CN105228596A - 用于制备载有一种或多种制药学感兴趣物质的红细胞的方法和由此得到的红细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备载有一种或多种制药学感兴趣物质的红细胞的方法。本发明还涉及由此得到的装载红细胞和包括所述装载红细胞群的药物组合物及其治疗性应用，特别是在治疗共济失调毛细血管扩张中的治疗性应用。

Description

用于制备载有一种或多种制药学感兴趣物质的红细胞的方法和由此得到的红细胞

技术领域

本发明涉及一种用于制备载有一种或多种活性成分的红细胞的方法、由此得到的装载红细胞和包括所述装载红细胞的药物组合物。

本发明还涉及包括所述红细胞的药物组合物及其治疗性应用，特别是在治疗共济失调毛细血管扩张中的应用。

背景技术

血红细胞，也被称为红细胞，是一种能够携带并释放到循环中和/或将活性成分有效地靶向靶位点的现有技术中的药物载体。使用红细胞作为药物载体的优点主要在于活性成分可以在循环中保持数天或数周的时间，且无论如何比通常情况下使用口服或静脉注射或者由脂质体或其他药物载体介导的缓释系统可以保持更长的时间。此外，一旦这些载体已经完成了其携带活性成分的任务，它们将被通过用于消除肝脏和脾脏中的天然红细胞的生理通路从循环中去除。

已经提出了多种方法以将活性成分或造影剂封装在人类或哺乳动物的血红细胞中以实现生物医学和临床用途。

特别地，专利EP0882448首次描述了将药物以足以获得所期望药理效应的浓度封装在红细胞中的方法。在上述现有专利中描述的方法包含一系列可概括为如下的操作步骤：

-将红细胞溶胀的第一步，

-使经过溶胀的红细胞裂解以将所述红细胞膜上的孔打开足够大从而使感兴趣的活性成分跨越到细胞内空间的第二步，

-对经过裂解的红细胞进行浓缩步骤，

-封装步骤，其中红细胞开始与活性成分接触，随后对红细胞进行关闭/再封闭以达到将活性成分捕获在血红细胞中的目的。

刚刚描述的方法有可能获得载有活性成分且适于用作药物载体的红细胞。目前，对于该领域的专家来说，涉及将药物封装在在红血细胞中的最有效的方法是上述方法。

然而，在使用这种方法时，观察到在上述专利(EP0882448)中所定义的操作条件中对经过裂解的红细胞进行浓缩的步骤中，这些经过裂解的红细胞受到机械应力，该机械应力可能使接下来对装载红细胞进行重建相当困难。

在用于将活性成分封装在红细胞中的各种已知的技术中，在专利EP1773452-B1中所述的方法提供了工艺参数的修正，如改变裂解液的流速和调节其渗透压，以便当患者的渗透脆弱性(或球状渗透阻力)变化时获得活性成分的封装的再现性。

本发明的范围是进一步提高EP0882448中所述的方法取得的已经令人满意的结果以获得一种用于将制药学感兴趣物质封装在红细胞中的改进方法。

发明内容

本发明涉及一种用于制备载有一种或多种制药学感兴趣物质的红细胞的方法，该方法与已知的现有技术中所描述的相同的方法相比，在几个方面有所提高。

特别地，该方法包括一系列操作步骤，其以在细胞裂解步骤前进行红细胞的浓缩步骤为特征，裂解步骤必须使药物活性分子被封装在红细胞中。更确切地说，该裂解步骤是在与包括待封装的物质的溶液接触的步骤中进行。

本发明的方法提供了使用适当的低渗溶液使起始红细胞经过两个相继的细胞溶胀步骤而不裂解；实际上，这些步骤取代了根据现有技术的相同方法的溶胀步骤和裂解步骤。

因此，本发明的目的是一种用于制备载有一种或多种制药学感兴趣物质(如活性成分)的红细胞的方法，包括以下步骤：

a)用第一低渗溶液使红细胞溶胀，

b)用比所述第一低渗溶液更低渗的第二低渗溶液使步骤a)得到的红细胞进一步溶胀，而没有达到裂解，

c)浓缩步骤b)得到的红细胞；

d)将由此经过浓缩的红细胞与包括一种或多种制药学有兴趣物质的裂解液接触，和随后

e)加入封闭以获得载有所述制药学感兴趣物质的红血细胞群。

有利地是，该方法可以包括步骤(a)和步骤(b)之间的中间步骤(a2)，其中在加入所述第二低渗溶液之前，去除至少部分所述第一低渗溶液。

本发明的另一方面是通过上述方法可获得的载有一种或多种活性成分的红细胞群和包括如上所定义的装载红细胞群的药物组合物。

本发明的另一方面是包括通过上述方法获得的载有一种或多种活性成分的红细胞的药物组合物，以及所述红细胞和组合物在治疗疾病(如共济失调毛细血管扩张)中的应用。

本发明是基于令人惊讶的发现，即将活性成分封装在仅经受溶胀和浓缩步骤而无需事先诱导溶血的红细胞中是可能的。的确，用相同的含有感兴趣物质的溶液进行浓缩后可有效地打开孔(溶血)。新的方法比先前的方法更有效，并产生与天然红细胞(未经过该方法)非常类似的最终产品(包含至少一种药物活性物质的红细胞)。

