WO2003030637A1 - Aliment permettant d'accroitre le taux d'infection virale chez des vers a soie et methode d'inoculation virale effectuee a l'aide dudit aliment - Google Patents
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- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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- A23K40/20—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by moulding, e.g. making cakes or briquettes
Definitions
- the present invention relates to a method for producing a feed that enhances the infection rate of silkworms against viruses, and an efficient virus inoculation method using the feed.
- the conventional method for producing a genetically modified useful substance using silkworms has a major problem.
- a method of injecting the virus into each silkworm, and a method of inoculating the virus orally by treating the silkworm immediately after the age of 5 at a low temperature of 5 ° C for 24 hours The method was taken.
- the former method requires a lot of power at once.
- the silkworm could not be inoculated with the recombinant virus, and it was necessary to do so without damaging the various organs in the silkworm body, which required skill and was troublesome.
- the present invention makes it possible to produce a feed that can efficiently inoculate a large amount of silkworm without requiring labor and that can increase the infection rate of the virus to the silkworm, which can significantly reduce the number of workers.
- a method and a method for infecting silkworms using the feed with a recombinant virus are provided.
- the inventors of the present invention mixed silkworm artificial feed with water containing one type of fluorescent whitening agent, stirred and ground the mixture, and fed the silkworm to feed the feed heated in an autoclave. Then, the present inventors have found that a large amount of silkworms can be infected with the virus at a time without trouble by feeding the animal with a virus-containing feed, thereby completing the present invention.
- the present invention is as follows.
- the artificial powdered feed is Tinopearl UNPA-GX, and the final concentration in the feed is 0.2 to 0.4 weight. /.
- a method for producing a feed that increases the infection rate of a silkworm by a recombinant virus comprising mixing with distilled water dissolved in such a manner as to obtain a mixture, stirring and grinding the mixture, placing the mixture in a heat-resistant plastic bag, and heating in an autoclave.
- This is a method of inoculating a large amount of silkworms reared on Silkworms with the recombinant virus at the same time orally. It is produced by the method of (1) to a large number of 5-year-old silkworms reared on Silkworms. Feeding the feed with the recombinant virus solution, and feeding the feed with the recombinant virus solution by placing a net on which the feed coated with the recombinant virus solution is placed on silkworms 20 to 24 hours later. (5)
- the large amount of silkworms of (4) are orally inoculated with the recombinant virus orally simultaneously, including placing the silkworm on the net that has eaten the recombinant virus on the common feed together with the net.
- Silkworm, virus and artificial feed for silkworm used in the present invention
- the silkworm used in the present invention is not particularly limited, and generally used varieties can be used.
- Japanese silkworm 137 X 146, Akiko X Ryuhaku, Kinshu X Xinhe, Fuyo X Tokai, etc. are preferably used.
- the silkworm is preferably a 5th-instar silkworm, particularly a 1st-day silkworm.
- feed can be used as a feed that serves as a feed for increasing the infection rate of the virus of the present invention to silkworms.
- silk mate registered trademark, manufactured by Nippon Nosan Kogyo Co., Ltd.
- the artificial feed is preferably in the form of powder, but pelletized feed may be used after being crushed. Mix the powdered artificial feed with distilled water containing Tinopearl UNPA-GX to a final concentration of 0.2 to 0.4% by weight in the feed, and thoroughly agitate and polish.
- an artificial feed containing the tinopearl of the present invention and increasing the virus infection rate to silkworms can be obtained.
- the material of the heat-resistant plastic bag used here is not limited, but for example, polyethylene terephthalate (PET), high-density polyethylene (HDPE, MDPE), unstretched polypropylene (CPP) and the like are used.
- the amount of virus administered to silkworms depends on the type of recombinant virus used and the type of useful proteins to be produced. For example, when using silkworm nucleopolyhedrovirus (BmNPV), nuclear polyhedrosis is used. A 0.1% solution of the centrifugal supernatant of the silkworm body fluid may be applied to the feed and eaten for several hours.
- BmNPV silkworm nucleopolyhedrovirus
- a 0.1% solution of the centrifugal supernatant of the silkworm body fluid may be applied to the feed and eaten for several hours.
- Examples of the recombinant virus used in the present invention include those obtained by incorporating a useful protein of interest into the structural gene portion of the polyhedron disease protein of the silkworm nuclear polyhedrosis virus DNA (BmNPV DNA).
- Can be Preparation of the recombinant virus can be performed according to a conventional method. For example, a polyhedrin disease protein expression promoter (plasmid) of the silkworm nucleopolyhedrovirus is prepared, and a useful protein of interest is downstream of this promoter. Prepare the transfer vector by incorporating the gene to be transferred.
