CN101031339A - 将活性成份掺入红细胞的裂解/再封方法和装置 - Google Patents

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Abstract

用于制备含有活性成分的红细胞的裂解/再封方法，该方法含有下列步骤：(1)将血球浓缩物悬于红细胞压积等于或高于65％的等渗溶液中，并维持在+1℃至+8℃，(2)基于来自相同血球浓缩物的红细胞样品测量渗透脆性，优选基于从步骤(1)所获得悬液的样品，(3)活性成分的裂解和内化步骤，在同一腔室内，温度恒定维持在+1至+8℃，包括允许红细胞压积水平等于或高于65％的红细胞悬液与在+1至+8℃冷藏的低渗裂解溶液在透析套管中循环，根据先前测量的渗透脆性调节裂解参数，和(4)在+30至+40℃温度下在第二个腔室中通过高渗溶液进行的再封步骤。

Description

将活性成份掺入红细胞的裂解/再封方法和装置
技术领域
本发明涉及允许实施所谓裂解/再封(resealing)技术的方法，其允许将活性成分并入红细胞中。本发明也涉及可实施该方法的装置。
本发明进一步涉及含有天冬酰胺酶等、或肌醇六磷酸的红细胞组合物，并且所述组合物可以通过实施根据本发明的方法而获得。
背景技术
裂解/再封技术在专利EP-A-101 341和EP-A-679 101中进行过描述。后者描述了一种相对复杂的装置，这种装置首先包含用于裂解部分的冷却结构，其中安置有一次性使用的组件，包括透析筒(cartridge)、管、曲折型(chicanetype)或弯曲(serpentine)囊袋以及可移除金属元件，比如弯曲型冷却装置；其次是用于再封的结构，此结构提供有再加热装置，里面装有一次性使用塑料组件。
事先从血浆中分离出红血球并置于弱离子力(在低渗介质中)，使之胀到临界体积，此时其膜胀到了容许离子和大分子透过的点。在显微镜下检查红细胞膜，显示孔的外观，其大小在20至500nm，因此血红蛋白可外逸(P.Seeman J.Cell.Biol.1967，32(1)：55-70)。恢复悬浮介质的等渗性将使孔关闭，使得大分子不能透过膜。仅维持了对离子的通透性。
通过使红血球在透析装置(优选有中空纤维)的“血液”室中循环，并使低渗溶液在该装置的“透析”室逆流循环从而进行低渗休克。这项技术的优点在于在低渗休克期间红血球被限制，使得这些细胞中生命必需组份的丧失显著减少。这样红血球的体内半衰期就不会明显改变。
与其它技术诸如封装于脂质体或微球中相比，用红血球作为药物载体的优点主要在于这些血球具有“天然”的生物兼容性，通过众所周知的方法可被完全生物降解，有相对较长的体内预期寿命(大约120天)，许多化学物质和治疗性分子都可以封装其中。
对红细胞裂解和再封的内化过程是一种复杂的多因素现象。与结果变异性有关的一些重要物理/化学参数是透析前血红蛋白浓度，红细胞悬液在透析装置中的流速，低渗透析缓冲液的摩尔渗透压浓度(osmolarity)，透析温度，再封温度以及透析装置的跨膜压力。红细胞的渗透脆性在不同的血液样品间有变化，这可能是一种首要生物因素。因此，L.Boucher等在Biotechnol.Appl.Biochem.1996，24，73-78中研究了不同群体红血球的渗透脆性变化对肌醇六磷酸的分布及终浓度的影响。在结论中作者指出红血球的起始渗透脆性对裂解程度以及活性成分内化差异起决定性作用，并且渗透脆性取决于许多因素，如红血球的渗透性、表面积/体积与离子含量之间的关系、供体的生理状态和年龄(也见A.AHussain et al.，Br.J.Haematol.1984，57(4)：716-718)、血液贮存时间的长短、药物的存在、疾病(也见K.Kolanjiappan et al.，Clin.Chim.Acta 2002，326(1-2)：143-149)和治疗。所得结果、以及红细胞悬液流速的变化证明了操作条件的极度敏感性，根据红血球是属于低水平脆组还是高水平脆性组，流速在12-14ml/分钟。
因此，这些文章提供了影响红血球渗透脆性的多种因素以及通过裂解/再封技术掺入的有效性的初步信息。它们让我们认识到在实践中碰到的困难，解释了这项技术不能常规用于人的保健。
一篇最近发表的文章很好地总结了目前的状况。作者是C.G.Millan等，发表于Journal of Controlled Release 2004，95：27-49，总体评述了红细胞作为药物载体的应用，文中作者认为尽管红细胞给人类医学带来了极大惊喜，然而由于保存困难、污染风险以及缺乏已验证的产业性制备方法，目前它们的发展依然十分有限。
天冬酰胺酶是一种由细菌微生物(大肠杆菌或欧文氏菌(Erwinia))产生的酶，它可以水解并消耗天冬酰胺，这是合成细胞生命尤其是成纤维细胞所必需蛋白质的不可缺少的氨基酸。不象正常细胞那样，一些癌性淋巴母细胞不能自己合成天冬酰胺，需要依赖于细胞外来源。因此天冬酰胺酶处理从这些细胞中去除该组分，导致其死亡。这种抗有丝分裂剂对于肿瘤细胞有选择性。
然而对于人类，天然的天冬酰胺酶诱导产生抗体，其平均存在于70％以上的患者，这导致天冬酰胺酶的清除增加以及过敏反应，有时过敏反应甚至十分严重(B.Wang et al.，Leukaemia 2003 17，8：1583-1588)。这样，尽管天冬酰胺酶对于治疗急性淋巴母细胞白血病十分有效，其毒性却十分大，可导致超敏反应，包括从简单的风疹型到全身性过敏性休克。此外，还观察到神经型(意识紊乱)、凝血型(低纤维蛋白原血症，抗凝血酶III和其它凝血因子的血清水平降低，导致出血和/或血栓性并发症)、胃肠型和胰腺型(包括胰腺的急性炎症)。
