JP2003111535A - カイコへのウイルスの感染率を高める飼料および該飼料を用いたウイルス接種方法 - Google Patents

カイコへのウイルスの感染率を高める飼料および該飼料を用いたウイルス接種方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 大量のカイコの組換えウイルスによる感染率
を高める飼料の製造方法及び大量のカイコに同時に経口
的に組換えウイルスを接種させる方法を提供する。 【解決手段】 粉体人工飼料をチノパールUNPA-GXを飼
料中の最終濃度が0.2〜0.4重量%となるように溶解させ
た蒸留水と混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れ、
オートクレーブで加熱することからなるカイコの組換え
ウイルスによる感染率を増加させる飼料の製造方法、お
よび蚕座上で飼育している大量の5齢のカイコに該方法
により製造した飼料を与え、20〜24時間後に、組換えウ
イルス液を塗布した飼料をのせた網を蚕座にのせること
により組換えウイルス液塗布飼料を給餌することを特徴
とする、蚕座上で飼育している大量のカイコに組換えウ
イルスを同時に経口的に接種する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カイコのウイルス
に対する感染率を高める飼料の製造方法および該飼料を
用いた効率的なウイルス接種方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子組換え技術を利用して、カ
イコで有用タンパク質を生産する技術が実用化されてい
る。 例えば、カイコ核多角体病ウイルスをベクターと
して利用する方法がある（特開昭６１−９２８８号、同
６２−２０８２７６号等）。これらの方法は、カイコ核
多角体病ウイルスの有する多角体病遺伝子をインターフ
ェロン等の他の有用物質をコードする遺伝子に置き換え
て組換えウイルスを調製し、これを５齢カイコに接種し
て感染させ、４〜８日後に組換え体ウイルスが増殖の過
程でカイコ細胞中で産生し、体液中に分泌した有用物質
を採取、分離、精製するというものである。このような
カイコを利用した遺伝子組換えの技術は、宿主となるカ
イコが、従来用いられている大腸菌や酵母と比べて遺伝
的に人間に近いものであるため、産生有用物質の活性や
抗原性の点等から好ましい。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
カイコを利用する遺伝子組換え有用物質産生方法には大
きな問題があった。すなわち、従来法において組換えウ
イルスをカイコに接種しようとする場合、ウイルスをカ
イコ１頭毎に注射する方法と、５齢直後のカイコを5℃
で24時間低温処理してウイルスを経口接種する方法が採
られていた。しかし、前者の方法では一度に大量のカイ
コに組換えウイルスを接種することはできず、また、カ
イコ体内の各種臓器に傷をつけないように行う必要があ
るため熟練が必要で、手間もかかっていた。さらに、後
者の方法では、カイコを低温室に移したり、低温室から
出したりする必要があり、やはり手間がかかっており、
大量のカイコへの組換えウイルスの接種には必ずしも適
していなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、大量のカイ
コを労力を要しないで効率よく接種することができ、し
かも作業者の人数を大幅に減少することができるカイコ
へのウイルスの感染率を高めることのできる飼料の製造
方法および該飼料を用いたカイコに組換えウイルスを感
染させる方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
の結果、カイコの人工飼料を蛍光増白剤の１種を含んだ
水と混合して攪拌磨砕し、オートクレーブで加熱した飼
料をカイコに摂食させ、次いでウイルスを混ぜた飼料を
摂食させることにより手間をかけずに一度に大量のカイ
コにウイルスを感染させることができることを見出し本
発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は以下のとおりである。 （１） 粉体人工飼料をチノパールUNPA-GXを飼料中の
最終濃度が0.2〜0.4重量%となるように溶解させた蒸留
水と混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れて、オー
トクレーブで加熱することからなる組換えウイルスによ
るカイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。 （２） 粉体人工飼料をチノパールUNPA-GXを飼料中の
最終濃度が0.3重量%となるように溶解させた蒸留水と混
合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れて、オートクレ
ーブで加熱する、（１）の組換えウイルスによるカイコ
の感染率を増加させる飼料の製造方法。 （３） オートクレーブによる加熱が、100〜121℃、10
〜30分である（１）または（２）の組換えウイルスによ
るカイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。 （４） 蚕座上で飼育している大量のカイコに組換えウ
