CN1595158A - 用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括蛋白芯片、反应液和洗涤液，其中蛋白芯片由固相载体和固定在该载体上的与ToRCH相关蛋白组成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相载体选自经硅烷化处理的载玻片或有机聚合物材料；所述的与ToRCH相关蛋白包括：CMV特异性抗原，HSVI、II型特异性抗原、RV特异性抗原和TOX特异性抗原，各抗原点样体积为1－100nl，点样浓度为1＊10^－6一100mg/ml；在蛋白芯片上还点有阴性对照和一系列已知浓度的内参照IgG，IgM，阴性对照为兔肌球蛋白、肌动蛋白或胶原蛋白。本发明试剂盒是一种灵敏、准确、迅速的孕妇血样检测的试剂盒。

Description

用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法。

背景技术

ToRCH是四种人类致病微生物英文名称字头的组合包括：弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)以及单纯疱疹病毒(HSV)I和II型。它们是四种最可能导致畸胎的传染病的病原体。

巨细胞病毒属疱疹病毒群，其传染源是患者和无症状的隐性感染者。若孕妇感染单纯疱疹易引起流产、死胎，后期感染主要引起小儿头畸形、智力发育障碍，亦有报道可引起先天性心脏病、脐疝、足畸形和肝脾肿大等。

单纯疱疹是由单纯疱疹病毒所致的传染性疾病，根据其抗原性质的不同分为两型：即HSV I和HSV II。若孕妇感染单纯疱疹，妊娠早期可引起死胎、流产、小儿头畸形、小眼畸形、脑内钙化等神经系统畸形，其症状与巨细胞病毒相似。

风疹病毒是传染性最强的致畸因子，亦是致畸作用最明显的一种病毒。风疹病毒诱发先天性畸形除白内障外，还有心脏畸形(动脉导管未闭、心房和心室间隔缺损)、耳聋、青光眼、小眼、小头、智能发育不全和牙釉质缺损等。最近发现风疹病毒还可以引起胎儿生长迟缓，心肌损害。患风疹发生先天性畸形可达40％以上。

弓形虫是专一性的细胞内寄生虫，它破坏人体除红细胞以外的所有有核细胞。若孕妇感染弓形虫，还可通过胎盘感染胎儿，造成早产、死产或胎儿畸形或其它先天性疾病，尤其是造成智力低下，带来严重后果。在我国，每年出生100多万与弓形虫感染有关的畸形儿和先天性残疾儿。

ToRCH患者造成孕妇流产、死胎，勉强出生后有严重的智力障碍，生活不能自理，并伴有复杂的心血管病，需要家人的长期照顾，造成极大的精神及经济负担。我国每年约有1000万个产妇，26000个ToRCH患儿出生，平均每小时就有3个。由于成人ToRCH感染的临床症状不明显，因此一般不易察觉。

世界上许多发达国家已将ToRCH列为孕期常规检查项目，在优生优育方面发挥重要作用。在国内，随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，人们对优生优育的认识逐步提高，许多地区已将ToRCH检测作为孕期常规检查项目。

ToRCH在临床诊断上通常检测的是针对相应病原物感染后人体内产生的IgG或IgM。检出特异性IgM说明患者为近期感染，或潜伏的病毒被激活产生复发感染；检出特异性IgG则为继往感染，已有一定的免疫水平。当患者复发感染时，IgM和IgG都会较快地上升到高滴度，其中IgG上升极其显著(一般可上升4倍以上的水平)，因此临床上若检测出高滴度的IgG，则意味着再次感染。

目前ToRCH感染的实验室诊断常规采用ELISA方法，另外还有PCR、金标等方法。PCR具有灵敏度极高的特点，能直接检测病原体基因；金标法比较操作简单，适合基层单位使用；而ELISA通常检测病原的特异性抗体，灵敏度较高、特异性较强。但以上方法涉及的试剂较多，操作复杂，反应时间长。

生物芯片技术是九十年代中期兴起的一项新兴生物技术，因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，迅速在诸多生物学领域得到应用。生物芯片技术按检测对象分类，主要分为基因芯片和蛋白芯片两类。蛋白芯片通过固定于支持介质上的多种蛋白质构成的微阵列，直接检测特定功能物质(标志性蛋白)。与传统检测方式相比，利用蛋白芯片技术对特殊致病微生物进行检测具有以下优点：1)高通量，同时可进行多人份多指标的检测，也可单独使用；2)高敏感度和特异性；3)操作快速、简便，适用于临床即时检测，只需一个半小时便能完成整个检测反应过程；4)所需样本量少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于利用蛋白芯片技术，同时对巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、风疹病毒(RV)和弓形虫(TOX)进行检测，提供一种灵敏、准确、迅速的孕妇血样检测的试剂盒。

