CN1623000A - 多肽的定量分析方法 - Google Patents

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CN1623000A CNA028239474A CN02823947A CN1623000A CN 1623000 A CN1623000 A CN 1623000A CN A028239474 A CNA028239474 A CN A028239474A CN 02823947 A CN02823947 A CN 02823947A CN 1623000 A CN1623000 A CN 1623000A
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract

本发明涉及通过测定从选定的多肽释放的水解产物的量以及利用对应于水解产物的外原多肽作为标准用于测定选定的多肽在样品中的实际量的方法和材料。这些方法和材料可用于例如定量分析一种或多种选定的多肽在复杂样品中的实际量。

Description

多肽的定量分析方法
技术领域
本发明涉及多肽的定量分析。具体来说，本发明涉及用于确定选定的多肽在样品中的实际量的方法和材料。本方法包括以相应于特定的水解产物的外源多肽为参照，来测量从选定的多肽中释放出的特定的水解产物的量。
发明背景
多肽在生物系统中具有重要的作用。例如，多肽可以作为催化生物反应的酶，作为多种分子的转运蛋白或载体，作为分子间和分子内信号传导的受体，作为激素，以及作为细胞、组织和器官的结构元件。
确定特定的多肽的量在研究中(例如在药物发现和开发中)和临床中(例如用于医疗诊断和监测治疗效果)通常都是重要的。特定的多肽通常通过例如亲和的方法来定量，包括免疫分析、质谱和高效液相色谱。放射性同位素、稳定的同位素、荧光和化学发光试剂可以与这些方法结合使用来对多肽定量。酶可以通过对其催化活性进行生物化学分析来定量。
传统的方法在测量样品中特定的多肽的实际量而不是相对量的能力方面有所局限。这个缺点使得其难以对由于例如疾病或药物治疗的影响而引起的蛋白水平的变化作出评估。对特定的多肽在复杂混合物或水不溶性环境(例如细胞膜)中的实际量进行定量，已经被证明是特别困难的。因此，本发明的方法避免了许多与不溶性蛋白相关的问题，这是因为可以选择一个可溶性的蛋白水解片段来定量地代表完整的蛋白。
发明概述
本发明的特征在于测定样品中选定的多肽的实际量的方法和材料。该方法包括以相应于特定的水解产物的外源多肽为参照，来测量从选定的多肽中释放出的特定的水解产物的量。公开的方法和材料与传统的多肽定量方法相比提供了许多优点。可以以一种容易制备的参照多肽为对照测定选定的多肽的实际量而不是相对量。参照多肽对应于被测量的特定水解产物，因此消除了与参照的和测量的水解产物的不同行为有关的误差。膜结合蛋白的测定可以通过将一种特定的水解产物释放到溶液中(例如通过对选定的多肽中溶液可进入的位点进行靶向水解)来简化。本发明的方法和材料可以用于对甚至是在复杂样品和水不溶性环境中的一种或多种选定的多肽进行定量。
本发明的特征在于测定样品中一种或多种选定的多肽的实际量的方法。这种特征方法包括：1)用至少一种水解试剂从每个选定的多肽上释放出至少一种特定的水解产物；以及2)通过与确定量的相应的外源多肽进行比较来确定每种特定水解产物的实际量。每种特定水解产物的实际量与它从其上释放出来的选定的多肽的实际量直接相关。
在某些实施方案中，样品含有一种选定的多肽。在其它的实施方案中，样品含有2到5种选定的多肽。在另一些实施方案中，样品含有6到10种选定的多肽。
在某些实施方案中，从选定的多肽上可以释放出一种特定的水解产物。在其它的实施方案中，从选定的多肽上可以释放出2到5种特定的水解产物。
在某些实施方案中，在特定的水解产物和选定的多肽的量之间有1∶1的直接关系。
在某些实施方案中，选定的多肽是膜多肽。在某些实施方案中，选定的多肽是神经受体。
在某些实施方案中，确定量的相应的外源多肽在释放步骤前被加入到样品中。
在某些实施方案中，水解试剂是一种酶(例如胰蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶、Arg-C内切蛋白酶和Glu-C内切蛋白酶)。在其它的实施方案中，水解试剂是一种化学试剂(例如溴化氰)。
在某些实施方案中，抗体被用于测量水解产物的量。在其它的实施方案中，串联的或高阶质谱被用于测量水解产物的量。
在某些实施方案中，这种特征方法还包括：1)在从选定的多肽上释放出水解产物之前在样品中先加入一种确定量的回收多肽；以及2)在从选定多肽上释放出水解产物后测量回收多肽的实际量。在这些实施方案中，回收多肽相应的特定水解产物的实际量被调整到能够反映出在样品中加入回收多肽后发生的回收多肽的损失。
