축적될 수 있다. 환자는 감염에 매우 민감하며, 심각한 폐 합병증 또는 백혈병의 발병으로 인해 일반적으로 20년 후 사망하게 된다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에서 모든 실험적 상세 내용과 함께 아래에 기술되며, 이는 단순히 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1: 적혈구 로딩 과정

적혈구 로딩 과정은 하기 기술된 바와 같이 특허 출원 (IT) BO2010A 000255 & 미국 61/373,018에 기술된 장치를 사용하여 수행하였다.

5600 rpm에서 "라탐 볼" 형 스피닝의 원심분리 시스템에 의해 전혈 50 mL로부터 분리된 적혈구를 225 mL/min의 세척 속도로 750 mL 염수액으로 세척하고 수송 백으로 수송하였다.

200 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 300 mL 정량의 제 1 저장액을 수송 백에 첨가하고, 이어서 이를 실온에서 5분 동안 교반 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 제 1 저장액을 약 80 mL의 부피에 도달할 때까지 원심분리 (볼)에 의해 제거하였다.

이렇게 농축된 적혈구를 다시 수송 백으로 옮기고, 이어서 여기에 삼투질농도가 180 mOsm/kg인 64 mL의 제 2 저장액을 첨가하였다.

이어서, 백을 5분 동안 교반하면서 플레이트 상에서 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 적혈구를 혈액농축 필터를 사용하여 농축하고, 약 80 mL의 한외여과물을 저장소에서 수집하는데 여기에 약간의 음압을 진공 펌프에 의해 가하였다. 이어서, 이렇게 농축된 적혈구를 검색하고 수송 백으로 옮겼다. 관심 약물, 본 실시예에서는, 덱사메타손 소듐 포스페이트 (25 mg/mL)를 주입액 (제조물은 약 20 mOsm/kg의 삼투질농도를 가짐)을 위한 대략 11 mL의 물과 사전 혼합시키고, 수송 백에서의 주입에 의해 농축된 적혈구에 첨가하였다. 이러한 작업은 5분 내에 수행되어야 한다. 이어서, 수송 백의 내용물을 10분 동안 교반하에 플레이트 상에서 실온하에 인큐베이션하였다. 이어서, 3 mL 정량의 밀봉액 (3800 mOsm/kg의 삼투질농도를 가짐)을 첨가하였다. 이러한 첨가는 5분 내에 이루어져야 한다. 수송 백을 교반 플레이트 상에서 37 ℃ ± 2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 적혈구를 볼로 옮기고, 225 mL/min의 유속으로 1100 mL의 염수액으로 완전히 세척하였다. 최종적으로, 이렇게 수득된 로딩된 적혈구를 최종 수집 백에 옮겼다. 공정의 총 시간은 대략 1시간 30분이다.

실시예 2: 캡슐화 효율

본 발명에 기술된 방법은 표 1에 기재된 바와 같이 공지된 방법 (공정 1)보다 대략 10배 큰 활성 성분 (본 실시예에서, 덱사메타손 소듐 포스페이트)의 캡슐화 효율 (도입)을 제공한다.

특히, 50 mL의 전혈을 출발 물질로서 사용하였다. 상기 기술된 공정의 활성 성분 로딩 페이스 (단계 d) 동안, 공지된 방법 (즉, EP0882448에 따름)에 있어서는 20 mL의 DSP (덱사메타손 소듐 포스페이트) 25 mg/mL를 첨가하고, 본 발명의 방법 (공정 2)에서는 단지 2.5 mL의 동일 용액의 DSP를 11 mL의 주입수와 함께 첨가하였다.

공정 1 또는 2에 따라 로딩된 적혈구에서 DSP 함량의 분석은 끓이고 물과 메탄올 중에 희석시킴으로써 적혈구의 내부로부터 활성 성분을 유출시킨 후 HPLC 장비를 이용하여 수행하였다. 결과는 표 1에 보고되어 있다.

