JPH03232462A

JPH03232462A - ウイルス感染用カイコ人工飼料およびカイコ用ウイルス感染促進剤並びにこれを利用する有用物質の製造法

Info

Publication number: JPH03232462A
Application number: JP2028476A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Watabe; 仁渡部; Masao Nagata; 永田　昌男; Toshiki Nagae; 永江　敏規
Original assignee: Katakura Industries Co Ltd
Current assignee: Katakura Industries Co Ltd
Priority date: 1990-02-09
Filing date: 1990-02-09
Publication date: 1991-10-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、遺伝子工学において、有用物質を生産させる
ためのベクターであるウィルスを効率良く宿主となるカ
イコに感染させるための人工飼料およびウィルス感染促
進剤並びにこれを利用する有用物質の製造法に関する。

［従来の技術］近年、遺伝子組替え技術を利用して、カイコで有用物質
を生産する技術が盛んに研究されている。例えば、カイ
コ核多角体ウィルスをベクターとして利用する方法が報
告されている（特開昭６１−９２８８号、同６２−２０
８２７６号等）。

これらの方法は、カイコ核多角体ウィルスの有する多角
体遺伝子を他の有用物質をコードする遺伝子に置き換え
て組換え体ウィルスを調製し、これを５齢カイコに接種
して感染させ、６〜８日後に組換え体ウィルスが増殖の
過程てカイコ細胞中で産生じ、体液中に分泌した有用物
質を分離、Ｆ＃製するというものである。

このようなカイコを利用した遺伝子組換えの技術は、宿
主として従来から用いられている大腸菌や酵母に比べて
、■産生有用物質が細胞外に分泌されるので、有用物質
の抽出操作がやり易く生産効率が良いことく大腸菌や酵
母は細胞外に出さない）、■カイコ体液にプロテアーゼ
がないので、産生される有用物質が分解されないこと（
大腸菌や酵母は細胞内の各種プロテアーゼによって産生
有用物質が分解される）、■微生物より細胞構造が人間
：こ近く、産生有用物質のプロセッシングが天然物に近
いこと等から有用物質生産には非常に優れた画期的な方
法であると有望視されている［発明が解決しようとする課題］しかしながら、従来のカイコを利用する遺伝子組換え方
法には大きな問題があった。

すなわち、組換え体ウィルスをカイコに接種する方法と
しては、ウィルス液をカイコ１頭づつに注射して感染さ
せる経皮接種方法と、飼料とともにウィルス液を給餅し
、消化管から感染させる経口接種方法の三方法が検討さ
れている。

この方法のうち、経口接種方法は、例えば人工飼料にウ
ィルス液を塗布し、−度に添食すれば接種が終了するの
で、有用物質の大量生産においては極めて効率的である
。しかし、この経口接種方法による場合、カイコ消化管
内に取り込まれた接種ウィルスがカイコ消化液で不活化
され、カイコがウィルスに感染しないことが多か′つた
。

このような理由から、組換え体ウィルスは経皮接種を行
なうことが一般的であるが、経皮接種は、カイコが脱皮
した直後に、カイコ１頭づつに注射をしなければならず
、しかもカイコに傷を付けないように行なう必要がある
ため熟練と手間が必要てあり、到底工業的な有用物質生
産において採用しつるものではなかった。

したがって、カイコを利用した遺伝子組換え技術を工業
的生産で行なうために、効Ｔの良いウィルス接種法の開
発が望まれていた。

［課組を解決するための手段］本発明者のうちの渡部・水田らは、従来からウィルスに
対するカイコ消化液の作用：こついて研究を行なってお
り、カイコ消化液のカイコ核多角体ウィルス（以下、ｒ
ＮＰＶＪと略称する）に対する不活化作用力とプロテア
ーゼの活性の間には密接な関係があり、下表；こ示すよ
うにプロテアーゼ活性の高い消化液はＮＰＶ不活化作用
力も強いことを発見し、先ｉ：報告した（　渡部ら、「
日本奎糸学雑誌」５８、　４０７〜４１１　（１９８９
）　）。

