CN1626652A - 促进动物的快速生长和改进肉质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明叙述了一种用腺病毒伴随病毒载体尤其是用1型腺病毒伴随病毒载体导入生长激素基因或相关基因的方法促进动物快速生长和改进动物肉质。本发明能显著提高饲料利用率和促进动物的生长。

Description

促进动物的快速生长和改进肉质的方法

发明领域    本发明属于生物技术领域，本发明涉及用腺病毒伴随病毒载体尤其是用1型腺病毒伴随病毒载体导入生长激素基因或相关基因的方法提高生猪饲料报酬率，促进动物快速生长和改进动物肉质。

背景技术    肉产品的质量对于饲养业十分关键，也是影响消费者选择的重要因素。消费者选择某种肉制品的欲望取决于其价格、鲜嫩程度及外观等因素。从饮食的营养和健康角度考虑，减少动物性脂肪的摄入量对预防心脑血管疾病及血管硬化性疾病有着积极的意义，因此，提高生猪的瘦肉与肥肉的比例变得越来越重要和有意义；同时，瘦肉/脂肪比值高对于肉类的加工也十分有利，因为可以避免繁重的剥去脂肪过程；另外，瘦肉/脂肪高比值有利于提高饲料转化效率即饲料报酬率，因为一般来说产生1公斤脂肪比产生1公斤瘦肉消耗的饲料要多4倍。然而，用天然饲料往往导致饲料/肉转化效率低下，在肌肉的表面和内部都含有高比例的脂肪。而从经营角度看，降低饲养成本，缩短出栏时间，提高肉料比，降低投入/产出比例，是饲养业为获得最大收益而努力追求的目标。

用传统的杂交育种方法增加动物瘦肉/脂肪比值已进行了大量且长期的尝试，并取得了非常大的成功。这些方法往往周期长、费用高，且无法避免副作用，如肉质下降，动物应激的易感性增加等。

猪肉在许多国家都是重要的食用肉来源。一般地，25～30公斤重的猪断奶后转入饲养棚中进行饲养。在30～90公斤重的范围内猪的生长速度相对恒定，但饲料的消耗显著增加。当接近屠宰体重90～110公斤时猪的饲料转化效率不断下降。生长晚期(60～90公斤)，肉质开始定型，增加的体重主要是脂肪。产生脂肪的能耗是产生瘦肉组织的2.4倍，因此，如果使代谢向生产瘦肉组织转化显然十分有利。

与动物生长和促性腺发育的激素类物质对于提高生猪的饲料报酬率有很明确的作用。但与促性腺发育的激素类物质如“瘦肉精”等因对热灭活等不敏感而容易导致生物残留，造成对人体和环境、生猪健康的损害，现在已严禁使用。

猪的生长激素(growth hormone，GH)等蛋白类激素，在具有促生长等作用的同时，因对热灭活等因素非常敏感而无生物残留，因此不会造成对人体和环境、生猪健康的损害。

生长激素(growth hormone，GH)在控制动物正常生长中起到重要作用。它对于绝大多数家养动物的生长代谢的控制机理现在已经比较清楚，但细节还有待进一步阐明，然而，人们已经知道用外源的生长激素是可以提高已研究过的儿乎所有种类动物的生长速度。例如，用天然的猪垂体激素或重组生长激素在一定时期给猪反复注射，可明显促进其体重的增加、肉质的改善、饲料消耗降低，从而提高饲料转化效率。

生长激素对动物的作用的一些研究报道的结果有所不同。主要影响因素包括动物的体重、性别、注射生长激素的剂量和频度等。过大剂量及过频(1次/天)地注射生长激素可导致动物的高死亡率，伴随肝脏和肾脏退变、胃出血、水肿及关节炎等。因此，许多研究都集中在生长激素的不同用法对动物的生长、肉质改善、饲料转化效率的影响等方面。Walker等(美国专利5637566)采用合成的猪生长激素0.06～0.15mg/kg毛重对35～100kg的猪进行隔日、每3天、每4天一次注射，共10～30天。结果大大提高了猪(包括母猪、阉猪及公猪)的生长速度和瘦肉/脂肪比例及饲料转化效率。然而，注射的生长激素在动物体内会迅速降解，因此无论是采用每天一次或几天一次的方法，都无可避免地需要多次注射，造成药物成本和操作成本的增加，并且反复注射易引起应激反应，不利于猪的生长和肉质改善，同时，工作量也很大。

解决用生长激素反复注射的问题可采用两种策略。一种是转基因动物，即将生长激素基因转移到受精卵中，筛选出阳性基因型的个体，并进行繁殖。然而这种方法往往成本高，在高等哺乳动物如猪、牛中更难以实现，转基因的胚胎在发育中往往畸形或流产，或出生后异常，获得遗传性状不容易稳定，难以形成种群。且转基因猪中，由于生长激素在胚胎期或幼猪期的过早的高表达将会导致个体的生理紊乱，反而对个体生长起到副作用。因此，生长激素的转基因猪的研究并未获得成功。另一种方法是用体细胞基因转移的方法，将携带生长激素基因的DNA导入动物个体体内，如肌肉注射，形成一个异位的内分泌器官，使生长激素在体内表达外源的生长激素并分泌到体循环系统中，促进动物的快速生长、瘦肉/脂肪比例及饲料转化效率提高。

除了用生长激素基因外，其它刺激生长激素分泌的激素也可达到同样目的。Schwartz R(Nat Biotechnol 1999 Dec；17(12)：1179-83)的研究组曾报道用含有猪生长激素释放激素基因(GHRH)的质粒DNA给小猪肌肉注射，结果使小猪生长速度明显加快，体重增加20％以上，并且没有器官肥大或相关病理变化。其中GHRH编码的蛋白对血清蛋白酶具有抗性，其表达受到肌肉特异性的合成的启动子(SP)控制。用该裸质粒DNA 10mg给3周龄的小猪一次性肌肉内注射，随后用电穿孔处理，可提高血清中GHRH的水平，增加生长激素的分泌，增加血清IGF-1的水平。

