ES2447165T3

ES2447165T3 - Prueba para predecir la neutralización de actividad de asparaginasa

Info

Publication number: ES2447165T3
Application number: ES09747859.8T
Authority: ES
Inventors: Yann Godfrin
Original assignee: Erytech Pharma SA
Current assignee: Phaxiam Therapeutics SA
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2014-03-11
Anticipated expiration: 2029-11-06
Also published as: JP2012507998A; US9580739B2; US20150071894A1; CA2743020C; US8852880B2; KR101803027B1; FR2938332B1; EP2358894A1; IL212643A; CN102272323A; JP5771149B2; IL212643A0; AU2009312702B2; CN102272323B; KR20110097806A; EP2358894B1; US20120121570A1; WO2010052315A1; AU2009312702A1; CA2743020A1

Abstract

Un procedimiento para predecir si una asparaginasa puede ser o no activa en un paciente, en el quese mide in vitro la presencia de factores que neutralizan la actividad de asparaginasa en una muestra de sangre,plasma, suero o medio derivado que puede contener dichos factores neutralizantes, obtenidos de dicho paciente,procedimiento que comprende mezcla de dicha muestra con dicha asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luegomedición de la actividad residual de dicha asparaginasa en la mezcla, y determinación o cuantificación de lapresencia de dichos factores neutralizantes.

Description

Prueba para predecir la neutralización de actividad de asparaginasa

5 [0001] La invención se refiere a una prueba para diagnosticar la capacidad de un paciente para responder a tratamiento con la enzima terapéutica asparaginasa. En particular se refiere a una prueba para predecir la eficacia de un tratamiento usando asparaginasa en un paciente dado como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0002] La L-asparaginasa es un componente esencial de los protocolos de quimioterapia que se han usado

10 durante más de 30 años para el tratamiento de leucemias linfoblásticas agudas. Su mecanismo de acción se basa en la hidrólisis del aminoácido plasmático asparagina, un elemento esencial para el crecimiento tumoral de linfoblastos. A diferencia de las células normales, las células linfoblásticas cancerosas son incapaces de producir su asparagina por sí mismas, y dependen de fuentes extracelulares. El tratamiento con asparaginasa las priva de este constituyente esencial y así provoca su muerte.

15 [0003] La enzima producida a partir de microorganismos se comercializa actualmente en tres formas: las dos primeras se derivan de fuentes bacterianas Escherichia coli y Erwinia chrysanthemi, la tercera se obtiene por acoplamiento de enlace covalente de polietilenglicol con la asparaginasa nativa de Escherichia coli (PEGasparaginasa).

20 [0004] A pesar de su eficacia antileucémica considerable, el tratamiento con asparaginasa está asociado a un cierto número de complicaciones conectadas a la inmunogenicidad de la enzima. Estas complicaciones pueden reflejarse en manifestaciones clínicas o en inactivación silenciosa.

25 [0005] Se han informado reacciones de hipersensibilidad, con gravedad variable de reacción alérgica moderada a choque anafiláctico, por muchos autores (Wang y col., Journal of Immunological Methods 239 (200) 7583). El desarrollo de reacciones de este tipo, observadas con las tres formas de asparaginasa, generalmente conduce a la suspensión del tratamiento por miedo a una reacción más grave.

30 [0006] Además, la asparaginasa produce la aparición de anticuerpos circulantes que poseen propiedades neutralizantes, reflejadas en un aumento en la eliminación de la enzima por el sistema reticuloendotelial y una disminución en su eficacia terapéutica (Müller H.J., Boos J. Crit Rev Oncol/hematol 1998; (28):97-113). Estos anticuerpos se han observado con las tres formas de la enzima (E. coli, Erwinia y PEG-asparaginasa), y en este caso no se consigue el objetivo terapéutico de la asparaginasa, que es lograr el rápido y completo agotamiento de la

35 asparagina plasmática, durante un periodo prolongado.

[0007] Esta inactivación de la enzima por factores neutralizantes, principalmente anticuerpos, presentes en el suero del paciente no está acompañada de signos clínicos, es silenciosa para el profesional clínico.

40 [0008] Por tanto, los inventores han identificado que hay una considerable necesidad de profesionales clínicos que tengan a su disponibilidad una prueba que sea rápida y sea fácil de usar para predecir la presencia de factores neutralizantes de asparaginasa, principalmente anticuerpos, presentes en suero del paciente. Esta prueba haría posible ajustar la dosis de enzima administrada o sustituir la asparaginasa usada con otra forma de asparaginasa que no es sensible, o es menos sensible, a estos factores neutralizantes.

45 [0009] Se consideraron varias posibilidades para monitorizar la actividad de asparaginasa en un paciente:

• Ensayo de L-asparaginasa en plasma

50 • Ensayo de la actividad de L-asparaginasa en plasma

• Ensayo de anticuerpos anti-asparaginasa

[0010] El nivel de asparagina en plasma es el principal parámetro bioquímico que refleja el efecto terapéutico

55 que se desea con asparaginasa: un agotamiento rápido, completo y de larga duración de asparagina. Por consiguiente, se han descrito varios procedimientos para su ensayo. La mayoría de ellos se basan en combinar una etapa de separación de los constituyentes de la muestra que va a ensayarse por cromatografía de líquidos de alto rendimiento y detección o cuantificación fluorométrica por espectrometría de masas. Estos procedimientos son tediosos, requieren personal entrenado y su coste y el tiempo necesario son incompatibles con el uso clínico rutinario.

[0011] Más recientemente, Verma y col. describieron un procedimiento para el rápido ensayo de asparagina basándose en la co-inmovilización de L-asparaginasa y un indicador coloreado sobre diversos sustratos (membrana

5 de nitrocelulosa, gel de silicona o perlas de alginato de calcio). Cuando uno de estos soportes se pone en contacto con una muestra de suero de un paciente, la L-asparaginasa inmovilizada degradará la asparagina presente. La producción de amonio tras esta reacción de hidrólisis conducirá a un cambio de color del indicador de rojo fenol. Aunque este procedimiento parece cumplir los requisitos de simplicidad y velocidad de uso, los autores no suministran datos por los que pueda validarse, y todavía hay dudas sobre su exactitud.

10 [0012] Aparte de la ausencia de procedimientos validados que puedan usarse fácilmente y rápidamente, el ensayo de L-asparaginasa en plasma está limitado por las siguientes consideraciones. In vivo, la degradación de asparagina por la acción de asparaginasa está contrarrestada por la producción fisiológica de asparagina mientras que, in vitro, el efecto catalítico de la enzima sobre la asparagina persistirá. Como consecuencia directa, cuando una

15 muestra de suero se toma de un paciente tratado con asparaginasa, la presencia de una cantidad residual de enzima conducirá a un sesgo en la medición del nivel de asparagina, que será “falsamente” menor que el nivel fisiológico (Boos y col., European Journal of Cancer (1996) 32, 1544-1550). Esta interferencia en el procedimiento analítico resulta en ausencia de correlación con la actividad fisiológica de asparaginasa en el paciente probado.