表カイコ　　　　試　　　料　　　　　　　ＰＨ７’けア
砕゛活性　　　ＮＰＶ不活化作用力品１■（＾＋ｍｌｌ
ａｇｌｃａｏ±５ＥＴ４イヒｘｍ日１２４号　　　１１
１水−−２，８５±０．２５×　　　　へ菖冑蔓カイコ
消イｂｌ！　　　　　＋１．１３　０．５６０　　　　
５．５１１±Ｏ１１２臼支１２４号　　人ＴＩＪＲＷＩ
Ｎ　カイコ消イＩＪ　　１１．［５０，３８１）　　　
　　４．！ｉ５±０．２１　　　１．７０日１コフ号蒸
台１水−−２５９±ＯＩコーｘ　　　　Ａ！ｒｗ！カイ
：＋ｍ化液　　　１１２１５　　０．４７２　　　　４
．９１±ｆ１．１４　　　２３２支１３７号　　人工１
料育薔カイコ消イ圀１０１）　０コ１９．　　　　４．
２０±０．２１　　　１．６１この結果は、経口投与さ
れたウィルスがカイコ消化管内で不活化され、カイコに
感染しないのは、消化液中のプロテアーゼによってウィ
ルスの本体であるコア（遺伝子ＤＮＡ）を被う外側のウ
ィルス粒子蛋白質が消化されるためにウィルス粒子がカ
イコ消化管の中賜細胞に浸入できないためであるとの示
唆を与えるものであった。

本発明者等は上記の知見を基に、経口投与によって効率
良くウィルスを感染させるためにはカイコ消化管内のプ
ロテアーゼを低下させるような飼料を与えつつウィルス
の経口投与を行なえば良いことに思い至った。そして、
更に研究を行なった結果、■蛋白質含有量を減少させた
人工飼料の給餌によってカイコの消化液中のプロテアー
ゼ活性が低下すること、■このプロテアーゼ活性の低下
に伴ない、ウィルス不活化作用力も低下しウィルスが消
化管から感染しやすくなること、■低蛋白質人工飼料の
給餌によってもカイコの成長はウィルスの増殖に影響を
及ぼすほど低下しないこと等を見出し本発明を完成した
。

すなわち本発明の目的は、乾物飼料中の蛋白質含有量が
２０重量％以下であるウィルス感染用カイコ人工飼料を
提供することである。

また本発明の池の目的は、上記人工飼料に組換え体ウィ
ルスを担持せしめたことを特徴とするウィルス感染促進
剤を提供することである。

本発明の更に他の目的は、カイコにウィルス感染促進剤
を経口投与し、飼育した復、ウィルス感染カイコの体液
を採取し、これから有用？！ｌ質を単Ｍ精製することを
特徴とする有用物質の製造法を提供することである。

従来よりカイコ人工飼料に関しては数多くの研究がなさ
れているが、いずれの研究も如何に収繭成績を上げるか
、如何に糸質の良い面を得るかにその目的が向けられて
おり、本発明のようにウィルス感染性を高めるといった
見地からの研究は皆無である。そして、従来の研究によ
れば、カイコが正常に育ち、面を作るためには、カイコ
にあった良質のまた適正量の蛋白質を給餌することが必
要とされている。この蛋白質の適正量は、桑葉で２０％
、人工飼料で２５％とされておりくいずれも乾物重量中
）、特に、幼虫体が著しく増加する５齢期間にはより蛋
白質含有量の多い飼料の給餌が必要とされていた。

本発明のウィルス感染用人工飼料は、上記したような従
来の人工飼料と解決すべき技術課Ｕが全く異なるもので
あり、その蛋白質含有量を２０重量％以下、好ましくは
４〜１６重量％以下とした点に特徴を有するものである
。