然而，裸DNA直接肌肉注射存在转染效率低、效果不稳定等缺点，有必要采用更有效的基因载体系统。

AAV载体其具有安全性好、可介导外源基因的持续表达，在肌肉、视网膜、肝脏、脑组织、肠道等靶组织中表达良好的特点，近年来受到基因治疗领域越来越多的关注，成为较为理想的基因转移和表达载体。许多研究表明，重组AAV载体可介导外源基因在肌肉组织持续高表达，并且可将目的蛋白分泌到体循环系统中起作用。用AAV载体开展的各种动物实验主要是在鼠体内进行的，而利用血清型2型AAV病毒介导的凝血因子IX基因治疗血友病B和血清型2型AAV病毒介导CFTR基因治疗肺囊性纤维化病变正在开展人体临床试验。

而其他的血清型如1、3、5等的AAV病毒所介导的目的基因的表达水平和特点与AAV-2的所介导的目的基因的表达水平和特点有相当大的区别，尤其是AAV-1(即血清型1的AAV病毒)，其表达水平高于AAV-2的表达水平2-3个数量级，且在进行基因转移后，目的基因的表达比AAV-2的更早。我们已经进行的实验结果和其他研究小组的工作已经表明证实了这些特点(Valder R.Arruda，et al，Safety and efficacy of factor IX gene transfer to skeletal muscle inmurine and canine hemophilia B models by adeno-associated viral vector serotype 1 Blood.2003Sep 11[Epub ahead of print]，PMID：12969984[PubMed-as supplied by publisher])。

AAV病毒是一类体积小、无包膜的病毒，内含单链DNA，其中正链和负链的数量基本相等。AAV病毒属于微小病毒属(Parvoviridae)，它的复制需要辅助病毒的存在。(Kotin，RM.1994.Hum.Gene Ther.5：793-801)。文献报道的的主要的灵长类AAV病毒有六种血清型，分别被命名为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6。(Baclunann PA，MD.Hoggan，JL.Melnick，1975，Parvoviridae，Intervirology 5：83-92)(Bantel-Schaal U.，and H.zur Hausen.1998.Virology 134：52-63)(Rutledge.EA.，CL.Halbert，and DW.Russell.1998.J.Virol.72：309-319)到目前为止，AAV1、2、3、4、5、6的全序列都已经清楚，各种血清型基因组的同源性在52-82％之间(Bantel-Schaal U.，and H.zur Hausen.J.Virol.1999，73：939-947)。另外，有越来越多的新的AAV血清型报道，比如AAV7、AAV8等。

AAV基因组的两末端各有一个145bp的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。

AAV病毒ITR长145bp。其中前125bp可形成一个T形的发夹结构，由两个小同纹结构(palindrome)组成，旁边为一个较大的回纹结构。ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件。

AAV病毒Rep基因编码至少4种非结构蛋白：Rep78，Rep68，Rep52，Rep40。由p5启动子起始的2种mRNA翻译成Rep78和Rep68；p19启动子起始的2种mRNA翻译成Rep52和Rep40。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分别与Rep78和Rep68相同。Rep78和Rep68蛋白与AAV基因表达的正负调控有关。这两种蛋白都可以和ITR中的特定序列(5’-GCTCTCTCGCTC-3’)结合。类似的序列在AAV的3个启动子上游均可找到。当ITR自我折叠时可加强这种结合作用。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。当其与ITR结合时便成为在124位点核苷酸处特异切割的缺口酶，识别的位点是5’-T/TGG。这两种蛋白对于AAV生活周期的每一时期都是必需的。在非允许条件下(没有辅助病毒和刺激因素)，Rep蛋白只有微量表达，这种表达又能抑制其进一步的表达。另外，在非允许条件下Rep的表达似乎可抑制AAV基因组以直接方式复制。近来的研究证明Rep蛋白的表达对位点特异性整合是必需的。相反，在允许条件下，Rep蛋白的表达对AAV病毒从整合状态的拯救、各种AAV基因的表达和AAV DNA的复制都是必需的。Rep52和Rep40参与了病毒的装配，它们在病毒双链DNA合成中是不需要的，但在单链DNA和病毒颗粒的累积中则是必需的。

AAV病毒Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA，拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分别为87、73和62kDa，在成熟毒粒中的比例为1∶1∶10。没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个共同完成核定位任务.

各种血清型AAV病毒的同源性比较

文献报道灵长类主要的六种血清型AAV病毒：血清型1、2、3、4、5、6。其中只有AAV5最初是从人体中分离出来的(Bantel-Schaal，and H.zur Hausen.1984.Virology134：52-63)，其余5种血清型的AAV病毒都是在研究腺病毒时发现的(Ursula Bantel-Schaal，Hajo Delius and Harald zur Hausen.J.Virol.1999，73：939-947)。到目前为止，全部6种血清型的AAV病毒的全序列都已经清楚，(John Chiorini，Frank Kim，Linda Yang，and Robert Kotin.J.Virol.1999，73：1309-1319)，AAV1、2、3、4、6血清型基因组的同源性普遍较高，特别是ITR和Rep区域，其中Rep在AAV1、2、3、4、6中的同源性高达89-93％，因此AAV1、2、3、4、6血清型之间Rep可以识别来自另一血清型的ITR，并支持其包装。(Chiorini J，L.Yang，Y.Liu，B.Safer，and M.Kotin.1997.J.Virol.71：6823-6833)(Muramatsu，S.，H.Mizukami，N.Young，and K.Brown.1996.Virology221：208-217)。

对现有AAV2载体进行“换壳”改造(杂合AAV病毒载体的构建)：

对现有AAV2载体进行“换壳”改造，是获得除AAV2外的其它5种AAV血清型的细胞亲嗜性的AAV病毒载体的最简捷途径。AAV各血清型的基因组之间既高度同源又有区别的特性，使我们可以比较容易地对我们现有的AAV2载体进行“换壳”改造。即不改变现有AAV病毒载体顺式元件ITR(来自AAV2)的同时，通过更换各AAV血清型的外壳蛋白Cap，分别获得具有AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6血清型细胞亲嗜性的杂合AAV病毒载体(ITR来自AAV2、外壳分别来自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6)。其中AAV1、AAV3、AAV4、AAV6与AAV2的同源性较高，只要改变Cap而不改变AAV2的Rep，就能反式包装出相应的外壳来自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5或AAV6而ITR来自AAV2的AAV杂合载体。