- silkworm-established cells are transfected with the transfer vector and the previously cloned silkworm nucleopolyhedrovirus, and the transformed recombinant virus is also cultured and propagated in the silkworm-established cells.
- the cells may be lysed to obtain a recombinant virus.
- ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the virus inoculation and breeding method of the silkworm of this invention, a large amount of silkworms can be efficiently raised at a time, and a virus inoculation can be performed.
- the number of silkworms can be increased or decreased as needed, but it can be raised from several thousand to tens of thousands at a time.
- a large amount of silkworms are placed on silkworm foil (silkworm) and bred with appropriate temperature and humidity adjustment, and the silkworm on silkworm foil is fed with the above-mentioned artificial feed containing tinopearl.
- the amount of artificial feed is desirably an amount that allows the silkworm to completely eat in 20 to 24 hours, for example, 1,000 g per 1,000 fifth-instar silkworms.
- the amount of feed at this time c of feeding the virus was applied diet silkworms beat eating a Tinopal-containing artificial diet are several hours silkworm, desirable amount capable food under example 6 hours, the amount is, for example, It weighs about 600 g per 1,000 fifth-instar silkworms.
- the feed be placed on a net through which the silkworm can pass, and put on the whole silkworm on which the silkworm is raised. By doing so, it is not necessary to transfer the silkworm, and the silkworm that has eaten the virus-coated feed is on the net, so that a large amount of the silkworm can be moved with the net at once.
- the silkworms fed the virus-coated feed are placed on a silkworm foil on which several days' worth of feed is placed together with the net, and reared.
- a stable target protein can be obtained in a certain number of days.
- the silkworm keratopolyhedrovirus when used as a recombinant virus and bred at a constant temperature of about 25 ° C, the infected silkworm larvae will become nucleopolyhedropathic (pus disease) 5 days after administration. ) Presents unique symptoms and the production of useful substances progresses.
- Recovery of target protein produced in the silkworm body 'Isolation involves collecting silkworm body fluids 4 to 6 days after infection, when the target protein is accumulated most in the silkworm body, and performing various methods such as centrifugation and column chromatography. By means of separation It can be obtained by obtaining and purifying useful proteins. Another method is to crush the silkworm, extract it with an SDS aqueous solution, urea aqueous solution, alkaline aqueous solution, acidic aqueous solution, etc., and then separate and collect useful proteins by a conventional method. .
- a useful protein is obtained by suspending a crushed silkworm in a phosphate buffer, sonicating, and adding a substance that specifically binds to the protein, such as blood cells, etc. Can be mentioned.
- Figure 1 shows a method of inoculating a large amount of silkworms orally with a virus using a tinopearl-containing feed and raising them.
- Fig. 1A shows a 5th-instar, 1st-day silkworm and feed for increasing the infection rate on silkworm foil.
- Fig. 1B is a diagram showing a state in which a net with a virus-coated feed is placed on a silkworm after eating a feed that increases the infection rate.
- FIG. 1C is a diagram showing a state in which a virus-coated feed is consumed.
- Fig. 1D shows the silkworm, which has eaten the virus and is on the net, placed on the feed for 4 days on the silkworm foil together with the net.
- Example 1 Production of feed for increasing the virus infection rate in silkworm Artificial feed of powder (commercially available Silkmate (registered trademark), manufactured by Nippon Agricultural Industries)
- Feeding frequency after BmNPV inoculation 1 time As shown in the table, all silkworms in the test plot were infected with BmNPV.
- silkworms fed with the artificial feed containing the tinopearl of the present invention before virus infection are susceptible to virus infection, and the method of the present invention makes it possible to efficiently treat large amounts of silkworms at once. Can be infected with viruses.