本发明的优点

在新方法中所引入操作变化较好的保留了血红细胞的细胞质膜，又达到了更高的浓度，从而提供了更高的封装效率。

在本发明的方法中，与已知的现有技术中所描述的方法相比，感兴趣的物质的封装有更好的产量，允许更大数量的治疗性活性物质的封装。特别地，该方法的发明人已经证明，为了取得被包封的活性成分的相同水平，在本发明的方法中可以使用比目前采用的EP0882448中所描述的标准方法中起始活性成分的量显著低的量。特别地，如同样在实验部分中所描述的，为了以相同量经过处理的血红细胞封装高达约11毫克的例如地塞米松磷酸钠，用现有技术的方法需要约500毫克的起始药物，而用本文中所描述的方法只需要62.5毫克。

此外，该方法已被证明在将感兴趣物质与其起始量成比例的量封装在血红细胞中是可重复的且可靠的：这些特性允许不同剂量的临床使用，使给药相称于不同临床需要的剂量成为可能，只需改变该方法过程中加入的活性成分的量。

增加的封装效率被证明不仅与具有低分子量的活性分子(例如，如示例1中所示的地塞米松磷酸钠)有关，而且还与具有高分子量的分子有关。如示例5中所报道，具有分子量大约110kDa(55kDa的酵母己糖激酶的二聚体-HK)或大约60kDa(胸苷磷酸化酶)的蛋白质已被有效地封装。

由于修改顺序的操作步骤，在与通过本发明的方法获得的装载红细胞群相关的生理参数也获得了显着的改善。特别地，如在示例中所示，使用在本文中所描述的方法装载的红细胞具有与那些未经处理的红细胞完全可比的参数，如平均细胞体积和细胞活性(代谢)。总体而言，实验数据表明，与现有技术相比，新方法能够更好地保留起始红细胞的细胞大小和细胞含量，从而能够获得从生理学角度看与未经处理的红细胞群显著更相似的装载红细胞群。

根据本法明或以现有技术(EP0882448)的类似方法对装载的红细胞群进行的对比实验已经表明，例如血红细胞的平均细胞体积(MCV)分别为约86毫微微升(本发明)和约71毫微微升(现有技术)，而未经处理红细胞的MCV值在80和97毫微微升之间。另外，经发现在经过本文中的方法和在现有技术中所描述的方法处理的血红细胞中所测量的平均红细胞血红蛋白(MCH)的量分别大约为21.2皮克(更接近正常量)和14皮克(现有技术)，未经处理红细胞的值通常在27.6和33.3之间变化。

以该方法装载的红细胞和未经处理红细胞之间较好的重叠也通过观察到的增加的细胞活性(代谢)而被确认。特别地，如下面更加详细地描述，根据本发明进行处理的红细胞的活性在增加代谢能力和减少衰老标记物存在方面均显著较好。如下面更加详细地讨论，与更强的细胞活性(更多代谢和更少衰老标记物)相关的数据允许我们声明，在本文中所描述的方法事实上能够产生相比于用现有技术获得的红细胞具有更长半衰期的装载红细胞群。由此断定依据本发明的红细胞群允许封装的物质的运输和/或它们的释放持续比根据在现有技术中所描述的方法装载的红细胞所允许的更长的时间。

由于所述的技术方式，本发明还克服了在EP1773452-B1所述方法的缺陷并获得活性物质的可重现封装，而不需要针对各个个体患者修正方法参数，因为该方法是独立于患者的血红细胞的不同渗透脆性(如示例7中所表明)和初始血细胞比容(如示例8中所表明)。

本发明的红细胞的上述有利的性质，特别是在红细胞中封装的最高量药物和它们更长的半衰期使所述红细胞在治疗不同的疾病(如共济失调毛细血管扩张)中是有效的。

附图说明

图1：图1为相比于现有技术(EP0882448)的方法本文所描述方法的示意图。

图2：图2为通过基于渗透压对总游离血红蛋白进行测量而评估出的关于针对两个个体的球状渗透阻力(RGO)的曲线图。RGO也表示为观察到50％溶血(即50％的游离血红蛋白)时的渗透压。

图3：表示当与如BO2010A000255所述的医疗设备一起使用时适合执行本发明的方法的试剂盒。

图4：图中的曲线显示了用现有技术中所示的方法(EP0882448)(旧方法)和根据本发明的方法(新方法)所产生的红细胞对4名患有共济失调毛细血管扩张的患者(02-01，02-02，02，05，02，08)进行治疗的慈善研究的结果。

具体实施方式

术语

技术领域的一些典型的技术术语解释如下。

为了本发明的目的，表达“红细胞的溶胀”指主要由水的进入所引起的内部压力的增加而引起的红细胞体积的增加和形成球形，而没有任何细胞膜上的孔的异常打开或不可逆破损的现象。通常情况下，本专利中所理解的溶胀并不意味着细胞物质的流出。

为了本发明的目的，和在特定的技术领域中，术语“裂解”或“溶血”或“部分裂解”指细胞膜上的孔的可逆打开，其结果是细胞内的物质和细胞外的物质在两个方向上均可以自由通行。因此，裂解是暂时可逆的透化作用且不涉及完全和不可逆的细胞膜破裂现象。

由此，术语“经过裂解的红细胞”指的是那些具有以恢复细胞膜完整性的方式而被重新封闭的孔为特征的质膜的红细胞。

为了本描述的目的，表达“(再)封闭溶液”指所采用的溶液能够主要通过水的流出而关闭红细胞质膜上的孔。由于所述孔的打开，这种溶液允许将制药学感兴趣物质封装在红细胞内。

