CN102272323A - 用于预测对天冬酰胺酶活性的中和作用的测试 - Google Patents
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Abstract
一种体外测量获取自患者的可能含有天冬酰胺酶中和因子的血液、血浆、血清或衍生基质样品中能中和天冬酰胺酶活性之因子的存在的方法，其包括将所述样品与天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后测量混合物中剩余的天冬酰胺酶活性并确定所述中和因子的存在或对其定量。用于预测天冬酰胺酶治疗效果的方法。
Description
本发明涉及诊断患者对用治疗性酶天冬酰胺酶治疗的反应能力的测试。本发明尤其涉及预测在给定患者中使用天冬酰胺酶的治疗效果的测试。
L-天冬酰胺酶是已应用超过30年的治疗急性淋巴母细胞性白血病的化学治疗方案的基本组分。其作用机制基于血浆氨基酸天冬酰胺的水解，天冬酰胺是淋巴母细胞肿瘤样生长的必要要素。不同于正常细胞，癌性淋巴母细胞自身不能产生其天冬酰胺，而是依赖细胞外来源。用天冬酰胺酶处理使其丧失该必要成分，从而使它们死亡。
目前市售的产自微生物的所述酶有三种形式：前两种来自细菌来源大肠杆菌(Escherichia coli)和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，第三种来自聚乙二醇与天然大肠杆菌天冬酰胺酶的共价键偶联(PEG-天冬酰胺酶)。
尽管其具有相当的抗白血病效果，但用天冬酰胺酶进行的治疗与一定数量的并发症相关，所述并发症与该酶的免疫原性有关。这些并发症可反映为临床表现或沉默失活。
许多作者已报道了超敏反应，其严重性从中度过敏反应到过敏性休克(Wang等，Journal of Immunological Methods，239(200)75-83)。使用三种形式天冬酰胺酶所观察到的该类反应的发生通常引起由于害怕更严重反应而导致治疗停止。
此外，天冬酰胺酶导致具有中和特性的循环抗体的出现，这反映为网状内皮系统对该酶清除的增加和其治疗效果的降低(Müller H.J.，Boos J.Crit Rev Oncol/hematol 1998；(28)：97-113)。用三种形式的酶(大肠杆菌、欧文氏菌(Erwinia)和PEG-天冬酰胺酶)均发现这些抗体，在这种情况下，用天冬酰胺酶达到在延长时间段内快速且完全地耗尽血浆天冬酰胺的治疗目标未实现。
这种患者血清中存在的中和因子(主要是抗体)导致的该酶失活不伴随临床征兆，对临床医师而言其是沉默的。
因此本发明人认为，临床医师很需要一种快速易用的测试为他们使用，以用于预测患者血清中天冬酰胺酶中和因子(主要是抗体)的存在。该测试将使得可以调整酶的施用剂量，或用另一种形式的对这些中和因子不敏感或敏感性更低的天冬酰胺酶替代所用的天冬酰胺酶。
对于监测患者天冬酰胺酶活性，考虑了几种可能性：
●血浆L-天冬酰胺的测定
●血浆L-天冬酰胺酶活性的测定
●抗天冬酰胺酶抗体的测定
血浆天冬酰胺水平是反映天冬酰胺酶所期望达到的治疗作用(快速、完全和持久地去除天冬酰胺)的主要生物化学参数。因此对该测定已描述了几种方法。它们大部分是基于将通过高效液相色谱分离待测定样品的组分的阶段和荧光检测或通过质谱定量整合在一起。这些方法很繁琐，需要专业人员，并且其费用和花费的时间不适于常规临床应用。
最近，Verma等描述了一种快速测定天冬酰胺的方法，其基于L-天冬酰胺酶和有色指示剂在多种基质(硝酸纤维素膜、硅凝胶或藻酸钙珠)上的共固定。当将这些支持物之一与患者血清样品接触时，固定化的L-天冬酰胺酶会降解存在的天冬酰胺。该水解反应后产生的铵能使酚红指示剂变色。尽管该方法似乎满足了应用简单及迅速的要求，作者没有提供可证实它的数据，对其准确性仍存有疑问。
