CN1554360A - 玉足海参多糖在制备抗凝血药及血管生成抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从玉足海参(Hojothurialeucospilota)中提取的总多糖中分离纯化得到的一种硫酸粘多糖(YC)在制药领域中的新用途。该多糖具有明显的抗凝血、抑制血小板聚集、抗血栓作用，表现为：玉足海参硫酸粘多糖对小鼠凝血时间影响的量效关系明显；能显著性延长家兔白陶土部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、家兔复钙时间；能显著性抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集，显著减少家兔体外血栓的形成，改善血液流度学，同时还具有显著性抑制血管的芽生及血管网络的形成、抑制内皮细胞增殖的作用，从而抑制体外血管的生成。可用于抗凝血，血液流变异常及血管生成增多密切相关疾病的防治。

Description

玉足海参多糖在制备抗凝血药及血管生成抑制剂中的应用

一、技术领域

本发明涉及中药提取物的用途，尤其是涉及一种从玉足海参(Hojothurialeucospilota)中提取的多糖YC在制药领域中的应用。

二、背景技术

玉足海参(Hojothuria leucospilota)，又称乌参。系广东省、海南岛一带的民间药。由玉足海参中提取的总多糖中分离纯化得到的一种硫酸粘多糖(以下简称多糖YC)，其主要功能为滋阴养血，温经通络，补肾益精。对从玉足海参中提取的多糖(YC)在抗凝血、改善血液流变学及抑制血管生成方面的研究目前尚未见报道，临床上也未见玉足海参多糖(YC)进行抗凝血，改善血液流变学及抗血管生成的应用。

三、发明内容

1.发明目的

本发明的目的在于提供玉足海参多糖YC的新用途，即在制药领域中的新应用。

2.技术方案

本发明涉及玉足海参多糖YC在制备抗凝血药中的应用。

还涉及玉足海参多糖YC在制备血管生成抑制剂的药中的应用。

为了更好地理解本发明的实质，下面将玉足海参多糖YC的药理试验及实验结果来说明其在制药领域中的新用途。

以下是玉足海参多糖YC抗凝作用及抗血管生成作用的研究，实验方法及结果如下：

(1)取健康ICR小鼠按不同剂量(41.6mg/kg、10.4mg/kg、5.2mg/kg、2.6mg/kg、1.3mg/kg)尾静脉注射玉足海参多糖YC，给药30分钟后眼眶取血，用玻片法和毛细管法同时测量其凝血时间，以41.6mg/kg剂量尾静脉注射受试小鼠，其凝血时间均大于10分钟，与对照组相比，均有显著性差异(P＜0.01)。

(2)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定白陶土部分凝血活酶时间(APTT)。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔白陶土部分凝血活酶时间，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

(3)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定凝血酶原时间(PT)。有效剂量范围为25～100mg/kg，

结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔凝血酶原时间，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

(4)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定血浆复钙时间。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔血浆复钙时间，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

(5)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定ADP和AA诱导的血小板聚集率。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，多糖YC终浓度为41.48和20.74mg/kg两个剂量均有抑制ADP诱导的体外血小板聚集的作用，与正常组比较有显著性差异。当用大剂量时(154mg/kg)，对AA诱导的血小板聚集率有一定的抑制作用。

(6)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，用血栓仪测定5分钟内体外血栓形成度。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，多糖YC可以降低家兔体外形成血栓长度(P＜0.05)，减轻血栓湿重(P＜0.01)和干重(P＜0.01)。

(7)采用体外三位立体血管生成模型，向培养体系中加入不同浓度的玉足海参多糖YC，观察玉足海参多糖YC对血管生成的作用。有效剂量范围为1.7～166.7μg/ml。结果表明，玉足海参多糖YC能显著抑制芽生高峰期时的芽生内皮细胞数，各给药组管腔结构较正常组显著减少，表明多糖YC有明显的抗血管生成作用。

(8)采用[³H]掺入法测定玉足海参多糖YC对体外培养的内皮细胞的增殖有何作用。有效剂量范围为10～500μg/ml。结果表明，各给药组能显著抑制人脐静脉内皮细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成，对内皮细胞增殖呈显著的抑制作用。