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Description
明細書 カイコへのウィルスの感染率を高める飼料および該飼料を用いたウイ ルス接種方法 技 分野
本発明は、 カイコのウィルスに対する感染率を高める飼料の製造方法 および該飼料を用いた効率的なウィルス接種方法に関する。 背景技術
近年、 遺伝子組換え技術を利用して、 カイコで有用タンパク質を生産 する技術が実用化されている。 例えば、 カイコ核多角体病ウィルスをべ クタ一と して利用する方法がある （特開昭 6 1 — 9 2 8 8号、 同 6 2— 2 0 8 2 7 6号等）。 これらの方法は、 カイコ核多角体病ウィルスの有す る多角体病遺伝子をィンターフニ口ン等の他の有用物質をコードする遺 云子に置き換えて組換えウィルスを調製し、 これを 5齢カイコに接種し て感染させ、 4〜 8 日後に組換え体ウィルスが増殖の過程でカイコ細胞 中で産生し、 体液中に分泌した有用物質を採取、 分離、 精製するという ものである。
このようなカイコを利用した遺伝子組換えの技術は、 宿主となるカイ コが、 従来用いられている大腸菌や酵母と比べて遺伝的に人間に近いも のであるため、 産生有用物質の活性や抗原性の点等から好ましい。 発明の開示
しかしながら、 従来のカイコを利用する遺伝子組換え有用物質産生方 法には大きな問題があった。 すなわち、 従来法において組換えウィルス をカイコに接種しよう とする場合、 ウィルスをカイコ 1頭毎に注射する 方法と、 5齢直後のカイコを 5°Cで 24時間低温処理してウィルスを経口 接種する方法が採られていた。 しかし、 前者の方法では一度に大量の力
ィコに組換えウィルスを接種することはできず、 また、 カイコ体内の各 種臓器に傷をつけないように行う必要があるため熟練が必要で、 手間も かかっていた。 さ らに、 後者の方法では、 カイコを低温室に移したり、 低温室から出したりする必要があり、 やはり手間がかかっており、 大量 のカイコへの糸且換えウィルスの接種には必ずしも適していなかった。 本発明は、 大量のカイコを労力を要しないで効率よく接種することが でき、 しかも作業者の人数を大幅に減少することができるカイコへのゥ ィルスの感染率を高めることのできる飼料の製造方法および該飼料を用 いたカイコに組換えウィルスを感染させる方法を提供する。
本発明者らは、 鋭意検討の結果、 カイ コの人工飼料を蛍光増白剤の 1 種を含んだ水と混合して攪拌磨砕し、 ォー トクレーブで加熱した飼料を カイコに摂食させ、 次いでウィルスを混ぜた飼料を摂食させることによ り手間をかけずに一度に大量のカイコにウィルスを感染させることがで きることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) 粉体人工飼料をチノパール UNPA- GX を飼料中の最終濃度が 0. 2 〜0. 4重量。/。となるように溶解させた蒸留水と混合し、 攪拌磨砕し、 耐熱 性ポリ袋に入れて、 ォートクレーブで加熱することからなる組換えウイ ルスによるカイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。
( 2 ) 粉体人工飼料をチノパール UNPA- GX を飼料中の最終濃度が 0. 3 重量。/。となるよ うに溶解させた蒸留水と混合し、 攪拌磨砕し、 耐熱性ポリ 袋に入れて、 オートク レープで加熱する、 （ 1 ) の組換えウィルスによる カイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。
( 3 ) オートクレーブによる加熱が、 100〜121° ( 、 10〜30分である（ 1 ) または （ 2 ) の組換えウィルスによ るカイ コの感染率を増加させる飼料 の製造方法。 （ 4 ) 蚕座上で飼育している大量のカイコに組換えウィル スを同時に経口的に接種する方法であって、 蚕座上で飼育している大量 の 5齢のカイコに （ 1 ) の方法により製造した飼料を与え、 20〜24時間 後に、 組換えウィルス液を塗布した飼料をのせた網を蚕座にのせること により組換えウィルス液塗布飼料を給餌することを含む、 方法。
( 5 ) さ らに、 組換えウィルスを食下した網上のカイコを網と共に普 通飼料上にのせることを含む、 （ 4 ) の大量のカイコに組換えウィルスを 同時に経口的に接種する方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 本発明に用いるカイ コ、 ウィルスおよびカイコ用人工飼料
本発明において用いられるカイコについては特に制限はなく、 一般に 普及している品種を用いることができ、 例えば日 137 号 X支 146号、 秋 光 X竜白、錦秋 X鐘和、芙蓉 X東海などの交雑品種が好適に用いられる。 また、 カイコは 5齢のもの、 特に 5齢 1 日 目のものが好ましい。