除了缺乏可简单快速使用的经验证的方法之外，血浆L-天冬酰胺的测定受以下因素的限制。在体内，通过天冬酰胺酶作用实现的天冬酰胺降解被天冬酰胺的生理产生所平衡，而在体外，所述酶对天冬酰胺的催化作用将持续。作为直接结果，当血清样品来自于经天冬酰胺酶治疗的患者时，剩余量的酶的存在会导致天冬酰胺水平检测的偏差，其会“虚假地”低于生理水平(Boos等，European journal of cancer(1996)32，1544-1550)。对分析过程的这种干扰导致结果与所检测患者中天冬酰胺酶的生理活性之间缺乏相关性。
已描述了几种测定血浆L-天冬酰胺酶的方法，最常用的方法基于：将含有L-天冬酰胺酶的血清在含有L-天冬酰胺的缓冲液中孵育，而后在终止反应后，用Nessler试剂测定产生的铵。Orsonneau等提出了一个更快更准确的自动化的变化方案以监测用L-天冬酰胺酶治疗的患者(J.L.Orsonneau等，Ann Biol Clin 2004，62：568-72)。该方法基于谷氨酸脱氢酶的作用，其利用L-天冬酰胺酶水解L-天冬酰胺时产生的铵将α-酮戊二酸转变成谷氨酸。
谷氨酸脱氢酶
α-酮戊二酸+NH4 ++NADPH→L-谷氨酸+NADP+H2O
在该反应中，反应过程中被氧化的NADPH的量相当于样品中所含的氨的量，并可通过检测光密度的降低来测定。由此可监测铵生成的动力学并计算L-天冬酰胺酶的活性。尽管该方法使监测患者的L-天冬酰胺酶活性成为可能，它也没提供关于存在于血清中的因子对该酶的中和作用的任何预测信息。
Wang等开发了用于定量患者血浆样品中抗天冬酰胺酶IgG的标准化ELISA测试(B.Wang等，Journal of Immunological Methods 239(2000)75-83)。该测试用于在临床研究范围内测量患者血清中存在的抗天冬酰胺酶抗体的浓度，所述患者患急性淋巴母细胞性白血病，并用L-天冬酰胺酶治疗并且出现或未出现过敏反应(M.H.Woo等，Leukemia(1998)12，1527-1533)。该作者证明，不管是在过敏反应出现前或后进行检测，抗天冬酰胺酶抗体浓度的中值在出现过敏反应的患者中都更高。他们得出结论，在临床实践中采用该检测利于预测过敏反应的未来发生。
然而，该检测的预测价值是值得怀疑的；出现过敏反应前所测的抗天冬酰胺酶抗体浓度的变化范围有交叠，它们分别为：
●对于随后出现过敏反应的患者，OD为0.001-0.375单位；
●对于随后未出现过敏反应的患者，OD为0.004-0.064单位。
此外，抗体浓度的测量没有提供关于患者中天冬酰胺酶的药理活性和血清中所存在因子的可能中和作用的任何信息。
E.H.Panosyan等，J.Pediatr.Hematol.Oncol.2004，26，4：217-226调查了患者血清中的抗天冬酰胺酶抗体和天冬酰胺酶的酶活性。该作者描述了采用患者血清样品作为抗天冬酰胺酶抗体来源而进行的离体中和测定。将血清样品与天然或PEG-天冬酰胺酶的抗原溶液一起孵育，并测量剩余的天冬酰胺酶的酶活性。该作者最终推荐在临床环境下对血清抗天冬酰胺酶抗体进行标准监测。
因此，本发明的目的是提出能克服现有技术缺点并能在给定时刻了解患者是否具有可中和天冬酰胺酶活性的因子的新方法。所述方法必须有具有完全预测性的优点，即它必须不需要向待诊断患者施用所述酶的阶段。其必须反映患者对任何形式的天冬酰胺酶的反应能力。因此，所述患者可为第一次用该酶治疗的患者，或已用天冬酰胺酶治疗或者目前正用天冬酰胺酶治疗的患者。其能检测可中和之前或目前治疗所用酶之活性的因子的存在，这使了解用该酶进行的治疗是否可被恢复或继续和任选地调整成为可能。该方法还能检测可中和考虑用于所述患者治疗中的酶之活性的因子的存在，这使确证或排除特定酶的使用成为可能。