将天冬酰胺酶封装至红细胞中使得治疗指数得以提高(D.Schrijvers et al.，Clin.Pharmacokinet.2003，42(9)：779-791)。因此，提供将天冬酰胺酶以可重复性和工业化方式封装至红细胞中的方法将是大有裨益的。
此外，肌醇六磷酸被认为是红细胞中2，3-DPG(2，3-二磷酸甘油酸)的替代物，用于显著降低氧与血红蛋白的亲合力，增加组织中的氧释放(EP-A-0 101341)。专利US 4,321,259、US 5,612,207以及US 6,610,702描述了将该替代物掺入红细胞以及它的多种治疗应用。它们包括作为癌症放射疗法辅助治疗的适应症，用以提高缺氧肿瘤的供氧以及它们对放射治疗的敏感性。然而该适应症并未伴随任何可行性要素。
为进行包封，US 4,321,259将红细胞与含肌醇六磷酸的脂质体融合。US5,612,207利用电穿孔技术。US 6 610 702提供了电穿孔改进技术，通过肌醇六磷酸与阳离子铵结合以形成生物相容性水溶性复合物，其能促进向红细胞的导入。最后在Biotechnol.Appl.Biochem.1996，24，73-78中，如前所述，L.Boucher等研究了用裂解/再封技术将肌醇六磷酸导入红细胞。因此，本领域技术人员有多种途径将该化合物导入红细胞。然而，正如C.G.Millan等(见上)参考肌醇六磷酸用于一般性氧传输时所提及的，利用红细胞掺入诸如肌醇六磷酸的分子目前遇到缺乏已验证的产业化方法的问题。
因此，在本申请中，建立一种以可重复性和产业化方式将肌醇六磷酸掺入红细胞的方法是十分有益的。
综上所述，申请人关注的问题是提供一种以可重复方式生产掺入期望量活性成分的红细胞的工业化裂解/再封方法，并获得符合输血标准(无菌、无病原体和热源)的产品。
发明内容
本发明的一个重要目的是提供一种可用于符合输血要求标准的血球(globular)浓缩物的方法。
另一个目的是提供一种能使天冬酰胺酶或肌醇六磷酸以有效、可重复、可靠和稳定方式包封入红细胞中的方法。
这些及其它目的可通过制备包含至少一种活性成分的红细胞的裂解/再封方法来实现，该方法包含下列步骤：
1.将血球浓缩物(globular concentrate)悬于红细胞压积(haematocrit)水平等于或大于65％的等渗溶液中，并维持在+1至+8℃，
2.基于来自该相同血球浓缩物的红细胞样品测量渗透脆性，步骤1和2能够以任意顺序进行(包括平行)，
3.在相同腔室中，恒定保持在+1至+8℃的温度下进行的活性成分的裂解和内化步骤，包括允许红细胞压积水平等于或高于65％的红细胞悬液与温度冷至+1至+8℃的低渗裂解溶液在透析筒(cartridge)中循环；根据先前测量的渗透脆性调节裂解参数；和
4.在适于再封的温度、优选+30至+40℃下在第二个腔室中在高渗溶液存在下进行的再封步骤。
在优选实施方案中，步骤2所使用的悬液样品由步骤1制备。正如后面所所解释的，悬液可能是从经过常规处理比如用盐水溶液洗涤的血球浓缩物制备的。此外，待内化的活性成分可以存在于悬液中。因此，用该悬液样品并在活性成分处于初始悬液中的条件下实施步骤2是有利的，用含活性成分的悬液样品进行步骤2。
术语“内化”指的是将活性成分导入红细胞。
根据本发明的特征，血球浓缩物被悬浮在具有高红细胞压积水平的等渗溶液中，所述红细胞压积水平等于或大于65％，优选等于或大于70％，并将悬液低温保存在+1至+8℃，优选+2至+6℃，典型地在+4℃。根据具体方法，红细胞压积水平在65％至80％，优选70％至80％。
根据本发明的重要特征，渗透脆性是相对于裂解步骤前短时间的红细胞测量的。红细胞或者含红细胞的悬液有利地处于与裂解所选温度接近或相等的温度。根据本发明的另一个有利的特征，迅速进行渗透脆性测量，也就是说裂解步骤在取样后短时间内进行。在取样和开始裂解之间的时间间隔优选少于或等于30分钟，更优选少于或等于25分钟，或者甚至20分钟。
允许控制透析的两个参数是细胞在透析器中存在的时间(根据其特征)以及透析液的摩尔渗透压浓度。这两个参数必须根据被处理以便用于裂解/再封步骤的红血球的渗透强度或者反过来根据渗透脆性来调节。该渗透强度可用下列参数的至少一种来表征：
a.出现溶血也即开始形成孔洞的介质摩尔渗透压浓度。
b.溶血速度V，其通过溶血％＝f(介质的摩尔渗透压浓度)曲线线性部分的梯度建立。
c.给定摩尔渗透压浓度的溶血百分比。
d.达到50％溶血(H50)的摩尔渗透压浓度。
e.获得给定溶血百分比(例如50％)需要的时间。
根据优选实施方案，渗透强度用参数b、d或b和d来表征。
因此，渗透脆性必须在短时间内测量，这与取样和开始裂解之间的短时间间隔相容。根据本发明的特征，通过半透膜对具有已知等渗性的低渗溶液，例如水(蒸馏水等)测量一或多个溶血参数。可以考虑手工方法。然而，根据本发明的一个优选实施方案，渗透脆性通过自动测量装置进行测量，该装置被设置为在少于15分钟的时间内、更具体地在12分钟内、优选在10分钟内测量红细胞样品的渗透脆性，所得结果在短期内使用以调节裂解参数并开始裂解。