在某些实施方案中，这种特征方法还包括：1)在从选定的多肽上释放出水解产物之前在样品中先加入一种确定量的合成的可水解多肽；2)用水解试剂从合成的可水解多肽上释放出至少2种不同标记的多肽；以及3)测量每种不同标记的水解产物的实际量。在这些实施方案中，特定水解产物的实际量被调整到能够反映出水解的不完全性。在某些这样的实施方案中，一种不同标记的多肽对应于特定的水解产物，而特定水解产物的实际量被调整到能够反映出在样品中加入可水解多肽后发生的相应的不同标记的多肽的损失。
本发明的其它特征和优点将从下面的发明详述和权利要求中变得明显。
除非有特别的定义，在此所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通专业人员所通常理解的含义。所有本文提到的著作、专利申请、专利和其它参考文献以其全文引为参考。在有冲突的情况下，以本发明的说明书、包括定义为准。所公开的材料、方法和实施例仅仅是说明性的而没有限制的目的。专业人员将会认识到与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以被用于实现本发明。
附图描述
图1显示了合成的多肽TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)的MS和MS/MS谱图。
图2显示了实验的和标准样品的LC/MS/MS离子色谱图。
发明详述
本发明提供了用于确定样品中选定多肽的实际量的方法和材料。本发明至少部分是基于这样一个发现，即人们可以通过从选定的多肽上释放出特定的水解产物，然后以相应于特定的水解产物的外源多肽为参照，来测量这种特定的水解产物的量，从而确定样品中选定多肽的实际量。不受理论的束缚，本测定方法是可能实现的，因为在选定的多肽和被测量的释放多肽之间有1∶1的摩尔关系。此外，特定的水解产物和相应的外源多肽在测量过程中有同样的行为，因此消除了由于测量样本和参照样本的不同行为而可能引起的潜在误差。
提供的方法和材料可以被用于测定样品中单个选定多肽的实际量，也可以被用于测定样品中多个选定多肽的实际量。可以测量一种以上的特定水解产物以便增加灵敏度和/或检查准确性。
此处公开的方法可直接适用于分子生物学、蛋白化学和临床化学中的许多现有的研究需要。此处公开的方法可以以比现有方法所能提供的更高的灵敏度、动力学范围、精确度和速度为多种不同的多肽提供绝对的定量。由于本发明的方法需要的分析循环时间相对较短，因此可以在例如应激或急性药剂发作后的许多时间点动态地测量特定的一组蛋白的水平，从而更清楚地阐明调节途径。此外，由于本发明方法比现有可用的方法允许更短的分析循环时间，本发明的方法适合于高通量实验。
选定的多肽和样品
选定的多肽可以是任何多肽(即两个或更多个氨基酸被肽键连接起来)，而样品可以是任何含有多肽的样品。适合的样品包括细胞样品、组织样品、体液和环境样品。样品可以来自动物(例如人类)，并可以包括动物细胞、组织或器官。样品可以来自植物，并可以包括植物细胞、组织或器官。样品也可以来自真菌、细菌和病毒。样品也可以来自环境(例如土壤、水和空气样品)。多肽可以来自动物、植物、真菌、细菌和病毒。多肽可以是膜结合的(即跨过脂双层或吸附在脂双层的表面)。膜结合的多肽可以与例如细胞质膜、细胞壁、细胞器膜和病毒衣壳结合。多肽可以在细胞质中或细胞器中。多肽可以在细胞外，被发现在间隙中或体液中(例如血浆和脊髓液)。多肽可以是生物催化剂，多种分子的转运蛋白或载体，细胞间和细胞内信号传导的受体，激素以及细胞、组织和器官的结构元件。某些多肽是肿瘤标记。
样品制备液根据所测定的选定多肽和特定的水解产物的位置和生物物理性质测定。样品在释放出特定的水解产物之前可以对选定的多肽进行富集。组织或细胞样品在用水解试剂处理前可以被匀浆或保持完整，这依赖于被测量的选定多肽和特定水解产物的细胞定位。膜结合的多肽例如受体，一般来说与细胞质中的蛋白操作不同。在用水解试剂处理之前可以通过例如离心来分离细胞膜，从而富集膜结合的多肽。在样品制备过程中，在用水解试剂处理之前可以分离细胞质，从而富集细胞质中的多肽。
在某些实施方案中，样品在用水解试剂处理之前被可溶解。样品多肽可以根据样品的本性溶解在多种介质中。例如，粗膜制备物可以溶解在含有6M尿素、还原试剂和烷基化试剂的缓冲的去污剂中。样品在用水解试剂处理之前可以被脱脂(例如在95％的乙醇和己烷或丙酮中)。样品在用水解试剂处理之前可以被溶解和脱脂(例如在95％的乙醇和己烷或丙酮中)。在某些情况下，特别是当特定水解产物可以在溶液中获得时，样品可以不需要溶解或脱脂就进行消化。可以在溶液中获得的特定水解产物包括例如从细胞质、细胞外、细胞间隙、体液和某些环境多肽上释放的水解产物，以及从膜结合多肽上释放到溶液中的水解产物。
特定水解产物和水解反应