该认识将在治疗形式(剂量、给药方案)或者酶或其施用形式的选择方面为专业人员提供比现有技术的方法恰当得多的指导。所述中和因子或不存在或以足够低水平存在而能用所检测酶进行治疗(任选地加强剂量或剂量方案)。或者所述中和因子的存在水平对于继续或开始这样的治疗而言过高，则本发明使得有可能检测和/或建议使用另一种酶形式或对所述中和因子敏感性更低或不敏感形式的酶(例如包含于生物载体中的酶)的替代性方法。
因此，本发明的目的是提出一种确定患者的血样中是否存在中和天冬酰胺酶活性之因子的体外方法。
本发明还旨在提出一种体外确定患者：(i)对天冬酰胺酶治疗阳性应答或(ii)对其不应答或(iii)仅不完全应答的能力的方法。
本发明还旨在提出用于预测用天冬酰胺酶治疗的效果或预测该酶不会立即成为活性被中和因子显著灭活的对象这一事实的方法。
因此，本发明涉及预测天冬酰胺酶是否可在患者中有活性的方法，其中体外测量获取自所述患者的样品中中和天冬酰胺酶活性的因子的存在，所述样品为可能包含所述中和因子的血液、血浆、血清或衍生基质。
本发明涉及对获取自患者的可能包含所述中和因子的血液、血浆、血清或衍生基质样品中能中和天冬酰胺酶活性之因子的存在进行体外测量的方法，其包括将所述样品与天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后测量混合物中剩余的天冬酰胺酶活性，这反映了样品中(并继而反映了患者体内)中和因子的存在，并允许对其进行测定和定量。该方法能定性和定量地诊断患者中天冬酰胺酶中和因子的存在。中和因子不仅指抗天冬酰胺酶抗体，还包括其它可抑制天冬酰胺酶或者其酶活性的任何因子，例如蛋白酶，如人天冬酰胺酰内肽酶。
本发明还涉及预测给定的天冬酰胺酶在给定患者中是否可有活性的方法。该方法包括体外测定患者对天冬酰胺酶治疗的应答能力，其中对获取自所述患者的可能包含中和天冬酰胺酶之因子的血液、血浆、血清或衍生基质样品实施所述方法，其包括将所述样品与所述天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后测量混合物中所述天冬酰胺酶的剩余酶活性，这反映了样品中(并继而反映了患者体内)能中和天冬酰胺酶活性的中和因子的存在并能对其进行确定和定量，因此反映了患者对用该酶治疗的应答能力。因此本发明提供了检测天冬酰胺酶在特定患者中效力的方法。
根据中和因子的存在与否并任选地根据其水平，所述过程与方法有可能确定患者是否可能(i)对天冬酰胺酶的治疗阳性应答还是(ii)对其无应答，还是(iii)仅仅不完全应答。
所述样品可来自目前正用天冬酰胺酶治疗的患者，或来自已用天冬酰胺酶治疗的患者。
所述样品还可来自从未用任一种天冬酰胺酶或这种天冬酰胺酶治疗的患者。
本检测中所用的天冬酰胺酶可为在对患者进行的治疗中正在用或用过的天冬酰胺酶。
所述天冬酰胺酶还可为期望在患者中测试以预测其效力的不同来源的酶。还可同时或依次测试多种酶以确定最适合患者的治疗。
因此，本发明提供了预测用天冬酰胺酶治疗的效果或预测该酶不会立即被中和因子显著灭活这一事实的方法。
本发明适用于所有形式的天冬酰胺酶，如L-天冬酰胺酶。我们可提及获取自任何细菌来源的天然酶，例如产自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶、产自欧文氏菌的酶、突变酶或经修饰的酶，例如PEG化酶(PEG-天冬酰胺酶)，但不限于此。该酶也可为天然、合成或重组来源的。其可为游离的或包含在生物载体中，例如在红细胞中。
混合物中天冬酰胺酶的剩余活性可通过向所述混合物中加入天冬酰胺(优选L-天冬酰胺)以及试剂系统来检测，所述试剂系统能检测活性天冬酰胺酶对天冬酰胺的酶促降解。
根据一个有利的方案，所述方法包括以下阶段：
(a)将所述样品与已知量的天冬酰胺酶一起孵育；
(b)将前述混合物与已知量的天冬酰胺一起孵育，优选地使得天冬酰胺的量相对于天冬酰胺酶的量而言是饱和的；
(c)将前述混合物与所述能测定所述剩余酶活性的试剂系统一起孵育；