渗透脆性的测量可用一种装置来完成，其已将J.V.Dacie在PracticalHaematology第二版(Churchill，London 1956)中描述的手工技术至少部分实现了自动化。J.Didelon等在Clinical Hemorheology and Microcirculation 23(2003)31-42中描述了这种装置的一个例子。其原理是基于使用一种装置，其将在半透膜一侧和另一侧的待测红细胞悬液样品、以及合适体积的已知等渗性的低渗溶液例如蒸馏水集合到一起，使得随着NaCl离子扩散到溶液例如蒸馏水时产生红细胞的缓慢溶血。溶血随时间的进展通过用波长808nm的激光束测量透光率进行跟踪(见J.Didelon et al.，Biorheology 37，2000：409-416)。光电池测量透过悬液的光的变化。例如，在10分钟期间测量。该装置允许获得一或多个上述参数a-e。
根据第一种方法，在温度变化对测量没有不利影响的条件下，对起始温度为+1至+8℃的样品进行渗透脆性测量，优选也使用该温度的蒸馏水。根据第二种方法，对温度保持在+1至+8℃的样品进行渗透脆性测量。这样，以上由J.Didelon等描述的测量装置可以调整以允许控制温度。优选地，该温度与裂解温度相似或一致。
一旦已经确定一或多个这些参数，可应用考虑这些参数的关系，以建立细胞在透析器中的流速、或者透析液的摩尔渗透压浓度，这足以获得包封有活性成分和/或其期望量的红血球：
红细胞流速＝[A×(H50)]+[B×(V)]+K
-A和B＝可根据透析器和裂解溶液的摩尔渗透压浓度调节的变量
-K＝调节常数
透析液的摩尔渗透压浓度＝[C×(H50)]+[D×(V)]+K
-C和D＝可根据透析器和透析器中红细胞流速调节的变量
-K＝调节常数
根据一个优选实施方案，测量导致约50％溶血的NaCl浓度(g/L)(参数d)，并根据测量的浓度值调节透析筒中红细胞悬液的流速。
根据本发明的一个方面，当红细胞悬液温度在+1至+8℃时开始裂解步骤，已经测量渗透脆性并记录裂解参数。
根据一个有利的特征，将待处理的起始悬液放于前面提到的裂解/内化室中。根据本发明的一个实施方案，本方法使用带温控的低温模块，保持低温在+1至+8℃的红细胞悬液袋被置于该模块上并连接或准备连接至无菌一次性使用可移除组件上，其包含透析筒、用于将透析筒一端连接至小袋和另一端连接至裂解溶液的管，模块还包含使红细胞悬液和裂解溶液循环的装置，模块内部的温度稳定在+1至+8℃。低温模块的尺寸可适应小袋和可移除一次性组件。实际上，将由很多管连接起来的小袋、透析筒、和裂解溶液提供在单个此类型的低温模块上，这是根据本发明方法的一个有利特征。
术语“小袋”指的是通常用于输血和血制品领域的弹性小袋。
根据本发明的一个重要方面，采取措施确保红细胞在袋中处于均匀悬液中以使通过透析器时悬液的红细胞压积水平保持稳定。根据本发明的一个特征，为此给小袋提供外环式循环，这可使悬液进出小袋来回循环。
术语透析筒(cartridge)指的是包含两个由透析壁分隔的隔室的器件，通过该透析壁可进行离子交换，通过将含盐的水溶液导入一个隔室，允许以受控方式来调节位于另一隔室的水溶液的渗透压。这种类型的筒被广泛用于医药领域。根据一种优选方法，采用具有中空纤维的透析筒，例如具有下列具体特征的这种类型的筒：纤维内径在100至400μm，纤维的总外表面积为0.3至2m2，纤维长度为10至40cm，超滤系数为1.5至8ml/h.mmHg。
根据上述所给细节，当袋中悬液温度为+1至+8℃时可开始裂解。依照一个便利方法，悬液温度通过安置于外环型循环器的传感器来控制。
根据检测的渗透脆性，可调节两个主要参数，即红细胞悬液在透析筒中的流速和裂解溶液的摩尔渗透压浓度，在两种情况下都优选固定裂解溶液于恒定流速。流速的值并不重要。典型地对有中空纤维的透析筒，如前所述，裂解溶液的流速固定在50至300ml/分钟，优选150至250ml/分钟。
裂解溶液是一种盐溶液，其相对于红血球悬液来说是低渗的。当其被固定在恒定值时，其摩尔渗透压浓度典型的是20至120mOsm，优选70至110mOsm，例如90mOsm量级。
作为实例，裂解溶液可包含Na2HPO4和/或NaH2PO4和糖，比如葡萄糖。
根据第一种方法，调节通过透析筒的红细胞悬液的流速，同时固定裂解缓冲液的流速和摩尔渗透压浓度。渗透脆性越高，悬液的流速增加越多。典型地，对于以上指出规格的筒，流速在5至200ml/分钟范围内变化，优选10至40ml/分钟。
根据第二种方法，调节裂解溶液的摩尔渗透压浓度，同时固定悬液和裂解溶液的流速。渗透脆性越高，裂解溶液的摩尔渗透压浓度增加越多。典型地，摩尔渗透压浓度在10至200mOsm/l范围内变动，优选20至150mOsm/l。
根据第三种方法，通过透析筒的红细胞悬液的流速和裂解溶液的摩尔渗透压浓度均被调节。
根据本发明，可引入一或多种活性成分掺入红细胞中。活性成分可以存在于悬液袋中，和/或导入(优选逐渐导入)透析筒上游或下游的悬液循环中。由于导入的体积小，活性成分的冷却并非必须。
红血球悬液优选产自与受体血型相配的血球浓缩物，其中已除去白细胞，未检测到病原，特别是以袋装方式提供，例如含500ml。当红血球意图用于可能经历移植物/宿主型免疫反应的高度免疫缺陷患者时，红血球可能已经放射处理(R.J.Davey Immunol.Invest.1995，24(1-2)：143-149)。
根据本发明的具体特征，用于制备悬液的起始血球浓缩物事先已经过处理以去除红细胞以外的其它血液组分。这种类型的处理是本领域技术人员已知的，例如用盐水溶液清洗以去除血浆或保存溶液。
根据具体方法，洗涤是在一或多种待掺入活性成分存在下进行的。