本発明のウィルスのカイ コへの感染率を高める飼料のベース となる飼 料と しては、 市販の人工飼料を用いることができ、 例えばシルクメー ト (登録商標、 日本農産工業社製） を用いるこ とができる。 人工飼料は、 粉末のものが望ま しいが、 ペレツ ト状の飼料を粉砕して用いてもよい。 粉末状の人工飼料をチノパール UNPA- GXを飼料中の最終濃度が 0. 2〜0. 4 重量％となるよ う に含んだ蒸留水と混合し、 十分に攪拌磨枠する。 その 後耐熱性ポリ袋に入れ、 オー トク レーブを用いて処理することによ り本 発明のチノパールを含有し、 カイ コへのウイルス感染率を高める人工飼 料を得ることができる。 ここで用いる耐熱性ポリ袋の素材は限定されな いが、 例えばポ リ エチレンテ レフタ レー ト ( PET) , 高密度ポリ エチレン ( HDPE、 MDPE)、 無延伸ポリ プロ ピレン （CPP) 等が用いられる。
カイコに投与するウィルス量は、 使用する組換えウィルスの種類、 産 生させるべき有用タンパク質の種類によ り変わるが、 例えばカイコ核多 角体病ウィルス （BmNPV) を用いる場合は、 核多角体病蚕体液の遠心上清 の 0. 1%液を飼料に塗布して、 数時間食下させればよい。
本発明において、 用いられる組換えウィルスの例と しては、 カイ コ核 多角体病ウィルス DNA (BmNPV DNA)の多角体病蛋白構造遺伝子部分に、 目 的とする有用タンパク質を組み込んだものが挙げられる。 組換えウィル スの調製は常法にしたがって行なう ことができる。 例えば、 カイ コ核多 角体病ウィルスの多角体病タンパク質発現プロモーター （プラスミ ド） を調製し、 このプ口モーターの下流に目的とする有用タンパク質をコ一
ドする遺伝子を組み込み、 トランスファーべクターを調製する。次いで、 この ト ランスファーベクターと予めクローン化してあるカイコ核多角体 病ウィルス とでカイコ樹立細胞をコ · ト ランスフエク トさせ、 形質転換 された組換えウィルスを同じくカイコ樹立細胞中で培養増殖し、 その細 胞を破壌して組換えウィルスを取得すれば良い。
2 . カイコへのウィルス接種おょぴ飼育方法
本発明のカイコへのウィルス接種おょぴ飼育方法によれば、 効率的に 一度に大量のカイコを飼育し、 ウィルス接種を行うことができる。 カイ コの数は、 必要に応じて増減することができるが、 一度に数千頭から数 万頭程度飼育することができる。
大量のカイコを、 蚕箔 （蚕座） 等に載せて温度および湿度を適度に調 節して飼育し、 蚕箔上のカイコに上述のチノパール含有人工飼料を給餌 する。 この際、 人工飼料の量は蚕が 20〜24時間で完全に食下できる量、 例えば 5齢カイコ 1， 000頭当たり 1， 00gが望ましい。 次いで、 ウィルス を塗布した飼料をチノパール含有人工飼料を食下したカイコに給餌する c この際の飼料の量は、 カイコが数時間、 例えば 6時間で食下できる量が 望ましく、その量は例えば、 5齢カイコ 1， 000頭当たり約 600 gである。 給餌はカイコが通過可能な網の上に載せてカイコを飼育している蚕箔に 網ごと載せるのが好ましい。 このよ う にすることによ り、 カイコを移す 手間が省け、 またウィルス塗布飼料を食下したカイコが網の上に載って いるので、 大量のカイコを一度に網ごと移動させることができる。 その 後、 ウィルス塗布飼料を食下したカイコを網ごと、 数日分の飼料を載せ た蚕箔上に載せて、 飼育する。 一定の飼育日数で安定した目的のタンパ ク質を得ることができる。 例えば、 組換えウィルスと してカイコ角多角 体病ウィルスを使用し、 約 25°Cの一定の温度で飼育した場合、 感染した カイコ幼虫は投与後 5 日目には核多角体病 （膿病） 特有の病徴を呈し、 有用物質の産生が進行する。
カイコ体中で産生された目的タンパク質の回収 '分離は、 カイコ体中 に目的タンパクが最も多く蓄積される感染後 4〜6 日 目にカイコ体液を 採取し、 遠心分離、 カラムクロマ トグラフィー等の各種分離手段により
有用タンパク質を取得、 精製することによりできる。 また、 別の手段と しては、 カイコを摺りつぶし、 S D S 水溶液、 尿素水溶液、 アルカ リ性水 溶液、 酸性水溶液等で抽出した後、 常法処理によって有用タンパク質を 分離、 採取する方法が挙げられる。 更に別の手段と しては、 摺りつぶし たカイコをリ ン酸バッファ一等に懸濁させ、 超音波処理したのち血球等 の、 そのタンパク質と特異的に結合する物質を加えて有用タンパク質を 取得する方法を挙げることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 チノパール含有飼料を用いて大量のカイコにウィルスを経口 的に接種し飼育する方法を示す図である。 図 1 A は、 蚕箔上に 5齢 1 日 目のカイコと感染率を高める飼料を載せた様子を示す図である。 図 1 B は、 感染率を高める飼料を食下後にカイコの上にウィルスを塗布した飼 料を載せた網を載せた様子を示す図である。 図 1 C は、 ウィルスを塗布 した飼料を食下した様子を示す図である。 図 1 D は、 ウィルスを食下し 網の上に載っているカイコを網ごと蚕箔上の 4 日分の飼料の上に載せる 様子を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれら の実施例によって限定される ものではない。