(d)定性或定量评价酶活性的损失或存留，其与所述样品中中和天冬酰胺酶活性的因子的存在或含量相关。
阶段(a)中的孵育时间尤其地为1-60分钟。酶含量尤其地为0.1-5IU/ml。
灭活或去除测试样品中任何痕量的活性酶可以是有用并有利的。因此，根据一个特征，在阶段(a)之前进行去除或灭活存在于样品中的任何天冬酰胺酶的阶段(a0)。
作为变化方法，阶段(a)之前可以进行测量样品中天冬酰胺酶基线含量的阶段(a0)，这使得有可能确定所述活性为零或可忽略，或者从通过本方法测得的所述活性中减去基线含量。
作为变化方法，由于检测前已知施用给患者的酶的半衰期，可在最后一次施用与采取血样之间留出必要的时间。
根据一个具体的实施方案，阶段(a)之后是去除抗体-天冬酰胺酶免疫复合物的阶段(a1)。所述去除可通过离心容易地实现，从而阶段(b)中涉及的混合物为上清液。优选地，离心以3000-25000g在指定速度下进行1-30分钟。
根据一个特征，所述试剂系统对天冬酰胺酶使天冬酰胺发生酶促降解而产生的铵离子的出现是敏感的。因此，中和因子的存在可通过进行定量消耗铵离子的反应来确定或检测。所述铵离子的消耗可通过检测混合物光密度(吸光度)的降低来跟踪，有利地进行定量跟踪。尤其地进行以下反应：
(1)天冬酰胺酶+天冬酰胺→天冬氨酸+NH4 +
(2)α-酮戊二酸+NH4 ++NADPH+谷氨酸脱氢酶(催化剂)→谷氨酸+NADP++H2O
与天冬酰胺的孵育优选与饱和量的天冬酰胺(相对于引入的酶量)(尤其地为10-50mg/ml)一起进行2-60分钟。
尤其地，与试剂系统一起孵育进行3-20分钟。
因此，本发明提供了确定患者是否有可能(i)对用天冬酰胺酶的治疗阳性应答还是(ii)对其无应答，还是(iii)仅不完全应答的方法。因此该方法能确定用所述测试酶进行治疗或排除其可能性，或者决定更改给药方案或用不同的天冬酰胺酶(尤其地包封在生物载体中的形式)治疗患者。
因此，本发明还涉及一种治疗患者中天冬酰胺酶敏感性病理状态的方法，其包括：
(A)实施体外测定患者对用给定形式的天冬酰胺酶(尤其是游离或经修饰形式)治疗的反应能力的方法，其中对获取自所述患者的可能包含天冬酰胺酶中和因子的血液、血浆、血清或衍生基质样品实施所述方法，其包括：将所述样品与所述形式的天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后测量所述混合物中剩余天冬酰胺酶活性并确定所述中和活性以及患者：(i)对这种形式天冬酰胺酶治疗阳性应答或(ii)对其不应答或(iii)仅不完全应答的能力，和
(B)在情况(i)中用该天冬酰胺酶治疗所述病理状态，或在其它情况下用另一种形式的天冬酰胺酶治疗所述病理状态。
根据一个优选的实施方案，天冬酰胺酶的其它形式是包封或包含在生物载体中的天冬酰胺酶，尤其是包封于红细胞中。尤其地，它们是通过红细胞溶解及重封(resealing)产生的，例如根据法国专利申请No.0408667的教导。
可受益于该方法的病理状态尤其包括白血病，例如急性淋巴细胞性白血病。我们也可提及(但不限于)实体肿瘤(WO2007/103290)，尤其是胰腺癌和卵巢癌。
现在通过实施例更详细地描述本发明，本实施例阐释但并不限制本发明。
实施例
实施例1：用L-天冬酰胺酶对兔进行免疫
第一次免疫前采集几毫升兔血清以获得免疫前血清。然后用500μgL-天冬酰胺酶(KidrolaseOPI-EUSA Limonest France)注射兔4次。在第一次与第二次免疫之间及第二次与第三次免疫之间采集血清。最后，在最后免疫后，收集全部血清并保存于-20℃。将最终血清根据其总蛋白质浓度(双缩脲法)和总免疫球蛋白浓度进行表征。
实施例2：纯化兔总IgG
用Sigma的pure 1A试剂盒(#PURE1A)从包含抗天冬酰胺酶IgG的最终血清中纯化兔总IgG。简言之，在纯化IgG前通过离心或经0.45μm滤器过滤而使2ml血清澄清。之后向2ml澄清血清中加入4ml“结合缓冲液”。按照Sigma推荐方案将混合物过柱后洗脱。为了使其可注射入动物，将总IgG置于阈值为10000道尔顿的过滤柱中离心以用PBS替换洗脱缓冲液。