可以通过一种或多种水解试剂的处理将特定水解产物从选定的多肽上释放出来。这种处理可以通过体外或原位的水解反应来完成，其中在含有多肽的样品中加入了一种或多种水解试剂。水解试剂在多肽的特定的氨基酸之间水解肽键，从而释放出特定的水解多肽。水解试剂可以单独使用，也可以组合使用以便从选定多肽上释放出特定水解产物。某些水解试剂是酶，例如Arg-C内切蛋白酶、Glu-C内切蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶和胰蛋白酶。这些特定的内切蛋白酶从商业化的生产商购买到，具有严格的特异性，使它们成为用于蛋白定量的理想的水解工具。其它有用的水解试剂是是化学试剂，例如溴化氰。
用一种水解试剂从具有已知氨基酸序列的选定多肽上释放出的特定水解产物的身份是可能预测的。这样的预测通常被称为“虚拟消化”。容易获得的计算机程序可以便利地进行选定多肽的虚拟消化。大鼠的嘌呤能受体P2X3(GenBank Accession No.CAA62594)的虚拟的胰蛋白酶消化显示在表1中。特定水解产物的终点相对于天然蛋白中的氨基酸位置在“从”和“到”栏中指明。
                                表1
产物号 从 到       水解产物的氨基酸序列(字母代表氨基酸的单字母代码)
    1     1     14  MNCISDFFTYETTK(SEQ ID NO：4)
    2     15     19  SVVVK(SEQ ID NO：5)
    3     20     28  SWTIGIINR(SEQ ID NO：6)
    4     29     47  AVQLLIISYFVGWVFLHEK(SEQ ID NO：7)
    5     48     52  AYQVR(SEQ ID NO：8)
    6     53     63  DTAIESSVVTK(SEQ ID NO：9)
    7     64     65  VK
    8     66     69  GFGR(SEQ ID NO：10)
    9     70     73  YANR(SEQ ID NO：11)
    10     74     95  VMDVSDYVTPPQGTSVFVIITK(SEQ ID NO：12)
    11     96     113  MIVTENQMQGFCPENEEK(SEQ ID NO：13)
    12     114     115  YR
    13     116     126  CVSDSQCGPER(SEQ ID NO：14)
    14     127     136  FPGGGILTGR(SEQ ID NO：15)
    15     137     145  CVNYSSVLR(SEQ ID NO：16)
16 146 176  TCEIQGWCPTEVDTVEMPIMMEAENFTIFIK(SEQ ID NO：17)
    17     177     180  NSIR(SEQ ID NO：18)
    18     181     188  FPLFNFEK(SEQ ID NO：19)
    19     189     198  GNLLPNLTDK(SEQ ID NO：20)
    20     199     201  DIK
    21     202     202  R
    22     203     204  CR
    23     205     209  FHPEK(SEQ ID NO：21)
    24     210     217  APFCPILR(SEQ ID NO：22)
    25     218     223  VGDVVK(SEQ ID NO：23)
    26     224     231  FAGQDFAK(SEQ ID NO：24)
    27   232   234   LAR
    28   235   242   TGGVLGIK(SEQ ID NO：25)
    29   243   251   IGWVCDLDK(SEQ ID NO：26)
    30   252   259   AWDQCIPK(SEQ ID NO：27)
    31   260   264   YSFTR(SEQ ID NO：28)
    32   265   271   LDGVSEK(SEQ ID NO：29)
    33   272   281   SSVSPGYNFR(SEQ ID NO：30)
    34   282   284   FAK
    35   285   287   YYK
    36   288   295   MENGSEYR(SEQ ID NO：31)
    37   296   299   TLLK(SEQ ID NO：32)
    38   300   304   AFGIR(SEQ ID NO：33)
    39   305   315   FDVLVYGNAGK(SEQ ID NO：34)
40 316 348   FNIIPTIISSVAAFTSVGVGTVLCDIILLNFLK(SEQ ID NO：35)