표 1

실시예 3: 적혈구의 락테이트 생산

건강한 도너로부터의 전혈 백을 사용하였다. 도너 적혈구의 초기 일부를 비처리된 샘플로서 사용하였다. 50 mL 양의 전혈을 본 발명의 공정을 이용하여 처리하였다. 공정 말기에, 30 mL의 처리된 적혈구를 수집하고, 원심분리에 의해 40% 헤마토크리트가 되게 하였다. 이어서, 글루코스를 각 샘플에 첨가하고, 3 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 매 30분 마다 상청액 중의 락테이트 축적 (당분해 경로를 통해 글루코스의 락테이트로의 변형)을 분석하였다. 분석은 혈액 가스 분석기의 사용을 통해 수행하였다.

비처리된 RBC (적혈구)의 락테이트 생산은 본원에 기술된 공정으로 수득된 RBC의 락테이트 생산에 필적한다. 이러한 결과는 표 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 목적을 이루는 방법에 의해 수득된 적혈구가 비처리된 적혈구 (대조군)의 것과 유사한 효율로 글루코스를 락테이트로 변형시키는 이들의 주요 대사 기능 (당분해)를 유지할 수 있음을 나타낸다.

표 2

실시예 4: 로딩된 적혈구의 반감기

본원에 기술된 공정에 따라 로딩된 적혈구의 추정된 반감기는 하기 상세히 기술된 세포 치사 (노쇠)의 마커로서 공지된 세포 표면 상의 아넥신 V를 측정함으로써 평가하였다.

상세하게는, 건강한 도너로부터의 전혈 백을 사용하였다. 도너 적혈구의 초기 일부를 비처리된 샘플로서 사용하였다. 50 mL 양의 전혈을 본 발명의 공정에 따라 처리하였다. 10⁶적혈구 양을 공정의 최종 산물 및 비처리된 샘플로부터 얻었다: 이들을 아넥신 V에 대한 반응 완충제 중에 희석하고, FITC 형광색소와 컨주게이팅된 3 ㎕의 아넥신 V를 첨가하고, 유세포 분석기에 의한 분석을 수행하였다.

하기 표 3에 나타난 바와 같이, 비처리된 대조군에서의 0.75%로부터 본원에 기술된 공정으로 수득된 적혈구의 6.26%로의 아넥신 V의 증가는, 후자가 장기간 동안 순환에서 높은 유지 용량을 여전히 가짐을 나타낸다. 투입 목적을 위한 적혈구를 기반으로 하는 생성물에 있어서, 문헌은 본원에 기술된 공정으로 수득된 로딩된 적혈구에 대해 수득된 것과 유사한 아넥신 V 값을 보고한다 (Relevy H. et al., 2008).

표 3

실시예 5: 캡슐화된 용량 변화

본 발명의 공정은 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 사용된 약물의 초기 용량을 단순히 변화시킴으로써 매우 광범위한 치료학적 범위의 용량의 활성 성분 예컨대, DSP (덱사메타손 소듐 포스페이트)의 캡슐화를 허용한다. 특히, 50 mL의 전혈이 각 실험 및 각 초리 용량의 DSP에 사용되었다. 20 mL 양의 DSP 25 mg/mL를 공지된 방법 (EP0882448)에 따라 DSP를 로딩하기 위해 첨가하였다.

본원에 기술된 공정의 경우에, 11 mL의 주입수에서 각각 사전혼합된 10 mL, 5 mL, 2.5 mL 및 2 mL의 DPS 25 mg/mL를 각각 250, 125, 62.5 및 50의 용량을 위해서 첨가하였다. 적혈구에 캡슐화된 DSP의 분석에는 먼저 증류수로의 1:10 희석, 단백질 변성을 위한 단순 비등 단계, 이어서 원심분리 및 물과 메탄올 중에서의 추출이 요구된다. 캡슐화된 DSP의 분석은 HPLC에 의해 수행되었다. 결과는 표 4에 보고되었다.

표 4

실시예 6 고분자량의 활성 성분의 캡슐화

본 설명의 공정은 또한 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 15% 초과의 초기 산물의 캡슐화 효율로 헥소키나제 (HK)와 같은 고분자량의 단백질의 캡슐화를 허용한다.

특히, 본원에 기술된 캡슐화 공정으로 처리된 건강한 도너로부터의 50 mL의 전혈을 사용하였다. 캡슐화된 활성 성분은 단백질 헥소키나제이다. 활성 성분 첨가 단계에서, 14 mL의 주입수에 용해된 200 mg의 HK를 첨가하였다.

