CN1599554A - 用于提高病毒对蚕的感染率的饲料以及应用该饲料的病毒接种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种存在大量蚕的情况下提高重组病毒感染率的饲料的生产方法，以及给大量蚕同时口服接种重组病毒的方法。用于提高重组病毒对大量的蚕的感染率的饲料的生产方法包括将粉状合成饲料与蒸馏水混合，所述蒸馏水中溶解有终浓度为0.2－0.4％重量的Tinopal UNPA－GX，搅拌研磨混合物，将混合物放入耐热聚乙烯袋中，在高压灭菌器中加热混合物；以及向饲养在蚕箱中的大量蚕同时口服接种重组病毒的方法包括将上述方法制备的饲料饲喂已饲养在蚕箱中的大量的5龄蚕幼虫，20－24小时后，将其上承载已涂布含重组病毒溶液的饲料的网放置在蚕箱上，由此提供1涂布重组病毒的饲料。
Description
技术领域
本发明涉及用于提高病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法以及利用该饲料将病毒有效接种蚕的方法。
背景技术
近来，通过基因重组技术在蚕体内获得有用蛋白的技术已在实践中应用。例如，已知利用蚕核多角体病病毒作为载体的方法(日本专利公开(公开号)61-9288和62-208276等)。这些方法包括将蚕核多角体病病毒中含有的多角体蛋白基因用编码另一有用物质如干扰素的基因替换以制备重组病毒；将重组病毒接种5龄蚕幼虫以使蚕感染重组病毒；4-8天后，将重组病毒的增殖过程中在蚕细胞内产生并分泌至体液中的有用物质收集，分离并纯化。
既然作为宿主的蚕的基因与通常用作宿主的大肠杆菌和酵母相比更接近于人，因此从产生的有用物质的活性和抗原性方面考虑，优选利用蚕的基因重组技术。
发明内容
然而，利用蚕生产有用物质的常规基因重组方法存在很多问题。当根据常规方法将重组病毒接种蚕时，给蚕注射病毒的方法需要一头一头地进行或者对于给蚕口服接种病毒的方法仅仅适用于在5℃的低温处理24小时后的5龄幼虫。然而，对于前一种方法，不可能将重组病毒同时接种大量的蚕。此外，由于完成接种的同时必须不伤害蚕的各器官，因此需要经过良好训练的技术和花费大量的时间。另一方面，对于后一种方法，需要花费大量的时间和劳动将蚕在低温室中搬入和搬出。因此，常规方法并不总是适于给大量的蚕接种重组病毒。
本发明提供了一种能够提高病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，采用该方法能够给大量的蚕有效地接种病毒而无需花费大量的劳动并显著减少工作人员的数量。本发明还提供了利用该饲料使重组病毒感染蚕的方法。
本发明人做了大量深入细致的研究。结果发现，通过给蚕提供由下述方法制备的饲料可以在花费最少的时间和劳动的情况下使大量的蚕被病毒同时感染：将蚕用合成饲料与含荧光增白剂的水混合，通过搅拌研磨上述混合物，在高压器中加热该混合物；将高压后的饲料饲喂蚕；然后用含病毒的饲料饲喂蚕。
更具体的，本发明概述如下。
(1)一种用于提高重组病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，包括：将粉状合成饲料与蒸馏水混合，上述蒸馏水中溶解有终浓度为0.2-0.4％饲料重量的Tinopal UNPA-GX；通过搅拌研磨；将混合物放入耐热聚乙烯袋中；在高压器中加热该混合物。
(2)根据第(1)项用于提高重组病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，包括：将粉状合成饲料与蒸馏水混合，上述蒸馏水中溶解有终浓度为0.3％饲料重量的Tinopal UNPA-GX；通过搅拌研磨；将混合物放入耐热袋中；在高压器中加热该混合物。
(3)根据第(1)或(2)项用于提高重组病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，其中高压中的加热是在100-121℃下加热10-30分钟。
(4)向饲养在蚕箱中的大量蚕同时口服接种重组病毒的方法，包括：用第(1)项方法制备的饲料饲喂已饲养在蚕箱中的大量的5龄蚕幼虫；20-24小时后，将其上承载已涂布含重组病毒溶液的饲料的网放置在蚕箱上，由此提供已涂布含重组病毒溶液的饲料。