在我们先前申报的发明“可用于大规模生产的腺病毒伴随病毒生产方法及用途”(专利申请号：99119039.4；公开号：CN 1252441A)中描述了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产策略制备重组腺病毒伴随病毒。

而在我们曾做过的研究中同样采用“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产策略，但是使用的“一株辅助病毒”是HSV1-r2c1，用辅助病毒HSV1-r2c1感染载体细胞以大量制备具有rAAV-1外壳的重组病毒。其中，一种载体细胞中导入了含有AAV2的ITR元件的真核表达质粒载体pSNAV；另一种载体细胞中导入了含有AAV1的ITR元件的真核表达质粒载体pSNAV-N1。试验显示，使用这两种细胞对病毒的包装和生产都没有不利的影响，它们均可以包装出具有AAV-1外壳的病毒颗粒，只是这两种rAAV-1病毒颗粒中包含的基因表达盒中的ITR元件是不相同的，一种含AAV2的ITR元件，我们称之为重组AAV2/1杂合病毒；另一种含AAV1的ITR元件，称为重组AAV1病毒。虽然这两种ITR元件的同源性很高，但仍然是不同的。

辅助病毒HSV1-r2c1：一种重组单纯疱疹病毒(HSV1)，其特征在于其基因组中插入了一种DNA序列，它具有SEQ ID NO.1(是rep2cap1)所示的核苷酸序列或其同源序列。其中DNA序列SEQ ID NO.1被插入HSV1基因组的UL2基因的xbaI位点中。rep2cap1核苷酸序列片段是被插入到Set C的COS6的UL2基因的xbaI位点中。

另外，DNA序列SEQ ID NO.1也可以通过插入HSV1的UL44基因的XbaI位点或用同源重组的方法插入HSV1的其它非必需基因区。比如用同源臂方法用SEQ ID NO.1替代HSV1的非必需基因tk。rep2cap1核苷酸序列片段是被插入到Set C的COS56的UL44基因的xbaI位点中。

将辅助病毒HSV1-r2c1感染载体细胞，被感染的载体细胞能在表达AAV2的Rep蛋白的同时还表达AAV1的Cap蛋白。用重组单纯疱疹病毒rHSV1-r2c1作为辅助病毒感染含有AAV2或AAV1的ITR和外源基因的基因序列(ITR--外源基因-ITR)的基因表达盒的细胞株，可以产生具有1血清型AAV外壳的重组AAV病毒载体(rAAVs)。

所用辅助病毒HSV1-r2c1的产生是在对一套含有HSV1病毒全基因组的粘性质粒Set C粘粒(包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56共5个粘粒，Cunningham，C.and A.J.Davison 1993 Acosmid-base system for constructing mutants of Herpes Simplex Virus Tupe 1.Virology 197：116-124)进行改造的基础上实现的。该套粘粒中装载的每一HSV1病毒基因组片段的末端与装载于另一粘粒中的HSV1片段的末端序列重复，这是5个HSV1基因组片段在细胞中发生同源重组从而产生重组HSV1的基础。Set C(见附图4)中的cos6上的非必需基因UL2和cos56上HSV1的非必需基因UL44中有一个XbaI单切点，用于将外源基因插入其中，并通过5个粘粒重组而产生插入了外源基因的重组HSV1病毒。

将AAV1的cap基因与AAV2的rep基因相连，成为rep2cap1 DNA片段(见附图1)，将这个DNA片段装入HSV1基因组中，得到表达AAV1的cap蛋白和AAV2的rep蛋白的重组HSV1：HSV-r2c1。rep和cap片段可以以单拷贝形式插入HSV1基因组的同一位置，也可以分别插入HSV1的不同位置。rep和cap片段也可以以两个或两个以上拷贝形式插入HSV1基因组的同一位置，也可以分别插入HSV1的不同位置。rep(AAV2)和cap(AAV1)基因分别用上下游引物从各自的病毒基因组模板，通过PCR方法获得后，再采用限制性内切酶切、连接的方法得到r2c1基因片段，这些基因片段的两端都是XbaI位点。将经过XbaI酶切的r2c1基因片段插入cos6或cos56的XbaI位点中，构建成重组粘粒cos6-r2c1ΔUL2或cos56-r2c1 UL44。然后将cos6-r2c1ΔUL2或cos56-r2c1 UL44与cos14，cos28，cos48，cos56等摩尔混合，用PacI酶切去cos骨架，用脂质体共转染BHK-21细胞，HSV1片段在细胞内发生同源重组而产生HSV1-r2c1重组病毒：5天后细胞开始出现病变，待细胞完全病变后收培养液上清，2000r/min离心5min，上清分装保存于-20℃。用该方法产生的含有目的DNA片段的重组HSV1病毒的概率达50～100％。通过空斑筛选很容易获得纯一的重组病毒。

另外，将r2c1基因片段通过同源臂重组、转座子、定点插入、随机插入等方式插入HSV1基因组中，同样可以得到与上述HSV1-r2c1重组病毒功能相同的重组病毒。

同样，以上描述的HSV1-r2c1重组病毒也可以是插入了与SEQ ID NO.1的DNA片段同源的其它DNA序列。“其它同源DNA序列”指非SEQ ID NO.1，但与其有一定DNA序列同源性，同样可以起AAV载体辅助病毒功能的其它DNA序列。