20 [0013] Se han descrito varios procedimientos para el ensayo de L-asparaginasa en plasmas, y aquellos usados casi siempre se basan en la incubación de suero que contiene L-asparaginasa en un tampón que contiene Lasparagina, entonces, después de detener la reacción, la determinación del amonio se produjo usando reactivo de Nessler. Orsonneau y col. propusieron una variante más rápida y más precisa, con la que pacientes tratados con Lasparaginasa pueden monitorizarse (J.L. Orsonneau y col. Ann Biol Clin 2004, 62: 568-72). Este procedimiento se

25 basa en la acción de glutamato deshidrogenasa, que usa el amonio producido durante la hidrólisis de L-asparagina por L-asparaginasa para convertir α-cetoglutarato en ácido glutámico.

Glutamato deshidrogenasa α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH - L-glutamato + NADP + H2O

30 [0014] En esta reacción, la cantidad de NADPH oxidada en el transcurso de la reacción es equivalente a la cantidad de amoniaco contenida en la muestra y puede determinarse midiendo la disminución en la densidad óptica. La cinética de la aparición de amonio puede así monitorizarse y la actividad de la L-asparaginasa puede calcularse. Aunque este procedimiento hace posible monitorizar la actividad de L-asparaginasa en un paciente, no da ninguna información predictiva referente a la neutralización de esta enzima por factores presentes en el suero.

35 [0015] Wang y col. desarrollaron una prueba de ELISA normalizada para cuantificar IgG anti-asparaginasa en muestras de plasma de pacientes (B. Wang y col., Journal of Immunological Methods 239 (2000) 75-83). Esta prueba se usó dentro del alcance de un estudio clínico para medir la concentración de anticuerpos anti-asparaginasa presentes en el suero de pacientes con leucemia linfoblástica aguda, tratados con L-asparaginasa y que

40 desarrollaron o no desarrollaron una reacción alérgica (M.H. Woo y col., Leukemia (1998) 12, 1527-1533). Los autores pudieron mostrar que la mediana de la concentración de anticuerpos anti-asparaginasa fue mayor en los pacientes que desarrollaron una reacción alérgica independientemente de si la medición se lleva a cabo o no antes o después de que se haya producido dicha reacción. Llegan a la conclusión de que hay un beneficio en la práctica clínica de usar una prueba tal para predecir el futuro desarrollo de una reacción alérgica.

45 [0016] Sin embargo, el valor predictivo de una prueba tal puede cuestionarse; los intervalos de variación de la concentración de anticuerpos anti-asparaginasa medidos antes del desarrollo de una reacción alérgica se solapan, son respectivamente:

50 • de 0,001 a 0,375 unidades de DO para los pacientes que desarrollaron una reacción alérgica posteriormente;

• de 0,004 a 0,064 unidades de DO para los pacientes que no desarrollaron una reacción alérgica posterior

[0017] Además, la medición de la concentración de anticuerpos no da ninguna información referente a la

55 actividad farmacológica de asparaginasa en el paciente y su posible neutralización por factores presentes en el suero.

[0018] Ogawa C. y col. (British Journal of Haematology, 141, Supl. 1, 1-121) desvelan un procedimiento para predecir si una L-asparaginasa puede o no ser activa en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda. La presencia de factores neutralizantes en muestras de sangre se identifica midiendo amoniaco en plasma.

[0019] E.H. Panosyan y col., J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2004, 26, 4: 217-226 investigaron el anticuerpo antiasparaginasa y la actividad enzimática de asparaginasa en los sueros de pacientes. Los autores describen un

5 ensayo de neutralización ex vivo realizado usando especímenes de sueros de paciente como fuente de anticuerpos anti-asparaginasa. Los especímenes de suero se incubaron con disoluciones de antígeno nativo o PEGasparaginasa y se midió la restante actividad enzimática de asparaginasa. Los autores recomendaron finalmente la monitorización convencional de anticuerpos anti-asparaginasa en suero en la práctica clínica.

10 [0020] Por tanto, el objetivo de la presente invención es proponer un enfoque novedoso que haga posible vencer los inconvenientes de la técnica anterior y conocer en un momento dado si un paciente tiene o no factores que puedan neutralizar la actividad de asparaginasa. El procedimiento debe tener la ventaja de ser completamente predictivo, es decir, no debe requerir una etapa de administración de la enzima al paciente que va a diagnosticarse. Debe reflejar la capacidad del paciente para responder a cualquier forma de asparaginasa. Así, el paciente puede

15 ser un paciente que tiene que tratarse por primera vez usando la enzima, o un paciente que ha sido tratado o está siendo actualmente tratado con asparaginasa. Es posible probar la presencia de factores que pueden neutralizar la actividad de la enzima usada para tratamiento previo o actual, que hace posible conocer si el tratamiento con esta enzima puede o no reanudarse y continuarse, y opcionalmente ajustarse. También es posible detectar la presencia de factores que pueden neutralizar la actividad de la enzima considerada para el tratamiento de dicho paciente, que

20 hace posible validar o descartar el uso de una enzima particular.

[0021] Este conocimiento proveerá al médico de orientación mucho más pertinente que con los procedimientos de la técnica anterior, en forma de tratamiento (posología, pauta de dosificación) o de la elección de enzima o su forma de administración. Tanto los factores neutralizantes están ausentes como presentes a un nivel 25 suficientemente bajo para el tratamiento por medio de la enzima de prueba para que sea posible, opcionalmente con fortalecimiento de la dosificación o de la pauta de dosificación. O los factores neutralizantes están presentes a un nivel que es demasiado alto para que un tratamiento tal continúe o se inicie, y entonces la invención hace posible probar y/o recomendar una solución alternativa usando otra forma de la enzima o una forma que es menos sensible

o no es sensible a los factores neutralizantes, tales como la enzima incluida en un biovector.

30 [0022] Así, la invención tiene como objetivo proponer un procedimiento in vitro de determinación de la presencia de factores que neutralizan la actividad de asparaginasa en una muestra de sangre de un paciente.

[0023] También tiene como objetivo proponer un procedimiento para la determinación in vitro de la capacidad

35 de un paciente para responder (i) positivamente al tratamiento con una asparaginasa o (ii) de no responder a él o (iii) solo responder incompletamente.

[0024] También tiene como objetivo proponer un procedimiento para predecir la eficacia de un tratamiento usando asparaginasa o el hecho de que esta enzima no sea inmediatamente el objetivo de inactivación sustancial de

40 su actividad por factores neutralizantes.