洗涤可以用任何常规技术来实施，例如洗涤红血球的四袋技术(MacroPharma法和转移袋)。使用COBE 2991 Cell Processor型自动红血球洗涤装置也是可以的。
根据本发明的另一个特征，红细胞可以预先用可增加和/或均化其渗透强度的溶液进行处理。这种溶液对本领域技术人员是已知的。例如，含L-肉毒碱的溶液可使待获得的红血球的渗透强度增加。其它实例包括肝素、柠檬酸-磷酸-葡萄糖(CPD)和甘露醇溶液。
在裂解步骤中温度优选维持在+2至+6℃，更优选大约在+4℃。
优选通过再加热裂解的悬液并添加高渗再封溶液来进行再封操作。再封温度可以在+30至+40℃之间，优选是+35至+38℃，例如大约+37℃。孵育时间典型地持续15至45分钟。
优选地，将从透析筒中排出的悬液和高渗再封溶液导入(优选连续导入)中间袋。悬液在此再加热并在期望温度孵育足以保证再封的一段时间。根据特定方面，中间袋放在一个加热了的腔室或模块中，其内部温度控制在选定温度。
作为另一种变化形式，悬液以及再封溶液被导至中间袋。当所有悬液都收集至该袋中时，密封并转移到允许加热至期望温度并在此温度孵育的模块上。
然后再封的红血球悬液可用盐水进行一或多步洗涤，以去除未密封或封得不好的细胞、剩余物和细胞外血红蛋白。
根据另一个特征，红细胞在用于保藏红细胞的溶液中处理红细胞，比如含L-肉毒碱的溶液。
生产出的红细胞优选保存在+1至+8℃，更优选+2至+6℃，典型地约+4℃。
待用产品最终的红细胞压积水平实际为40-70％。
本发明也涉及可用于实施根据本发明制备红细胞的方法的裂解/再封装置，该装置包含：
-可冷却至+1至+8℃的模块，其包含冷却和控温装置，
-无菌一次性使用的可移除组件，其配置成能放于模块中并且包含透析筒，该透析筒能在一侧连接至裂解溶液入口、在另一侧连接至红细胞悬液入口，
-根据待加工红细胞的渗透脆性，调节通过裂解筒的红细胞悬液流速和/或调节裂解溶液摩尔渗透压浓度的装置。
根据一个实施方案，本身构成本发明一个方面的可移除组件是一次性使用的试剂盒，包含可含有红细胞悬液的小袋以及连接该小袋至透析筒的管，该模块包含有泵，该泵能与所述管协作使红细胞悬液从袋中循环至并通过筒，该泵任选地连接了调节流速的装置。该组件可保持无菌。
根据有利的特征，所述小袋还带有环形管与袋子两端相连，并且模块包含有泵，其可与该管协作使袋中内容物循环起来。这种带有环形管和至少一个入口或出口点的柔性袋自身也构成本发明的一个方面。该袋可包含至少一个其它柔性管，其与每个入口/出口相连。袋子可与泵相连(例如蠕动泵)，泵配置成与环形管和/或用于袋以及任选地泵的支持物协作。由于合乎需要的是保持组合物、例如用于胃肠道外供应的组合物的给定程度均一性，因此这种小袋可用于向人或动物施用组合物(例如悬液、乳液)。
根据另一个有利特征，温度探测器安置在环形管上。
根据另一个特征，用于注射活性成分的管连接至将小袋连接至透析筒的血液入口的管。
根据另一个特征，透析筒由管子连接至可含有裂解溶液的瓶(flask)，并且冷却模块包含用于该瓶的接收装置和可与该管协作使裂解溶液在透析筒中循环的泵。
根据本发明的一个优选特征，冷却装置和控温装置能将模块内温度维持在+2至+6℃，优选为约+4℃。
根据另一个特征，透析筒的“血液”出口与流出管相连，该管开口或可开口于模块外。根据另一个特征，用于注射活性成分的管连接至该流出管。流出管可连于第二个小袋(中间袋)，该袋可收集从裂解溶液以及再封溶液(优选由第二根管导入，该管开口入流出管中，位置在其开口于中间袋中位点的稍上游)中流出的红细胞悬液。该袋有利地安置在第二个模块中，该模块配有能将模块温度控制在+30至+40℃、优选控制在+35至+38℃的装置。
根据一个有利的实施方案，一次性使用的可移除组件在一个单元中包含：小袋、循环管、注入管(配有注入装置或旨在与该装置协作的接受器)、透析筒以及优选地裂解溶液瓶。
优选地，可移除组件本身不包含专用于冷却或加热的装置。这些功能仅由放置该组件此两部分的模块或腔室来实现。
用于本发明方法和装置的泵优选是蠕动泵(闭塞泵)；根据一个实施方案，使悬液在起始小袋再循环的泵和使裂解缓冲液循环的泵具有恒定、预设的转速，而传送悬液至透析筒的泵具有可根据待处理红细胞的渗透脆性调节的转速。
活性成分可通过任何合适方式导入，例如，固定速率的活塞注射器，其任选地是受控制的、并连于相应的注入管。作为一种变化形式，活塞注射器可用蠕动泵代替。
所述装置包含根据待处理红细胞的渗透脆性来调节通过裂解筒的红细胞悬液流速和/或调节裂解溶液摩尔渗透压浓度的器件。
根据一个特征，流速调节器件被配置成控制传输悬液至透析筒的泵。根据另一种替代特征，调节器件被配置成控制裂解溶液的摩尔渗透压浓度，以稀释和降低摩尔渗透压浓度或者通过导入合适的溶质以增加摩尔渗透压浓度。作为一种变化形式，任选地可以将具有相对于待处理红细胞的渗透脆性进行调节的摩尔渗透压浓度的裂解溶液引入模块。
根据一种优选的方法，所述装置包含可根据操作者输入的指令(例如，操作者直接输入关于红细胞悬液流速的数据)、或者根据操作者的数据输入针对渗透脆性(电子器件配置成建立和调节裂解参数，例如红细胞悬液的流速)来控制裂解过程和任选地再封过程的电子器件。这些电子器件优选连接于温度传感器(以控制模块内和/或用于红细胞悬液的温度传感器处的温度)。这些器件可以控制并操作泵，例如，通过透析筒的悬液的压力和流速。
优选地，这些模块至少有一面是玻璃表面，其允许对装置、以及溶液和悬液的循环进行可视控制。