표 5

실시예 7: 적혈구의 로딩에 대한 구형 삼투 저항성의 영향.

모든 개체는 고유의 구형 삼투압 저항성 (RGO)을 가지며, 이는 로딩 공정의 결과에 영향을 끼칠 수 있다. 하기 제시된 데이타는 다양한 삼투력을 갖는 도너들이 매우 유사한 약물 로딩을 유지함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 공정은 유사한 공지된 방법에 대해 나타낸 것과 상이하게, 표 6의 데이타에 의해 예시된 것으로서 환자의 초기 RGO에 의해 현저하게 영향을 받지 않는 것으로 입증되었다.

다양한 개체의 RGO를 기반으로 하는 적혈구 내부에서 로딩 산물의 가변성을 측정하기 위해, 50 mg과 동일한 초기 용량의 DSP (덱사메타손 소듐 포스페이트)를 사용한 본 발명에 기술된 공정이 이용되었다. 다양한 RGO를 갖는 5명의 상이한 개체로부터 50 mL의 전혈로부터 출발하는 총 5개의 평가를 수행하였다.

각 개체의 구형 삼투 저항성을, 용액중의 이들의 전혈 부분을 감소하는 농도의 NaCl (8개의 다양한 값의 삼투질농도)로 희석하고, 각 용액 중의 자유 헤모글로빈을 측정하고, 삼투질농도의 함수로서 총 자유 헤모글로빈의 그래프를 만듬으로써 측정하였다 (도 1 참조). 이어서 RGO (50% 용혈 또는 50% 자유 헤모글로빈에서의 삼투질농도 상응)의 값을 수득된 상기 곡선의 내삽법에 의해 수득하였다. 방출된 헤모글로빈을 분광광도계 해독과 함께 드라킨 시약 (Drakin's reagent)에 의해 정량화하였다 (Drabkin DL. Med Sci 1949). 최종 적혈구에 로딩된 DSP (덱사메타손 소듐 포스페이트)의 분석은 적혈구의 세포분해 후, 비등, 물-메탄올 중의 추출 및 HPLC에 의해 수행하였다. 결과는 표 6에 기록하였다.

표 6

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 공정에서, 다양한 초기 RGO (141 내지 153 mOsm/kg)를 갖는 개체의 적혈구에서 덱사메타손 소듐 포스페이트 (DSP) 로딩은, 약물학적으로 상이한 효과 (10.0 ± 0.4 mg/bag의 평균 로드)가 존재함이 추정될 수 있는 변화를 나타내지 않는다. 본 실시예에 기술된 바와 같은 개체의 RGO의 변화와 비교되는 캡슐화된 DSP의 변화는 약물학적 관점에 있어서 무시할만 하다.

실시예 8: 적혈구 로딩에 대한 초기 헤마토크리트 변화의 영향.

초기 혈액의 헤마토크리트를 기반으로 하는 적혈구 로딩의 가변성을 측정하기 위해, 62.5 mg의 초기 용량의 DSP(덱사메타손 소듐 포스페이트)를 사용한 본 발명에 기술된 공정을 이용하였다.

5명의 상이한 개체로 총 10개의 평가를 수행하였다 (각 도너에 있어서 약 40% 헤마토크리트를 갖는 1개의 헤마토크리트 평가 및 약 50% 헤마토크리트를 갖는 1개의 평가). 각 도너에 대한 헤마토크리트의 표준화는 초기 혈액의 원심분리 또는 희석에 의해 수행하였다. 최종 적혈구에서 로딩된 DSP의 분석은 적혈구 용해 후 비등, 물-메탄올중의 추출 및 HPLC에 의해 수행하였다. 결과는 표 7에 보고되어 있다.