[0025] Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento según la reivindicación 1.

[0026] En el presente documento se desvela un procedimiento de medición in vitro de la presencia de factores

45 que neutralizan la actividad de asparaginasa en una muestra de sangre, plasma, suero o medio derivado que puede contener dichos factores neutralizantes, obtenidos de un paciente, que comprende mezclar dicha muestra con una asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luego medición de la actividad residual de esta asparaginasa en la mezcla, que refleja y hace posible determinar y cuantificar la presencia de factores neutralizantes en la muestra y, por tanto, in vivo en el paciente. El procedimiento hace posible diagnosticar, cualitativamente y cuantitativamente, la

50 presencia de factores neutralizantes de asparaginasa en un paciente. Por factores neutralizantes está previsto no solo anticuerpos anti-asparaginasa, sino también cualquier otro factor que pueda inhibir la asparaginasa o su actividad enzimática, por ejemplo, proteasas tales como asparaginil endopeptidasa humana.

[0027] Así, la invención se refiere a un procedimiento para predecir si una asparaginasa dada puede o no ser

55 activa en un paciente dado. Este procedimiento comprende la determinación in vitro de la capacidad de un paciente para responder a tratamiento con una asparaginasa, en el que una muestra de sangre, plasma, suero o medio derivado que puede contener factores que neutralizan actividad de asparaginasa, obtenidos de dicho paciente, se somete al procedimiento que comprende mezcla de dicha muestra con dicha asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luego medición de la actividad enzimática residual de dicha asparaginasa en la mezcla, que refleja y hace posible determinar y cuantificar la presencia de factores neutralizantes en la muestra y, por tanto, in vivo en el paciente, que puede neutralizar actividad de asparaginasa y, por tanto, la capacidad del paciente para responder a tratamiento con esta enzima. Por tanto, la invención ofrece un procedimiento para probar la eficacia de una asparaginasa para un paciente particular.

5 [0028] Dependiendo de la presencia o ausencia de factores neutralizantes, y opcionalmente de su nivel, el procedimiento y el método hacen posible determinar si es probable que el paciente (i) responda o no positivamente al tratamiento con asparaginasa o (ii) no responda a él o (iii) solo responda incompletamente.

10 [0029] La muestra puede proceder de un paciente que actualmente está tratándose con una asparaginasa o de un paciente que se ha tratado con una asparaginasa.

[0030] La muestra también puede proceder de un paciente que nunca se ha tratado con una asparaginasa o con esta asparaginasa.

15 [0031] Las asparaginasa usada en la prueba pueden ser una que está siendo usada o se usó en el tratamiento llevado a cabo en el paciente.

[0032] También puede ser una enzima de una fuente diferente que los presentes inventores desean probar en 20 el paciente para predecir su eficacia. También es posible probar diversas enzimas simultáneamente o sucesivamente para determinar el tratamiento más adecuado para el paciente.

[0033] Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para predecir la eficacia de un tratamiento con asparaginasa o para predecir el hecho de que esta enzima no se someta inmediatamente a inactivación sustancial 25 por factores neutralizantes.

[0034] La invención se aplica a todas las formas de asparaginasa, por ejemplo, L-asparaginasa. Sin limitarse a ellas, los presentes inventores pueden mencionar las enzimas nativas obtenidas de cualquier fuente bacteriana, por ejemplo, L-asparaginasa producida por E. coli, la enzima producida por Erwinia, enzimas mutadas o enzimas

30 modificadas, por ejemplo, las enzimas PEGiladas (PEG-asparaginasa). La enzima también puede ser de origen natural, sintético o recombinante. Pueden estar libres o incluidas en un biovector, por ejemplo, en eritrocitos.

[0035] La actividad residual de la asparaginasa en la mezcla puede medirse añadiendo, a dicha mezcla, asparagina, preferentemente L-asparagina, y un sistema de reactivos que puede detectar la degradación enzimática 35 de asparagina por asparaginasa activa.

[0036] Según una configuración ventajosa, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a): incubación de la muestra con una cantidad conocida de asparaginasa; 40

(b) incubación de dicha mezcla con una cantidad conocida de asparagina, preferentemente en una cantidad que causa saturación con respecto a la cantidad de asparaginasa;

(c): incubación de dicha mezcla con el sistema de reactivos que puede proporcionar ensayo de la actividad 45 enzimática residual;

(d) evaluación cualitativa o cuantitativa de la pérdida o retención de actividad enzimática, que se correlaciona con la presencia o el contenido en la muestra, de factores que neutralizan la actividad de asparaginasa.

50 [0037] La incubación en la etapa (a) dura en particular de 1 a 60 min. El contenido de enzima es en particular de 0,1 a 5 UI/ml.

[0038] Puede ser útil y ventajoso inactivar o eliminar cualquier traza de enzima activa en la muestra de prueba. Así, según una característica, antes de la etapa (a) se lleva a cabo una etapa (a0) de eliminación o 55 inactivación de cualquier asparaginasa presente en la muestra.

[0039] Como variante, antes de la etapa (a) es posible llevar a cabo una etapa (a0) de medición del contenido de asparaginasa inicial de la muestra, que hace posible tanto verificar que dicha actividad sea cero o insignificante, como restar dicha actividad de la medida mediante el procedimiento.

[0040] Como una variante, conociendo la semivida de la enzima administrada al paciente antes de la prueba, los presentes inventores pueden esperar el tiempo necesario entre la última administración y la toma de la muestra de sangre.

5 [0041] Según una realización particular, la etapa (a) va seguida de una etapa (a1) de eliminación de los complejos inmunitarios de anticuerpo-asparaginasa. Dicha eliminación puede efectuarse fácilmente por centrifugación, de manera que la mezcla implicada en la etapa (b) sea el sobrenadante. Preferentemente, la centrifugación se lleva a cabo a 3000-25000 g durante entre 1 y 30 min a la velocidad especificada.

10 [0042] Según una característica, el sistema de reactivos es sensible a la aparición de ión amonio resultante de la degradación enzimática de asparagina por asparaginasa. Así, la presencia de factores neutralizantes puede determinarse o medirse llevando a cabo una reacción que consume el ión amonio cuantitativamente. Dicho consumo de ión amonio puede ir seguido, ventajosamente cuantitativamente, de la medición de la disminución en la densidad

15 óptica (absorbancia) de la mezcla. En particular se llevan a cabo las siguientes reacciones:

(1): asparaginasa + asparagina - ácido aspártico + NH4+

(2): α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH + glutamato deshidrogenasa (catalizador) - glutamato + NADP+ + H2O.