    41   349   354   GADHYK(SEQ ID NO：36)
    42   355   356   AR
    43   357   357   K
    44   358   367   FEEVTETTLK(SEQ ID NO：37)
    45   368   385   GTASTNPVFASDQATVEK(SEQ ID NO：38)
    46   386   397   QSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO：39)
一般来说，选择具有5到100个(例如5-10、10-20、20-40、60-80和80-100个)氨基酸的特定水解产物进行测定。
一般来说，选择可能被释放并进入溶液中的特定水解产物来进行测定。水解和测定的可达性可以在例如选定多肽的已知的或预测的三级结构的基础上进行评估。此外，具有相对亲水的氨基酸序列的特定水解产物特别适合于测定。特定水解产物的疏水性/亲水性可以使用计算机软件、或者在已知的氨基酸疏水性指数的基础上手动地进行估计。
一般来说，选择具有较低的翻译后修饰的可能性的特定水解产物进行测定。用于翻译后修饰的氨基酸序列的决定簇是熟知的(参见Han和Martinage，1992，Int J Biochem.，24：19-28)，缺乏这样的序列决定簇的特定水解产物可以通过手工检查容易地鉴别。
水解反应的条件依赖于使用的水解试剂。样品多肽可以在含有水解试剂释放特定水解产物所需的任何分子(例如ATP或Mg++)的缓冲液中稀释。用蛋白水解酶处理一般在较高的温度(例如37℃)进行几个小时或以上。
特定的水解产物可以通过例如凝胶过滤、反相色谱(例如高效液相色谱和快效液相色谱)、固相抽提、离子交换色谱、亲和色谱和免疫亲和分离，以及这些技术的不同组合，从水解反应中获得。用于免疫亲和分离的抗体可以使用相应于特定水解产物的外源肽来制备。
多肽的测量和定量
特定水解产物的实际量可以通过本领域已知的任何方法测量。在某些实施方案中，特定水解产物的量使用质谱(例如串联的质谱或更高阶的质谱(例如MSN))测量。在其它的实施方案中，特定水解产物的量通过亲和分析例如免疫分析(例如ELISA或RIA)来测量。免疫分析可以是竞争性的，也可以是非竞争性的。对于使用RIA的测量，一般使用外源的多肽作为示踪剂，一般用放射性同位素例如3H、14C或125I进行标记。在另外的实施方案中，特定水解产物的量通过高效液相色谱进行测量。在某些实施方案中，测量特定水解产物的实际量包括对水解产物进行可检测的标记(例如通过与荧光、化学发光或放射性分子结合)。例如，特定水解产物可以用稳定的同位素例如2H、15N、13C或18O进行标记以便利用质谱进行测量。
特定水解产物的实际量的确定以相应的外源多肽作为参照。测量确定量的相应外源多肽，然后产生将获得的信号与多肽量相关的标准曲线。实验样品通过同样的方法进行测量，使用标准曲线将测量的信号转换成实际的多肽量。选定多肽的实际量可以被测量，这部分是因为相应的外源多肽在测量中与特定水解产物有同样的行为，因而消除了与特定水解产物和外源多肽的不同行为有关的潜在误差。在本文中使用的化合物(例如特定水解产物或选定多肽)的“实际”量是指样品中化合物的绝对量。化合物的“实际”量可以通过使用例如质谱进行直接测量而获得，也可以通过与使用确定量的相应化合物所产生的标准曲线进行比较而获得。这样的相应化合物对于样品来说一般是外源的(即来自或产生于细胞、组织或器官之外)。化合物的“实际”或“绝对”量与化合物的“相对”量不同，后者中测定的化合物的量是基于或依赖于(即相对于)不相应于被测量的化合物的化合物(“不相应”的化合物)的量。对于本领域的专业技术人员来说，显然适当的不相应的化合物应该与被测量的化合物是同样类型的化合物(例如，如果测量多肽，不相应的化合物也应该是多肽)。
本发明的方法允许测定选定的多肽的实际量，因为在多肽和从其产生的独特的水解产物之间有1∶1的摩尔比率。为了使1∶1的比率得到保证，需要水解试剂的完全水解。本发明还提供了在水解不完全的情况下(下面讨论)测定选定多肽的实际量的方法。本发明的方法特别适合于获得例如不能容易或有效地纯化的多肽的实际量。这样的多肽包括但不限于膜多肽(例如受体如G蛋白偶联受体和神经受体)。可以认识到，本发明的方法可以用于在正常实验误差的范围内测定特定水解产物的实际量以及随后的选定多肽的实际量。
在使用质谱定量分析选定多肽的应用中，相应的外源多肽一般与特定水解产物在组成上一致。在此所用的组成一致的多肽包括同样的氨基酸，但是可以有不同的一级序列。在使用抗体定量分析选定多肽的应用中，相应的外源多肽与结合从选定多肽水解产生的特定水解产物的抗体具有特异性免疫反应性。特异性免疫反应多肽是一个抗体制备物能够与其结合并显示出稀释线性(即对一系列抗原稀释度有成比例的反应性)的多肽。抗体制备物不应该表现出与选定多肽及其片段以外的其它多肽的交叉反应性。抗体制备物的特异性免疫反应性可以针对多肽中任意组的氨基酸(例如抗原决定簇)。与一种生物的多肽特异性反应的抗体制备物可以与另一种生物结构相似的多肽具有特异性免疫反应性。例如，与大鼠的多肽特异性反应的抗体制备物可以与人类的多肽具有特异性免疫反应性。具有免疫反应性的相应的外源多肽应该与特定水解产物一致。对于本领域的专业人员来说，显然用于定量选定多肽的免疫分析中使用的抗体制备物需要过量，以便100％的特定水解产物可以被检测到。