本发明公开的用于同时检测ToRCH指标的试剂盒由蛋白芯片、反应液、洗涤液组成。蛋白芯片由固相载体和固定在该载体上的与ToRCH相关蛋白组成。其中所述的固相载体选自经硅烷化处理的载玻片或有机聚合物材料等；所述的ToRCH相关蛋白包括：CMV特异性抗原，HSV I、II型特异性抗原、RV特异性抗原和TOX特异性抗原；各抗原点样体积为1-100nl，点样浓度为1×10^-6-100mg/ml。

为提高检测的准确度和可靠性，本发明蛋白芯片中还设计了阴性对照和一系列已知浓度的内参照IgG，IgM。其中阴性对照为兔肌球蛋白(myosin)、肌动蛋白或胶原蛋白等。

本发明试剂盒中的反应液为荧光试剂标记的抗人IgG、抗人IgM或荧光试剂标记的抗人IgG和抗人IgM的混合物。该荧光试剂可以为Fluorescein，Rhodamine，Coumarin，CY Dyes和Alexa Dyes，其中优选CY Dyes和Alexa Dyes，与其他荧光试剂相比，上述两种试剂具有更好的光稳定性，高水溶性和高荧光效率。

本发明试剂盒中洗涤液至少含有一种下述浓度的溶液：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。

本发明所述固相载体为经过硅烷化处理的载玻片，特别是经过氨丙基三甲氧基硅烷试剂处理的玻片；有机聚合物材料是指聚苯乙烯等。

本发明所述的硅烷化处理的载玻片通过下述方法制得：

1)载玻片用铬酸洗液浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入10--30％氨水中过夜，蒸馏水洗；

2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的50--95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至3-5，室温处理，乙醇超声清洗，水超声清洗，140--180℃烘干2-24小时；

3)用2-8％戊二醛处理成醛基化；

4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗两次，空气干燥后0.01--5％NaBH₄溶液还原5--30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空气干燥后用待用。

本发明所要解决的另一技术问题是提供上述检测试剂盒的制备方法。

一、蛋白芯片的制备方法

1)用稀释液将蛋白芯片上所要点制的蛋白质稀释到一定浓度；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在固相基质上，点样密度在10-200点/cm²；

HSV II型特异性抗原，RV特异性抗原，TOX特异性抗原的稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；

CMV特异性抗原稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；

HSV I型特异性抗原和标准IgG的稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01--20％聚烯吡酮(PVP)；

标准IgM的稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)；

2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥0.5-24小时；

其中所述的封闭液配方为：70-95％CBS，5-15％小牛血清，1-9％蔗糖；或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN₃的PBS。

为确保产品的质量，蛋白芯片的制备过程应严格控制环境温度和环境湿度。温度应控制在18-28℃，湿度控制在35-70％。

二、反应液的制备

Alexa Dyes标记的抗IgG抗体和Alexa Dyes标记的抗IgM抗体外购，反应液中荧光标记的IgM抗体和荧光标记的IgG抗体的比例为(0-1)∶0.5。

三、洗涤液的制备

至少含有一种下述浓度的溶液：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。

本发明公开的同时检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒和弓形虫所感染的试剂盒具体使用方法包括：

1)将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍；

2)血样用洗涤液按1∶50稀释，吸取200μl加入芯片上；

3)25--37℃振荡反应20--60分钟，弃去液体；

4)加满稀释后的洗涤液，温育振荡2--10分钟，弃去洗涤液。共

洗涤3次；

5)加200μl反应液于芯片上；

6)用扫描仪采集数据，并进行数据分析。

本发明同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒，由于采用了经特殊处理的固相载体和阴性对照，使对四种致畸胎疾病的检测更为准确和灵敏。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

附图说明

图1  蛋白芯片点样示意图

图2  弓形虫病人血样检测结果图

图3  风疹病毒病人血样检测结果图

图4  IgM标准曲线

图5  IgG标准曲线

具体实施方式：

实施例1：硅烷化玻片的制备：

(1)载玻片用铬酸洗液浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入25％氨水中过夜，Milli-Q水洗。

(2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至4.5，室温处理，95％乙醇超声清洗，水超声清洗，160℃烘干4hrs。

(3)用5％戊二醛处理成醛基化。

使用前0.2％SDS和清水各洗两次，空气干燥后1％NaBH₄溶液还原10min，0.2％SDS洗一次，水洗一次，空气干燥后用待用。

实施例2：用于检测ToRCH相关指标蛋白芯片的制备

严格控制生产过程温度25±1℃，湿度控制在55±3％。

(1)用稀释液将蛋白芯片上所要点制的蛋白质稀释到一定浓度；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在固相基质上，点样密度在20点/cm²。点样体积为20nl/点，点样浓度为20mg/l。

(2)点阵排布如下：(点样示意图见图1)

IgG1	IgG1	IgM1	IgM1	HSV I	HSV II
						IgG2	IgG2	IgM2	IgM2	HSV I	HSV II
IgG3	IgG3	IgM3	IgM3	HSV I	HSV II
						IgG4	IgG4	IgM4	IgM4	CMV	RV
IgG5	IgG5	IgM5	IgM5	CMV	RV
						TOX	TOX	TOX	myosin	CMV	RV