20 [0043] La incubación con asparagina se lleva a cabo preferentemente durante 2 a 60 min con una cantidad saturante de asparagina (con respecto a la cantidad de enzima introducida), en particular de 10 a 50 mg/ml.

[0044] La incubación con el sistema de reactivos en particular dura de 3 a 20 min.

25 [0045] Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para determinar si es probable que el paciente (i) responda o no positivamente a tratamiento con una asparaginasa o (ii) no responda a él o (iii) solo responda incompletamente. Por tanto, hace posible confirmar o descartar la posibilidad de uso de tratamiento con la enzima de prueba, o tomar una decisión para modificar la pauta de dosificación o para tratar el paciente usando una

30 asparaginasa diferente, en particular de una forma encapsulada en un biovector.

[0046] También en el presente documento se desvela un procedimiento de tratamiento de una patología sensible a asparaginasa en un paciente, que comprende:

35 (A) aplicación del procedimiento de determinación in vitro de la capacidad de un paciente para responder a tratamiento con una forma dada de asparaginasa (en particular forma libre o modificada), en el que una muestra de sangre, plasma, suero o medio derivado que puede contener factores neutralizantes de asparaginasa, obtenidos de dicho paciente, se somete a procedimiento que comprende mezcla de dicha muestra con dicha forma de asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luego medición de la actividad de asparaginasa residual en la mezcla y

40 determinación de dicha actividad neutralizante y de la capacidad del paciente para responder (i) positivamente a tratamiento con esta forma de asparaginasa o (ii) no responder a él o (iii) solo responder incompletamente, y

(B) tratamiento de la patología por medio de esta asparaginasa en caso (i) o por medio de otra forma de asparaginasa en otros casos.

45 [0047] Según una realización preferida, la otra forma de asparaginasa es asparaginasa encapsulada o incluida en un biovector, en particular encapsulada en eritrocitos. En particular, son eritrocitos producidos por lisis y resellado, por ejemplo, según la enseñanza de la solicitud de patente francesa nº 0408667.

50 [0048] Las patologías que pueden beneficiarse de este procedimiento incluyen en particular leucemias, por ejemplo, leucemias linfoblásticas agudas. Los presentes inventores pueden también mencionar, sin limitarse a esto, tumores sólidos (documento WO2007/103290), en particular cáncer pancreático y cáncer de ovario.

[0049] La invención se describirá ahora en más detalle por medio de los ejemplos, que ilustran, pero no 55 limitan, la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inmunización de un conejo con L-asparaginasa

[0050] Algunos mililitros de suero se toman del conejo antes de la primera inmunización de manera que tenga un suero pre-inmune. Entonces, el conejo se inyecta 4 veces con 500 µg de L-asparaginasa (Kidrolase®, OPI-EUSA Limonest, Francia). Los sueros se toman entre la primera y la segunda inmunización y entre la segunda y la tercera

5 inmunización. Finalmente, después de la última inmunización, el suero total se recupera y se guarda a -20 ºC. El suero final se caracteriza según su concentración de proteína total (procedimiento de Biuret) y su concentración de inmunoglobulina total.

Ejemplo 2: Purificación de IgG totales de conejo

10 [0051] La purificación de las IgG totales de conejo del suero final, que contiene IgG anti-asparaginasa, se lleva a cabo con el Kit pure 1 A de Sigma (# PURE1A). Brevemente, 2 ml de suero se clarifican por centrifugación o filtración sobre un filtro de 0,45 µm antes de la purificación de las IgG. Entonces se añaden 4 ml de “tampón de unión” a los 2 ml de suero clarificado. La mezcla se pasa, luego se eluye de la columna siguiendo el protocolo

15 recomendado por Sigma. De manera que puedan inyectarse al animal, las IgG globales se centrifugan en una columna de filtración con un umbral de 10.000 Dalton con el fin de sustituir el tampón de elución con PBS.

Ejemplo 3a: Medición de la inhibición de un suero intermedio en la actividad enzimática de L-asparaginasa (ensayo de la mezcla)

20 [0052] El ensayo de la L-asparaginasa se llevó a cabo según el protocolo publicado en: Orsonneau y col., “Automatic kinetic assay of plasma L-asparaginase in therapeutic monitoring of acute lymphoblastic leukaemias”, Ann Biol Clin, 62: 568-572.

25 [0053] Se usó primero un suero intermedio (obtenido entre la primera y la segunda inmunización) para elaborar la medición de la inhibición de actividad enzimática. Se usa una concentración de 2 UI/ml de Lasparaginasa. La enzima se pre-incuba durante 15 minutos a 37 ºC con varias diluciones de suero, luego se mide la actividad enzimática en la mezcla. Los resultados se presentan en la Tabla 1:

30 Tabla 1

Tubo nº: L-asparaginasa añadida (UI/ ml) Dilución del suero L-asparaginasa en la mezcla (IU / ml) Actividad residual, %

1: 2 - 1,96 100

2
2: 1,11 0,72 36,43

3: 2 1/2 0,78 39,63

4: 2 1/4 0,85 43,04

5: 2 1/16 1,18 60,16

6: 2 1/32 1,29 65,91

7: 2 1/128 1,64 83,74

[0054] La Tabla 1 resume las mediciones de actividades enzimáticas residuales de L-asparaginasa en las mezclas (tubos 2 a 7). El suero de conejo inhibe la actividad enzimática de L-asparaginasa: cuanto mayor sea la 35 dilución del suero, más débil será la inhibición.

[0055] El tubo 1 constituye un control, que muestra que la incubación de la enzima sola a 37 ºC durante 15 minutos no afecta su actividad enzimática.

40 Ejemplo 3b: Medición de la inhibición de un suero intermedio en la actividad enzimática de L-asparaginasa (ensayo de un sobrenadante)

[0056] Se usó un suero intermedio (obtenido entre la primera y la segunda inmunización).

45 [0057] Con el fin de simular fagocitosis de los complejos antígeno-anticuerpo por el sistema reticuloendotelial, la mezcla de L-asparaginasa / suero se incuba durante 15 minutos a 37 ºC, luego se centrifuga durante 10 minutos a 17500 g a 4 ºC con el fin de eliminar los complejos inmunitarios. La actividad enzimática se ensaya en el sobrenadante. Los resultados del ensayo se presentan en la Tabla 2:

Tabla 2

Tubo nº: L-asparaginasa añadida (UI/ml) Dilución del suero L-asparaginasa en sobrenadante (UI/ml) Actividad residual en sobrenadante (%)

1: 2 - 1,91 95,63

2
2: 1,11 0,21 10,39

3: 2 1/2 0,14 6,77

4: 2 1/4 0,05 2,72

5: 2 1/16 0,03 1,53

6: 2 1/32 0,02 0,98

7: 2 1/128 0,02 1,00

control: 2 pre-inmune 1,82 90,81

[0058] Un control, que sustituye el suero con el suero pre-inmune, se añadió de manera que se probara la 5 especificidad de la interacción entre L-asparaginasa y los anticuerpos anti-asparaginasa presentes en el suero. Esto demuestra que más de un 90 % de la enzima no participa en la interacción con anticuerpos no específicos.