本発明の人工飼料に配合される蛋白質としては、従来の
人工飼料用の蛋白源をそのまま利用することができるが
、好ましくは脱脂大豆粉末である。　この脱脂大豆粉末
は、その蛋白質含有量が４０〜４８重量％であるとされ
ているので、これを蛋白源として使用する場合には、８
〜３６重量％程度を人工飼料中に配合すれば良い。

本発明の人工飼料に配合する他の成分としては、桑葉粉
末、セルロース粉末、とうもろこし粉末（コーン・ミー
ル）、馬鈴薯澱粉、脱脂米糠、各種糖類、各種ステリン
、各種有機酸、各種無機塩混合物、各種ビタミン類、各
種摂食誘引物質、各種アミノ酸等従来の人工飼料の原材
料から適宜選択することができる。

これら従来公知成分のうちで桑葉粉末はカイコ消化管内
のプロテアーゼ活性を上昇させる作用があるので、カイ
コとして広食性の品種のものを利用する場合は配合しな
いほうが好ましい。　しかし、本発明のような低蛋白質
人工飼料で桑葉を入れない場合はカイコの食い込みが低
下するので、接種ウィルスを効率良く貴下させ、さらに
ウィルス感染後のカイコの成長を良くするためにも、セ
ルロース粉末を添加することが望ましい。

用いられるセルロース粉末としては特に制限はなく、セ
ルロースを含むものであり、カイコの忘避性のないもの
であれば精製品や代替品などのいずれであっても良い。

セルロース粉末の添加量は、用いるカイコの品種、発育
の程度によっても異なるが５〜４０％程度とすることが
好ましい。

本発明のウィルス感染促進剤は、上記の様にして得られ
た人工飼料に組換えウィルスを担持せしめることにより
調製される。

組換えウィルスは既に公知の方法により、例えばベクタ
ーであるＮＰＶの多角体遺伝子を目的とする物質をコー
ドする遺伝子に換えること（こより調製され、また、そ
の増埴も公知方法またはこれに準じて行なわれる。

組換えウィルスの担持は、上記人工飼料に組換えウィル
スを含有する溶液を塗布したり含浸せしめることにより
行なわれる。

カイコに組換えウィルスを感染せしめるためには、カイ
コ１頭当り１０３個程度以上、好ましくは１０７個程度
以上の組換えウィルスが必要であるので、カイコの飼料
摂取量から人工飼料に担持させる組換えウィルス量を決
定する必要がある。

このウィルス感染促進剤は、カイコの４齢時に使用する
こともてきるが、カイコの体が大きくなり、体液量も増
加する５齢にはいってから投与することが好ましい。

叙上のウィルス感染促進剤を利用して所望の有用物質を
製造するには、例えば５齢のカイコにウィルス感染促進
剤を経口投与し、６〜８日間飼育を続けた後、カイコか
ら体液を採取し、この体液中に含まれる有用物質を分離
、精製すれば良い。有用物質の分離、精製方法は目的と
する有用物質の物性によって各種の９１ｗ精製手段を組
合せ採用することがてきる。

［作用および発明の効果］本発明は、カイコに低蛋白質の人工飼料を給餌してカイ
コ消化管内のプロテアーゼ活性およびウィルス不活化作
用力を低下させ、消化管からのウィルス感染を容易にし
、しかもカイコ自身の成長はほとんど妨げないものであ
る。

したがって、従来極めて困難とされていた、カイコに対
する組換え体ウィルスの経口接種が容易に実施できるこ
ととなり、カイコを宿主とする遺伝子組換え技術を工業
的規模で行なうことが可能となる。

［実施例］次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、本発
明はこれら実施例によってなんら制約されるものではな
い。

実施例　１カイコ消化管内のプロテアーゼ活性およびウィルス不活
化作用力のカイコ飼料による影響を以下に示すようにし
て調べた。この結果を第２表に示す。

１、試験方法：（１）供試材料奎の飼育カイコ品種はＪ１２４ｘＣ１２４またハＪ１３７Ｘｃ１
３７を用いた。この供試カイコは、発明者らが開発した
稚蚕人工飼料で１〜４齢の幼虫期間を常法にしたがって
ＳＰＦ清浄飼育（カイコの病原菌フリーの環境で飼育）
を行ない、得られた５齢起奎を以下の実験に用いた。な
お、４ＢＩｉ！期以徨の供試カイコには試験区に応じた
所定の試験飼料以外は給餌しなかった。