〔実施例 1 〕 カイ コへのウィルスの感染率を高める飼料の製造 粉体の人工飼料（市販のシルクメート （登録商標）、 日本農産工業社製）
1000gと蛍光増白剤 （市販のチノパール UNPA-GX (登録商標、 S i gma社製） を飼料中の最終濃度が 0. 3重量％となるように含んだ蒸留水 2700ml を混 合し、 攪拌磨碎し、 耐熱性ポリ袋に入れ、 さらにォ一トク レーブで 20分 間加熱した。 加熱したチノパール含有人工飼料は 4°Cにて保存した。
〔実施例 2〕 カイ コへのウィルス接種
1000頭の 5齢 1 日 目のカイコを蚕箔に載せ、 実施例 1のチノパール含 有飼料一日分を蚕箔上に置きカイコに食下させた （図 l a)。 20〜24時間
後カイ コが食下した後に、 BmNPV液 （核多角体病蚕体液を 0. 1 %となるよ うに蒸留水で希釈したもの） を洗浄瓶を用いて全面に塗布した普通飼料 をカイ コが通過可能な大きさの網目 を有する網の上に置き、 網ごと蚕箔 上のカイコの上に載せた （図 l b)。 カイコが BmNPV塗布飼料を完全に食 下した 6 時間後、 カイコは蚕箔から網の上に移っており （図 l c；)、 網ご と別の蚕箔上に置いた 4 日分の普通飼料の上に載せた （図 l d)。 飼料の 乾燥とカイ コの這い出しを防ぐために蓋をし、 4 日間放置した。 5齢 10 00頭のカイコを BmNPV感染させるために用いた各飼料の量と食下に要し た時間は、 表 1 のとおりであった。
5齢カイコ 1, 000頭を感染させるのに要する飼料
4 日経過後、 各々のカイコから体液を採取し、 BmNPV 感染の有無を調 ベた。 この際、 チノパール含有飼料および BmNPV塗布飼料の代わり に普 通飼料を摂食させたカイコ群を対照群と して同時に飼育した。 表 2に飼 育結果を示す。 表 2
1 , 000頭飼育試験結果
* ： カイコ 20頭の体重
供試カイコ品種 ： 日 137号 X支 146号 5齢
BmNPV接種後の給餌回数 ： 1回 表に示すように、 試験区のカイコでは全数が BmNPVに感染していた。
産業上の利用可能性
実施例に示すように、 本発明のチノパールを含む人工飼料を、 ウィル ス感染前に給餌したカイコはウィルスに感染しやすく なつており、 本発 明の方法により、 一度に大量のカイコに効率的にウィルスを感染させる ことができる。
本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書 に取り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想 および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更 が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこ のよ うな変形および変更をも包含することを意図している。
Claims
1 . 粉体人工飼料をチノパール UNPA- GXを飼料中の最終濃度が 0. 2〜0. 4重量/。となるように溶解させた蒸留水と混合し、 攪拌磨砕し、 耐熱性ポ リ袋に入れて、 ォートクレーブで加熱することからなる組換えウィルス によるカイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。
2 . 粉体人工飼料をチノパール UNPA- GXを飼料中の最終濃度が 0. 3重 量％となるよ うに溶解させた蒸留水と混合し、 攪拌磨砕し、 耐熱性ポリ袋 に入れて、 オートクレープで加熱する、 請求項 1記載の組換えウィルス によるカイコの感染率を増加させる飼料の製造方法。
3 . オートクレーブによる加熱が、 100〜121。C、 10〜30分である請求 項 1または 2記載の組換えウィルスによるカイコの感染率を増加させる 飼料の製造方法。
4 . 蚕座上で飼育している大量のカイコに組換えウィルスを同時に経 口的に接種する方法であって、 蚕座上で飼育している大量の 5齢のカイ コに請求項 1記載の方法により製造した飼料を与え、 20〜24 時間後に、 組換えウィルス液を塗布した飼料をのせた網を蚕座にのせることにより 組換えウィルス液塗布飼料を給餌することを含む、 方法。
5 . さらに、 組換えウィルスを食下した網上のカイコを網と共に普通 飼料上にのせることを含む、 請求項 4記載の大量のカイコに組換えウイ ルスを同時に経口的に接種する方法。
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