[0059] Los anticuerpos presentes en el suero interaccionaron con toda la enzima para las diluciones 1/4, 1/16, 1/32 y 1/128. 10

Ejemplo 4: Medición de la inhibición de las IgG totales de conejo de la actividad enzimática de Lasparaginasa

[0060] El mismo experimento que el presentado en el Ejemplo 3b se llevó a cabo con las IgG totales de 15 conejo y una concentración de 1,25 UI/ml de L-asparaginasa. Los resultados se presentan en la Tabla 3:

Tabla 3

Tubo nº: L-asparaginasa añadida (UI/ml) Dilución de las IgG L-asparaginasa en sobrenadante (UI/ml) Actividad residual en sobrenadante (%)

control: 1,25 - 1,19 94,99

1: 1,25 - 1,26 100,00

2: - 1/8 0,02 1,38

3: 1,25 1/8 0,02 1,52

4: 1,25 1/16 0,01 0,40

5: 1,25 1/32 0,01 0,62

6: 1,25 1/64 0,01 0,98

20 [0061] Las IgG totales de conejo, que contienen IgG anti-asparaginasa, interaccionan con L-asparaginasa a partir de la dilución 1/64 y producen inhibición total de la actividad enzimática (99,02 % de la enzima precipitada).

Ejemplo 5: Inactivación, por las IgG totales de conejo, de L-asparaginasa libre inyectada en el ratón

25 [0062] Se fijó un experimento para el ratón (16 ratones) para investigar la inhibición de L-asparaginasa por las IgG anti-asparaginasa. [0063] Las condiciones experimentales fueron del siguiente modo:

30 - dosis de 100 UI/kg de L-asparaginasa, equivalente a 1,25 UI/ml que circulan en un ratón de 25 g

-: inyección de 7,5 pg de IgG totales de conejo.

[0064] La inyección de las IgG o de PBS se lleva a cabo 20 minutos antes de la inyección de L-asparaginasa, 35 libre o encapsulada en glóbulos rojos de ratón (Asp-RBC). Entonces, 6 horas después de esta última inyección mencionada, los ratones se sacrifican y la sangre se recoge.

[0065] Entonces, la actividad de L-asparaginasa se ensaya en el plasma y en los RBC. La Tabla 4 resume los valores obtenidos:

Tabla 4

Actividad de L-asparaginasa (UI/ml)

IgG: PBS

Asp-RBC: Glóbulos rojos 0,798 ± 0,126 0,879 ± 0,146

Plasma: 0,013 ± 0,002 0,126 ± 0,029

L-asparaginasa libre: Glóbulos rojos 0,132 ± 0,019 0,098 ± 0,013

Plasma: 0,002 ± 0,002 0,417 ± 0,103

5 [0066] El ensayo de L-asparaginasa en los RBC de ratones que recibieron Asp-RBC detecta 0,798 y 0,879 UI/ml en presencia de IgG o de PBS, respectivamente. Por tanto, las IgG presentes en el plasma no tuvieron un efecto inhibidor sobre la enzima encapsulada. En el plasma de estos mismos ratones, L-asparaginasa libre inyectada con Asp-RBC (todavía hay de hecho una pequeña cantidad de enzima libre fuera de los RBC, del orden del 10 % de la dosis) se inhibe en presencia de las IgG (0,013 UI/ml) y sigue siendo activa en presencia de PBS

10 (0,126 UI/ml).

[0067] Cuando la L-asparaginasa libre se inyectó, las IgG inhibieron su actividad (0,002 UI/ml) mientras que la inyección de PBS no tuvo efecto sobre la actividad de la enzima (0,417 UI/ml). Teniendo en cuenta la semivida de Lasparaginasa libre (10 horas), la medición de 0,417 UI/ml de L-asparaginasa en plasma se corresponde con la

15 actividad residual de la enzima libre 6 horas después de su inyección.

[0068] La concentración en plasma de L-asparagina se midió en el plasma de 14 de los ratones en el estudio (no pudieron usarse dos ya que el volumen era demasiado pequeño). Los resultados se presentan en la Tabla 5.

20 Tabla 5

L-asparaginasa en plasma (µmol/litro)

IgG: PBS

Asp-RBC: < 2 < 2

L-asparaginasa libre: 28,09 ± 3,63 < 2

[0069] El agotamiento de L-asparagina fue total cuando los ratones se trataron con Asp-RBC o cuando recibieron L-asparaginasa libre en presencia de PBS.

25 [0070] Solo los ratones tratados con L-asparaginasa libre en presencia de IgG tienen una concentración en plasma de L-asparagina de 28,09 µM. Por tanto, la enzima se inhibió en el plasma por las IgG.

Ejemplo 6: Medición de la inhibición de IgG totales de conejo en la actividad enzimática de PEG30 asparaginasa

[0071] Las IgG totales de conejo, que contienen IgG anti-asparaginasa, se probaron en PEG-asparaginasa (Sigma nº A5336). El mismo experimento que el presentado en el Ejemplo 4 se llevó a cabo con la PEGasparaginasa. Los resultados se presentan en la Tabla 6.

35 Tabla 6

Tubo nº: PEG-Aspa añadida (UI/ml) Dilución de las IgG PEG-Aspa ensayada (UI/ml) Actividad residual en sobrenadante (%)

1: 0,40 - 0,360 90,00

2: 0,79 1/8 0,023 2,97

3: 0,79 1/16 0,026 3,32

4: 0,79 1/32 0,023 2,90

5: 0,79 1/64 0,029 3,67

[0072] Las IgG de conejo que contienen IgG anti-asparaginasa interaccionaron con la PEG-asparaginasa. La 40 actividad detectada en el sobrenadante es inferior al 4 % de la actividad mixta inicial con las IgG.

Ejemplo 7: Protocolo de prueba

[0073] Este protocolo se aplica a un paciente que está siendo considerado para el tratamiento con una asparaginasa particular. Se toma una pequeña muestra de sangre de este paciente y se trata convencionalmente 5 para obtener una muestra de suero.