根据本发明的方法和装置可用于掺入多种活性成分，特别是选自用于人或动物治疗的药物、疫苗、酶、肽、抗原和造影剂(见例如C.G.Millan，J.ControlledReleased 2004，95：27-49)。
本发明也涉及根据本发明方法来有效、可重复、可靠和稳定地掺入天冬酰胺酶的应用。根据本发明，术语天冬酰胺酶是指任何来源的任何天冬酰胺酶，不管是天然的、合成的、人工的还是重组的，以及掺入它的衍生物，例如，天冬酰胺酶与聚合物如聚乙二醇(PEG)的组合(例如，PEG化天冬酰胺酶或peg天冬酰胺酶，这是包封在PEG中的一类天冬酰胺酶；例如Oncaspar，其由Enzon和Medac销售)。
根据多种可能的方法，将天冬酰胺酶引入初始袋和/或透析筒上游和/或下游悬液的循环。优选引入透析筒上游悬液的循环。最好用含有天冬酰胺酶的悬液测定渗透脆性。然后对悬液进行再封、洗涤、任选地向其加入保护溶液，再保存备用，优选保存于柔性袋中。
计量悬液中天冬酰胺酶的方法是已知的，这样可以根据治疗要求的剂量调节最终袋中的悬液体积。
根据一个优选实施方案，起始浓缩液去除了白细胞，和/或经过辐照。
根据一个具体方面，也可导入意图用于组合治疗的活性成分，例如，长春新碱和/或氨甲喋呤，和/或任选地除天冬酰胺酶以外还有其它有利的活性成分。
本发明也涉及可通过实施本发明方法获得的含天冬酰胺酶的红细胞悬液或浓缩物。该悬液可制备于制药可接受的盐水溶液中(通常是红细胞的标准介质，含NaCl和选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇中的一或多种成分的溶液；例如SAG-甘露醇或ADsol)。这种溶液能够确保对红细胞的保护作用并且可包括保护添加剂如L-肉毒碱。红细胞也可包含长春新碱和/或氨甲喋呤、和/或任选地任何与天冬酰胺酶联合有益的其它活性成分。悬液或浓缩物也可处理以在使用前稀释。悬液也可处理以备使用。备用产品的最终红细胞压积水平优选在40％至70％。
本发明也涉及通过施用有效量的含天冬酰胺酶并可根据本发明方法获得的红细胞悬液以治疗急性淋巴母细胞白血病和淋巴瘤的方法。本发明的一个特别方面包括从患者或一或多个供体获取一或多个血液样品，制备红细胞浓缩物，根据本发明掺入天冬酰胺酶、和生产一批掺入天冬酰胺酶的红细胞，然后将悬液通过静脉内途径施用给患者。典型地，施用处理后红细胞悬液的体积对应每千克体重60至200单位的天冬酰胺酶。
本发明也涉及含天冬酰胺酶并可根据本发明方法获得的红细胞用于制备治疗患者中急性淋巴母细胞白血病或淋巴瘤的药剂或药物的用途。本发明的一个具体方面包括从患者或一或多个供体获取的一或更多单位的血液制备红细胞浓缩物，根据本发明掺入天冬酰胺酶、并生产一批掺入天冬酰胺酶的红细胞，用于将这些红细胞治疗患者的用途。根据一种专门方法，这种用途意图生产含一定剂量、例如一定体积的处理后红细胞悬液的小袋，所述一定体积的处理后红细胞悬液包含相当于每千克体重60至200单位的天冬酰胺酶。
本发明也涉及应用本发明方法来有效、可重复、可靠和稳定地掺入肌醇磷酸，特别是肌醇六磷酸和肌醇五磷酸、或其衍生物。优选肌醇六磷酸。
根据许多可能的方法，将肌醇磷酸引入至初始袋和/或至透析筒上游和/或下游悬液的循环。优选引入至初始袋中。最好用包含肌醇磷酸的悬液测量渗透脆性。然后对悬液进行裂解、再封、洗涤、任选地添加保护溶液，再保存备用，优选保存于柔性袋中。
计量悬液中肌醇磷酸的方法是已知的，这样可以根据治疗要求的剂量调节最终袋中的悬液体积。
根据一个优选实施方案，起始浓缩液去除了白细胞，和/或经过辐照。
本发明也涉及可通过实施本发明方法获得的含肌醇磷酸、特别是肌醇六磷酸或五磷酸的红细胞悬液或浓缩物。悬液可制备于制药可接受的盐水溶液中(通常是红细胞的标准介质，含NaCl和选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇中的一或多种成分的溶液；例如SAG-甘露醇或ADsol)。这种溶液能够确保对红细胞的保护作用并且可包括保护添加剂如L-肉毒碱。也可处理悬液或浓缩物以在使用前稀释。悬液也可处理以备使用。备用产品的最终红细胞压积水平优选在40％至70％。
本发明也涉及肿瘤供氧、特别是联合放射治疗的方法，包括向患者施用有效量的掺入肌醇磷酸、特别是肌醇六磷酸的红细胞悬液，这种悬液可通过本发明方法获得。本发明的一个特别方面包括从患者或一或多个供体获取一或多个血液样品，制备红细胞浓缩物，根据本发明掺入肌醇磷酸、尤其是肌醇六磷酸、和生产一批掺入该化合物的红细胞，然后将悬液通过静脉内途径施用给患者。优选地，这种方法与放射治疗联合使用，因此可以通过静脉内途径与全部或部分放射治疗连续地施用处理后红细胞一段足够长时间，此外优选在该治疗之前和/或之后。
根据本发明的方法可用于治疗多种癌症，特别是肺癌、前列腺癌、直肠癌、食管癌以及脑肿瘤。该方法尤其可用于对辐射不敏感的肿瘤，这类肿瘤通常有组织缺氧，尤其是恶性胶质瘤。根据本发明的具体方面，该方法可用于治疗胶质母细胞瘤和ENT(耳鼻喉)癌。
本发明进一步涉及含肌醇磷酸、特别是肌醇六磷酸并可根据本发明方法获得的这些红细胞用于制备药剂或药物的用途，所述药剂或药物旨在用于治疗患者中上述类型的癌症，特别是与放射治疗联合使用。本发明的一个具体方面包括从患者或一或多个供体获取一或多个血液样品，制备红细胞浓缩物，根据本发明掺入活性化合物、和批量生产掺入该化合物的红细胞，用于将这些红细胞治疗患者的用途。