在本说明书中，表达“装载的红细胞”指封装有可变量的一种或多种感兴趣物质的红细胞(也称为血红细胞)。

为了本发明的目的，表达“密闭的红细胞”的指的是，不同于经过裂解的红细胞，以可与未经处理的血红细胞的膜透性相比(重叠)的膜透性为特点的红血细胞。

为了实施本发明的方法，起始红细胞可通过从个体血液样本收集和分离红血细胞而获得。优选地，用抗凝血剂(如肝素)对起始样本进行处理以防止其凝固。

任选地，在根据本发明对红细胞进行处理前，可以分离红细胞并用盐溶液进行一次或多次洗涤以获得起始红细胞群，其中没有或只有可忽略不计浓度的污染物，如血浆、血小板、淋巴细胞等。

步骤(a)

如上所指出，所述方法包括通过使用第一低渗溶液对红细胞群进行初始溶胀的步骤(a)。

在本发明的一个实施方式中，所述第一低渗溶液具有230和150mOsm/kg之间的渗透压和例如优选180mOsm/kg的渗透压。在任何情况下，所述第一低渗溶液的渗透压和体积是这样的以致与该第一低渗溶液接触能够使血红细胞达到从250到200mOsm/kg范围内的渗透压。特别地，例如通过混合5体积的盐溶液和3体积的无菌蒸馏水可以得到第一低渗溶液。以非限制性示例的方式，可以约300mL浓度(红细胞压积)为约3-7％的第一低渗溶液中的红细胞维持在室温下约5分钟的时间而进行步骤(a)。

任选地，可以在步骤(a)后进行从经过溶胀的红细胞中去除至少部分第一低渗溶液的步骤。例如，可以通过对经过处理的红细胞进行温和离心以及分离上清液来实现这种去除。

步骤(b)

然后，使用第二低渗溶液对如上所述所获得的经过溶胀的红细胞然后通过进行进一步的溶胀(步骤b)。所述第二溶液以比第一溶液更低渗的事实为特征。以引起红细胞的进一步溶胀然而却不引起其裂解的方式选择第二溶液的低张力，所述裂解将引起细胞内物质流出的后果。鉴于红细胞接下来的浓缩步骤，以避免诱导过度细胞脆性的方式对低张性进行控制。以实验的方式确定所述第二低渗溶液的渗透压值且在该方法中恒定。所述第二溶液的渗透压诱导红细胞的溶胀态而不导致其表面的孔的打开而引起细胞内容物的初始流出和红细胞的过度脆性。

所述第二低渗溶液具有从80到170mOsm/kg范围内的渗透压。在一个优选的实施方式中，所述第二溶液的渗透压为约120mOsm/kg。在任何情况下，所述第二溶液的渗透压和体积是这样的以致与该第二溶液接触能够使血红细胞达到从200到170mOsm/kg范围内的渗透压。

特别地，例如通过混合5体积的盐溶液和7体积的无菌蒸馏水可以得到第二低渗溶液。

通过举例的方式，可以将约64mL的浓度(红细胞压积)为约8-15％的第二溶液中的红细胞维持在室温约5分钟的时间来进行步骤(b)。

步骤(c)

然后，对从上述步骤a)和步骤b)所得到的经过溶胀的红细胞进行浓缩步骤c)。任何已知的适合对红细胞样品进行浓缩技术，如血液滤过、离心或透析，可以被用来浓缩经过溶胀的红细胞。在本发明的一个优选实施方式中，通过血液滤过进行浓缩。

特别地，在血液滤过中，任何本领域专家已知的血液浓缩过滤器(或者甚至透析液过滤器)均可以被用来从悬浮有细胞的液体中分离细胞部分以降低悬浮体积，以及由此因此对经过溶胀的红细胞进行了浓缩。通常，血液浓缩过滤器的体积(例如，用于新生儿和儿科使用的尺寸)越小，可以达到的血液浓缩的水平越高。

优选地，在室温下进行15分钟和35分钟之间变化的一段时间的血液浓缩。通常，步骤c)的最后得到的红细胞的浓度(血球容积)超过30％，例如35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％。在该浓缩步骤中，红细胞悬浮液的渗透压几乎恒定，与先前步骤b)中所使用的所述第二低渗溶液接触后得到的渗透压相比只有几个mOsm/kg单位的变化。

由于浓缩步骤是在被溶胀但其结构基本完整(即没有裂解)的红血细胞上进行的，在本文中所描述的方法大大降低了得到被不可逆地破坏至它们不能再被有效用作药物载体的程度的红细胞的风险。事实上，该方法的最佳目是获得装载和重建的具有尽可能接近起始群的生理学特性的特性且仍能够以有效的方式和长时间发挥载体的作用的红细胞群。

步骤(d)

将由此浓缩的红细胞与包括一种或多种制药学感兴趣物质的裂解低渗溶液接触(步骤d)。该溶液的特征是降低了血红细胞的渗透压至引起它们暂时裂解的程度，即可逆性打开细胞膜上的孔。含有活性成分的该溶液可以为例如低渗透压的水溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述裂解液具有从10到100mOsm/kg范围内的渗透压。在任何情况下，所述裂解液的渗透压和体积是这样的以致与该裂解液接触使血红细胞达到从150到110mOsm/kg范围内的渗透压。