[0074] Entonces se sigue el siguiente procedimiento:

(a0) inactivación o eliminación opcional de cualquier asparaginasa presente en la muestra de suero, o medición de la 10 actividad enzimática residual

(a) incubación de la muestra con 0,1 a 5 UI/ml de asparaginasa durante 1 a 60 min;

(a1) eliminación opcional de los complejos inmunitarios, preferentemente por centrifugación a 3000-25000 g, durante 15 1 a 30 min a la velocidad especificada;

(b) incubación de la mezcla de (a) o del sobrenadante de (a1) durante 2 a 60 min con una cantidad saturante de asparagina, en particular de 10 a 50 mg/ml;

20 (c) incubación, en particular durante 3 a 20 min, de la mezcla precedente con el sistema de reactivos (αcetoglutarato, NADPH, glutamato deshidrogenasa) que puede detectar la actividad enzimática residual;

(d) evaluación cualitativa o cuantitativa de la pérdida o retención de actividad enzimática, que se correlaciona con la presencia o el contenido de factores neutralizantes de asparaginasa en la muestra.

25 [0075] Es posible determinar niveles o umbrales de niveles de actividad residual enzimática dependiendo de si se incluye o no o no la etapa (a1).

[0076] En un paciente que ya ha sido tratado, si el procedimiento muestra marcada presencia de factores

30 neutralizantes, se recomienda y se aplica un tratamiento de sustitución usando una forma diferente de asparaginasa. En particular, cuando es probable que la forma libre o modificada se inhiba, se recomienda la enzima encapsulada en eritrocitos.

[0077] El mismo protocolo es aplicable simplemente para probar la posible eficacia de una asparaginasa en el 35 paciente.

Ejemplo 8: Efecto de la matriz de suero del paciente sobre la medición de la actividad de L-asparaginasa

[0078] Tres sueros humanos, sin tratamiento previo con L-asparaginasa, se mezclaron con 7 concentraciones

40 de L-asparaginasa (de 0 a 800 UI/l) para garantizar que el suero humano no tuviera interferencia sobre la actividad de medición de L-asparaginasa. Las muestras se incubaron 15 minutos a 37 ºC y se centrifugaron 10 minutos a 17500 g a 4 ºC. La actividad de L-asparaginasa se comprueba en el sobrenadante. Como control, tampón 1X PBS4% de BSA se mezcló con las mismas concentraciones de L-asparaginasa. Los resultados se presentan en la Tabla

7. 45

Tabla 7:

Actividad de L-asparaginasa medida (UI/l)

condición: L-asparaginasa añadida UI/l sérum 246922 sérum 25579 sérum 255810

pure sérum: 800 685 783 788

400: ND* 442 461

200: 220 220 246

100: 101 125 122

50: 30 76 72

25: 19 37 33

0
0
0: 3

control de tampón: 800 753 802 851

400: 407 455 463

200: 218 236 244

100: 115 120 124

50: 63 59 77

25: 24 45 37

0
0: -
0

* : No determinado

5 [0079] No se observó interferencia de suero humano sobre la medición de actividad de L-asparaginasa (en comparación con el control de tampón: véase la Tabla 7 y la Figura 1).

Ejemplo 9: Efecto de la matriz de suero del paciente sobre la medición de actividad de L-asparaginasa y determinación de la actividad basal de suero humano

10 [0080] Cincuenta y dos sueros humanos, sin tratamiento previo con L-asparaginasa, se mezclaron con Lasparaginasa a una concentración final de 500 UI/l para garantizar que el suero humano no tuviera interferencia sobre la medición de actividad de L-asparaginasa. Las muestras se incubaron 15 minutos a 37 ºC y se centrifugaron 10 minutos a 17500 g a 4 ºC. La actividad de L-asparaginasa se comprueba en el sobrenadante. Como control,

15 tampón 1X PBS-4% de BSA se mezcló con la misma concentración final de L-asparaginasa. Los resultados se presentan en la Tabla 8 y en la Figura 2.

Tabla 8: Medición de la actividad de L-asparaginasa en 52 sueros humanos con L-asparaginasa añadida a una concentración final de 500 (UI/l) 20

Suero: Actividad de L-asparaginasa medida (UI/l)

1: 467

2: 493

3: 505

4: 492

5: 466

6: 482

7: 470

8: 474

9: 453

10: 474

11: 482

12: 472

13: 467

14: 469

15: 468

16: 456

17: 476

18: 477

19: 481

Suero: Actividad de L-asparaginasa medida (UI/l)

20: 477

21: 479

22: 486

23: 478

24: 479

25: 472

26: 479

27: 457

28: 457

29: 483

30: 472

31: 418

32: 462

33: 477

34: 477

35: 467

36: 442

37: 464

38: 464

39: 489

40: 452

41: 475

42: 484

43: 480

44: 480

45: 475

46: 478

47: 473

48: 482

49: 480

50: 473

51: 478

52: 477

Control: 480

Media: 473,02

Desviación estándar: 13,4

Mean - 2DE: 446,22

Mean + 2DE: 499,82

[0081] La actividad media medida para los 52 sueros humanos es 473 UI/l, la desviación estándar (DE) es 13,4 UI/l. La actividad media medida para los sueros no es significativamente diferente de la actividad de control. Todos los valores están comprendidos dentro de un intervalo aceptable: de las 52 mediciones, solo 3 están fuera del

5 intervalo de confianza de [media - 2SD; media + 2SD]. La distribución de la actividad medida según el suero ensayado indica que la actividad de L-asparaginasa no está afectada por el suero de matriz (Figura 2).

[0082] Para comprobar la ausencia de la señal de actividad enzimática en suero humano: 25 sueros humanos sin tratamiento previo con L-asparaginasa se ensayaron para actividad de L-asparaginasa. 10 Tabla 9: Medición de la actividad de L-asparaginasa en 25 sueros humanos sin tratamiento previo con Lasparaginasa

Suero: Actividad de L-asparaginasa medida (UI/l)

1: 0

2
2

3: 2

4: 1

5: 2

6: 0

7: 0

8: 0

9: 0

10: 0

11: 0

12: 0

13: 0

14: 1

15: 2

16: 1

17: 5

18: 2

19: 0

20: 3

21: 1

22: 0

23: 0

24: 0

25: 0

Media: 0,88

Desviación estándar: 1,27

Ejemplo 10: Inhibición de la actividad de L-asparaginasa por sueros humanos enriquecidos en IgG anti10 asparaginasa

[0083] Con cada uno de los 25 sueros humanos ensayados, la actividad de L-asparaginasa es próxima a cero. La actividad media medida es 0,88 UI/l y la desviación estándar es 1,27 UI/l. La actividad máxima medida es 5

5 UI/l, para el suero 17 esta señal de la actividad basal probablemente no está afectada por la medición de actividad de L-asparaginasa ya que representa el 1 % de la actividad medida para sueros mixtos con L-asparaginasa a una concentración final de 500 UI/l.