표 7

표 7에서 보고된 데이타에 의해 입증된 바와 같이, 다양한 초기 헤마토크리트 값 (40% 내지 50% 헤마토크리트)을 갖는 개체의 적혈구 중의 덱사메타손 소듐 포스페이트의 로딩은 매우 일정하며 (11.41 내지 11.19 mg/최종 백), 통계학적 유의성 (쌍을 이룬 데이타에 대한 t-스튜던트 테스트로 p> 0.05)의 변화를 나타내지 않으며, 본원에 기술된 공정 변수를 변화시킬 필요가 없다. 10% 변화의 초기 헤마토크리트와 비교하여, 이에 반해 이들 실시예에 기술된 개체의 매우 현저한 변화 (쌍을 이룬 데이타에 대한 t-스튜던트 테스트로 p> 0.001)인 캡슐화된 DSP의 변화는 약물학적 관점에서 무시할만하다.

실시예 9: 종래 기술 및 본 발명의 적혈구로의 AT의 치료:

임상 연구 IEDAT-01

IEDAT-01 (또는 IEDAT)로 불리는 임상 연구를 두 이탈리아 유니버시티 센터 브레스시아 (Brescia) - 로마 (Rome) - 시빌 호스피탈 (Civil Hospital) 및 라 사피엔자 유니버스티 (La Sapienza University)에서 수행하였다. 본 연구에 등록된 운동실조 - 모세혈관확장증 환자를 EP0882448 (종래 절차)에 따른 종래 기법에 따라 생성된 적혈구에 캡슐화된 덱사메타손 소듐 포스페이트로 처리하였다. 이는 6개월 기간의 예상된 개방 연구이다. 환자에 치료법 EryDex 즉, 환자 자체로부터의 적혈구에 캡슐화된 덱사메타손 소듐 포스페이트를 매달 한달 간격으로 투여하였다.

4세 내지 19세의 총 22명의 환자가 등록되었으며, 이들 중 18명은 6개월 동안 제공된 치료를 정기적으로 완료하였다. 연구의 주요 효능 종점은 치료를 시작하기 전 (기준선) 수득된 ICARS ("International Cooperative Ataxia Rating Scale") 값과 관련하여 6개월 기간의 말기에 수득된 값을 비교하여, 신경학적 증상 변화를 평가하는 평점 척도 ICARS에 의해 측정하였다. 일차 종결 포인트 (p = 0.02)에 대한 결과 및 연구의 이차 종결 포인트의 결과는 통계학적으로 유의하였다. 이는 연구에 투입된 모든 22명의 환자 (이들이 모두 끝마치지는 못하였다 하더라도)를 포함하는 분석 인텐트 투 트리트 (Intent to Treat) (ITT) 군집, 및 대신 6개월 치료를 완료한 환자만 고려되는 분석 퍼 프로토콜 (Per Protocol) (PP) 둘 모두에 해당한다.

안전성의 관점으로부터, 치료제는 연구에 포함된 환자에 의해 매우 내약성인 것으로 밝혀졌다.

ICARS

1997년 Trouillas에 의해 개발된 ICARS 척도 ("국제 운동실조 등급 척도 (International Ataxia Rating Scale)" )가 운동실조로서 소뇌 기능이상 (소뇌)과 관련된 증상의 가장 일반적인 신경학적 징후를 평가하고 표준화하는데 신경학자가 가장 빈번하게 사용하는 수단이다. ICARS는 특히, 프리드리히 운동실조에서 다양한 중재적 임상 시험의 결과 척도로서 사용되었다. 이는 하기 구역과 관련된 4개의 하위 척도로 나누어진 반-정량적 척도이다: 이상 자세와 보행 이상; 운동 기능; 동안 장애 및 언어 장애. 최대 총 스코어는 100 포인트이다 (0은 건강한 대상체에 해당하며, 100은 가장 나쁜 정도의 환자 상태에 해당한다).

IEDAT, 동정 연구, 및 종래 절차 및 신규 절차에 따른 신경학적 개선

IEDAT 연구를 22명의 AT 환자에서 수행하였으며, 이의 목적은 스케일 ICARS를 통해 환자의 신경학적 상태에 대한 EryDex 처리 (공지된 절차에 따라 자가 적혈구에 캡슐화된 덱사메타손 소듐 포스페이트)의 영향을 측정하는 것이다.

IEDAT 연구에 참여한 환자 4명에게 소위 "동정 사용 (compassionate use)"으로 불리는 임상 프로토콜로 연구의 말기 후 EryDex로의 처리를 계속하였다.