（２）試験飼料下の第１表に示すように、脱脂大豆粉末量５０ｇを添加
した飼料を基本飼料とし、その脱脂大豆粉末添加量を３
６ｇに減量した飼料を低蛋白質飼料１、同じく１０ｇに
減量した飼料を低蛋白質飼料２とした。水の添加割合は
乾物１ｇ当たり２．２ｍｌとし、その水分率は基本飼料
と同一とした。

第　　　１　　　表［乾物１２２．８ｇ当り配合量］ウエッソンの無機塩混合物ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ニコチン
酸、パントテン酸カルシュウム、葉酸、塩化コリンおよびイノシトールの混合物（３）試験カイコの飼育と消化液の採取５齢起蚕を蛋白
質含有量の異なる上記３種の飼料で５日間飼育し、６日
目のカイコ体重を測定？＆５時間絶食させた。次いて、
１を気ショック法により消化液を個体別にそれぞれ採取
し、遠心分離した（３，０００　ｒｐｍ、１０　ａｋｉ
ｎ　）。

得られた上清について以下に示す方法によりｐＨ、プロ
テアーゼ活性およびＮＰＶ不活化作用力を求めた。

（４）ｐＨ測定個体別に採取した消化液のｐＨをＦ−７型ｐＨメーター
（日立堀場製）を用いて測定し、その平均値を消化液の
ｐＨとした。

（５）プロテアーゼ活性の測定プロテアーゼ活性測定用の緩衝液としては、ＣＡＰ８Ｉ
！衝液（０，１Ｍ　　３−シクロへキシルアミノプロパ
ンスルホン酸を０．１λ（水酸化ナトリウムでｐＨ１１
，５に調整したもの）を用い、基質としてはこの＆！衝
液にカゼイン（Ｍｅｒｋ社製Ｈａａｍａｒｓｔｅｉｎ　
）を１％溶解させたもの、を利用した。

測定は、基質２ｍｌに試料カイコの消化液１０μｍを加
えて３０″Ｃ″′ｃｌＳ分間反応させた。次いで２ｍｌ
の１０％ＴＣＡを加えて反応を停止させた徨３０分氷冷
し、１０分間遠心分Ｉｌｌ　（３，００Ｏｒｐｍ）　Ｌ
、、遠沈上清中ノベブチド等の分解物をローリ−法によ
り測定した。すなわち、上清０．２ｍｌにフォリンＣ液
　５．８ｍｌを加え、１０分後フェノール試薬０．５ｍ
ｌを添加し、３０分後に７５０ｎｍの吸光度を測定して
プロテアーゼ活性を求めた。

（６）ＮＰＶ不活化作用力の測定多角体として１０８・５濃度の核多角体液０．５ｍｌに
試料カイコの消化液０．５ｍｌを加え、２５°Ｃで２０
分間保持した後、各々の１０倍段階希釈液を直ちに標準
の人工飼料で飼育した２齢起蚕に経口接種した。この感
染基からフィニーのプロビット法によって１ｏｇＩｃｓ
ｏを求め、消化液のがわりに蒸留水を使用した対照の１
０ｇＩＣ５ｏとの差である不活化対数で各消化液のウィ
ルス不活化作用力を比較した。なお、ここで用いるＩＣ
，、は、中央感染濃度（ｍｅｄｉａｎ　１ｎｆｅｃｔｉ
ｖｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　）であり、被験カ
イコの５０％が感染するウィルス濃度を意味する。した
がって、数値が少ないものほど低濃度でウィルスに感染
することを示す。