[0084] Dos sueros humanos, sin tratamiento previo con L-asparaginasa, se reunieron y se enriquecieron con concentraciones de IgG anti-asparaginasa que oscilan entre 1 y 100 µg/ml (1, 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100 µg/ml). Las IgG anti-asparaginasa se obtuvieron como se describe en los Ejemplos 1 y 2.

15 Entonces se añadieron 500 UI/l de L-asparaginasa. Las muestras se incubaron 15 minutos a 37 ºC y se centrifugaron 10 minutos a 17500 g a 4 ºC. La actividad residual de L-asparaginasa se midió en el sobrenadante. Como control se usó tampón 1X PBS-4% de BSA en lugar del conjunto de sueros humanos. Los resultados se presentan en la Tabla 10 y la Figura 3.

Tabla 10

IgG de control añadida (µg/ml): IgG anti-aspa añadida (µg/ml) L-asparaginasa añadida (UI/l) actividad de Lasparaginasa medida (UI/l) inhibición (%)

conjunto de suero humano: 100 500 589 0,00

40: 500 537 0,00

0
0: -

0: 500 534 0,00

1: 500 518 3,00

2: 500 548 0,00

5: 500 515 3,56

10: 500 426 20,22

20: 500 4 99,25

40: 500 3 99,44

80: 500 1 99,81

100: 500 0 100,00

control de tampón: 100 500 558 0,00

40: 500 592 0,00

0
0: -

0: 500 564 0,00

1: 500 595 0,00

2: 500 562 0,00

5: 500 550 2,48

10: 500 378 32,98

20: 500 7 98,76

40: 500 ND* -

80: 500 2 99,65

100: 500 0 100,00

*: No determinado

5 [0085] Cuando la L-asparaginasa se mezcla con concentraciones crecientes de IgG anti-asparaginasa (IgG específica), en control de suero humano o de tampón, la inhibición de la actividad enzimática total se produce a una concentración de IgG de 20 µg/ml y superior. La inhibición parcial se produce cuando la enzima se mezcla con 5 a 20 µg/ml de IgG anti-asparaginasa. Por debajo de 5 µg/ml de IgG anti-asparaginasa, la actividad de L-asparaginasa no se inhibe.

10 La no inhibición se observa cuando la L-asparaginasa se incuba con IgG no específica (véase IgG de control añadida en la Tabla 10).

[0086] Para refinar la reacción de inhibición de la concentración de IgG anti-asparaginasa entre 10 y 20 µg/ml en la actividad de L-asparaginasa se realizó un experimento con concentraciones de IgG que oscilaban de 8 a 22

15 µg/ml. Como es usual, la L-asparaginasa se añade a una concentración final de 500 UI/l. Todas las muestras se incubaron 15 minutos a 37 ºC y se centrifugaron 10 minutos a 17500 g a 4 ºC. La actividad residual de Lasparaginasa se mide en el sobrenadante. El ensayo se realiza con un conjunto de suero humano. Los resultados se presentan en la Tabla 11 y la Figura 4.

20 Tabla 11 [0087] La inhibición total de la actividad de L-asparaginasa aparece a una concentración de IgG de 16 µg/ml. Por debajo de 16 µg/ml, la inhibición de la actividad de L-asparaginasa es parcial. Se probó la reacción opuesta: una concentración de IgG anti-asparaginasa fija (13,64 µg/ml correspondiente al 80% de inhibición) se mezcló con

IgG anti-aspa añadida (µg/ml): L-asparaginasa añadida (UI/l) actividad de L-asparaginasa medida (UI/l) inhibición (%)

conjunto de suero humano: 2 -

22: 1

500: 580 -

8: 500 510 12,07

10: 500 410 29,31

12: 500 98 83,10

14: 500 65 88,79

16: 500 5 99,14

18: 500 1 99,83

20: 500 0 100,00

22: 500 2 99,66

5 concentraciones de L-asparaginasa que oscilaban de 500 a 10000 UI/l. Las muestras se incubaron 15 minutos a 37 ºC y se centrifugaron 10 minutos a 17500 g a 4 ºC. La actividad residual de L-asparaginasa se mide en el sobrenadante. Los resultados se muestran en la Tabla 12 y la Figura 5.

Tabla 12

conjunto de suero humano: 13,64 0 -

13,64: 500 36 93,00

13,64: 1000 716 32,00

13,64: 5000 5010 9,00

13,64: 10000 10780 3,00

500: 548 -

1000: 1052 -

5000: 5480 -

10000: 11080 -

[0088] Cuanto más concentrada esté la L-asparaginasa, menos concentración de IgG fija (13,64 µg/ml) inhibe su actividad. Una cantidad fija de IgG anti-asparaginasa inhibe una cantidad fija de L-asparaginasa. Por tanto, la actividad de inhibición de L-asparaginasa es dependiente de la dosis.

Ejemplo 11: Prueba de 57 sueros humanos de 17 pacientes tratados con L-asparaginasa

[0089] Para garantizar que el ensayo tiene la capacidad de cuantificar la neutralización de asparaginasa en un paciente: 57 sueros humanos muestreados de 17 pacientes con leucemia linfoblástica aguda bajo tratamiento con L

20 asparaginasa se probaron según el protocolo de prueba descrito en el Ejemplo 7. Las muestras se tomaron en diferentes momentos del transcurso de tiempo y se realizó una medida de la actividad enzimática de L-asparaginasa residual para verificar que esta actividad era insignificante y no interfería con el procedimiento de prueba.

[0090] Entonces, se mezclaron los sueros con L-asparaginasa a una concentración final de 500 UI/I y se

25 incubaron 15 minutos a temperatura ambiente. La actividad de L-asparaginasa se determinó entonces antes y después de una etapa de centrifugación de 6 minutos a 7800 rpm. Como control, tampón 1X PBS-4% de BSA se mezcló con L-asparaginasa a una concentración final de 500 UI/l. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 13 y en la Figura 6.