本发明也涉及治疗镰刀型细胞贫血或其它缺氧状态的方法，包括向患者施用掺入肌醇磷酸、尤其是肌醇六磷酸并可以用本发明方法获得的红细胞悬液。本发明的一个具体方面包括从患者或一或多个供体获取一或多个血液样品，制备红细胞浓缩物，根据本发明掺入肌醇磷酸、尤其是肌醇六磷酸、和生产一批掺入该化合物的红细胞，然后将悬液通过静脉内途径施用给患者。
本发明进一步涉及含肌醇磷酸、特别是肌醇六磷酸并可根据本发明方法获得的这些红细胞制备用于治疗组织缺氧患者的药剂或药物的用途，组织缺氧的特征是向组织、尤其是肌肉和骨骼的氧传送很低。这种治疗对镰刀型细胞贫血的患者特别有益。本发明的一个具体方面包括从患者或一或多个供体获取的一或多个单位的血液用于制备红细胞浓缩物，根据本发明掺入活性化合物、和批量生产掺入该化合物的红细胞，用于将这些红细胞治疗患者的用途。
掺入到红细胞中的肌醇六磷酸或类似物导致血红蛋白的氧亲合力降低。这导致了更好的组织供氧，并降低了由镰刀型红细胞贫血引起的缺氧症状。P50是对应血红蛋白达到50％氧饱和的氧压力(PO2)。P50增加25mmHg将导致供氧提高约两倍(供氧是100mmHg和40mmHg的PO2值之间饱和的差异)。因此，对于有2000mL红细胞的成年人，输注含200ml含肌醇六磷酸的红细胞的血袋可导致增加超过10％的供氧能力为正常情况两倍的红细胞。这可使供氧作用增加20％以上，对于组织缺氧个体这是十分有益的。
这种方法包括输注代表个体5％至20％、优选10％至15％红细胞量的体积，输血频率最好是每个月或每两个月一次。
附图说明
本发明现在要通过参考实施方案和附图用非限制性实施例来更详细描述，其中：
-图1是根据本发明的裂解/再封装置的示意图；
-图2是所述过程的基本流程图；
-图3显示红细胞的溶血过程，表示为根据以分钟表示的孵育时间致使约50％溶血的NaCl浓度(g/L)；
-图4是类似于图3的图表，在此在天冬酰胺酶(200IU/ml)存在下测量溶血；
-图5是与图3和图4类似的图表，在天冬酰胺酶(400IU/ml)存在下进行测量；
-图6显示根据致使50％溶血的NaCl浓度(g/L)的包封率。
具体实施方式
实施例1：装置
首先参考图1。第一个虚线框指示第一模块1，其通常为平行六面体形状，包括玻璃前面(其未示出)，该玻璃前面可打开和关上。蠕动泵P1、P2和P3以及可移除组件的接受器件(未标注)被安置在模块底部，现在将描述该组件。泵P1和P3有恒定、预设的流速。控制泵2以使流速变化。
可移除组件包含柔性小袋2，其包含待裂解的红细胞悬液。袋2附带柔性管3，呈环形，其与泵1协作使小袋循环以保持红细胞处于悬浮状态。袋底部进一步连接柔性管4，其连接至透析筒5的“血液”隔室的入口。管4与泵2协作将悬液从袋子循环至筒中。受控活塞型注射器PS1在筒5上游连于管4，该活塞型注射器用于将活性成分引入至红细胞循环中。筒5的“血液”隔室出口连至柔性出口管6，其开口于模块1之外。第二个受控活塞型注射器PS2连于管6，该活塞型注射器用于将活性成分引入裂解红细胞的循环中。盛有裂解溶液的瓶7被安置在模块1中，并用柔性管8连接至筒5的“透析液”入口，柔性管8与泵P3协作，使裂解溶液通过筒5循环。最后从筒中流出的裂解溶液从模块1中通过柔性排出管9排出，管9开口于位于模块1外的瓶10中。
出口管6延伸入第二模块11，其通常为平行六面体形并包括未示出的玻璃前面，该玻璃前面可打开和关上。接收器件装置(未示出)作为可移除组件的一部分被安置在该模块底部。这些包含与管6相连的柔性袋12，袋中保存已裂解悬液。受控的活塞型注射器PS3与管6相连，用以注入再封产物。
可移除组件完全用柔性透明塑料材料生产，使得该过程完全可视。
进一步以多种未示出的方式提供该装置：
-用于模块1内部冷却并将其温度控制在+2至+4℃的器件，其包含温度探头，被置于管3上以测量在该处循环的悬液的温度，测量模块1内部温度T1的温度探头，
-模块11还带有能加热其内部并将此处温度T2控制在+37至+38℃的器件；
温度探头置于该模块内部，
-检测(例如，超声或比色方法)D1和D2处管中红细胞的存在情况的装置，
-测量透析筒入口处压力的装置PR1，
-电子设备，其首先接收来自温度探头、压力探头和检测器件的信息，然后是关于调节裂解参数的信息；基于这些数据，该设备控制泵P1、P2和P3。图2显示了工艺流程图。
该电子设备由设计为执行上述流程的计算机组成。
根据另一个特征，其记录每个裂解步骤以及每种处理后浓缩物的参数。
实施例2：封装天冬酰胺酶
在该实施例中，渗透脆性定义为导致约50％溶血的以g/L表示的NaCl浓度。
1)天冬酰胺酶对渗透脆性的影响：
a.制备天冬酰胺酶溶液：
通过隔膜用注射器将2.5ml 0.9％NaCl注入含10000IU粉状天冬酰胺酶的瓶中。搅动该混合物直至溶解，这样就获得了浓度为4000IU/ml的母液。用注射器将内容物取出并将其置于5ml溶血管中。准备三种溶液并保存在+4℃：0IU/ml溶液(构成0.9％NaCl对照)，3200IU/ml溶液(加625μl 0.9％NaCl至母液中)以及1600IU/ml溶液(取1ml 3200IU/ml溶液，加入1ml 0.9％NaCl溶液)。
b.洗涤红血球：
-从在柠檬酸磷酸右旋糖上取出、并于+4℃下1000g离心20分钟的全血开始，
-轻轻移出血浆，并去除暗黄层(buffycoat)，
-在+4℃将等体积0.9％NaCl加至红血球浓缩物中，
-于1000g离心20分钟，弃除上清，
-重复上述两步进行第二次和第三次洗涤，
-弃除上清，用0.9％NaCl溶液将红细胞压积调整到80％，
-用875μl体积的红血球悬液准备管。