(5)根据第(4)项给大量蚕同时口服接种重组病毒的方法，包括将已饲喂重组病毒和置于网上的蚕与网一起转移至普通饲料上。
发明详述
1.本发明使用的蚕，病毒以及蚕用合成饲料
对于本发明中使用的蚕没有特别限制，可以是普遍应用的蚕品系。这些蚕品系的实例包括杂交种，如Japanese No.137×ChineseNo.146，Shuko×Ryuhaku，Kinshu×Syowa和Fuyo×Tokai。另外，优选5龄的蚕，特别是5龄第1天的蚕。
本发明的用于提高病毒对蚕的感染率的饲料可采用市场上可以购得的合成饲料如Silkmate(商品名：Nosan Corporation)作为基料来制备。对于合成饲料，粉状饲料是理想的；然而，球状(pellet)饲料也可经研磨后使用。将粉状合成饲料与含有终浓度为0.2-0.4％饲料重量的Tinopal UNPA-GX的蒸馏水混合并通过充分搅拌研磨。然后将上述混合物放入耐热聚乙烯袋中并经高压处理。通过这种方式，可以获得用于提高病毒对蚕的感染率的含Tinopal的本发明合成饲料。此处对于耐热聚乙烯袋所使用的材料没有限制；例如，可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，高密度聚乙烯(HDPE，MDPE)，铸型用聚丙烯(CPP)。
给蚕喂食的病毒量根据使用的重组病毒的类型和所产生的有用蛋白而变化。例如，当使用蚕核多角体病病毒(BmNPV)时，使用含有由感染多角体病病毒的蚕体液离心获得的0.1％上清液的饲料并将其饲喂蚕几小时。
本发明使用的重组病毒的实例包括将编码有用蛋白的基因与用于蚕核多角体病病毒DNA(BmNPV DNA)的多角体蛋白的组成基因整合而获得的重组病毒。重组病毒可以根据常规方法制备。更具体的，制备蚕核多角体病病毒的多角体蛋白表达启动子(质粒)。将编码所需有用蛋白的基因整合至启动子的下游以制备转移载体。随后，将靶标蚕细胞(established silkworm cells)用转移载体和先前克隆的蚕核多角体病病毒共转染。已转染的重组病毒在上述靶蚕细胞中培养增殖。通过破碎靶蚕细胞可以获得重组病毒。
2.蚕的病毒接种以及饲养方法
根据本发明的蚕接种病毒方法和蚕的饲养方法，可以有效地饲养大量的蚕并同时接种病毒。蚕的数量可以根据需要增加或减少。可以同时饲养几千至几万头蚕。
将大量的蚕放在蚕座(蚕箱)等器皿上面饲养，同时适当控制温度和湿度并在蚕座上给蚕饲喂上述含Tinopal的合成饲料。理想的是此处喂食的合成饲料的量保持在可被蚕在20-24小时内完全吃光的饲料量，例如每1000头5龄蚕提供1400g饲料。随后，将病毒涂布的饲料饲喂先前已取食含Tinopal合成饲料的蚕。理想的是此处喂食的饲料的量保持在可被蚕在几小时，例如6小时内吃光的饲料量。更具体的，每1000头5龄蚕提供约600g饲料量。将饲料优选放在蚕通过的网上并将网全部安放在饲养蚕的蚕座上。通过该方法，除去了用于转移蚕的时间和劳动。此外，由于将已喂食涂布病毒的饲料的蚕放在网上，大量蚕可以通过网同时全部转移。其后，将已喂食涂布病毒的饲料的蚕通过网全部转移至其上载有可供几天食量的饲料的蚕座上，使蚕生长。预定天数后，可确保获得所需蛋白。例如，使用蚕核多角体病病毒作为重组病毒并将蚕在约25℃的恒温下饲养时，饲喂后第5天被核多角体病病毒侵染的蚕幼虫表现出核多角体病(肥肿病)的固有症状。这样，产生了有用物质。
在感染后4-6天，当所需蛋白在蚕体内累积至最大量的时候从蚕中采集体液回收和分离蚕体内产生的所需蛋白，以及通过如离心分离或柱色谱法的分离方式分离体液，由此获得并纯化了有用蛋白。作为另一种方式，即如下方法包括将蚕体破碎，用SDS水溶液、尿素水溶液、碱性水溶液、或酸性水溶液提取破碎的蚕，然后通过常规方法分离并回收有用蛋白。还有另一种方式，即如下方法包括将破碎的蚕悬浮于磷酸盐缓冲液中，超声处理悬浮溶液，然后向溶液混合物中加入例如血细胞的特异结合有用蛋白的物质，由此获得了有用蛋白。
附图简述
图1图示了用含Tinopal的饲料饲养蚕以给大量的蚕口服接种病毒的方法。图1A图示了在蚕座上放置5龄第1天的蚕和用于提高感染率的饲料。图1B图示了将其上载有病毒涂布的饲料的网安放在已取食了用于提高感染率的饲料的蚕上。图1C图示了已取食病毒涂布的饲料的蚕。图1D图示了将放在网上并已取食病毒的蚕转移至蚕座的饲料上饲喂4天。