本发明用腺病毒伴随病毒载体尤其是用1型腺病毒伴随病毒载体导入生长激素基因或相关基因的方法更显著地提高了生猪饲料报酬率，促进动物快速生长和改进动物肉质。

发明内容

本发明提供了一种促进动物生长发育、提高动物肉质和提高饲料转化效率的新方法。

本发明通过使外源生长激素基因或相关基因如生长激素释放激素基因在动物体内高水平、持续稳定的表达达到促进动物生长发育、提高动物肉质和提高饲料转化效率的目的。

在一个实施方案中，本发明提供了能表达目的DNA的重组腺病毒伴随病毒，该目的基因稳定地插入在上述重组腺病毒伴随病毒基因组的适当位置。

在另一实施方案中，本发明提供了含有重组腺病毒伴随病毒的重组质粒以及含有该质粒的宿主细胞。

在再一实施方案中，本发明提供了一种促进动物生长，提高饲料转化率且改善饲养动物肉质的方法。该方法是在特定的饲养阶段用含有目的DNA的重组腺病毒伴随病毒对对动物进行肌肉注射。

本发明的详细描述：

本发明提供一种新的重组腺病毒伴随病毒，该病毒基因组中含有促进动物生长发育的基因。提供一种用该病毒促进动物生长发育、提高畜禽肉质的新方法。

本发明的目的DNA为与动物生长发育有关的基因，优选的是生长激素基因和生长激素释放激素基因。更优选的是生长激素基因。最优选的是猪的生长激素基因。

本发明的方法可适用于促进动物的生长，优选的是适用于家养动物，例如：猪、牛、羊的生长发育。

在一优选实施方案中，先用PCR方法获得猪的生长激素基因全长cDNA片段。取1周龄乳猪的垂体组织，用Trizol试剂提取住组织总RNA，以之为模板用猪生长激素基因特异性引物进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃ 45秒、56℃ 45秒、72℃ 45秒，30个循环。PCR反应产物经1％琼脂糖电泳分离，用玻璃奶方法回收约650bp的DNA片段，插入克隆质粒pTeasy(Promega公司)中，测序(测序结果见附图10)。结果表明该DNA片段为猪的生长激素基因全长cDNA(650bp)。

通用型的AAV载体质粒pSNAV-1(见附图5)是通过将一特定DNA片段插入pSV2neo质粒的BamHI位点中构成。插入的DNA片段含有AAV-2病毒两端ITR序列及其间的CMV启动子/增强子元件、多克隆位点及多聚腺苷酸加尾信号序列。目的DNA片段可插入在AAV载体质粒pSNAV-1 CMV启动子/增强子下游的多克隆位点中构成重组AAV载体质粒。其中CMV启动子/增强子元件与目的基因和polyA序列构成了目的基因的表达单位；SV40病毒复制子/启动子-neo-polyA构成了neo基因表达单位。后者使获得该质粒的动物细胞产生对G418药物的抗性。利用这种特性可将重组AAV载体质粒pSNAV-1导入细胞(可选的细胞包括：Vero细胞、BHK细胞、293细胞等)中进行G418选择培养，获得重组AAV病毒的生产细胞株。

用辅助病毒HSV1-r2c1感染(moi 0.1~10)该细胞株，2-5天，细胞发生完全病变后收集病变细胞和培养液，即获得含有大量重组AAV病毒的混合物。其中的AAV两个ITR序列及夹于其间的目的基因表达单位会被“拯救(rescue)”出来，即从基因组DNA上特异地切下来，大量复制并被包装到AAV病毒壳粒中形成重组AAV1病毒颗粒。被包装到AAV1病毒壳粒中的AAV基因组为单链的两端带有AAV ITR序列的DNA，不包含重组AAV质粒中ITR序列以外的细菌质粒骨架和neo基因表达单位。

我们对我们先前申报的发明(申请号：99119038.6公开号：CN 1243878A)所涉及的真核表达质粒载体pSNAV进行了改造。我们将pSNAV中含有的AAV-2的ITR元件更换成了AAV-1的ITR元件，相应构建成了pSNAV-N1(结构见附图6)。

同样，将重组AAV载体质粒pSNAV-N1导入细胞(可选的细胞包括：Vero细胞、BHK细胞、293细胞等)中进行G418选择培养，获得重组AAV病毒的生产细胞株，用辅助病毒HSV1-r2c1感染(moi 0.1~10)该细胞株，~5天，细胞发生完全病变后收集病变细胞和培养液，即获得含有大量重组AAV1病毒的混合物。

重组AAV1病毒的纯化：用1/10体积的氯仿处理上述任一收集的病变细胞和培养液混合液，可极为有效地灭活其中含有的重组单纯疱疹病毒的生物活性，同时使大量的蛋白质变性沉淀。离心去除沉淀和氯仿，取上清进一步浓缩和纯化重组AAV病毒。用聚乙二醇(PEG8000)和氯化钠沉淀重组AAV病毒。离心去除上清。沉淀用少量PBS缓冲液重悬、溶解。用氯仿抽提，取上清均可获得纯化的重组AAV1病毒。

将猪生长激素全长cDNA插入AAV载体质粒pSNAV-1的CMV启动子下游，构建成含有猪生长激素基因的重组AAV载体质粒pSNAV-GH。其基因组结构见附图8.

将猪生长激素全长cDNA插入AAV载体质粒pSNAV-N1的CMV启动子下游，构建成含有猪生长激素基因的重组AAV载体质粒pSNAV-N1-GH。其基因组结构见附图9.

用以上所述方法制备和纯化含有猪生长激素基因的重组AAV1病毒。

含有猪生长激素基因的重组AAV1病毒具有野性型人AAV病毒的理化特征和感染性，注射到肌肉组织后可逐渐在肌肉细胞中形成染色体外高分子DNA形式及染色体中整合形式稳定存在，形成一个异位的内分泌器官，长期表达并释放生长激素至体循环系统中。

给1月龄至3月龄的乳猪一次性肌肉注射含有猪生长激素基因的重组AAV1病毒10(e9)~10(e12)病毒颗粒/kg体重可长期表达和释放猪生长激素，促进生猪的快速生长和提高饲料报酬率。

附图说明

图1为rep2cap1图谱。rep基因以AAV2的rep基因为主体(长约1721bp)，3’端含有来自AAV1的一小段rep(长约280bp)。cap基因完全来自AAV1(长约2210bp)。