这用来自六个不同供体的六个血液样品进行。
c.添加天冬酰胺酶溶液
-测量所述6个样品的初始渗透脆性，
-对每个天冬酰胺酶浓度，以6管的比率添加125μl的0、1600或3200IU/ml天冬酰胺酶溶液；每管轻摇片刻。三个六管组中包含的终浓度为：0，200和400IU/ml。将这些管在碎冰上保存在+4℃直至测量渗透脆性。
-检测四个孵育时间：5，15，30和60分钟。孵育时间的终点确定为将管从碎冰上拿开的时间，
-在环境温度下测量渗透脆性。
d.在法国SODEREL MEDICAL，Haillecourt销售的名为OSMOCELLS的装置上测量渗透脆性。
e.结果
图3、4和5展示了无天冬酰胺酶或存在天冬酰胺酶的情况下透析前红细胞渗透脆性的发展和分布。
这些结果证明根据存在的天冬酰胺酶浓度和根据时间，红细胞的渗透脆性在血液样品之间有较宽的变异。这些结果强调了尽可能接近透析阶段、优选在待包封的天冬酰胺酶存在下测量待处理红细胞样品的渗透脆性的重要性。
2)包封和再封过程：
a.设备
-透析筒：
.PRISMA M60 PPI型，由GAMBRO，Lakewood，CO，USA销售
.尺寸(cm)38×21×9
.血液腔室体积：84ml
.中空纤维：丙烯腈和甲代烯丙基磺酸钠共聚物
.有效表面积：0.60m2
-装置的操作参数：
-P1＝20ml/分钟
-P2＝可变
-P3＝150ml/分钟
-PS3＝P2的10％
-T2＝30分钟
b.产品
-由“Centre de Transfusion Sanguine”(法国输血中心)提供的压紧红细胞(packed red blood cells)，也就是说，SAG-甘露醇中的红细胞悬液，
-调节红细胞压积至70％
-天冬酰胺酶溶液：透析前通常是400IU每毫升的红血球悬液。
c.结果
图6显示在透析器中在400IU/ml天冬酰胺酶并且P2流速为22ml/分钟时的包封率。似乎包封率根据透析前的渗透脆性而变化(5个样品)。根据测量的渗透脆性，通过调节透析参数，特别是透析器中红细胞悬液的流速来优化本发明方法，以确保尽管有血样中固有的变异而尽可能保持包封率恒定。
将流速P2(透析筒中红细胞悬液的流速)作为调节手段，可以建立所用透析筒的下列优化水平。
表1
    渗透脆性g/L     流速P2ml/分钟
    ＞4.7     24
    4 to 4.7     25
    3.5 to 4     22
    ＜3.5     20
渗透脆性大于4.7时流速P2的降低可用透析产生的现象解释。在流速为26ml/分钟及以上时跨膜压力的增加导致渗透效应增加。因此，如前所指，降低流速P2是有利的。
记录根据本发明方法处理的7个不同红细胞样品的血液学和掺入参数(根据表1、即依赖于每个样品的渗透脆性调节P2)，将这些血液学参数与从健康个体获得的值进行比较。表2给出测量的血液学参数的平均值。
表2
血液学参数 起始细胞物质 终产物(J0)     终产物+4℃24小时后     正常值(循环细胞)
  平均细胞体积(MCV)(飞升fl)     84.7±2.9     76.6±3.9     80±3.7     83-97
  平均细胞血红蛋白(pg)     28.4±1.7     22.1±0.7     22.5±1.6     28-32
  平均细胞血红蛋白浓度(％) 34.0±1.2 29.2±0.9 27.9±1.2 31-35
  渗透脆性(盐度诱导约50％溶血)(g/l)     3.97±0.5     3.53±0.4     Not carried out     3.7-4.3
  悬液的红细胞压积(％)     60.5±3     50.4±2.6     47.6±3     NA
  悬液的血红蛋白浓度(g/dl) 18.7±1.1 12.9±0.7 13.1±0.6 NA
  红细胞浓度(106/mm3)     6.31±0.44     5.8±0.44     5.8±0.37     NA
  细胞外血红蛋白(g/dL)     0     0     1     NA
NA＝不适用
掺入参数：
用J.L.Orsonneau在Annales de Biologie Clinique 2004，Vol.62，No.5中描述的方法，对经冻融裂解后的红细胞确定天冬酰胺酶的剂量。
-天冬酰胺酶的平均血球(globular)水平，表示为天冬酰胺酶IU每109个红细胞：10±1.1。
-天冬酰胺酶的平均血球浓度，表示为IU/ml红细胞：112±11.3。
-包封率(终产品中天冬酰胺酶的血球浓度/透析前天冬酰胺酶的浓度)：29.8％±2.1。
在用十四个不同样品进行的初步实验中，不考虑渗透脆性也不调节流速，但流速P2在18至30ml/分钟，有可能测量平均包封率是32±12.4％，其代表非常大的变异性。相反，在以上实验中调节流速P2可获得更加均匀的平均包封率(29.8％±2.1)。

Claims (22)

1.制备包含活性成分的红细胞的裂解/再封方法，该方法包括下列步骤：
(1)将血球浓缩物悬于红细胞压积水平等于或大于65％的等渗溶液中，并维持低温在+1至+8℃，
(2)基于来自相同血球浓缩物的红细胞的样品测量渗透脆性，步骤1和2可以任何顺序进行，
(3)在相同腔室内、在恒定维持在+1至+8℃的温度下裂解和内化活性成分的步骤，其包括允许红细胞压积水平等于或高于65％的红细胞悬液以及冷却在+1至+8℃的低渗裂解溶液在透析筒内循环；根据先前测量的渗透脆性调节裂解参数；