除了为低渗的，该溶液含有待封装的感兴趣物质。因此，红细胞质膜的透化作用将有利于它们在细胞内的扩散。

以举例的方式，可将与含有活性物质的裂解液接触的浓度(红细胞压积)为30-65％的红细胞维持在室温下约10分钟的时间来进行步骤(d)。

步骤(e)

为了将感兴趣的分子封装在红细胞内，使用封闭液来恢复经过处理的红细胞的参数以尽可能接近生理学条件。所述封闭液是渗透压在从300到5000mOsm/kg范围内高渗溶液。

在本发明的一个具体实施方式中，所使用的封闭液是磷酸肌苷葡萄糖丙酮酸腺嘌呤(PIGPA)的溶液。因此，能够获得与任何由例如蒸馏水和矿物质或其他血红细胞所用的营养物所组成的高渗溶液相似的关闭效果。然而，PIGPA高渗溶液是优选的，因为它包括有助于细胞恢复部分丢失的内容物以及细胞代谢功能的营养物。就这一点而言，再封闭孔是有利的，且正常的膜结构被恢复(再退火)。

以举例的方式，所述封闭液优选地具有以下组分：33mMNaH₂PO₄、1.606MKCl、0.194MNaCl、0.1M肌酐、5mM腺嘌呤、20mMATP,0.1M葡萄糖、0.1M丙酮酸盐和4mMMgCl₂。以举例的方式，约3mL的封闭液可以用于体积约35-55mL浓度(血球容积)约为15-40％经过的裂解红细胞。具体地，封闭液与红细胞的接触可以优选地在37℃的温度下进行例如约30分钟。在这个阶段，红血细胞悬浮液的渗透压达到至少等于或大于生理学水平。尽管37℃的温度并非必不可少的，但其有助于细胞内代谢过程的快速和最佳恢复。

单独的或者组合形式的待封装于血红细胞中的制药学感兴趣物质可以根据所需的具体治疗需要从已知的那些物质中进行选择。

在本发明的一个实施方式中，制药学感兴趣的化合物选自以下组：选自肽、寡肽、多肽、蛋白质的活性成分；选自寡核苷酸、核苷酸类似物、核苷、核苷类似物的活性成分；选自激素、免疫抑制剂、恶性细胞生长抑制剂、皮质类固醇、糖皮质激素、抗逆转录病毒和非甾体抗炎药、细胞因子、毒素、与接种疫苗作用的物质的活性成分；诊断用造影剂；选自含金属纳米颗粒、磁性纳米粒子、超顺磁性纳米粒子(SPIO)和纳米颗粒-活性分子复合体的颗粒和纳米颗粒。

例如，物质可以选自6-巯基嘌呤、氟达拉滨磷酸盐、磷酸化叠氮胸苷、双脱氧胞苷、双脱氧腺苷、谷胱甘肽、二膦酸盐、泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、倍他米松、倍他米松磷酸钠、胸苷磷酸化酶、苯丙氨酸氨裂解酶、吲哚菁绿、超顺磁性粒子。优选的活性物质是地塞米松和β-地塞米松，同样以磷酸盐的形式，以及地夫可特，而最优选的活性物质是地塞米松磷酸钠。在本发明的一个实施方式中，活性成分还可以包括前药，即生物活性成分的前体。以非限制性示例的方式，这种前药可以是地塞米松磷酸钠(或地塞米松21-磷酸盐)，其一旦被封装在血红细胞中并给药至患者将通过内源激活(脱磷酸化)的机制被转换成叫做塞米松的活性抗炎药。可选地，从前药到药物的转化可以通过在相同的红细胞中共同施用适当的活化剂而获得，以防没有内源激活的机制。

本发明的另一个目的是通过上述方法可以获得的载有一种或多种制药学感兴趣物质的红细胞群。

如已经指出的，与以在文献中所描述的方法得到的相同的群相比，以本发明的方法得到的红细胞群显示出更强的细胞活性(代谢和存活)。特别地，根据本发明处理的红细胞具有与天然红细胞非常相似的细胞半衰期，细胞半衰期用膜联蛋白V试验测量的磷脂酰丝氨酸的比例来评估。膜联蛋白V试验是在实验室实践中由实验室技术人员来进行，并被描述在文献中(CanonicoB.等人.2010)。因此，在此不再进一步详述。所述试验测量了在质膜外表面表达磷脂酰丝氨酸的红细胞的比例，其存在指示了通过自然淘汰机制的损伤和加速的细胞老化。通常，具有暴露的磷脂酰丝氨酸的血红细胞遭到吞噬作用并比外膜不具有这种蛋白质的红细胞更快地从血流中被清除。因此具有暴露的磷脂酰丝氨酸的血红细胞的比例越低，进入人体循环的红细胞的半衰期可预见性地将更长。增长的半衰期反映在药物的更长的释放时间或在血流中更长的运输时间。在以本发明的方法装载的红细胞群中，观察到暴露的磷脂酰丝氨酸平均比例低于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，而在用其他方法处理的红细胞上暴露的磷脂酰丝氨酸的相应值可能超过20-40％。这些结果表明本发明的方法可以获得具有几乎天然可预测的半衰期的载体红细胞，该红细胞携带在血流中和/或释放被封装物质的时间充分长足以满足最常见的药理学需求。