IEDAT 동안, 절차 (특허 EP0882448에 기술된 바와 같은 EryDex 종래 절차)에 의해 덱사메타손 포스페이트가 로딩된 적혈구를 연구에 사용하였다. 동정 사용에 투입된 4명 환자를 종래 절차를 이용하여 EryDex 처리를 계속하였으며, (평균 5회 처리 후)이어서 본 출원 (EryDex, 신규 절차)에 따라 기술된 절차에 의해 수득된 EryDex로의 처리로 이동하였다. 이러한 절차는 종래 절차와 비교하여 현저한 개선을 유도하였다.

하기 표 8은 종래 절차로의 4명 AT 환자의 처리는 ICARS 연구의 기준선과 비교하여 동정 사용으로의 5개월 연속 처리 후 ICARS 척도에서 3.25 포인트의 향상을 유도하였음을 보여준다. 5.9%의 향상 백분율에 상응하는 이러한 값은 임상적 관점에서 보통인 것으로 간주된다. 10% 미만의 ICARS 척도의 향상은 일반적으로 실제 신경학자에 의해 대수롭지 않은 것으로 간주된다.

신규 절차로 수득된 EryDex 처리로의 전환 후 4명 환자에서 관찰된 이점이 특히 눈에 띈다. 평균 향상은 종래 절차에 따른 처리 후 관찰된 ICARS 값과 비교하여 실제 6.75 포인트 ICARS (13.1%)이다. 적혈구의 특정 특징의 개선 (환자의 적혈구와 가장 유사함) 및 약물 캡슐화의 더욱 우수한 재현성으로 인해 신규 절차는 임상 관점으로부터 관련된 높은 신경학적 개선을 획득가능하게 한다. IEDAT 연구의 시작시부터 동정 연구의 말기까지 EryDex로 처리된 총 4명의 환자는 평균 10 포인트 또는 18.3% (하기 표의 마지막 열)의 ICARS 향상이 있었다. 이러한 데이타는 시험 기간 동안 EryDex 치료제가 투여되지 않은 AT 환자 및 ICARS 척도 평균 7 포인트 악화된 AT 환자에서 관찰된 것과 비교할 경우 더욱 더 중요하다.

표 8

도 4의 그래프는 종래 및 신규 절차 (서로 연속되는)로의 처리 기간의 극단에 4명 환자의 ICARS 값을 보여준다. 4명 환자중 3 명 (환자 02-02, 02-05, 02-08)과 관련된 내삽 직선의 기울기는 신규 절차로의 처리 기간 동안 분명히 더 컸다. 이러한 더 큰 기울기는, 신규 절차의 사용 기간에서 환자가 종래 절차로의 처리 기간보다 그의 신경학적 상태가 더욱 신속하게 개선됨을 분명히 나타낸다 (어떤 한 경우에, 환자 02-02는 심지어 더욱 악화를 나타냄). 신규 절차를 사용하는 경우 단지 한명의 환자 (02-01)만이 개선 속도가 더 느렸다; 그러나, 이 환자는 이전 치료로 매우 현저한 개선을 이미 획득한 경우였으며, 그러나, 신규 절차로 그의 신경학적 상태가 추가로 개선되었다.

종래 절차로 획득된 EryDex 처리에 훨씬 더 반응적이지 않거나 전혀 반응적이지 않은 환자에서도, 치료의 높은 수준의 내약성 (tolerability)과 관련하여 신경학적 상태의 점진적인 개선은, 본 신규 절차에 따른 및 본 발명에 따라 수득된 EryDex 치료법이 모세관확장실조로부터 고통받는 환자에서 현저한 임상적 이점을 유도한다는 것을 입증한다.