イルスを同時に経口的に接種する方法であって、蚕座上
で飼育している大量の5齢のカイコに（１）の方法によ
り製造した飼料を与え、20〜24時間後に、組換えウイル
ス液を塗布した飼料をのせた網を蚕座にのせることによ
り組換えウイルス液塗布飼料を給餌することを含む、方
法。 （５） さらに、組換えウイルスを食下した網上のカイ
コを網と共に普通飼料上にのせることを含む、（４）の
大量のカイコに組換えウイルスを同時に経口的に接種す
る方法。 以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】１．本発明に用いるカイコ、ウイ
ルスおよびカイコ用人工飼料 本発明において用いられるカイコについては特に制限は
なく、一般に普及している品種を用いることができ、例
えば日137号×支146号、秋光×竜白、錦秋×鐘和、芙蓉
×東海などの交雑品種が好適に用いられる。また、カイ
コは５齢のもの、特に５齢１日目のものが好ましい。
【０００８】本発明のウイルスのカイコへの感染率を高
める飼料のベースとなる飼料としては、市販の人工飼料
を用いることができ、例えばシルクメート（登録商標、
日本農産工業社製）を用いることができる。人工飼料
は、粉末のものが望ましいが、ペレット状の飼料を粉砕
して用いてもよい。粉末状の人工飼料をチノパールUNPA
-GXを飼料中の最終濃度が0.2〜0.4重量％となるように
含んだ蒸留水と混合し、十分に攪拌磨砕する。その後耐
熱性ポリ袋に入れ、オートクレーブを用いて処理するこ
とにより本発明のチノパールを含有し、カイコへのウイ
ルス感染率を高める人工飼料を得ることができる。ここ
で用いる耐熱性ポリ袋の素材は限定されないが、例えば
ポリエチレンテレフタレート（PET）、高密度ポリエチ
レン（HDPE、MDPE）、無延伸ポリプロピレン（CPP）等
が用いられる。カイコに投与するウイルス量は、使用す
る組換えウイルスの種類、産生させるべき有用タンパク
質の種類により変わるが、例えばカイコ核多角体病ウイ
ルス（BmNPV）を用いる場合は、核多角体病蚕体液の遠
心上清の0.1%液を飼料に塗布して、数時間食下させれば
よい。
【０００９】本発明において、用いられる組換えウイル
スの例としては、カイコ核多角体病ウイルスDNA(BmNPV
DNA)の多角体病蛋白構造遺伝子部分に、目的とする有用
タンパク質を組み込んだものが挙げられる。組換えウイ
ルスの調製は常法にしたがって行なうことができる。例
えば、カイコ核多角体病ウイルスの多角体病タンパク質
発現プロモーター（プラスミド）を調製し、このプラス
ミドの下流に目的とする有用タンパク質をコードする遺
伝子を組み込み、発現ベクターを調製する。次いで、こ
の発現ベクターと予めクローン化してあるカイコ核多角
体病ウイルスとでカイコ樹立細胞をコ・トランスフェク
トさせ、形質転換された組換えウイルスを同じくカイコ
樹立細胞中で培養増殖し、その細胞を破壊して組換えウ
イルスを取得すれば良い。
【００１０】２．カイコへのウイルス接種および飼育方
法 本発明のカイコへのウイルス接種および飼育方法によれ
ば、効率的に一度に大量のカイコを飼育し、ウイルス接
種を行うことができる。カイコの数は、必要に応じて増
減することができるが、一度に数千頭から数万頭程度飼
育することができる。
【００１１】大量のカイコを、蚕箔（蚕座）等に載せて
温度および湿度を適度に調節して飼育し、蚕箔上のカイ
コに上述のチノパール含有人工飼料を給餌する。この
際、人工飼料の量は蚕が20〜24時間で完全に食下できる
量、例えばカイコ1,000頭当たり1,400gが望ましい。次
いで、ウイルスを塗布した飼料をチノパール含有人工飼
料を食下したカイコに給餌する。この際の飼料の量は、
カイコが数時間、例えば６時間で食下できる量が望まし
く、その量は例えば、カイコ1,000頭当たり約600ｇであ
る。給餌はカイコが通過可能な網の上に載せてカイコを
飼育している蚕箔に網ごと載せるのが好ましい。このよ
うにすることにより、カイコを移す手間が省け、またウ
イルス塗布飼料を食下したカイコが網の上に載っている
ので、大量のカイコを一度に網ごと移動させることがで
きる。その後、ウイルス塗布飼料を食下したカイコを網
ごと、数日分の飼料を載せた蚕箔上に載せて、飼育す
る。一定の飼育日数で安定した目的のタンパク質を得る
ことができる。例えば、組換えウイルスとしてカイコ角
多角体病ウイルスを使用し、約25℃の一定の温度で飼育
した場合、感染したカイコ幼虫は投与後５日目には核多
角体病（膿病）特有の病徴を呈し、有用物質の産生が進
行する。
【００１２】カイコ体中で産生された目的タンパク質の
回収・分離は、カイコ体中に目的タンパクが最も多く蓄
積される感染後４〜６日目にカイコ体液を採取し、遠心
分離、カラムクロマトグラフィー等の各種分離手段によ
り有用タンパク質を取得、精製することによりできる。
また、別の手段としては、カイコを摺りつぶし、SDS水
溶液、尿素水溶液、アルカリ性水溶液等で抽出した後、
常法処理によって有用タンパク質を分離、採取する方法
が挙げられる。更に別の手段としては、摺りつぶしたカ
イコをリン酸バッファー等に懸濁させ、超音波処理した
のち血球等の、そのタンパク質と特異的に結合する物質