回收多肽和水解对照
回收多肽可以被用来校正在样品制备、水解和/或定量分析过程中可能发生的特定水解产物的任何损失。回收多肽是一种相应于特定水解产物的标记的外源多肽。在使用时，回收多肽可以以确定的量直接加到样品中作为内标。回收多肽的加入允许对在将其加入到样品中之时一直到回收多肽被测量时为止的期间可能发生的损失进行校正。因此，为了校正在样品制备、水解和定量分析过程中发生的所有损失，可以在开始样品制备之前在样品中加入确定量的回收多肽，然后在测量相应的特定水解产物的量时测量回收多肽的量。回收多肽的损失(因此也是相应的特定水解产物的损失)可以通过将样品制备后存在的回收多肽的量与加入到样品中的确定的量进行比较而确定。然后可以将特定水解产物的测定量调整到反映出回收多肽的损失。
回收多肽可以与被测量的特定水解产物一致。在使用质谱定量分析选定多肽的应用中，回收多肽一般与被测定的特定水解产物一致。在使用抗体定量分析选定多肽的应用中，回收多肽一般与结合被测定的特定水解产物的抗体具有特异性免疫反应性。
回收多肽可以使用本领域已知的任何方法进行标记。例如，回收多肽可以用稳定的同位素例如2H、15N、13C和18O进行标记以便用质谱进行测量。回收多肽可以使用uH、14C或125I进行标记以便用免疫分析进行测量。回收多肽还可以用荧光或化学发光分子进行标记。当回收多肽被加入到含有标记的特定水解产物的样品中时，标记的特定水解产物和相应的回收多肽的标记一般来说是不同的。当使用放射性免疫分析测量特定水解产物时，在回收多肽中的放射活性的量一般来说是足够低的，以便不干扰特定水解产物的测量。
为了证实特定水解产物与起始的选定多肽之间有1∶1的摩尔关系，应该证实水解反应的完全性。多种方法可以被用来证实水解反应的完全性。例如，一种监测已知的多肽(例如选定多肽)转化为水解产物的动力学实验可以被用来估计特定的水解试剂将选定多肽完全转化为水解产物所需要的时间。
另一种证实选定多肽的完全水解的方法包括设计和制备具有一个可水解位点(例如，如果使用胰蛋白酶作为水解试剂，为赖氨酸)的不同标记的合成的可水解肽。在可水解位点的N-端的一种或多种氨基酸和可水解位点的C-端的一种或多种氨基酸用不同的同位素标记。例如N-端的氨基酸可以用14C标记，而可水解位点的C-端的氨基酸可以用3H标记。带有不同标记的可水解多肽在水解反应前被加入到样品中，既可以直接加到含有选定多肽的样品中，也可以加入到平行样品中。同位素的量可以使用双通道的液闪计数器定量，一种同位素对另一种同位素的比率是水解反应完全性的一种度量单位。
如果带有不同标记的可水解多肽直接被加入到含有选定多肽的样品中，它被加入的量应该不干扰特定水解产物的测量。如果可水解的肽被直接加入到含有选定多肽的样品中，它应该使用与任何标记的特定水解产物(例如通过MS/MS测量的水解产物)不同的标记。
在合成的可水解多肽的可水解位点一侧或两侧的氨基酸可以相应于特定的水解产物。如果在可水解位点任何一侧的氨基酸对应于被测量的特定水解产物，这些氨基酸可以用作回收多肽来说明特定水解产物的任何损失。
多个水解产物的测量
对于任何特定的样品，可以测量多个不同的特定水解产物。通过测量从一个特定的选定多肽上释放出的多个特定水解产物，人们可以增加这个特定的选定多肽定量分析的灵敏度和/或证实其准确性。通过测量从不同选定多肽上释放的特定水解产物，人们可以对一个特定样品中的多个选定多肽进行定量。每个特定水解产物可以以相应的外源多肽作为参照进行测量，并且回收多肽可以被用来说明任何或所有被测量的特定水解产物的损失。
在下面的实施例中将对本发明进行进一步的描述，这并不对权利要求中描述的本发明的范围构成限制。
实施例
实施例1：人P2X3的ELISA定量
本实施例描述了一种膜结合的嘌呤能受体人P2X3的定量。以相应的合成多肽为参照，测量了从人P2X3羧基端释放的水解产物。该水解产物的氨基酸序列为：QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO：2)。相应的合成多肽具有大鼠P2X3的氨基酸序列：VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ IDNO：3)。合成的多肽被用来产生与合成多肽和水解产物具有特异性免疫反应性的抗体。抗体也通过免疫组化和Western印迹进行证实，以表明对选定多肽的特异性反应性。