(4)在第二腔室中在+30至+40℃温度下由高渗溶液进行的再封步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中用配置成在小于15分钟内测量红细胞样品渗透脆性的测量装置测量渗透脆性，并且所得结果在短期内应用以调节裂解参数。
3.根据权利要求1或2的方法，其中对具有已知等渗性的低渗溶液通过半透膜测量红细胞样品的一或多个溶血参数。
4.根据权利要求3的方法，其中测量一或多个以下参数：
a.发生溶血的介质的摩尔渗透压浓度，
b.溶血速率，其是通过溶血％＝f(介质的摩尔渗透压浓度)曲线线性部分的梯度而建立，
c.给定摩尔渗透压浓度下的溶血百分比，
d.允许获得50％溶血的摩尔渗透压浓度，
e.获得给定溶血百分比所需的时间。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中使用带有温度控制的低温模块，低温保持在+1至+8℃的红细胞悬液的小袋被放于模块中，并连接或待连接至无菌、一次性使用的可移除组件，其包含透析筒、将透析筒一侧连接至小袋且另一侧连接至瓶的管，所述模块进一步包含能使红细胞悬液和裂解溶液循环的装置，模块内部的温度被稳定在+1至+8℃。
6.根据权利要求5的方法，其中当袋中悬液温度为+1至+8℃时开始裂解步骤。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中在悬液在透析筒中穿过的全部时间中悬液中维持稳定的红细胞压积水平。
8.根据权利要求7的方法，其中使用带有外部环形循环的小袋，其能使悬液出入小袋而循环。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中基于渗透脆性测量来调节通入透析筒的红细胞悬液的流速或者来选择裂解溶液的摩尔渗透压浓度。
10.根据前述任一项权利要求的方法，其中活性成分存在于悬液袋中和/或在通过透析筒之前和/或之后引入至悬液循环中。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中血球浓缩物含有先前已经用能增加和/或均化其渗透强度的溶液处理过的红细胞。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤1和3中的温度维持在+2至+6℃，优选约+4℃。
13.根据前述任一项权利要求的方法，其中活性成分选自天冬酰胺酶和肌醇六磷酸。
14.根据权利要求13的方法，来生产掺入天冬酰胺酶的红细胞用于治疗患者中急性淋巴母细胞白血病和淋巴瘤，或者来生产掺入肌醇六磷酸的红细胞用于与放射治疗联合以治疗组织缺氧性肿瘤或治疗镰刀型细胞贫血或其它缺氧状态。
15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中对步骤(1)获得的悬液样品测量渗透脆性。
16.裂解装置，可用于实施根据前述任一项权利要求的制备含活性成分的红细胞的方法，该装置包含带有冷却器件的模块(1)，配置成能置于模块(1)中并包含透析筒(5)的无菌、一次性使用的可移除组件(2至12)，所述透析筒(5)能在一侧连接至裂解溶液入口而在另一侧连接至红细胞悬液入口，其特征在于，模块(1)中带有将温度控制在+1至+8℃的器件和根据待处理红细胞的渗透脆性来调节通过裂解筒的红细胞悬液流速和/或调节裂解溶液摩尔渗透压浓度的器件。
17.根据权利要求16的装置，其中可移除组件包含能含有红细胞悬液和管(4)的小袋(2)，所述管(4)将该小袋连接至透析筒(5)，并且模块(1)包含能与所述管(4)协作并使红细胞悬液从袋中循环至和通过筒(5)的泵(P2)，该泵(P2)任选地连接至调节流速的器件。
18.根据权利要求16或17的装置，其中小袋带有在其两端连接至袋(2)的环形管(3)，并且模块(1)包含能与管(3)协作并使袋中内容物在袋中进出而循环的泵(P1)。
19.根据前述任一项权利要求的装置，其中注入活性成分的管连接至管(4)，管(4)将小袋(2)连接至透析筒(5)的“血液”入口，透析筒(5)通过管(8)连接至能含裂解溶液的瓶(7)，并且模块(1)包含瓶(7)的接收器件和泵(P3)，该泵(3)能与管(8)协作使裂解溶液进和通过透析筒而循环；并且透析筒的“血液”出口连接至开口或可以开口于模块外的管(6)。
20.根据权利要求19的装置，其中管(6)连接至能收集从裂解以及再封溶液中排出的红细胞悬液的第二小袋(12)，该袋安置在第二模块(11)中，该模块带有能将模块中温度控制在+30至+40℃、优选+35至+38℃的器件。
21.根据前述任一项权利要求的装置，其包含能根据操作者所输入指令或者根据操作者的数据输入针对渗透脆性来控制裂解过程和任选再封过程的电子器件。
22.柔性塑料材料的一次性使用组件，其适于实施根据前述任一项权利要求的方法和装置，其包含带环形管(3)的袋(2)，环形管(3)通过其两端与袋相连，然后袋(2)连接至管(4)，管(4)连接至透析筒(5)的血液入口，其“血液”出口连接至与第二小袋(12)相连的管(6)，至少一个另外的管开口入管(4)或管(6)中，并且透析筒进一步连接至用于循环裂解溶液的两管(8和9)；管(6)优选连接至第二小袋(12)并且第二管(12)与管(6)相连。
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