实施例3a：测量中间血清对L-天冬酰胺酶酶活性的抑制(混合物测定)
L-天冬酰胺酶测定根据Orsonneau等，”Automatic kinetic assay ofplasma L-asparaginase activity in therapeutic monitoring of acutelymphoblastic leukaemias”，Ann Biol Clin，62：568-572发表的方案实施。
首先使用中间血清(在第一次与第二次免疫之间获得)来测量对酶活性的抑制。所用L-天冬酰胺酶的浓度为2IU/ml。将所述酶与系列稀释的血清一起于37℃预孵育15分钟，之后检测混合物中的酶活性。结果如表1所示：
表1
表1总结了混合物中L-天冬酰胺酶的剩余酶活性的检测(管2-7)。兔血清抑制了L-天冬酰胺酶的酶活性：血清稀释度越高抑制越弱。
管1为对照，其说明将该酶单独于37℃孵育15分钟不影响其酶活性。
实施例3b：测量中间血清对L-天冬酰胺酶的酶活性的抑制的检测(上清
液测定)
使用了中间血清(在第一次与第二次免疫之间获得)。
为了刺激网状内皮系统对抗原-抗体复合物的吞噬作用，将L-天冬酰胺酶/血清混合物于37℃孵育15分钟，之后以17500g在4℃下离心10分钟以去除免疫复合物。测定上清液中的酶活性。测定结果如表2所示：
表2
加入用免疫前血清替换血清的对照以检测L-天冬酰胺酶与血清中存在的抗天冬酰胺酶抗体之间相互作用的特异性。这证明多于90％的酶不参与与非特异性抗体的相互作用。
血清中存在的抗体与所有1/4、1/16、1/32和1/128稀释的酶相互作用。
实施例4：测量兔总IgG对L-天冬酰胺酶的酶活性的抑制
用兔总IgG和浓度为1.25IU/ml的L-天冬酰胺酶进行与实施例3b中所述相同的实验。结果如表3所示：
表3
包含抗天冬酰胺酶IgG的兔总IgG在1/64稀释时开始与L-天冬酰胺酶相互作用，引起对酶活性的完全抑制(99.02％的酶被沉淀)。
实施例5：兔总IgG对注射入小鼠的游离L-天冬酰胺酶的灭活
对小鼠(16只小鼠)进行实验以研究抗天冬酰胺酶IgG对L-天冬酰胺酶的体内抑制。
实验条件如下：
-100IU/kg的L-天冬酰胺酶的剂量，相当于25g小鼠循环中的1.25IU/ml。
-注射7.5μg兔总IgG。
在注射L-天冬酰胺酶(游离或包封于小鼠红细胞中(Asp-RBC))之前20分钟注射IgG或PBS。然后在注射L-天冬酰胺酶6小时后，处死小鼠并收集血液。
之后测定血浆及RBC中的L-天冬酰胺酶活性。表4总结了所得值：
表4
在IgG或者PBS存在下，接受Asp-RBC的小鼠的RBC中的L-天冬酰胺酶分别测定为0.798和0.879IU/ml。因此血浆中存在的IgG对包封的酶无抑制作用。在这些相同小鼠的血浆中，用Asp-RBC(实际上在RBC外仍存在少量的游离酶，在剂量的10％上下)注射的游离L-天冬酰胺酶在IgG存在下受到抑制(0.013IU/ml)，而在PBS存在下保持活性(0.126IU/ml)。
当注射游离的L-天冬酰胺酶时，IgG抑制其活性(0.002IU/ml)，而注射PBS对该酶活性无影响(0.417IU/ml)。考虑到游离L-天冬酰胺酶的半衰期(10小时)，血浆L-天冬酰胺酶的测量值0.417IU/ml与该游离酶在注射6小时后的剩余活性相一致。
测量了本研究中14只小鼠血浆中的L-天冬酰胺的血浆浓度(2只由于体积太小而未使用)。结果如表5所示。
表5
当小鼠用Asp-RBC处理或在PBS存在下接受游离的L-天冬酰胺酶时，L-天冬酰胺被完全消耗。
仅在小鼠在IgG存在下用游离L-天冬酰胺酶处理时，L-天冬酰胺的血浆浓度为28.09μM。因此血浆中的该酶被IgG抑制。