样品和水解反应：含有P2X3的制备物从表达人P2X3的Hex细胞转染子制备。简单地说，含有P2X3的Hex细胞被悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)中，超声，在-70℃冷冻。冷冻的细胞悬浮液在冰浴中融化，超声，然后在4℃ 100000xg离心1小时。沉淀重新悬浮在PBS中。细胞悬浮液被超声，在4℃ 100000xg离心1小时。沉淀重悬浮在膜溶解缓冲液(6M尿素，2mM二硫苏糖醇(DTT)，1％Chaps，0.05M Tris(pH8.0))中，以便在膜制备液中的蛋白浓度在每100μl大约1.0到1.5mg之间。通过Pierce BCA方法测定蛋白表明在样品中存在大约8mg的总膜蛋白。Western印迹证实了在膜制备液中存在P2X3。膜制备液在-70℃冷冻。
在用水解试剂胰蛋白酶处理之前，将细胞悬浮液融化，超声，在室温保温15分钟，并在5ml Wheaton管中用50mM Tris(pH7.6)和1mMMgCl2稀释7倍。通过在每mg蛋白中加入10μg胰蛋白酶(测序级，Promega，Madison，WI)起始水解反应。水解反应在37℃摇动保温24小时。为了保证完全的消化，平行地用胰蛋白酶消化细胞色素C，消化的进程通过HPLC监测。水解反应用100％TFA酸化到大约pH1-2，得到的沉淀在高速离心机中通过10000rpm离心除去。
水解反应分两次上样到先用10ml甲醇再用10ml 0.1％TFA洗涤过的C18 Sep-Pak(Waters Corp.)柱。用1ml 0.1％TFA和8％乙腈冲洗Sep-Pak柱。水解产物用1ml 0.1％TFA和48％乙腈洗脱到预先称重的12×75mm管中。洗脱液在氮气中干燥到大约200μl。将管称重，通过参照管的干重将样品体积用水调整到300μl，取200μl试样用1％BSA-PBS稀释5倍，并调整pH到7.2-7.4，用于ELISA。HPLC分析证实多肽包括水解产物得到了接近完全的回收。
ELISA测量和定量：参比曲线如下产生。将两份50μl含有0.078到2.5μg/ml合成多肽的BSA-PBS的样品吸取到封闭、清洗和印迹过的96孔Nunc Polysorb板的孔中，每个孔预先用0.25μg合成的多肽包被。在每个孔中加入补充有胰蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的抗体(稀释20000倍)50μl。抗体通过用与牛甲状腺球蛋白偶联的合成的大鼠P2X3多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ IDNO：3)注射兔而获得，并通过免疫组化和Western印迹证实了其与人P2X3水解产物QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO：2)和合成多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO：3)具有特异性反应性。在4℃保温24-48小时后，板被洗涤4次，倒置在印迹纸上。在每个孔中加入100μl与辣根过氧化物酶偶联的驴抗兔抗体(稀释50000倍)，在室温保温45分钟后，板被洗涤4次，并倒置在印迹纸上。在每个孔中加入100μl HRP底物显色试剂(500μl 0.48％TMB溶液+10ml含有0.0024M H2O2的0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.25))，保温直到蓝色完全显现。在每个孔中加入100μl 2.0N H2SO4，测定在450nm的吸光度。以A450作为VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO：3)的量为函数作图得到的参比曲线表明最小的可检测剂量是大约1pmol。实验样品的分析表明当用于QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO：2)水解产物时分析为线性。
ELISA分析被用来测量存在于实验的胰蛋白酶消化样品中的水解产物的量。实验的ELISA测量与参比曲线进行比较，从而确定了存在于胰蛋白酶消化样品中的QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO：2)的量。参见表2。
                              表2
  被分析的μl     pmol/孔  Pmol x稀释度     总pm
                          含P2X3的细胞
    50      9.85     9.85     295.5
    25      4.39     8.78     263.4
    12.5      2.30     9.2     276
    6.25      0.99     7.92     237.6
    平均值     268.13