HSV II型特异性抗原，RV特异性抗原，TOX特异性抗原，兔肌球蛋白的稀释液的配方为：0.15％KCl，1.4％Na₂HPO₄，0.2％KH₂PO₄，6％NaCl，pH为7.5，0.2％Tween20。

CMV特异性抗原稀释液的配方为：0.15％KCl，1.4％Na₂HPO₄，0.2％KH₂PO₄，6％NaCl，pH为7.5，0.2％Tween20，10％蔗糖。

HSV I型特异性抗原和标准IgG的稀释液的配方为：0.15％KCl，1.4％Na₂HPO₄，0.2％KH₂PO₄，6％NaCl，pH为7.5，0.2％Tween20，0.1-1.0％Tween20，10％聚烯吡酮(PVP)。

标准IgM的稀释液的配方为：0.15％KCl，1.4％Na₂HPO₄，0.2％KH₂PO₄，6％NaCl，pH为7.5，0.2％Tween20，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)。

(3)用封闭液将蛋白芯片封闭处理30分钟，干燥过夜。

其中所述的封闭液配方为：6％BSA，4％蔗糖，0.3％NaN₃的PBS。

实施例3：ToRCH相关指标检测试剂盒的制备方法

1、蛋白芯片的制备同实施例2

2、浓缩洗涤液的制备：按以下配方配制洗涤液：0.3％KCl，1.2％Na₂HPO₄，0.8％KH₂PO₄，11％NaCl，0.6％Tween20，调pH值为7.4。

3、反应液的制备：Alexa Dyes标记的抗IgG抗体和Alexa Dyes标记的抗IgM抗体外购。反应液中荧光标记的抗IgM抗体和荧光标记的抗IgG抗体的比例为1∶1。

实施例4：ToRCH相关指标检测试剂盒的使用方法

用ToRCH相关指标检测试剂盒对弓形虫病人血样、风疹病毒病人血样进行检测

(1)浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍。

(2)血样用洗涤液按1∶50稀释，吸取200μl加入芯片上。

(3)37℃振荡反应30分钟，弃去液体。

(4)加满稀释后的洗涤液，温育振荡5分钟，弃去洗涤液。共洗涤3次。

(5)加200μl反应液于芯片上。

(6)用扫描仪采集数据，并进行数据分析

IgM标准曲线如图4所示，IgG标准曲线如图5所示。检测结果如图2、图3所示。

Claims (5)

1、一种同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒，该试剂盒包括蛋白芯片、反应液和洗涤液，其中蛋白芯片由固相载体和固定在该载体上的与ToRCH相关蛋白组成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相载体选自经硅烷化处理的载玻片或有机聚合物材料；所述的与ToRCH相关蛋白包括：CMV特异性抗原，HSVI、II型特异性抗原、RV特异性抗原和TOX特异性抗原，各抗原点样体积为1-100nl，点样浓度为1×10^-6-100mg/ml；在蛋白芯片上还点有阴性对照和一系列已知浓度的内参照IgG，IgM，阴性对照为兔肌球蛋白、肌动蛋白或胶原蛋白。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其中所述的洗涤液至少含有一种下述浓度的溶液：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其中所述的反应液为荧光试剂标记的抗人IgG、抗人IgM或荧光试剂标记的抗人IgG和抗人IgM的混合物。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其中所述的反应液为比例为(0-1)∶0.5的荧光标记IgM抗体和荧光标记IgG抗体。

5、根据权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于该试剂盒的蛋白芯片制备包括下述步骤：

(1)硅烷化处理的载玻片制备：

1)载玻片用铬酸洗液浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入10-30％氨水中过夜，蒸馏水洗；

2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的50-95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至3-5，室温处理，乙醇超声清洗，水超声清洗，140-180℃烘干2-24小时；

3)用2-8％戊二醛处理成醛基化；

4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗两次，空气干燥后0.01-5％NaBH₄溶液还原5-30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空气干燥后用待用；

(2)蛋白芯片的制备方法：

1)用稀释液将蛋白芯片上所要点制的蛋白质稀释到一定浓度；用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在步骤(1)制得的硅烷化处理的载玻片，点样密度在10-200点/cm²；

HSVII型特异性抗原，RV特异性抗原，TOX特异性抗原的稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；

CMV特异性抗原稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；

HSVI型特异性抗原和标准IgG的稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-20％聚烯吡酮；

标准IgM的稀释液的配方包括：0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na₂HPO₄，0.01-1.0％KH₂PO₄，0.01-20.0％NaCl，pH为7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二烷基硫酸钠；

2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果，干燥0.5-24小时；

其中所述的封闭液配方为：70-95％CBS，5-15％小牛血清，1-9％蔗糖；或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN₃的PBS。

3)制备时控制环境温度在18-28℃，湿度控制在35-70％。

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