实施例6：测量兔总IgG对PEG-天冬酰胺酶的酶活性的抑制
用含有抗天冬酰胺酶IgG的兔总IgG检测PEG-天冬酰胺酶(Sigma#A5336)。用PEG-天冬酰胺酶进行与实施例4所示相同的实验。结果见表6。
表6
含有抗天冬酰胺酶IgG的兔IgG与PEG-天冬酰胺酶相互作用。上清液中检测到的活性小于与IgG初始混合的活性的4％。
实施例7：测试方案
该方案用于正考虑用特定天冬酰胺酶治疗的患者。采集该患者的少量血样并常规处理以获得血清样品。
之后过程如下：
(a0)任选地将存在于血清样品中的任何天冬酰胺酶灭活或去除，或测量剩余酶活性。
(a)将样品与0.1至5IU/ml的天冬酰胺酶一起孵育1-60分钟。
(a1)任选地去除免疫复合物，优选地通过以3000-25000g在所述速度下离心1-30分钟。
(b)将从(a)得到的混合物或从(a1)得到的上清液与饱和量的天冬酰胺(尤其地为10-50mg/ml)一起孵育2-60分钟。
(c)将前述混合物与能检测剩余酶活性的试剂系统(α-酮戊二酸、NADPH、谷氨酸脱氢酶)一起孵育，尤其地孵育3-20分钟。
(d)定性或者定量评价酶活性的损失或存留，这与样品中天冬酰胺酶中和因子的存在或其含量相关。
取决于是否包含阶段(a1)，可以检测剩余酶活性的水平或阈值水平。
对于已经被治疗的患者，如果该方法显示明显存在中和因子，则推荐和使用采用不同形式天冬酰胺酶的替代治疗。显然，在游离或经修饰的形式可能被抑制的情况下，推荐使用包封于红细胞中的酶。
相同的方案可简单地适用于患者中天冬酰胺酶潜在效力的检测。
实施例8：患者血清基质对L-天冬酰胺酶活性测量的影响
将未用L-天冬酰胺酶治疗过的3例人血清与7种浓度(0-800IU/L)的L-天冬酰胺酶混合，以确保人血清对L-天冬酰胺酶的活性测量无干扰。样品在37℃孵育15分钟，之后于4℃以17500g离心10分钟。检测上清液中L-天冬酰胺酶的活性。将缓冲液1×PBS 4％BSA与相同浓度的L-天冬酰胺酶混合作为对照。结果见表7。
表7
*：未测定
未观察到人血清对L-天冬酰胺酶活性检测的干扰(与缓冲液对照相比：见表7和图1)。
实施例9：患者血清基质对L-天冬酰胺酶活性测量的影响以及人血清基本活性的测定
将未用L-天冬酰胺酶治疗过的52例人血清与终浓度为500IU/L的L-天冬酰胺酶混合，以确保人血清对L-天冬酰胺酶活性测量无干扰。将样品于37℃孵育15分钟，并于4℃以17500g离心10分钟。检测上清液中L-天冬酰胺酶的活性。将缓冲液1×PBS 4％BSA与相同终浓度的L-天冬酰胺酶混合作为对照。结果见表8及图2。
表8：52例人血清中L-天冬酰胺酶活性的测量，所加l-天冬酰胺酶的终浓度为500(IU/L)
所测52例人血清的平均活性为473IU/L，标准差(SD)为13.4IU/L。所测血清的平均活性与对照活性无显著差异。所有值均在可接受范围内：52例检测中仅有3例在置信区间[平均值-2SD，平均值+2SD]之外。根据测定血清检测的活性分布表明，L-天冬酰胺酶活性不受血清基质的影响(图2)。
为了检查人血清中酶活性信号的缺失：测定25例未用L-天冬酰胺酶治疗过的人血清的l-天冬酰胺酶活性。
表9：25例未用L-天冬酰胺酶治疗过的人血清中l-天冬酰胺酶活性的测量
| 血清 | 测量的L-天冬酰胺酶活性(IU/L) |
| 1 | 0 |
| 2 | 2 |
| 3 | 2 |
| 4 | 1 |
| 5 | 2 |
| 6 | 0 |
| 7 | 0 |
| 8 | 0 |
| 9 | 0 |
| 10 | 0 |
| 11 | 0 |
| 12 | 0 |
| 13 | 0 |
| 14 | 1 |
| 15 | 2 |
| 16 | 1 |
| 17 | 5 |
| 18 | 2 |
| 19 | 0 |
| 20 | 3 |
| 21 | 1 |