                         未转染的Hex细胞
    50      1.1     1.1     33
为了得到P2X3定量检测的量，测量的水解产物的量被调整以校正在样品制备、消化和加工过程中发生的损失。作为损失的对照，合成多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO：3)进行了平行的样品制备、消化和加工步骤。合成多肽的回收率被确定为67％。表3显示了在上述实验和重复的实验中测定的含有P2X3的Hex细胞中存在的P2X3的量。
                     表3
    实验     重复
  pmol/mg膜蛋白     50.0     71.1
  mg受体/mg膜蛋白     3.00     4.27
  P2X3占膜蛋白的百分数     0.30     0.43
实施例2：视紫红质的LC/MS/MS定量
本实施例说明了对一种跨膜G-蛋白偶联受体视紫红质的定量。从视紫质的羧基末端释放的水解产物以相同的合成多肽作为参照进行测定。水解产物和相应的外源多肽的氨基酸序列如下：TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)。
样品和水解反应：含视紫红质的制备物从牛的视杆细胞外节(ROS)制备，参考Nemis和Dratz的方法(1982，Methods Enzymol.，81：116-23，Packer主编，Academic Press，New York)。含有13μg/μl或者315pmol/μl视紫红质的ROS制备物稀释13倍，取20μl样品加入微量离心管中。每一个被定量的样品含有485pmol视紫红质。在某些样品中补充了480pmol合成多肽(即12μl 40pmol/μl的储备液)。对照样品含有缓冲液和480pmol合成多肽。
在用水解试剂胰蛋白酶处理之前，样品用50mM Tris缓冲液(pH8.0)+1mM CaCl2将体积调整到200μl。水解反应液为含有5μl 1μg/μl的胰蛋白酶储液的样品，于37℃保温过夜。在水解反应中加入纯的TFA到浓度为1％进行酸化，然后于20000xg离心30分钟以沉淀剩余的ROS。水解反应液使用SpeedVac真空离心浓缩至体积为大约40μl。取10μl样品用于LC/MS/MS的分析。
LC/MS/MS的测定与定量：通过在几种浓度下(即0.500pmol/μl，1pmol/μl，和40pmol/μl)使用LC/MS/MS对合成多肽TETSQVAPA(SEQID NO：1)进行测定，产生了一个符合线性的、1倍加权的参考曲线。参考曲线使用了多个监测的反应(即测定了来自带单或双电荷的合成多肽离子的多个子离子所对应的峰面积)来获得。图1显示了合成多肽TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)的MS和MS/MS谱图。上图表示MS谱图，箭头指示的峰尖代表了与在m/z903Da所示的多肽的单电荷[M+H]+1离子相关的质量。下图显示了来自多肽[M+H]+1离子的碰撞诱导解离的MS/MS谱图。用于LC/MS/MS定量的子离子位于m/z 717、646和187。参考曲线表明LC/MS/MS方法的检测极限大约为0.5pmol，线性动态范围大约为1至2000pmol。
使用LC/MS/MS方法，测定了在实验性胰蛋白酶消化的含有ROS、ROS+合成多肽和缓冲液+合成多肽的样品中TETSQVAPA(SEQID NO：1)多肽的量。图2显示实验和标准样品的LC/MS/MS离子谱图。峰的面积代表从HPLC柱上洗脱下的多肽离子数。峰面积数用于线性标准曲线的计算和未知浓度的确定。实验的LC/MS/MS测定值与参考曲线进行比较，以确定存在于胰蛋白酶消化的含有ROS、ROS+合成多肽和缓冲液+合成多肽的样品中TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)的量。参见表4。
                                   表4
  实际量(pmol)   测定量(pmol)     平均量(pmol) CV(％) 回收率(％)
    ROS   161.7±35.6   22.0     33.3
    样品1   485.0   145.3
    样品2   485.0   137.4
    样品3   485.0   202.6
  ROS+合成多肽   421.6±11.2   2.70     43.7
    样品1   965   411.3
    样品2   965   419.8
    样品3   965   433.6
  缓冲液+合成多肽   234.9±23.0   9.80     48.9
    样品1   480   219.2
    样品2   480   224.3
    样品3   480   261.3