图2为cos6-r2c1ΔUL2图谱。基因方向不限。

图3为cos56-r2c1ΔUL44图谱。基因方向不限。

图4为SetC图谱。cos6、cos28、cos14、cos56、cos48组成SetC，后者用PacI切去cos骨架后，转染细胞，经同源重组得到HSV1病毒。其中cos6的HSV1的UL2基因、cos56上的HSV1的UL44基因中各有一各Xba1位点，用于插入外源基因。

图5为AAV载体质粒pSNAV-1的结构示意图。

图6为AAV载体质粒pSNAV-N1图谱，其中ITR为AAV-1的ITR元件。

图7为pSNAV-GFP图谱。GFP(绿色荧光蛋白)基因由人CMV病毒的立即早期启动子启动，polyA来自SV40病毒。GFP表达盒两端是AAV2的ITR(反向末端重复)。将本发明的重组HSV病毒HSV-r2c1感染已经转染pSNAV-GFP的细胞株，能得到带有AAV1血清型的表达报告基因GFP的AAV病毒载体。

图8为重组AAV质粒pSNAV-GH的结构示意图。

图9为重组AAV质粒pSNAV-N1-GH的结构示意图，其中ITR为AAV-1的ITR元件。

图10为猪生长激素基因特异的PCR引物序列和测序结果。

具体实施方式    以下通过实施例进一步详细描述本发明。但是，所有实施例不以任何方式构成对本发明内容的限定。

实施例1  从乳猪脑垂体扩增猪的生长激素基因

将出生一周的长白猪乳猪从左前肢处心脏放血处死，迅速切开猪颅骨，充分暴露颅底脑组织，在颅底垂体窝处用DEPC水处理过的镊子小心取下猪脑垂体。将垂体在DEPC处理过的缓冲液中洗1次，然后将垂体放入干烤灭菌的组织匀浆器中，进行匀浆处理。

按照提取RNA的实验方法，将经匀浆处理后的垂体组织用总RNA提取Trizol试剂盒(Gibco公司)进行RNA的快速提取。以所提取的RNA做为模板，以OligoT为引物进行反转录反应，之后取5ul产物为模板，用所设计的猪生长激素基因的PCR引物进行体外基因扩增。PCR的上游引物primer 1和下游引物primer 2的序列分别为：

primer 1：5’ta ggt acc atg gct gca ggc cct cgg a 3’(SEQ ID NO.4)

primer 2：5’gt aga tct cta gaa ggc aca gct gct ctc 3’(SEQ ID NO.5)

其中，primer 1中设计了KpnI酶切位点，primer 2中设计了Bgl II酶切位点。

PCR反应条为94℃ 45秒、56℃ 45秒、72℃ 45秒，30个循环。将PCR产物进行电泳，电泳结果证实得到获得的DNA片段与猪的生长激素基因大小相符。

将PCR产物DNA插入克隆载体T-easy Vector(Promega公司，得到重组质粒pTeasy-GH。用此重组质粒DNA转化大肠杆菌E.Coli.DH5α后，挑取转化菌克隆，进行质粒DNA的快速提取。经过酶切鉴定，初步确定T-easy Vector载体中插入的DNA片段为猪生长激素基因的cDNA(含信号肽DNA片段)。然后进行DNA序列测定，确切证实所插入的DNA片段为猪生长激素基因的cDNA，测序结果见附图10，该序列与GeneBank公布的猪生长激素序列(E00229，E00217)完全一致。将此重组质粒的保留均种大量扩增，进行DNA的大量提取。

实施例2  通用型AAV载体质粒pSNAV-1的构建

首先采用酶切、补平、再连接的方式，经两步克隆去除pSV2neo上的EcoR I和Bgl II位点，成为pSV2neoΔEΔB；将pCMV-lacZ中CMV启动子控制下的LacZ表达盒用Xho I和BamH I切出并回收，连接入pAV53质粒(含有AAV-2病毒两端的ITR序列)用Xho I和BamHI双切后的ITR中间，构成携带LacZ表达盒的AAV载体质粒pAV-LacZ；pAV-LacZ用Bgl II酶切，回收ITR-CMV-LacZ-ITR片段，连接入pSV2neoΔEΔB的BamH I位点，构成携带LacZ表达盒的又一AAV载体质粒pSNAV-lacZ；用Xho I和BamH I双切pSNAV-lacZ，去除其中的LacZ表达盒，代之以pCMVPA用Xho I和BamH I双切得到的CMV和polyA片段，构建成pSNAV-1(见附图5)。

pSNAV-1含有AAV-2基因组两端的ITR，在两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、多克隆位点和polyA信号。在ITR外侧具有SV40启动子控制下的新霉素抗性基因表达盒。质粒的骨架上含有在大肠杆菌中进行复制所需的复制起点序列和氨苄青霉素抗性基因。多克隆位点包括KpnI、EcoR I、Sal I、Bgl II。所能容纳的外源基因长度约为3.6kb。

实施例3  cos6-r2c1ΔUL2的构建

以AAV1(AAV1病毒株背景：ATCC编号为ATCC VR645)为模板，PCR方法扩增出相应的cap1(AAV1)(见引物1、2)。反应条件：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30个循环，得到2210bp的PCR片段cap1，用限制性内切酶KpnI+XbaI双酶切后，与从pSSV9(pSSV9：含AAV2的rep和cap基因的质粒。Du B，Wu P，Boldt-Houle DM，Terwilliger EF GeneTher 1996，3：254-61)用KpnI+XbaI切出的AAV2的rep2(1721bp)相连接，将连接产物装入pGEM-p3zf(+)质粒(Promega公司)的XbaI位点中，得到p3zf-r2c1质粒。再用XbaI从p3zf-r2c1质粒中切下r2c1(约4347bp)，装入cos6的Xbal位点中，得到cos6-r2c1ΔUL2。

引物1：AAV1 cap上游引物：5’-GTCTGGAGCATGACTTTGGC-3’(SEQIDNO.2)

引物2：AAV1 cap下游引物：5’-TCTAGAAGCGCAACCAAGCAGTTAAT-3’(SEQIDNO.3)