3.有益效果

(1)玉足海参多糖YC具有明显的抗凝血作用。玉足海参多糖YC能显著性延长APTT、PT、血浆复钙时间、对血小板聚集也有一定抑制作用，能显著性减少体外血栓的形成。其抗凝血作用呈良好的量效关系，且作用与肝素相似，表明玉足海参多糖YC可用于抗凝血。

(2)玉足海参多糖YC有抑制血管生成的作用。许多疾病与血管生成异常关系非常密切，如肿瘤生长与血管生成密切相关，Folkman等认为肿瘤一旦出现，其体积增加之前必然伴随会聚于该肿瘤的新生血管的增加；患有视网膜病变的糖尿病病人视网膜上的血管是增生的。此外，诸如关节炎、牛皮癣等疾病也与血管生成过度相关。实验结果显示，大鼠主动脉环在玉足海参多糖YC的作用下，血管生成明显被抑制(P＜0.05，P＜0.01)。进一步的研究表明，玉足海参多糖YC还能够显著性抑制体外培养的内皮细胞的增殖。实验结果显示，玉足海参多糖YC可以通过抑制内皮细胞增殖来抑制血管生成。

四、具体实施方式

本发明的有益效果可以通过以下实施例作进一步说明：

实施例1.玉足海参多糖YC抗凝作用研究。

(一)玉足海参多糖YC对小鼠凝血时间的影响。

1.实验材料

动物：ICR小鼠，由南京中医药大学实验动物中心提供。

试剂：生理盐水、玉足海参多糖YC

2.实验方法与结果

取健康ICR小鼠55只，随机分成6组，除最大剂量组为5只外其余每组各10只。玉足海参多糖YC组尾静脉注射(41.6mg/kg、10.4mg/kg、5.2mg/kg、2.6mg/kg、1.3mg/kg)给予YC、正常组尾静脉注射等体积生理盐水。每只受试小鼠用玻片法及毛细管法测凝血时间，给药组与正常组比较，并根据所得数据画出量效关系图。

玉足海参多糖YC以41.6mg/kg剂量尾静脉注射，5只受试小鼠用玻片法及毛细管法所测凝血时间均＞10分钟(其中一只死亡)，除了最小剂量1.3mg/kg外，其余各组玻片法和毛细管法所测凝血时间与对照组相比，均有显著性差异(P＜0.01)。见表1和图1。

    表1：玉足海参多糖YC对小鼠凝血时间的影响( X±SD，n＝10)

组别              剂量         毛细管法(秒)      玻片法(秒)

生理盐水组        10ml/kg      107±76.8         125.2±71.5

玉足海参多糖YC    41.6mg/kg    600±0^**         600±0^**

                  10.4mg/kg    446.8±247.6^**   389.1±242.1^**

                  5.2mg/kg     422.4±190.2^**   420.8±199.5^**

                  2.6mg/kg     331.3±174.8^**   358±194.9^**

                  1.3mg/kg     113.1±59.6       172.9±140.7

注：与对照组相比，^**P＜0.01。玉足海参多糖YC41.6mg/kg剂量组的小鼠数n＝5。

(二)玉足海参多糖对家兔白陶土部分凝血活酶时间的影响(APTT)

1.实验材料

动物：青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。

试剂：生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵、白陶土

2.实验方法与结果

取家兔24只，随机分为4组，按5ml/kg连续灌胃10天。于第10天给药1h后，颈动脉放血。以1.34％草酸钠按9∶1抗凝采血，混匀后3000rpm离心10min，分离血浆备用。取试管5只，每管中加入充分混匀的白陶土部分凝血活酶和血浆各0.1ml摇匀，37℃水浴中孵育3min，其间轻轻振摇试管，再加入已加温到37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，同时开始计时，每隔15s取出试管轻轻倾斜，直到自陶土颗粒聚集变粗，凝固成块为止。

  表2.玉足海参多糖对家兔白陶土部分凝血活酶时间的影响( X±SD，n＝6)

组别        给药途径    剂量(mg/kg×d)      白陶土部分凝血活酶时间(S)

对照组      ig          等体积蒸馏水        23.08±7.86

YC组        ig          100×10             37.25±5.91^**

YC组        ig          25×10              42.00±6.96^**

阿司匹林组  ig          82×10              35.17±3.95^**

与对照组比较**P＜0.01

结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔白陶土部分凝血活酶时间(P＜0.01)。

(三)玉足海参多糖对家兔凝血酶原时间的影响(PT)