在ROS样品中测量的TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)多肽的量被调整，以便说明补充的合成TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)多肽的存在，并且根据回收率加以调整。含有缓冲液和合成的TETSQVAPA(SEQ IDNO：1)多肽的样品，为水解和测量后存在于补充有TETSQVAPA(SEQ IDNO：1)多肽的ROS样品中的合成多肽的量提供了一个指示，并且为TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)多肽的回收率提供了指示。假定从缓冲液样品和ROS样品中合成多肽的回收率是相同的。
对于补充有合成多肽的ROS样品：421.6pmol-234.9pmol＝186.7pmol，186.7pmol x(1/0.49)＝381pmol。视紫红质测定值与已知存在于样品中的视紫红质的量完全符合(即381pmol是485pmol的78.6％)。水解产物测定值与在未补充的ROS样品中测量的TETSQVAPA(SEQ ID NO：1)水解产物的量完全符合(即186.7pmol对161.7pmol)。因此，从缓冲液样品和ROS样品中合成多肽的回收率是相同的这个假设很可能是有效的。
其它实施方案
可以理解，当本发明已经与其详细的描述结合起来得以说明时，上述描述的目的是为了说明，并不对本发明的范围构成限制，本发明的范围由附加的权利要求的范围界定。本发明其它的方面、优点和修饰在下列的权利要求的范围之内。

Claims (24)

1.一种测定一种或多种选定多肽在样品中的实际量的方法，所述方法包括：
用至少一种水解试剂从每个所述一种或多种选定多肽中释放出至少一种特定水解产物；以及
通过与确定量的相应的外源多肽进行比较，确定每个所述至少一种特定水解产物的实际量，
其中每个所述至少一种特定水解产物的实际量与它从其中释放出的选定多肽的实际量直接相关。
2.权利要求1中的方法，其中所述样品含有一种选定多肽。
3.权利要求2中的方法，其中从所述选定多肽释放出一种特定水解产物。
4.权利要求1中的方法，其中所述特定水解产物和所述选定多肽之间的所述直接关系是1∶1。
5.权利要求3中的方法，其中所述特定水解产物和所述选定多肽之间的所述直接关系是1∶1。
6.权利要求1中的方法，其中所述确定量的所述相应的外源多肽在所述释放步骤之前加到所述样品中。
7.权利要求2中的方法，其中从所述选定多肽中释放出2到5种特定的水解产物。
8.权利要求1中的方法，其中所述样品含有2到5种选定多肽。
9.权利要求8中的方法，其中从每个所述选定多肽上释放出一种特定水解产物。
10.权利要求8中的方法，其中从每个所述选定多肽上释放出2到5种特定水解产物。
11.权利要求1中的方法，其中所述样品含有6到10种选定多肽。
12.权利要求11中的方法，其中从每个所述选定多肽上释放出一种特定水解产物。
13.权利要求11中的方法，其中从每个所述选定多肽上释放出2到5种特定水解产物。
14.权利要求1中的方法，其中至少一种所述水解试剂是酶。
15.权利要求14中的方法，其中所述酶选自：胰蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶、Arg-C内切蛋白酶和Glu-C内切蛋白酶。
16.权利要求1中的方法，其中至少一种所述水解试剂是化学试剂。
17.权利要求16中的方法，其中所述化学试剂是溴化氰。
18.权利要求1中的方法，其中至少一种所述选定多肽是膜多肽。
19.权利要求1中的方法，其中至少一种所述选定多肽是神经受体。
20.权利要求1中的方法，其中所述测定步骤包含使用抗体测量至少一种所述水解产物的实际量。
21.权利要求1中的方法，其中所述测定步骤包含使用串联质谱或更高阶的质谱测量至少一种所述水解产物的实际量。
22.权利要求1中的方法，进一步包括：
在所述释放步骤前向所述样品中加入确定量的回收多肽；以及
在所述释放步骤后测量所述回收多肽的实际量，
其中所述测定步骤包括对所述回收多肽与之相应的所述特定水解产物之一的量进行调整，以反映在所述添加步骤后发生的所述回收多肽的损失。
23.权利要求1中的方法，进一步包括：
在所述释放步骤前向所述样品中加入确定量的合成的可水解多肽；
用所述水解试剂从所述合成的可水解多肽上释放出至少两种不同标记的多肽；以及
测量每种所述不同标记的多肽的实际量，
其中所述测定步骤包括对每种所述特定水解产物的量进行调整，以反映由所述水解试剂水解的不完全性。
24.权利要求23中的方法，其中一种所述不同标记的多肽对应于至少一种所述特定水解产物，以及其中所述测定步骤包括对所述至少一种特定水解产物的量进行调整，以反映在所述添加步骤后发生的所述相应的不同标记的多肽的损失。
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