本文所述红细胞群的优异活性也通过评估所得到的红细胞的代谢能力而得到证实。代谢能力的评估，如本领域专家已知的，是细胞维持其存活所必需的生化功能的能力的指示。血红细胞其能量生产基本上是基于终产物为乳酸的糖酵解的生化通路的细胞。经证明，对于形成本申请目的的红细胞群来说，每10⁶个红细胞所产生平均乳酸量大于0.100nmol/h，即与天然红细胞的平均乳酸量非常相似。

相对于本申请目的的红细胞群，以上描述的生化/分子特性表明这种群可以比在现有技术中所描述的红细胞群被更有效地用作活性成分的载体，因为其以更强的活性和可预测性更长的半衰期为特征。

本发明的另一个目的是包括根据本发明获得的装载红细胞的药物组合物和药学上可接受的赋形剂。

本文所描述的组合物为适用于给药红细胞并适合到达药理学感兴趣靶位点的组合物。因此，这些是用于胃肠外给药的组合物，优选地在生理学溶液中，以及，例如，(包含葡萄糖的)水溶性悬浮液或那些如现有技术中所描述制剂。以非限制性示例的方式，水或缓冲液，结合防腐剂、稳定剂、糖和矿物质等，可被用作药学上可以接受的赋形剂。这样的组合物还可以是冻干形式以在使用前储存并重建于合适的载体中。

本申请的方法可以用任何已知的适于血液滤过的装置通过处理不同的溶液和控制流动、渗透压和体积来实施。优选地，基于合适的程序对该装置和该方法进行自动操作，例如通过使用被称为红细胞装载仪(RedCellLoader)的电疗设备。

图3示出了与先前意大利专利申请BO2010A000255中所描述的设备一起使用来实施根据权利要求的方法的试剂盒的示例，该试剂盒包含下列编号的结构要素：

(1)用于低渗溶液1的斯派克(Spike)连接器

(2)用于低渗溶液2的Spike连接器

(3)用于2升装的可注射盐溶液(洗涤)的Spike连接器

(4)用于废弃袋的连接器

(5)用于输入50毫升患者的血液的Luer连接器(50毫升注射器)

(6)最终收集袋

(7)废弃袋

(8)传送袋

(9)用于给红细胞装载仪打气的连接器(机器的右侧，立杆侧)

(10)储液器(用于超滤液)

(11)血液浓缩过滤器

(12)碗(用于血液分离和洗涤的莱瑟姆(Latham)碗)

(13)可刺穿的点(对于输入药物和PIGPA封闭液)。

任何类型的需要用合适的可封装的活性成分的药物来治疗的疾病可以有利地用本发明的红细胞进行治疗。所述疾病的示例是用地塞米松，优选地用塞米松磷酸钠治疗的共济失调毛细血管扩张(AT)。

L'AT是一种由具有1：40,000/1：300.000发生率的ATM基因突变引起的罕见的遗传性，常染色体隐性病理。AT会引起渐进性共济失调(动作混乱)的渐进性神经退行性小脑。它可以在约2年的时间被确定且其退行性相当快，通常导致在大约第二个十年时被限制于轮椅上。主要的神经系统症状是小脑性构音障碍、辨距不良和缺乏眼球运动协调，锥体外系症状，如舞蹈病或运动迟缓可以积累成缺乏协调的眼运动。患者很容易受到感染，且通常在20年后因严重的肺部并发症或白血病发病而死亡。

示例

下面结合以下示例中的所有实验细节描述本发明，其纯粹为描述性的并不限制本发明。

示例1：用于装载红细胞的方法

如下所述，使用在专利申请(IT)BO2010A000255和U.S.61/373,018中所描述的装置来实施用于装载红细胞的方法。

对以"LathamBowl"型的离心系统在5600rpm下进行旋转而从50mL的全血中分离出的红细胞用750mL的盐溶液在225mL/min的清洗速度下进行洗涤并被转移到传送袋中。

将300mL数量的具有200mOsm/kg的渗透压的第一低渗溶液加入到传送袋中，然后在室温下在搅拌盘上培养5分钟。然后通过离心(碗)去除第一低渗溶液直到体积达到约80毫升为止。

由此浓缩的红细胞被转移回传送袋，然后向传送袋中加入64mL具有180mOsm/kg渗透压的第二低渗溶液。

然后在搅拌下将该袋在盘子上室温培养5分钟。培养后，用血液浓缩过滤器对红细胞进行浓缩且将约80mL的超滤液收集在储液器中，通过真空泵的方式对储液器施加轻微的负压，然后将由此浓缩的红细胞补偿并被转移到传送袋中。在该示例中感兴趣的药物地塞米松磷酸钠(25mg/mL)与大约11mL的水进行预混合以形成可注射的溶液(该制剂具有大约20mOsm/kg的渗透压)，然后在传送袋中通过注射加入到经过浓缩的红细胞。该操作必须在5分钟内进行。然后传送袋中的物质在搅拌下在盘子上室温培养10分钟。然后加入3mL量的封闭液(具有3800mOsm/kg的渗透压)。该加入必须在5分钟内进行。传送袋在37℃±2的温度下在搅拌盘上培养30分钟。然后将红细胞转移进碗中并在225mL/min的流速下用1100mL的盐溶液进行彻底洗涤。最后，将由此得到的装载红细胞转移到最终采集袋。该方法的全部时间为约1小时30分钟。