1.实验材料

动物：青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。

试剂：生理盐水、玉足海参多糖、阿斯匹灵、氯化钙

2.实验方法与结果

取家兔24只，分组及给药同前。于第10天给药1h后颈动脉放血，以3.8％枸椽酸钠按9∶1抗凝采血，混匀后3000rpm离心10min，分离血浆备用。取试管3支，先加入凝血活酶和0.025mol/L氯化钙各0.1ml，再加入血浆0.1ml，混匀后立即放入37℃水浴中温育，同时开始计时，每隔2～3s倾斜试管1次，记录纤维蛋白凝固液面不动所需时间。

    表3.玉足海参多糖对家兔凝血酶原时间的影响( X±SD，n＝6)

组别        给药途径    剂量(mg/kg×d)         凝血酶原时间(s)

对照组      ig          等体积蒸馏水           13.88±0.96

YC组        ig          100×10                29.90±3.82^**

YC组        ig          25×10                 25.40±7.00^**

阿司匹林组  ig          82×10                 21.93±1.78^**

与对照组比较：**P＜0.01

结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔凝血酶原时间(P＜0.01)。

(四)玉足海参多糖YC对家兔复钙时间的影响

1.实验材料

动物：青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。

试剂：生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵

2.实验方法与结果

取家兔24只，分组及给药同前。于第10天给药1h后颈动脉放血，以3.8％枸椽酸钠按9∶1抗凝采血，混匀后3000rpm离心10min，分离血浆备用。取试管3支，每管各先加入血浆0.1ml，随即放入37℃水浴中温育1分钟，然后加入0.025mol/L氯化钙各0.1ml，混匀后再次放入37℃水浴中温育，同时开始计时，每隔2～3s倾斜试管1次，记录纤维蛋白凝固液面不动所需时间。

    表4.玉足海参多糖对家兔复钙时间的影响( X±SD，n＝10)

组别        给药途径    剂量(mg/kg×d)          时间(s)

对照组      ig          等体积生理盐水          23.83±5.53

YC组        ig          100×10                 47.67±7.93^**

YC组        ig          25×10                  46.00±8.15^**

阿司匹林组  ig          82×10                  43.50±3.89^**

与对照组比较**P＜0.01

结果显示，玉足海参多糖YC多糖可以显著延长家兔复钙时间(P＜0.01)。

(五)玉足海参多糖YC对ADP和AA诱导的家兔血小板聚集的影响

1.实验材料

动物：青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。

试剂：生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵、ADP、AA

2.实验方法与结果

青紫兰家兔用普鲁卡因颈部局部麻醉，颈动脉插管放血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以800r/min离心10min，取富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r/min离心10min，取贫血小板血浆(PPP)，聚集诱导剂用ADP(浓度40nmol/L)和AA(浓度2mg/ml)，每管PRP中加入不同药物10μl，对照的PRP中加入缓冲液10μl，相对的PPP管中则加入相应的药物，37℃温育5分钟，然后按文献方法用PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪检测血小板聚集率。

(1)ADP诱导的血小板聚集率的影响

结果玉足海参多糖YC终浓度为41.48和20.74μg/ml两个剂量均有抑制ADP诱导的体外血小板聚集的作用，与正常组比较差异有高度显著性，二个阳性对照药也有抑制血小板聚集的作用，其中又以脉络宁为最强(见表5)。

    表5：玉足海参多糖YC对ADP诱导的家兔体外血小板聚集率的影响( X±SD)

组别      终浓度    例    1min聚集率       最大聚集率       5min聚集率   抑制率

          (μg/ml)  数    (％)             (％)             (％)          (％)

正常      等容积    12    29.33±2.93    38.51±3.98     32.63±7.86

脉络宁    100％     6     3.67±1.51^②    5.72±1.79^②      0.33±0.82^②        85.15

肝素钠    18.52     6     19.50±2.88^②   22.17±2.56^②   16.67±4.27^②      42.43

玉足多糖  41.48     6     19.33±1.97^②③ 23.17±2.62^②③ 20.33±2.58^②③   39.83

          20.74     6     21.67±0.52^②③ 25.90±2.63^②③ 18.33±2.88^②③   32.75

          12.96     6     30.00±4.60     34.97±4.14     29.17±4.75      9.19

注：与正常组比较①P＜0.05，②P＜0.01；与12.96μg/ml剂量组比较③P＜0.01(下同)。

(2)AA诱导的家兔体外血小板聚集率的影响

结果提示玉足海参多糖YC在终浓度为41.48μg/ml和低分子肝素钠在18.52μg/ml时对AA诱导的体外血小板聚集均未见明显的抑制作用，在加大剂量后玉足海参多糖YC(154.1μg/ml)和低分子肝素钠(148.1μg/ml)才表现出微弱的抑制作用。脉络宁注射液则对AA诱导的体外血小板聚集有明显的抑制作用(见表6)。