（結　　果　　）（以下余白）これらの結果から、■消化液のｐＨ値は飼料の種類とは
無関係である、■蛋白質含有量の低い人工飼料はど消化
液のプロテアーゼ活性が低い傾向にあり、特に低蛋白質
飼料は著しくその活性値が低いこと、■プロテアーゼ活
性とウィルス不活化作用力の間には正の相関関係があり
、プロテアーゼ活性が低い消化液はどウィルス不活化作
用力も小さいことがわかる。

１０ｇＩＣ５ｏを基に、基本餌料に対する低蛋白質飼料
のウィルス感染の難易を比較すると、低蛋白質間Ｒ１て
は４．７９倍（１０’−”）、低蛋白質飼料２では６．
７６倍（１０’・＠３）に感染性が高くなった。

このことから、蛋白質含有量を低下させたカイコ人工飼
料は、消化管内のウィルスを不活化しにくく、カイコの
消化管内でウィルスの感染を容易に引き起こしつるもの
であることが示された。

実施例　２より好適なウィルス感染用カイコ人工飼料を調製するた
め、ウィルス不活化作用力に及ぼす桑葉粉末やセルロー
ス粉末の影響を調べた。飼料としては第３表に示す５種
類の飼料組成を用い、基本飼料で斬化幼虫を飼育した２
齢起カイコに、各試験飼料の表面に１０倍段階希釈した
ＮＰＶ液を均一に塗布して２４時間経口接種し、以後新
鮮な当該飼料を給餌後、感染率を調査した。１０ｇＩＣ
５ｏ等の算出は実施例１の方法と同一にした。

この結果を第４表に示す。

く飼料組成）（以下余白）（結果）第表この結果から、飼料組成とｌｏｇ　Ｉ　Ｃｓｏ　（不活
化作用力）との関係は、基本飼料〉Ｓ−１＞Ｍ−０＞Ｃ
−１＞Ｃ−２の順序で小さくなった（つまりウィルスの
感染性は逆に、この順序で大きくなる）。従ってこれら
の結果から、■セルロース粉末の添加はウィルスの感染
性を高くし、特に低蛋白質飼料においてその効果は顕著
であり、また飼料の食い込みも、良くなる、■桑葉粉末
の添加はカイコの食い込みが良くなるが、ウィルスは不
活化される傾向にある、■シュークロースはむしろ添加
量を少なくした方がウィルスの感染性はよくなること等
が判明した。

したがって、ウィルス感染用人工飼料を調製する場合に
は、用いるカイコの品種等を考慮し、桑葉粉末、セルロ
ース、シュークロース等の添加を決定することが必要で
ある。

以　　上出願人片倉工業株式

Claims

【特許請求の範囲】

（１）乾物飼料中の蛋白質含有量が２０重量％以下であ
るウイルス感染用カイコ人工飼料。
（２）乾物飼料中の蛋白質含有量が４〜１６重量％であ
る請求項第１項記載のウイルス感染用カイコ人工飼料。
（３）蛋白質が脱脂大豆粉末であり、その乾物飼料中の
配合量が８〜３６重量％である請求項第１項記載のウイ
ルス感染用カイコ人工飼料。
（４）桑葉粉末を含有しない請求項第１項ないし第３項
のいずれかの項記載のウイルス感染用カイコ人工飼料。
（５）更にセルロース粉末を含有することを特徴とする
請求項第１項ないし第４項のいずれかの項記載のウイル
ス感染用カイコ人工飼料。
（６）請求項１項記載のウイルス感染用カイコ人工飼料
に組換えウイルスを担持せしめたことを特徴とするウイ
ルス感染促進剤。
（７）組換えウイルスがカイコ核多角体ウイルスより導
かれたものである請求項第６項記載のウイルス感染促進
剤。
（８）カイコに、請求項６項記載のウイルス感染促進剤
を経口投与して飼育した後、ウイルス感染カイコの体液を採取し、これから有用物質
を単離精製することを特徴とする有用物質の製造法。
（９）投与されるカイコが５齢のものである請求項第８
項記載の有用物質の製造法。