实施例4  重组HSV1-r2c1的制备

将cos6-r2c1ΔUL2与cos14，cos28，cos48，cos56等5个粘粒等摩尔混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分离去除)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍无水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul与10ug DNA按产品说明书共转染80％铺满的BHK-21细胞(约2×106)细胞，5个HSV1片段将在细胞内发生同源重组而分别产生HSV1-r2c1重组病毒。转染24h后换用含2％FBS的1640培养液37℃培养，每天换液一次。5天后细胞开始出现病变，待细胞完全病变后收培养液上清，2000r/min离心5min，上清分装保存于-20℃。对获得的重组病毒进行两次空斑纯化，可得到纯一的HSV1-r2c1重组病毒。

实施例5  AAV包装细胞株BHK/pSNAV-GFP和BHK/pSNAV-N1-GFP的建立

在pSNAV-1质粒(伍志坚、吴小兵、侯云德，系列腺病毒伴随病毒载体的构建及表达半乳糖苷酶的研究，病毒学报，2000，16(1)，1-6)的基础上构建成含有GFP基因的重组质粒pSNAV-GFP，其结构为带有“ITR(AAV2)-外源基因-ITR(AAV2)”和抗性基因neo′的质粒(见附图8)。将该质粒用脂质体方法导入BHK-21细胞(ATCC CCL-10)，用G418 200ug/ml选择培养10-15d，获得的抗性细胞株命名为BHK/pSNAV-GFP。

AAV1和腺病毒5感染293细胞，3天后冻融细胞，5800g离心30分钟，CsCl纯化方法见(J.V.1997，71：8429-8436)。上述AAV1病毒在0.1％SDS、0.2毫克/毫升蛋白酶k，37℃作用3小时，再用酚/氯仿抽提2次，氯仿抽提1次，加醋酸钠和酒精沉淀DNA，DNA沉淀后用TE(PH8.0)重悬，95℃、5分钟，在0.3-1.0M NaCl中50-60℃处理2小时，使双链退火。用QiaexIIgel extraction kit(Qiagen)纯化琼脂糖凝胶上跑出的约5Kb的AAV1 DNA带，再用Klenow大片段补平末端，加上Xba I Linker(dCTCTAGAG)连接纯化后Xba I切开，装入pGEM-3zf(Promega公司产品)的Xba I位点中，在E.Coli DH5α Max Efficiency中扩增。挑出单克隆，提取质粒，用内切酶酶切以及rep2探针方法筛出含完整AAV1基因组的克隆，再将该质粒转染BHK细胞，24小时后再感染HSV-1，2天后用Hirt法提取细胞染色体外小分子DNA，Dpn I酶切、Southern转印，用rep探针杂交，用monomer以Dimer带证明基因组完整性，得到pAAV1。pAAV1用Eco47-3和NcoI双切，回收含AAV1 ITRs的载体质粒片段用T4 DNA聚合酶补平，将Promega公司的pSV2neo的抗性基因neo^r用Bgl II和Sma I酶切回收抗性基因neo^r、用T4 DNA聚合酶补平，装入含AAV1 ITRs的载体质粒片段中，再将pSNAV-1用Xho I和BamH I酶切回收CMV-PolyA片段，用T4 DNA聚合酶补平，装入含AAV1 ITRs的载体质粒片段中，得到含有AAV1的ITR元件的重组质粒pSNAV-N1。

在pSNAV-N1的基础上构建成含有GFP基因的重组质粒pSNAV-N1-GFP，其结构为带有“ITR(AAV1)-外源基因-ITR(AAV1)”和抗性基因neo^r的质粒。将该质粒用脂质体方法导入BHK-21细胞(ATCC CCL-10)，用G418 200ug/ml选择培养10-15d，获得的抗性细胞株命名为BHK/pSNAV-N1-GFP。

实施例6  含猪生长激素基因的重组AAV 1病毒的制备

将携带重组质粒pTeasy-GH的E.Coli.DH5α菌种大量扩增，用碱裂解法进行质粒DNA的大量提取。用Kpn I和Bgl II双酶切将660bp的猪生长激素基因从pTeasy-GH质粒中切出并回收；用Kpn I和Bgl II双酶切AAV载体质粒pSNAV-N1(结构见附图6)，将回收的660bp生长激素基因与双酶切的pSNA-N1连接，得到重组AAV载体质粒pSNAV-N1-GH(结构见附图9)。

用脂质体转染法将pSNAV-N1-GH转染至真核细胞株BHK-21细胞(ATCC CCL-10)中，用G418 800ug/ml选择培养10～15天，每3天换液1次，直至获得G418抗性细胞克隆。将各抗性细胞克隆混合、扩增作为猪生长激素基因的重组AAV1病毒的生产细胞。将细胞进行传代并保种，获得的抗性细胞株命名为BHK/pSNAV-N1-GH。

将生产细胞株BHK/pSNAV-N1-GH用转瓶方式扩大培养，待转瓶(110×288mm)中细胞长满后倾出培养液，用HSV1-r2c1感染BHK/pSNAV-N1-GH细胞，待细胞完全病变，盖紧瓶盖剧烈振摇，将瓶壁上的细胞全部洗脱至培养液中，收集病变的细胞及其培养液，装至一只三角烧瓶中(其中便含有重组rAAV1-GH病毒)，然后进行重组病毒rAAV1-GH的分离和纯化。

在三角瓶中加入氯仿25ml(10∶1v/v)，然后置37℃摇床中剧烈振摇1-2小时后室温下静置10min。加DNase和RNase至终浓度1ug/ml。轻轻混匀，室温下消化45min。加入固体氯化钠至终浓度1mol/L，振摇溶解。4℃12000rpm离心15min。取出上层水相，弃氯仿和沉淀。加PEG8000至终浓度10％(w/v)。振摇溶解。4℃放置过夜后，4℃11000rpm离心15min。将上清倒入干净容器中。将离心管倒扣在吸水纸上，让上清尽量流尽。用5mlPBS2+缓冲液将各离心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并，将其分装至1.5-ml塑料离心管中(0.6ml/管)，加等体积的氯仿抽提。4℃12000rpm离心5min，在无菌操作下小心吸出上层水相，移入无菌管中。然后进行超滤，去除氯仿，即获得纯化的重组病毒rAAV1-GH。该病毒液体积比初始体积浓缩了200倍。