表6：玉足海参多糖YC对AA诱导的家兔体外血小板聚集率的影响( X±SD)

组别    终浓度    例   1min聚集率     最大聚集率     5min聚集率    抑制率

        (μg/ml)  数   (％)           (％)           (％)          (％)

正常    等容积    8    32.88±3.83    51.59±2.64   51.59±2.64

脉络宁  25％      5    9.80±2.78^②   18.94±8.24^② 15.20±9.73^② 63.29

肝素钠  148.1     6    31.00±1.16    48.05±4.10^① 48.05±4.10^① 6.86

        18.52     5    25.20±5.59^①  50.00±3.35    50.00±3.35   3.08

YC组    154.1     6    28.75±3.95    45.70±5.08^① 45.70±5.08^① 11.42

        41.8      5    27.20±3.90^①  50.02±2.95    50.02±2.95   3.04

实验结果提示玉足海参多糖YC对弱诱导剂ADP诱导的体外血小板聚集有一定的抑制作用，而对强诱导剂AA诱导的血小板聚集抑制作用不明显，说明本品抑制血小板聚集的作用较弱。

(六)玉足海参多糖YC多糖对家兔体外血栓形成的影响

1.实验材料

动物：青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。

试剂：生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵

2.实验方法与结果

青紫兰家兔用普鲁卡因颈部局部麻醉，颈动脉插管放血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以800r/min离心10min，取富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r/min离心10min，取贫血小板血浆(PPP)，聚集诱导剂用ADP(浓度40nmol/L)和AA(浓度2mg/ml)，每管PRP中加入不同药物10μl，对照的PRP中加入缓冲液10μl，相对的PPP管中则加入相应的药物，37℃温育5分钟，然后按文献方法用PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪检测血小板聚集率。

表7.玉足海参多糖YC对家兔体外血栓形成的影响( X±SD，n＝6)

组别        剂量(mg/kg×d)  长度(cm)      湿重(g)            干重(mg)

对照组      等体积生理盐水  11.58±3.44   0.4597±0.082      122.33±48.45

YC组        100×10         6.23±2.61^*  0.1663±0.078^**   26.62±22.69^**

YC组        25×10          7.03±3.13^** 0.1998±0.0086^***  19.45±18.31^**

阿司匹林组  82×10          3.47±2.09^** 0.1093±0.0082^***  18.98±21.69^***

与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

结果表明，玉足海参多糖YC可以降低家兔体外形成的血栓长度(P＜0.05)，减轻血栓湿重(P＜0.01)和干重(P＜0.01)。

实施例2.玉足海参多糖YC抗血管生成作用研究方法及剂量如下：

1.实验材料

动物：雄性SD大鼠，由南京中医药大学实验动物中心提供

试剂：M199培养基、碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)、Fibrinogen、乌拉坦、玉足海参多糖YC

器械：手术器械、高压灭菌锅、培养皿、48空培养板、超净工作台、恒温细胞培养箱、倒置显微镜

2.实验方法及结果

取8～12周龄的SD雄性大鼠2只，乌拉坦麻醉后打开胸腔，剪取胸主动脉。在预冷的PBS液中分离除去血管外组织并洗去管内淤血，将动脉条剪成1mm后的动脉环备用。吸取400μl用M199配制的Fibrinogen，加2μl 25U/ml的thrombin混匀后立即加入到48孔板内，放入血管环。待胶凝固后加入600μ1的无血清M199培养基。给药组培养基由550μl无血清M199培养基加50μl药液组成；联合给药组则由500μl无血清M199培养基加50μl A药及50μl B药组成。隔天换液并计数芽生细胞数及管腔结构数，作统计学处理。