30 Tabla 13: Prueba de 57 sueros humanos de 17 pacientes bajo tratamiento con L-asparaginasa

Paciente: Suero Actividad inicial (UI/l) Actividad después de la adición de Lasparaginasa (UI/l) Actividad después de adición de asparaginasa centrifugación (UI/l) la Ly % de inhibición sin centrifugación % de inhibición después de la centrifugación

Control: 6 655 662 NA NA

1
1: 2 551 515 15,88 22,21

2
2: 440 342 32,82 48,34

3: 1 559 518 14,66 21,75

4: 2 658 655 -0,46 1,06

Paciente: Suero Actividad inicial (UI/l) Actividad después de la adición de Lasparaginasa (UI/l) Actividad después de la adición de Lasparaginasa y centrifugación (UI/l) % de inhibición sin centrifugación % de inhibición después de la centrifugación

2: 5 7 NA 441 NA 33,38

6: 13 767 727 -17,1 -9,82

3: 7 1 706 701 -7,79 -5,89

8: -2 724 716 -10,53 -8,16

9: 11 692 731 -5,65 -10,42

10: 2 680 666 -3,82 -0,6

11: 1 711 733 -8,55 -10,73

12: 1 754 711 -15,11 -7,4

13: 2 726 730 -10,84 -10,27

4: 14 2 664 744 -1,37 -12,39

15: 15 804 667 -22,75 -0,76

Control: 6 636 NA NA

5: 16 1 690 516 -8,49 18,87

17: 2 649 678 -2,04 -6,6

18: 2 684 575 -7,55 9,59

19: ND 622 633 2,2 0,47

20: 1 670 604 -5,35 5,03

21: 1 609 583 4,25 8,33

6: 22 1 659 519 -3,62 18,4

7: 23 2 508 492 20,13 22,64

8: 24 1 761 473 -19,65 25,63

25: 0 633 608 0,47 4,4

9: 26 4 705 524 -10,85 17,61

27: 2 656 525 -3,14 17,45

10: 28 3 608 623 4,4 2,04

29: 1 649 560 -2,04 11,95

30: 3 610 609 4,09 4,25

31: 7 694 570 -9,12 10,38

32: -1 598 586 5,97 7,86

33: 2 589 516 7,39 18,87

34: 0 527 NA 17,14 NA

Control: 3 661 629 NA NA

11: 35 2 713 587 -7,87 6,68

36: 1 499 667 24,51 -6,04

37: 3 596 666 9,83 -5,88

38: 2 701 579 -6,05 7,95

39: 2 850 408 -28,59 35,14

12: 40 2 798 446 -20,73 29,09

41: 2 599 596 9,38 5,25

42: 5 814 448 -23,15 28,78

43: 3 752 265 -13,77 57,87

13: 44 1 705 570 -6,66 9,38

14: 45 1 685 659 -3,63 -4,77

15: 46 1 573 388 13,31 38,31

47: 2 492 408 25,57 35,14

48: 1 605 678 8,47 -7,79

49: 2 571 355 13,62 43,56

50: 2 725 275 -9,68 56,28

51: 2 464 437 29,8 30,52

52: 3 497 475 24,81 24,48

53: 0 540 445 18,31 29,25

16: 54 3 550 524 16,79 16,69

55: 2 568 637 14,07 -1,27

56: 1 595 379 9,98 39,75

17: 57 1 709 585 -7,26 7

ND: No determinado NA: No aplicable

[0091] Todas las muestras tienen una actividad residual de asparaginasa que es insignificante, la mayor actividad residual es de 15 UI/l y no debe interferir con el procedimiento de prueba ya que representa solo el 3 % de la L-asparaginasa añadida teórica. La actividad de asparaginasa medida para el control es superior a la esperada

5 (655, 636 y 661 UI/l, respectivamente, para los 3 controles en comparación con las 500 UI/l que se esperaban). El porcentaje de inhibición de la actividad de asparaginasa se calculó basándose en la actividad enzimática medida para el control. El hecho de que numerosos valores de porcentaje de inhibición sean negativos indica un sesgo en el procedimiento de medición. El porcentaje de inhibición de la actividad de asparaginasa es superior después de la centrifugación, sugiriendo que

10 la etapa de centrifugación ha eliminado algunos complejos inmunitarios que se formaron entre asparaginasa y anticuerpos anti-asparaginasa.

[0092] En los 17 pacientes ensayados, 14 experimentan una inhibición de la actividad de asparaginasa por factores presentes en su suero (Figura 6). Ocho pacientes tienen un porcentaje de inhibición superior al 20 %, pero 15 solo tres pacientes tienen un porcentaje de inhibición superior al 40 % (Figura 6).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para predecir si una asparaginasa puede ser o no activa en un paciente, en el que se mide in vitro la presencia de factores que neutralizan la actividad de asparaginasa en una muestra de sangre,

5 plasma, suero o medio derivado que puede contener dichos factores neutralizantes, obtenidos de dicho paciente, procedimiento que comprende mezcla de dicha muestra con dicha asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luego medición de la actividad residual de dicha asparaginasa en la mezcla, y determinación o cuantificación de la presencia de dichos factores neutralizantes.

10 2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es de un paciente que actualmente está tratándose con una asparaginasa o de un paciente que se ha tratado con una asparaginasa.
3. El procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la medición de la actividad residual de

asparaginasa en la mezcla se lleva a cabo añadiendo, a dicha mezcla, asparagina y un sistema de reactivos 15 adecuados para ensayar la actividad enzimática residual.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas:

(a) incubación de la muestra con una cantidad conocida de dicha asparaginasa; 20

(b)

incubación de dicha mezcla con una cantidad conocida de asparagina;

(c)

incubación de dicha mezcla con el sistema de reactivos adecuados para ensayar la actividad enzimática residual;

25 (d) evaluación cualitativa o cuantitativa de la pérdida o retención de actividad enzimática, que se correlaciona con la presencia o con el contenido de factores neutralizantes de dicha asparaginasa en la muestra.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende, antes de la etapa (a), una etapa (a0) de

eliminación o inactivación de cualquier asparaginasa que puede estar presente en la muestra. 30
6. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende, antes de la etapa (a), una etapa (a0) de medición del contenido de referencia de asparaginasa en la muestra.
7. El procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el sistema de reactivos es sensible 35 a la aparición del ión amonio resultante de la degradación enzimática de asparagina por asparaginasa.
8. El procedimiento según la reivindicación 7, que emplea una reacción que consume el ión amonio cuantitativamente.

40 9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el consumo cuantitativo del ión amonio se mide midiendo la disminución en densidad óptica de la mezcla.
10. El procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 9, que emplea las siguientes reacciones:

45 (1) asparaginasa + asparagina- ácido aspártico + NH4+

(2) α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH + glutamato deshidrogenasa (catalizador) - glutamato + NADP+ + H2O.
11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la

50 determinación de la capacidad del paciente para responder (i) positivamente a tratamiento con esta forma de asparaginasa o (ii) no responder a él o (iii) solo responder incompletamente.
12. El procedimiento según la reivindicación 11, que comprende, para los casos (ii) y (iii), la decisión de

tratar al paciente usando alguna otra asparaginasa. 55
13.

El procedimiento según la reivindicación 11, que comprende, para el caso (i), la decisión de tratar el paciente usando esta asparaginasa.
14.

El procedimiento según la reivindicación 12, en el que la otra asparaginasa es una asparaginasa

incluida en un biovector.
15.

El procedimiento según la reivindicación 14, en el que la otra asparaginasa está encapsulada en eritrocitos.