Claims

a) 제 1 저장액 (hypotonic solution)을 사용하여 적혈구를 팽윤시키는 단계;
b) 제 1 저장액보다 더욱 저장성인 제 2 저장액을 사용하여 세포용해에 도달하지 않으면서 단계 a)에서 수득된 적혈구를 추가로 팽윤시키는 단계;
c) 단계 b)에서 수득된 적혈구를 농축시키는 단계;
d) 농축된 적혈구를 하나 이상의 약제학적 관심 물질을 포함하는 세포 용해액과 접촉되게 하는 단계, 및 후속하여
e) 상기 하나 이상의 활성 성분이 로딩된 적혈구 군집을 수득하기 위한 목적으로 밀봉액을 첨가하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 활성 성분이 로딩된 적혈구를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 1 용액이 적혈구의 삼투질농도를 250-200 mOsm/Kg이 되게 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 2 저장액이 적혈구의 삼투질농도를 200 내지 170 mOsm/Kg이 되게 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에 제 1 저장액의 적어도 일부를 제 2 저장액의 첨가 전에 제거하는 추가적인 단계를 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 단계 (c)가 혈액여과, 혈액투석 또는 원심분리에 의해 수행되는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 세포 용해액이 적혈구의 삼투질농도를 150 내지 110 mOsm/Kg이 되게 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 밀봉액이 300 내지 5000 mOsm/kg의 고장액 (hypertonic solution)인 방법.
제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적 관심 물질이, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질; 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체로부터 선택된 활성 성분; 호르몬, 면역억제제, 항-종양제, 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 항-레트로바이러스 항-염증 약물, 사이토킨, 독소, 면역화 활성을 지닌 물질으로부터 선택된 활성 성분; 진단용 조영제; 금속-함유 나노입자, 자성 나노입자, 초상자성 입자 (SPIO), 복합 나노입자-활성 분자로부터 선택된 입자 및 나노입자의 활성 성분으로부터 선택되는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 활성 성분이 6-메르캅토푸린, 플루다라빈 포스페이트, 아지도티미딘 포스페이트, 디데옥시시티딘, 데옥시아데노신, 글루타티온, 비스포스포네이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 포스페이트, 베타메타손, 베타마타손 포스페이트, 데플라자코르트(deflazacort), 티미딘 포스포릴라제, 페닐알라닌 암모니아 분해효소, 인도시아닌 그린, 초상자성 입자인 방법.
제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 하나 이상의 약제학적 관심 물질이 로딩된 적혈구.
제 10항에 있어서, 아넥신 V 검정으로 측정된, 적혈구에 의해 생성된 포스파티딜세린의 백분율이 10% 미만인 적혈구.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 각 10⁶ 적혈구에 대해 생성된 락테이트의 양이 0.100 nmol/h를 초과하는 적혈구.
제 10항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 약제학적 관심 물질이 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질; 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체로부터 선택된 활성 성분; 호르몬, 면역억제제, 항-종양제, 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 항-레트로바이러스 항-염증 약물, 사이토킨, 독소, 면역화 활성을 지닌 물질로부터 선택된 활성 성분; 진단용 조영제; 금속-함유 나노입자, 자성 나노입자, 초상자성 입자 (SPIO), 복합 나노입자-활성 분자로부터 선택된 입자 및 나노입자의 활성 성분으로부터 선택되는 적혈구.
제 13항에 있어서, 상기 활성 성분이 6-메르캅토푸린, 플루다라빈 포스페이트, 아지도티미딘 포스페이트, 디데옥시시티딘, 데옥시아데노신, 글루타티온, 비스포스포네이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 포스페이트, 베타메타손, 베타마타손 포스페이트, 데플라자코르트, 티미딘 포스포릴라제, 페닐알라닌 암모니아 분해효소, 인도시아닌 그린, 초상자성 입자로부터 선택되는 적혈구.
제 10항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 적혈구 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물.
치료학적 처리에 사용하기 위한 제 10항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 적혈구 또는 제 15항에 따른 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 활성 성분이 프레드니솔론, 프레드니솔론 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 포스페이트, 베타메타손, 베타마타손 포스페이트, 데플라자코르트로부터 선택되는, 치료학적 처리에 사용하기 위한 적혈구 또는 조성물.
제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 활성 성분이 덱사메타손 소듐 포스페이트 및 소듐 포스페이트 베타마타손으로부터 선택되는, 치료학적 처리에 사용하기 위한 적혈구 또는 조성물.
제 16항 내지 제 18항 중의 어느 한 항에 있어서, 모세관확장실조의 치료에 사용하기 위한 적혈구 또는 조성물.