结果显示，玉足海参多糖YC能够显著性抑制芽生高峰期(7day)时的芽生内皮细胞数。各给药组管腔结构较正常组显著减少，见表8和表9。表明玉足海参多糖YC有明显的抗血管生成作用。

            表8玉足海参多糖YC对芽生内皮细胞数的影响

组别          剂量           3day          5day           7day

正常组        等量培养基     1.52±1.15    2.72±1.61     2.82±1.84

bFGF组        41.7ng/ml      2.01±1.44    3.61±2.03^*   3.64±1.37^*

YC大剂量组    166.7μg/ml    1.34±1.04    2.36±1.66     2.23±1.26

YC中剂量组    16.7μg/ml     1.22±0.68    2.63±1.43     1.90±0.91^**

YC小剂量组    1.7μg/ml      1.23±0.87    2.58±1.85     1.77±1.12^**

与对照组比较*p＜0.05  **P＜0.01

                     表9玉足海参多糖YC对管腔结构数的影响

组别        剂量         7day         9day           11day          13day         15day

正常组      等量培养基   1.12±0.72   1.42±0.82     1.44±0.75     1.27±0.72    1.13±0.54

bFGF组      41.7ng/ml    1.24±0.62   1.47±0.79     1.46±0.68     1.61±0.80^*  1.32±0.67

YC大剂量组  166.7μg/ml  0.84±0.42^* 0.85±0.34^*** 0.89±0.36^***  0.88±0.33^** 0.82±0.25^**

YC中剂量组  16.7μg/ml   0.82±0.32^* 0.86±0.40^*** 0.87±0.37^***  0.85±0.31^** 0.80±0.32^**

YC小剂量组  1.7μg/ml    0.84±0.35^* 1.03±0.45^*   0.93±0.44^**  0.97±0.48    0.96±0.48

与对照组比较*p＜0.05  **P＜0.01  ***P＜0.01

实施例3.玉足海参多糖YC抑制体外培养的内皮细胞的增殖作用的研究。

1.实验材料

细胞株：HUVEC(人脐静脉内皮细胞)

试剂：1640培养基、碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)、[³H]-TdR、[³H]-UdR、[³H]-Leu、玉足海参多糖YC

器械：计数器、烘箱、96孔细胞培养板、倒置显微镜

2.实验方法及结果

取对数生长期的HUVEC细胞，消化计数，配成4×10⁴个/毫升的细胞悬液，以0.2ml/孔接种于96孔板，置37℃、5％CO₂培养箱中培养12小时。弃上清，换含不同药物浓度的培养液继续培养24小时。在终止作用前6小时加放射性同位素0.5μGi/孔，6小时后弃去培养液，每孔加0.1ml消化液，于37℃消化30分钟。用多头细胞样品收集器将每孔细胞分别收集于醋酸纤维滤膜上，蒸馏水冲洗20次。取下此膜，置80℃烘箱中干烤15分钟。置闪烁杯中，加闪烁剂4ml。暗处放置15分钟后测cpm值，计算药物对内皮细胞增殖的影响。

结果发现，各给药组能显著性抑制HUVEC的DNA、RNA及蛋白质的合成，对内皮细胞增殖呈显著的抑制作用，见表10。

           表10玉足海参多糖YC多糖对内皮细胞增殖的影响( X±SD，n＝4)

组别      剂量          DNA              RNA               蛋白质

正常组    等量培养基    781.9±192.28    675.3±82.89      4249.4±468.57

          25ng/ml       915.0±358.84    992.2±31.36^***  4572.7±369.87

bFGF组    50ng/ml       1280.9±325.07^* 1080.0±71.90^*** 5195.6±214.81^*

          100ng/ml      1121.9±178.12^* 978.4±61.39^**   5143.9±308.16^*

          1μg/ml       748.8±213.20    748.6±74.87      3546.3±778.67

YC组      10μg/ml      477.6±57.62^*   710.0±55.54      3207.0±236.83^**

          100μg/ml     393.9±126.69^*  466.9±84.81^*    3404.4±234.47^*

          500μg/ml     371.7±73.01^**  420.3±56.20^**    2963.7±169.16^**

与对照组比较*p＜0.05  **P＜0.01  ***P＜0.001

Claims (2)

1.玉足海参多糖YC在制备抗凝血的药中的应用。

2.玉足海参多糖YC在制备用于血管生成抑制剂的药中的应用。