示例2：封装效果

如表1所示，在本发明所描述的方法提供了比已知方法几乎强10倍的活性成分(在该示例中为地塞米松磷酸钠)的封装效率(引入)，如表1所示。

特别地，将50mL的全血用作起始材料。在上述方法的活性成分的装载阶段(步骤d)，已知的方法(即根据EP0882448)中加入20mL的25mg/mL的DSP(地塞米松磷酸钠)，本发明的方法中只加入2.5mL相同的DSP溶液与11mL的水用于注射。

通过煮沸和在水和甲醇中稀释而从红血细胞的内部萃取活性成分后，使用HPLC设备对根据方法1或2装载的红细胞中的DSP内容物进行分析。结果列于表1中。

表1

示例3：红细胞中的乳酸产量

使用一包来自健康供体的全血。供体的血红细胞的初始部分被用作未处理的样品。用本发明的方法处理50mL量的全血。在该方法的最后，通过离心收集30mL的经过处理的红细胞和产生40％的血球容积。然后向每个样品中加入葡萄糖并在37℃对它们培养3小时，每30分钟对在上清夜中的乳酸的积累(葡萄糖通过糖酵解通路转化为乳酸)进行分析。通过使用血液气体分析仪进行分析。

未处理的RBC(血红细胞)的乳酸产量与用本文中所述的方法得到的RBC的乳酸产量是可比较的。如表2所示，该结果表明通过形成本发明目的的方法获得的血红细胞能够保持它们的代谢功能(糖酵解)，以与未处理的血红细胞(对照)相似的效率将葡萄糖转化为乳酸。

表2

示例4：装载红细胞的半衰期

根据本文所描述方法装载的红细胞的估计半衰期通过测量细胞表面的膜联蛋白V进行评估，膜联蛋白V已知为细胞死亡的标记物，如下详述。

特别地，采用一包来自健康供体的全血。供体的血红细胞的初始部分被用作未处理的样品。用本发明的方法处理50mL量的全血。从该方法的最终产物和从未处理的样品中提取10⁶量的红细胞；在膜联蛋白V反应缓冲液中对它们进行稀释，加入3μl结合有FITC荧光染料的膜联蛋白V并通过流式细胞术进行分析。

如以下表3所示，膜联蛋白V从在未处理对照组中的0.75％增加到的以本文所描述方法获得的血红细胞的6.26％，其表明后者仍然具有在循环中长时间维持高能力的事实。对于基于输血目的的血红细胞的产物，文献报道膜联蛋白V的值与那些以本文所描述方法获得的装载血红细胞而得到膜联蛋白V的值相似(RelevyH.等人,2008)。

表3

示例5：装载剂量的变化

如下表4所示，本发明的方法允许通过简单地改变所使用药物的初始剂量而在非常宽的治疗性范围内封装不同剂量的活性成分，如DSP(地塞米松磷酸钠)。特别地，对每个实验和对每个初始量的DSP使用50mL的全血。加入20mL量的25mg/mL的DSP以根据已知方法(EP0882448)装载DSP。

在本文所述的方法的情况下，将10mL、5mL、2.5mL和2mL的25mg/mL的DSP分别与11mL的水进行预混合以用于注射，而分别形成250、125、62.5和50剂量。被封装在血红细胞中的DSP的分析首先需要在蒸馏水中按1:10稀释，对样品进行煮沸步骤以使蛋白质变性。用HPLC对封装的DSP进行分析。结果列于表4中。

表4

示例6：高分子量活性成分的封装

本发明的方法还允许以大于15％的初始产物的封装效率对高分子量蛋白质(如己糖激酶(HK))进行封装，如下表5所示。

特别地，采用经过本文所述封装方法处理的50mL来自健康供体的全血。所封装的活性成分为己糖激酶蛋白质。在添加活性成分步骤中，加入200mg溶解在14mL注射用水中的HK。

表5

示例7：球状渗透阻力对红细胞装载的影响

每个个体都有其自己的能够影响装载方法结果的球状渗透阻力(RGO)。下面的数据表明，具有不同渗透强度的供体保持非常相似的药物装载。因此，如表6中数据表明，与相似的已知方法所表明的不同，本发明的方法已被证明不受患者的初始RGO的显著影响。

为了根据不同个体的RGO测定装载在血红细胞内部的产物的可变性，以DSP(地塞米松磷酸钠)等于50mg的初始剂量采用本发明中所述的方法。从来自具有不同RGO的5个不同个体的50毫升全血开始一共进行5次测试。

通过将每个个体的全血的一部分稀释于具有递减浓度的NaCl溶液中(8个不同的渗透压值)来测量每个个体的球状渗透阻力，测量每个溶液中的游离血红蛋白并建立作为渗透压函数的总游离血红蛋白的曲线图(见图1)。然后通过插入获得的所述曲线得到RGO的值(对应于50％的溶血或50％的游离血红蛋白时的渗透压)。利用德拉布金试剂(Drabkin's试剂)以分光光度法计读取值对释放的血红蛋白进行定量(DrabkinDL.MedSci1949)。在通过煮沸使其裂解、在水-甲醇和HPLC中萃取后对装载在最终红细胞中的DSP(地塞米松磷酸钠)进行分析。结果列于表6中。