同样，用与上面相同方法和步骤，用Kpn I和Bgl II双酶切将660bp的猪生长激素基因从pTeasy-GH质粒中切出并回收；用Kpn I和Bgl II双酶切AAV载体质粒pSNAV-1将回收的660bp生长激素基因与双酶切的pSNAV-1连接，得到重组AAV载体质粒pSNAV-GH；将该质粒用脂质体方法导入BHK-21细胞，用G418 200ug/ml选择培养10-15d，获得的抗性细胞株命名为BHK/pSNAV-GH；将生产细胞株BHK/pSNAV-GH用同样的转瓶方式扩大培养，同样用HSV1-r2c1感染BHK/pSNAV-GH细胞株，得到重组rAAV1-GH病毒，用相同的分离和纯化方法获得体积比初始体积浓缩了200倍的重组rAAV1-GH病毒。

实施例7  用含有绿色荧光蛋白基因的重组AAV1病毒给小猪肌肉注射

为了了解重组AAV1病毒在猪肌肉组织中的表达情况，取含有绿色荧光蛋白基因的重组AAV1病毒(rAAV1-GFP)用PBS缓冲液2ml稀释，给出生30公斤左右的长白猪(雌、雄各1只)进行颈部肌肉注射，注射剂量为1×10(e9)病毒颗粒/kg体重。在注射部位用苦味酸做记号。GFP-rAAV病毒颗粒注射后第15天、30天、45天分别施行手术，在注射区域分别取少量肌肉组织，冰冻切片后，放在载玻片上，在倒置荧光显微镜下用长波紫外线激发观察。观察结果显示，两只猪在15天、30天、45天所取的肌肉组织均有绿色荧光蛋白(GFP)的表达，且随时间的延长，GFP的表达强度增强。

rAAV1-GFP的制备方法：用HSV1-r2c1感染BHK/pSNAV-GFP细胞或BHK/pSNAV-N1-GFP，细胞病变(36-72h)后反复冻融4次裂解细胞。细胞裂解液中含有rAAV/r2c1-GFP和辅助病毒HSV1-r2c1。低速离心去除细胞碎片，取裂解液56℃处理30min以灭活辅助病毒HSV1-r2c1，得到细胞裂解液上清中含有的AAV1血清型的rAAV1-GFP。

实施例8  用含有猪生长激素基因的重组AAV1病毒给猪肌肉注射

选用32头血缘相近、日龄一致、体重相仿的长白猪健康生长猪(30±1.0kg)，公母各半，按体重随机分为两组，试验组24头，分三圈饲养，每圈8头，公母各4头，对照组8头，同样公母各4头。采用猪场自配的饲料日粮，由玉米、麦麸、豆粕、菜籽柏等和要原料组成试验组和对照组猪群的饲养管理条件尽可能一致，试验开始前先预饲10天，期间按猪场正常程序进行常规免疫，并进行驱虫和去势，然后开始为期6周的正试期。猪群自由采水，饲料记量不限量。

取含有猪生长激素基因的重组病毒rAAV1-GH按每公斤体重肌肉注射1×10(9e)病毒颗粒。另外，用不含生长激素的重组AAV病毒用同样的方法和剂量，给对照组猪进行颈部肌肉注射。在注射部位用苦味酸做记号。

在六周试验期间及结束当天早饲前称量并记录每头猪的体重，以圈为单位记录耗料量。生产性能测试指标主要有：日增重、日采食量、饲料增重比(也称为饲料报酬率)。在正试期结束即屠宰所有参试猪只，测定胴体重量，分离瘦肉，计算每头猪的瘦肉率。

统计分析：原始数据按重复为单位进行整理，日增重、日采食量、饲料增重比按单因子样本数不等有重复对比试验进行t检验。

肌肉注射含猪生长激素基因1型重组腺相关病毒对生长肥猪体增重、瘦肉率和饲料利用率的影响见下表：

试验阶段及指标            试验组             对照组饲料

初始体重(IWT/kg)          30.5+1.0           30.2+1.2

平均日耗料量(ADFI/g)      1953.49±169.21^N  1918.2±179.12

平均日增重(ADG/g)         743.62±48.2^**    550.83±62.3

饲料增重比(F/G)           2.627^*            3.48

由上表可见，注射1型重组腺相关病毒可使猪的日增重比对照组提高35％，经t检验，试验组与对照组差异极显著(P＜0.01)，使饲料增重比减少24.05％，差异显著(P＜0.05)。试验组瘦肉率提高增加18％。从以上试验结果可以看出，注射含猪生长激素基因的1型重组腺相关病毒可以显著地促进生长肥育猪的生长和提高饲料报酬率。

                             序列表

<110>本元正阳基因技术股份有限公司

<120>促进动物的快速生长和改进肉质的方法

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4347

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>rep2cap1

<400>1

ctagagtcct gtattagagg tcacgtgagt gttttgcgac attttgcgac accatgtggt    60

cacgctgggt atttaagccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggttt    120

gaacgcgcag ccgccatgcc ggggttttac gagattgtga ttaaggtccc cagcgacctt    180

gacgggcatc tgcccggcat ttctgacagc tttgtgaact gggtggccga gaaggaatgg    240

gagttgccgc cagattctga catggatctg aatctgattg agcaggcacc cctgaccgtg    300

gccgagaagc tgcagcgcga ctttctgacg gaatggcgcc gtgtgagtaa ggccccggag    360

gcccttttct ttgtgcaatt tgagaaggga gagagctact tccacatgca cgtgctcgtg    420

gaaaccaccg gggtgaaatc catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa    480

ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca    540

aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat    600

tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat    660

ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac    720

gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg    780

atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg    840

attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg    900

gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc    960

ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc    1020

aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc    1080

tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct    1140

gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg    1200

tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc    1260

tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctggga    1320

ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc    1380

gtgatcgtca cctccaacac caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc aacgaccttc    1440

gaacaccagc agccgttgca agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg ccgtctggat    1500

catgactttg ggaaggtcac caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg ggcaaaggat    1560

cacgtggttg aggtggagca tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagaccc    1620

gcccccagtg acgcagatat aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca    1680

tcgacgtcag acgcggaagc ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct    1740

cgtcacgcgg gcatgcttca gatgctgttt ccctgcaaga catgcgagag aatgaatcag    1800

aatttcaaca tttgcttcac gcacgggacg agagactgtt cagagtgctt ccccggcgtg    1860

tcagaatctc aaccggtcgt cagaaagagg acgtatcgga aactctgtgc cattcatcat    1920

ctgctggggc gggctcccga gattgcttgc tcggcctgcg atctggtcaa cgtggacctg    1980

gatgactgtg tttctgagca ataaatgact taaaccaggt atggctgccg atggttatct    2040

tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc gagtggtggg acttgaaacc    2100

tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac gacggccggg gtctggtgct    2160

tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac aagggggagc ccgtcaacgc    2220

ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac cagcagctca aagcgggtga    2280

caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt caggagcgtc tgcaagaaga    2340

tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag gccaagaagc gggttctcga    2400

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gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcatcggc aagacaggcc agcagcccgc    2520

taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag tcagtccccg atccacaacc    2580

tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct actacaatgg cttcaggcgg    2640

tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga gtgggtaatg cctcaggaaa    2700

ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc accaccagca cccgcacctg    2760

ggccttgccc acctacaata accacctcta caagcaaatc tccagtgctt caacgggggc    2820

cagcaacgac aaccactact tcggctacag caccccctgg gggtattttg atttcaacag    2880

attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcagcgactc atcaacaaca attggggatt    2940

ccggcccaag agactcaact tcaaactctt caacatccaa gtcaaggagg tcacgacgaa    3000

tgatggcgtc acaaccatcg ctaataacct taccagcacg gttcaagtct tctcggactc    3060

ggagtaccag cttccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag ggctgcctcc ctccgttccc    3120

ggcggacgtg ttcatgattc cgcaatacgg ctacctgacg ctcaacaatg gcagccaagc    3180

cgtgggacgt tcatcctttt actgcctgga atatttccct tctcagatgc tgagaacggg    3240

caacaacttt accttcagct acacctttga ggaagtgcct ttccacagca gctacgcgca    3300

cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac caatacctgt attacctgaa    3360

cagaactcaa aatcagtccg gaagtgccca aaacaaggac ttgctgttta gccgtgggtc    3420

tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct ggaccctgtt atcggcagca    3480

gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaat tttacctgga ctggtgcttc    3540

aaaatataac ctcaatgggc gtgaatccat catcaaccct ggcactgcta tggcctcaca    3600

caaagacgac gaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc atgatttttg gaaaagagag    3660

cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatt acagacgaag aggaaattaa    3720

agccactaac cctgtggcca ccgaaagatt tgggaccgtg gcagtcaatt tccagagcag    3780

cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgctatggga gcattacctg gcatggtgtg    3840

gcaagataga gacgtgtacc tgcagggtcc catttgggcc aaaattcctc acacagatgg    3900

acactttcac ccgtctcctc ttatgggcgg ctttggactc aagaacccgc ctcctcagat    3960

cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggcg gagttttcag ctacaaagtt    4020

tgcttcattc atcacccaat actccacagg acaagtgagt gtggaaattg aatgggagct    4080

gcagaaagaa aacagcaagc gctggaatcc cgaagtgcag tacacatcca attatgcaaa    4140

atctgccaac gttgatttta ctgtggacaa caatggactt tatactgagc ctcgccccat    4200

tggcacccgt taccttaccc gtcccctgta attacgtgtt aatcaataaa ccggttgatt    4260

cgtttcagtt gaactttggt ctcctgtcct tcttatctta tcggttacca tggttatagc    4320

ttacacatta actgcttggt tgcgctt                                      4347

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于AAV1的cap1的上游引物

<400>2

gtctggagca tgactttggc                                              20

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于AAV1的cap1的下游引物

<400>3

tctagaagcg caaccaagca gttaat                                       26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于猪的生长激素基因的上游引物

<400>4

taggtaccat ggctgcaggc cctcgga                                      27

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于猪的生长激素基因的下游引物

<400>5

gtagatctct agaaggcaca gctgctctc                                    29

Claims (12)

1、一种能表达目的DNA的重组腺病毒伴随病毒，其中的目的DNA存在于病毒伴随病毒两个ITR元件之间。

2、根据权利要求1所述的重组AAV病毒，其中所述的目的DNA编码与动物生长相关的因子。

3、根据权利要求2所述的重组AAV病毒，其中所述的目的DNA编码的动物生长相关的因子选自：动物生长激素(GH)、动物生长激素释放激素(GHRH)。

4、根据权利要求1-3中任一项所述的重组AAV病毒，其中所述的腺病毒伴随病毒为人腺病毒伴随病毒。

5、根据权利要求4所述的重组AAV病毒，其中所述的腺病毒伴随病毒为人1型腺病毒伴随病毒。

6、根据权利要求5所述的重组AAV病毒，其中所携带的目的DNA为天然或人工合成的猪生长激素(GH)的编码序列。

7、根据权利要求5所述的重组AAV病毒，其中所携带的目的DNA为天然或人工合成的猪生长激素释放激素(GHRH)的编码序列。

8、一种促进动物生长、提高饲料转化率并改善动物肉质的方法，该方法包括利用专利要求1-7中任一项所述的重组腺病毒伴随对动物进行肌肉注射。

9、根据权利要求8的方法，其中所述动物选自猪、牛、羊等饲养动物。

10、根据权利要求8的方法，其中所述动物为猪。

11、根据权利要求8的方法，其中是在动物生长的早、中期对其进行肌肉注射。

12、一种促进猪的生长并提供其瘦肉比例的方法，该方法包括用含有天然或人工合成的猪生长激素基因重组人1型腺病毒伴随病毒对猪进行肌肉注射。