を加えて有用タンパク質を取得する方法を挙げることが
できる。
【００１３】
【実施例】本発明を以下の実施例によって具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるも
のではない。 〔実施例１〕 カイコへのウイルスの感染率を高める飼
料の製造 粉体の人工飼料（市販のシルクメート（登録商標）、日
本農産工業社製）1000gと蛍光増白剤（市販のチノパー
ルUNPA-GX（登録商標、Sigma社製）を飼料中の最終濃度
が0.3重量%となるように含んだ蒸留水2700mlを混合し、
攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れ、さらにオートクレー
ブで20分間加熱した。加熱したチノパール含有人工飼料
は4℃にて保存した。
【００１４】〔実施例２〕 カイコへのウイルス接種 1000頭の５齢１日目のカイコを蚕箔に載せ、実施例１の
チノパール含有飼料一日分を蚕箔上に置きカイコに食下
させた（図１a）。20〜24時間後カイコが食下した後
に、BmNPV液（核多角体病蚕体液を0.1％となるように蒸
留水で希釈したもの）を洗浄瓶を用いて全面に塗布した
普通飼料をカイコが通過可能な大きさの網目を有する網
の上に置き、網ごと蚕箔上のカイコの上に載せた（図１
b）。カイコがBmNPV塗布飼料を完全に食下した6時間
後、カイコは蚕箔から網の上に移っており（図１c）、
網ごと別の蚕箔上に置いた４日分の普通飼料の上に載せ
た（図１d）。飼料の乾燥とカイコの這い出しを防ぐた
めに蓋をし、４日間放置した。5齢1000頭のカイコをBmN
PV感染させるために用いた各飼料の量と食下に要した時
間は、表１のとおりであった。
【００１５】
【表１】
【００１６】４日経過後、各々のカイコから体液を採取
し、BmNPV感染の有無を調べた。この際、チノパール含
有飼料およびBmNPV塗布飼料の代わりに普通飼料を摂食
させたカイコ群を対照群として同時に飼育した。表２に
飼育結果を示す。
【００１７】
【表２】 ＊：カイコ20頭の体重 供試カイコ品種：日137号×支146号 ５齢 BmNPV接種後の給餌回数：１回 表に示すように、試験区のカイコでは全数がBmNPVに感
染していた。
【００１８】
【発明の効果】実施例に示すように、本発明のチノパー
ルを含む人工飼料を、ウイルス感染前に給餌したカイコ
はウイルスに感染しやすくなっており、本発明の方法に
より、一度に大量のカイコに効率的にウイルスを感染さ
せることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】チノパール含有飼料を用いて大量のカイコにウ
イルスを経口的に接種する方法を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古田 要二 茨城県つくば市花室1463−12 (72)発明者 宮澤 光博 茨城県つくば市松代４−26−405−204 (72)発明者 新川 徹 茨城県つくば市二宮１−16−14 メゾン片 見205 Ｆターム(参考） 2B005 FA02 FA10 MB02 2B150 AA09 AB10 AC39 AE02 BB10 BD01

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 粉体人工飼料をチノパールUNPA-GXを飼
    料中の最終濃度が0.2〜0.4重量%となるように溶解させ
    た蒸留水と混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れ
    て、オートクレーブで加熱することからなる組換えウイ
    ルスによるカイコの感染率を増加させる飼料の製造方
    法。
  2. 【請求項２】 粉体人工飼料をチノパールUNPA-GXを飼
    料中の最終濃度が0.3重量%となるように溶解させた蒸留
    水と混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れて、オー
    トクレーブで加熱する、請求項１記載の組換えウイルス
    によるカイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。
  3. 【請求項３】 オートクレーブによる加熱が、100〜121
    ℃、10〜30分である請求項１または２記載の組換えウイ
    ルスによるカイコの感染率を増加させる飼料の製造方
    法。
  4. 【請求項４】 蚕座上で飼育している大量のカイコに組
    換えウイルスを同時に経口的に接種する方法であって、
    蚕座上で飼育している大量の5齢のカイコに請求項１記
    載の方法により製造した飼料を与え、20〜24時間後に、
    組換えウイルス液を塗布した飼料をのせた網を蚕座にの
    せることにより組換えウイルス液塗布飼料を給餌するこ
    とを含む、方法。
  5. 【請求項５】 さらに、組換えウイルスを食下した網上
    のカイコを網と共に普通飼料上にのせることを含む、請
    求項４記載の大量のカイコに組換えウイルスを同時に経
    口的に接種する方法。
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