表6

如上表6所示，在本文所述的方法中，在具有不同初始RGO(从141至153mOsm/kg)的个体的血红细胞中装载的地塞米松磷酸钠(DSP)没有显示出变化，因此可以认为存在不同的药理学效果(10.0±0.4毫克/袋的平均装载)。从药理学的观点来看，与在这些示例中所述的个体的RGO的变化相比，封装的DSP的变化是微不足道的。

示例8：初始红细胞压积变化对红细胞装载的影响

为了根据初始血液的红细胞压积测定血红细胞的装载的可变性，以DSP(地塞米松磷酸钠)等于62.5mg的初始剂量采用本发明中所述的方法。

对5个不同的个体一共进行了10次测试(对每个供体进行1次约40％的红细胞压积的红细胞压积测试和1次约50％的红细胞压积的测试)。通过对初始血液进行离心或稀释而对每个供体的红细胞压积进行标准化。在通过煮沸使其裂解、在水-甲醇和HPLC中萃取后对装载在最终红细胞中的DSP进行分析。结果列于表7中。

表7

如表值7中所列出的数据所示，在具有不同初始红细胞压积值(红细胞压积从40％至50％)的个体的血红细胞中装载的地塞米松磷酸钠是非常恒定的(从11.41mg/终包到11.19mg/终包)并且显示出没有统计学显着性变化(P>0.05采用配对数据的t学生测试)而无需改变本文所述的方法参数。相比于初始红细胞压积10％的变化，这些示例中所描述的个体的封装的DSP的变化相反地是一个高度显著变化(P>0.05采用配对数据的t学生测试)，从药理学的观点来看是微不足道。

示例9：用现有技术和本发明的红细胞处理AT

临床研究IEDAT-01

称作IEDAT-01(或IEDAT)的临床研究是在两个意大利大学中心，罗马-布雷西亚-民用医院(Brescia-Rome-CivilHospital)和萨皮恩扎大学(LaSapienzaUniversity)进行的。以根据依照EP0882448(旧方法)中的先前技术而产生的封装在红细胞中的塞米松磷酸钠对参加本研究的患有共济失调-毛细血管扩张的患者进行治疗。这是为期6个月的前瞻性开放性研究。患者每隔一个月接受EryDex治疗，即封装于来自患者自身的红细胞的地塞米松磷酸钠。

共有22名年龄在4到19岁之间的患者参加，其中18名患者已定期完成为期6个月的治疗。该研究的主要疗效终点由等级量表ICARS(“国际合作组织共济失调量表”)测量，等级量表ICARS通过比较在6个月的治疗期结束时获得的值与开始治疗(基线)之前ICARS得到的相应的值来评估神经症状的改变。该研究的主要终点的结果和次要终点的结果具有统计学显著性。这一点在分析意向治疗(ITT)人群和分析每个疗程(PP)中均具有统计学显著性，ITT包括所有进入该研究的22名患者，即使他们没有完成该研究，PP反而只考虑完成6个月治疗的患者。

从安全的角度来看，发现该治疗对包括在该研究中的患者很好地耐受。

ICARS

1997年由Trouillas开发的量表ICARS(“国际合作组织共济失调量表”)是神经学家评估和标准化与小脑功能障碍(小脑)，如共济失调，有关的最常见的神经系统表现所最经常使用的工具。ICARS在多种介入性临床实验中，尤其是在弗里德里希的共济失调(Friedrich's共济失调)中用作测量结果。它是分为4个与下述领域有关的子规模的半定量规模：异常姿势和异常步态；运动功能；动眼神经紊乱和语言紊乱。最大总分数为100分(0对应于健康受试者，100对应于患者状况的最差程度)。

IEDAT富有同情心的研究和用旧方法和新方法的神经功能改善

对22名AT患者进行IEDAT研究，其目的是通过量表ICARS对患者的神经功能状况的EryDex治疗(根据已知方法封装于自体红细胞中的地塞米松磷酸钠)效果进行测量。

在所谓“同情使用”的临床疗程中研究结束之后继续用EryDex对参加IEDAT研究的4名患者进行治疗。

在IEDAT期间，该研究使用了通过方法(EryDex旧方法，如在专利EP0882448中所描述)装载有地塞米松磷酸钠的红细胞。继续利用所述旧方法进行EryDex治疗的进入同情使用的4名患者继而(平均5次治疗之后)转用通过根据本发明所述的方法(EryDex，新方法)获得的EryDex进行治疗。与先前的方法相比，该方法引起显著改善。

以下表8显示，与ICARS研究的基线相比，以同情使用进行连续5个月的治疗后，以旧方法对4名AT患者进行治疗已经引起ICARS表中3.25分的提高。从临床角度来看，相对于百分比为5.9％的改进，该值被认为是温和的。事实上，小于10％的ICARS表的提高通常被神经学专家认为是没有意义的。

在转向用新方法获得的EryDex治疗后在4名患者上所观察到益处特别明显。事实上，与用旧方法治疗后所观察到的ICARS值相比，ICARS的平均提高为6.75分(13.1％)。由于血红细胞的某些特性的改善(与患者的血红细胞最相似)和较好的药物封装再现性，从临床的角度来看，该新方法允许在高度相关神经学方面获得改善。从IEDAT研究开始直到同情研究结束，用EryDex进行治疗的总共4名患者具有10分ICARS值或18.3％(下表的最后一列)的平均提高。与在AT患者身上在还没有接受EryDex治疗的检查期间或ICARS量表中平均具有7分的恶化所观察到的相比，该数据具有更多的重要性。