本发明的最佳实施方式
通过下列实施例详述本发明，但这不应当解释为限制本发明的范围。
[实施例1]制备用于提高病毒对蚕的感染率的饲料
将1000克粉状合成饲料(Nosan Corporation生产的市售产品Silkmate)与2700毫升含终浓度为0.3％饲料重量荧光增白剂(Sigma生产的市售产品Tinopal UNPA-GX)的蒸馏水混合。将所得混合物通过搅拌研磨，放入耐热聚乙烯袋中，在高压器中加热20分钟。将加热后的含Tinopal的合成饲料在4℃下贮藏。
[实施例2]给蚕接种病毒
将1000头5龄第1天的蚕置于蚕座上并将实施例1制备的1天食量的含Tinopal的饲料放在蚕座上以饲喂蚕(图1a)。在蚕取食饲料20-24小时后，将BmNPV溶液(含有用蒸馏水稀释至0.1％浓度的核多角体病病毒的蚕体液)通过洗瓶涂整个表面的普通饲料置于带有足以使蚕通过的大筛孔的网上。将网全部放置在蚕座内的蚕上(图1b)。6小时后当蚕吃光了涂布BmNPV的饲料时，将蚕由蚕座移至网上(图1c)。然后，将其上载有蚕的网放置在普通饲料上饲喂蚕4天，所述普通饲料放在另一蚕座上(图1d)。在蚕座上放上盖以防止饲料干燥和蚕爬出，将其单独保持4天。用BmNPV感染1000头5龄蚕所需的饲料量和时间列于表1中。
表1
感染1000头5龄蚕所需的饲料
| 饲料样本 | 饲料量(克) | 喂食饲料的时间(小时) | 注释 |
| 含Tinopal的饲料 | 1400 | 24 | 含0.3％Tinopal |
| 用于接种病毒的饲料 | 600 | 6 | 涂布有50毫升的0.1％含核多角体病病毒的蚕体液 |
| 合成饲料 | 8700 | 96 | 覆盖以防止蚕爬出 |
4天后，取每头蚕的体液以确定蚕是否被BmNPV侵染。在这种情况下，将用普通饲料替代含Tinopal的饲料以及涂布BmNPV的饲料饲喂的蚕同时饲养作为对照组。表2列出了生长后的结果。
表2
饲养的1000头蚕的试验结果
| 区域 | 24小时后蚕的重量 | 96小时后蚕的重量 | 感染率 |
| 试验区(1000头蚕) | 31.8 | 75.7 | 100 |
| 对照区(50头蚕) | 34.6 | 85.2 | - |
：表示20头蚕的重量
用于试验的蚕的品种：Japanese No.137×China No.146，5龄
BmNPV接种后的饲喂次数：一次
如表所示，试验区中的所有蚕均被BmNPV侵染。
工业实用性
如实施例所示，在病毒侵染前饲喂本发明的含Tinopal的合成饲料的蚕易于被病毒感染。因此，通过本发明方法可以有效地使大量的蚕同时被病毒感染。
这里引用的所有公开文献在本说明书中全部引入作为参考。而且，本领域普通技术人员很容易理解可以进行各种改进和变化而不脱离附后的权利要求范围内所述的本发明技术主旨和范围。本发明应包括上述改进和变化。
Claims (5)
1.一种用于提高重组病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，包括：将粉状合成饲料与蒸馏水混合，上述蒸馏水中溶解有终浓度为0.2-0.4％饲料重量的Tinopal UNPA-GX；通过搅拌研磨；将混合物放入耐热聚乙烯袋中；在高压器中加热该混合物。
2.根据权利要求1的用于提高重组病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，包括：将粉状合成饲料与蒸馏水混合，上述蒸馏水中溶解有终浓度为0.3％饲料重量的Tinopal UNPA-GX；通过搅拌研磨；将混合物放入耐热袋中；在高压器中加热该混合物。
3.根据权利要求1或2的用于提高重组病毒对蚕的感染率的饲料的生产方法，其中高压器中的加热是在100-121℃下加热10-30分钟。
4.向饲养在蚕箱中的大量蚕同时口服接种重组病毒的方法，包括：用权利要求1的方法制备的饲料饲喂已饲养在蚕箱中的大量的5龄蚕；20-24小时后，将其上承载已涂布含重组病毒溶液的饲料的网放置在蚕箱上，由此提供涂布有含重组病毒的溶液的饲料。
5.根据权利要求4的给大量蚕同时口服接种重组病毒的方法，包括将已饲喂重组病毒并置于网上的蚕与网一起转移至普通饲料上。
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