| 22 | 0 |
| 23 | 0 |
| 24 | 0 |
| 25 | 0 |
| 平均值 | 0.88 |
| 标准差 | 1.27 |
所测25例中的每一例人血清中L-天冬酰胺酶活性均接近于0。所测平均活性为0.88IU/L，标准差为1.27IU/L。所测最大活性为17号血清的5IU/L，该基本活性信号不太可能影响L-天冬酰胺酶活性的检测，因为其相当于血清与L-天冬酰胺酶(终浓度为500IU/L)所测得活性的1％。
实施例10：加入抗天冬酰胺酶IgG的人血清对L-天冬酰胺酶活性的抑制
合并2例未用L-天冬酰胺酶治疗过的人血清，并加入浓度范围在1-100μg/mL(1，2，5，10，20，40，80，100μg/mL)的抗天冬酰胺酶IgG。该抗天冬酰胺酶IgG如实施例1和2所述获得。
之后加入500IU/L的L-天冬酰胺酶。样品在37℃孵育15分钟，之后于4℃以17500g离心10分钟。检测上清液中的剩余L-天冬酰胺酶活性。用缓冲液1×PBS 4％BSA代替人血清库作为对照。结果见表10及图3。
表10
*：未测定
当L-天冬酰胺酶与人血清或缓冲液对照中浓度递增的抗天冬酰胺酶IgG(特异性IgG)混合时，在20μg/mL及更高的IgG浓度时发生酶活性的完全抑制。酶与5-20μg/mL的抗天冬酰胺酶IgG混合时产生部分抑制。抗天冬酰胺酶IgG在5μg/mL以下时，L-天冬酰胺酶活性未受抑制。
当L-天冬酰胺酶与非特异性IgG一起孵育时未观察到抑制(见表10中加入的IgG对照项)。
为了细化浓度在10-20μg/mL的抗天冬酰胺酶IgG对L-天冬酰胺酶活性的抑制反应，对浓度范围在8-22μg/mL的IgG进行实验。加入的L-天冬酰胺酶的终浓度照例为500IU/L。所有样品在37℃孵育15分钟，之后于4℃以17500g离心10分钟。检测上清液中剩余的L-天冬酰胺酶活性。该测定用人血清合并物进行。结果见表11及图4。
表11
IgG浓度为16μg/mL时出现L-天冬酰胺酶活性的完全抑制。低于16μg/mL时，L-天冬酰胺酶活性被部分抑制。
检测了相对的反应：将固定浓度(13.64μg/mL，对应于80％的抑制)的抗天冬酰胺酶IgG与浓度范围在500-10000IU/L的L-天冬酰胺酶混合。样品在37℃孵育15分钟，之后于4℃以17500g离心10分钟。测量上清液中的剩余L-天冬酰胺酶活性。结果见表12及图5。
表12
L-天冬酰胺酶的浓度越高，固定浓度(13.64μg/mL)的IgG对其活性的抑制越小。固定量的抗天冬酰胺酶IgG抑制固定量的L-天冬酰胺酶。因此，L-天冬酰胺酶活性的抑制是剂量依赖的。
实施例11：测试来自17名用L-天冬酰胺酶治疗的患者的57例人血清
为了确保该测定能够定量患者中天冬酰胺酶的中和作用：按照实施例7所述检测方案检验了取样自17名正用L-天冬酰胺酶治疗的急性淋巴母细胞性白血病患者的57例人血清。样品取自治疗过程的不同时间并进行了剩余L-天冬酰胺酶活性的检测以确定该活性可忽略而且不干扰检测过程。
而后将血清与终浓度为500IU/L的L-天冬酰胺酶混合，室温下孵育15分钟。7800rpm离心6分钟的步骤之前及之后检测L-天冬酰胺酶活性。将缓冲液1×PBS 4％BSA与终浓度为500IU/L的L-天冬酰胺酶混合作为对照。结果见下表13及图6。
表13：测试17名正用L-天冬酰胺酶治疗的患者的57例人血清
ND：未测定
NA：不适用
所有样品的剩余天冬酰胺酶活性均可忽略，最高的剩余活性是15IU/L并且不会干扰检测过程，因为其占理论上所加L-天冬酰胺酶的3％。所测对照的天冬酰胺酶活性高于预期(三组对照分别为655、636和661IU/L，相对于预期值500IU/L)。天冬酰胺酶活性抑制百分比的估算基于所测得的对照酶活性。许多抑制百分比为负值的事实提示检测过程存在偏差。
离心后的天冬酰胺酶活性抑制百分比更高，这提示该离心步骤清除了一些天冬酰胺酶与抗天冬酰胺酶抗体之间形成的免疫复合物。