表8

图4中的曲线图示出了4名患者在用旧方法和新方法的极端治疗期间(彼此的连续性)的ICARS值。用新方法治疗期间，4名患者中涉及3名患者(患者02-02、02-05、02-08)的插入直线的斜率明显较大。较大的斜率清晰地表明，患者在使用新方法期间比在用旧方法治疗期间更快地改善其神经功能状况(然而在一名患者02-02的情况中表现出更差)。只有一名患者(02-01)当使用新方法时具有更低的提高速度；然而，该患者用先前的治疗已经取得了非常显著的提高，但是用新方法进一步改善了他的神经功能状况。

与高水平的治疗耐受性有关，即使在对用旧方法获得的EryDex治疗反应不强或者没有反应的患者中的神经功能状态的逐步改善表明显著的临床益处，根据新方法和根据本发明获得的EryDex治疗经该显著的临床益处带给患有共济失调毛细血管扩张的患者。

Claims (19)

1.一种用于制备载有一种或多种活性成分的红细胞的方法，包括以下步骤：

a)用第一低渗溶液使红细胞溶胀；

b)用比所述第一低渗溶液更低渗的第二低渗溶液使步骤a)得到的红细胞进一步溶胀，而没有达到裂解；

c)浓缩步骤b)得到的红细胞；

d)将经过浓缩的红细胞与包括一种或多种制药学感兴趣物质的裂解液接触，和随后

e)加入封闭液以获得载有所述一种或多种活性组分的红细胞群。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液使红细胞的渗透压达到250-200mOsm/Kg之间。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二低渗溶液使红细胞的渗透压达到200和170mOsm/Kg之间。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，包括在步骤(a)和(b)之间的额外步骤，其中至少部分所述第一低渗溶液在加入所述第二低渗溶液之前被去除。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中通过血液滤过、血液透析或离心来进行所述浓缩步骤(c)。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述裂解液使红细胞的渗透压达到150和110mOsm/Kg之间。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤(e)中的所述封闭液为从300到5000mOsm/Kg的高渗溶液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述制药学感兴趣物质选自以下活性组分：肽，寡肽，多肽，蛋白质，选自寡核苷酸、核苷酸类似物、核苷、核苷类似物的活性成分；选自激素、免疫抑制剂、抗肿瘤、皮质类固醇、糖皮质激素、抗反转录病毒消炎药、细胞因子、毒素、免疫活性物质的活性组分；诊断用造影剂；选自含金属纳米颗粒、磁性纳米粒子、超顺磁性粒子(SPIO)、复合纳米颗粒-活性分子的颗粒和纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述活性成分为6-巯基嘌呤、氟达拉滨磷酸盐、叠氮胸苷磷酸盐、双脱氧胞苷、脱氧腺苷、谷胱甘肽、二膦酸盐、泼尼松龙、泼尼松龙磷酸盐、地塞米松、地塞米松磷酸盐、倍他米松、倍他米松磷酸盐、地夫可特、胸苷磷酸化酶、苯丙氨酸氨裂解酶、吲哚菁绿、超顺磁性粒子。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法可获得的载有一种或多种制药学感兴趣物质的红细胞。

11.根据权利要求10所述的红细胞，其中用膜联蛋白V试验测量出的由所述红细胞产生的磷脂酰丝氨酸的比例小于10％。

12.根据权利要求10或11所述的红细胞，其中每10⁶个红细胞所产生的乳酸量大于0.100nmol/h。

13.根据权利要求10-12任一项所述的红细胞，其中所述一种或多种制药学感兴趣物质选自以下活性组分：肽，寡肽，多肽，蛋白质，选自寡核苷酸、核苷酸类似物、核苷、核苷类似物的活性成分；选自激素、免疫抑制剂、抗肿瘤、皮质类固醇、糖皮质激素、抗反转录病毒消炎药、细胞因子、毒素、免疫活性物质的活性组分；诊断用造影剂；选自含金属纳米颗粒、磁性纳米粒子、超顺磁性粒子(SPIO)、复合纳米颗粒活性分子的颗粒和纳米颗粒。

14.根据权利要求13所述的红细胞，所述活性成分选自：6-巯基嘌呤、氟达拉滨磷酸盐、叠氮胸苷磷酸盐、双脱氧胞苷、脱氧腺苷、谷胱甘肽、二膦酸盐、泼尼松龙、泼尼松龙磷酸盐、地塞米松、地塞米松磷酸盐、倍他米松、倍他米松磷酸盐、地夫可特、胸苷磷酸化酶、苯丙氨酸氨裂解酶、吲哚菁绿、超顺磁性粒子。

15.一种药物组合物，包括根据权利要求10-14任一项所述的红细胞和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

16.根据权利要求10-14任一项所述的红细胞或根据权利要求15所述的组合物在治疗性治疗中的应用。

17.根据权利要求16所述的红细胞或组合物在治疗性治疗中的应用，其中所述活性成分选自泼尼松龙、泼尼松龙磷酸盐、地塞米松、地塞米松磷酸盐、倍他米松、倍他米松磷酸盐、地夫可特。

18.根据权利要求16或17所述的红细胞或组合物在治疗性治疗中的应用，其中所述活性成分选自地塞米松磷酸钠和倍他米松磷酸钠。

19.根据权利要求16-18任一项所述的红细胞或组合物在治疗共济失调毛细血管扩张中的应用。