17名测定患者中的14名出现了其血清中所存在因子对天冬酰胺酶活性的抑制(图6)。很多患者的抑制百分比在20％以上，仅有3个患者的抑制百分比高于40％(图6)。
Claims (17)
1.用于预测天冬酰胺酶是否可在患者中有活性的方法，其中对获取自所述患者的样品中中和天冬酰胺酶活性的因子的存在进行体外测量，所述样品为可能包含所述中和因子的血液、血浆、血清或衍生基质的样品。
2.权利要求1的方法，其包括将所述样品与所述天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后测量所述混合物中所述天冬酰胺酶的剩余活性，并确定所述中和因子的存在或对其定量。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述样品来自目前正用天冬酰胺酶治疗的患者，或来自用天冬酰胺酶治疗过的患者。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中通过向所述混合物中添加天冬酰胺和适于测定所述剩余酶活性的试剂系统来测量所述混合物中天冬酰胺酶的剩余活性。
5.权利要求4的方法，其包括以下阶段：
(a)将所述样品与已知量的所述天冬酰胺酶一起孵育；
(b)将前述混合物与已知量的天冬酰胺一起孵育；
(c)将前述混合物与所述适于测定所述剩余酶活性的试剂系统一起孵育；
(d)定性或定量评价酶活性的损失或存留，其与所述样品中所述天冬酰胺酶中和因子的存在或含量相关。
6.权利要求5的方法，其包括在(a)阶段之前去除或失活所述样品中可能存在的任何天冬酰胺酶的(a0)阶段。
7.权利要求5的方法，其包括在(a)阶段之前测量所述样品中天冬酰胺酶基线含量的(a0)阶段。
8.权利要求4至7中任一项的方法，其中所述试剂系统对由于天冬酰胺酶酶促降解天冬酰胺而产生的铵离子的出现敏感。
9.权利要求8的方法，其利用定量消耗所述铵离子的反应。
10.权利要求9的方法，其中通过测量所述混合物的光密度降低来测量所述铵离子的定量消耗。
11.权利要求4至10中任一项的方法，其利用如下反应：
(1)天冬酰胺酶+天冬酰胺→天冬氨酸+NH4 +
(2)α-酮戊二酸+NH4 ++NADPH+谷氨酸脱氢酶(催化剂)→谷氨酸+NADP++H2O
12.前述权利要求中的任一项的方法，其包括确定所述患者：(i)对此形式天冬酰胺酶治疗阳性应答或(ii)对其不应答或(iii)仅不完全应答的能力。
13.权利要求12的方法，其包括在(ii)和(iii)的情况下决定用其它天冬酰胺酶治疗所述患者。
14.权利要求12的方法，其包括在(i)的情况下决定用这种天冬酰胺酶治疗所述患者。
15.权利要求13的方法，其中所述其它天冬酰胺酶是包含于生物载体中、优选地包封于红细胞中的天冬酰胺酶。
16.治疗患者中天冬酰胺酶敏感性病理状态的方法，其包括：
(A)实施体外确定患者对用给定形式的天冬酰胺酶(尤其是游离或经修饰形式)治疗的应答能力的方法，其中对获取自所述患者的可能包含天冬酰胺酶中和因子的血液、血浆、血清或衍生基质的样品实施所述方法，其包括：将所述样品与所述形式的天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后测量所述混合物中剩余天冬酰胺酶活性以及所述患者：(i)对这种形式的天冬酰胺酶治疗阳性应答或(ii)对其不应答或(iii)仅不完全应答的能力，和
(B)在(i)的情况下用该天冬酰胺酶治疗所述病理状态，或在(ii)和(iii)的情况下用其它形式的天冬酰胺酶治疗所述病理状态。
17.权利要求16的方法，其中所述其它形式由包含所述天冬酰胺酶的生物载体组成，优选由包封了所述天冬酰胺酶的红细胞组成。
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