CN1592720A - 金属结合蛋白及相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了金属结合蛋白，相关组合物及其制备方法和用途。金属结合蛋白包含相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白及其保守性氨基酸替代的氨基酸。本发明还提供了编码金属结合蛋白的相关核酸序列。

Description

金属结合蛋白及相关方法
                         发明背景
1.发明领域
本发明一般地涉及对重金属具有高结合亲和力的独特的金属结合蛋白。更特别地，本发明涉及包含独特金属结合蛋白的组合物以及相关的制备方法和在需要减低或回收重金属中的用途。
2.发明背景
由于金属污染物的毒性和对人类健康的潜在危险以及稀有重金属的经济价值，因此金属回收和金属治理(remediation)以及对有效而安全地清理金属废弃物方法的相关需要是一个持久的环境和商业问题。由于农业、工业及其它商业行为持续地排放有毒废弃物如重金属，这就增加了对有效、安全而低成本金属治理方法的需求。根据最近美国EPA的报道，金属污染物仍然是且在历史上都是众多污染地点的关键性问题(USEPA Work Assignment，#011059，1997年3月5日，条约#68-W5-0055)。另外，已有大量报道指出来自污染土壤和废弃物中的金属毒害导致对野生动植物、家畜、植物以及人类健康的损害(铅污染的土壤对公众健康的影响，Xintaras，C，1992年5月，网址：http：//www.atsdr.cdc.gov)。例如，对人类来说最主要的就是由铅(Pb)污染造成的健康危险。暴露于铅中可以发生在很多种情况下，例如从食物、水、土壤中摄取铅或甚至是吸入尘埃。铅中毒非常危险而且有可能导致死亡，其症状包括颠痫发作、精神障碍和行为异常。因此，金属治理方法在保护我们的环境以及防御疾病的方面都具有极大的价值。
从多种废弃物、遗弃物中回收金属以及金属回收再利用提供了巨大的经济价值而且增强了对环境污染的控制。可以从无数的各种资源如废弃的电子装置(晶体管、集成电路芯片、变压器、母线、阴极管和微处理器、计算机组装电路PCB板、主板)中回收金属。在没有进行金属回收的情况下，对工业废弃物的处理危险而相关花费巨大。因此，金属回收再利用或从废弃的或遗弃的包含金属的物质中所提取金属的再利用不仅降低了需要特别处置和处理的金属废弃物的量和费用，而且回收的金属还可以再次出售或再利用而产生附加经济价值。
现有技术中通常采用传统清除技术来处理金属污染，所述传统清除技术包括首先物理去除，然后处理污染的物质。这些方法不仅是劳动量大和效率低下，而且会带来与去除和处理大量或大体积污染废弃物相关的高昂费用。金属污染特别难于治理，这是因为其与其它类废弃物如化学或有机物质不同，金属不能直接破坏或转化。例如，现在用于治理金属污染土壤的技术主要包含采用物理或化学分离金属污染物的垃圾掩埋或土壤挖掘。污染的地下水的处理通常包括抽水冲洗、过滤或化学提取来去除污染金属。结果，治理土壤或地下水的成本高昂，每一地点的五年成本预算为几亿至几十亿美元(美国，EPA，1993年)。
另外，重金属污染对人类和环境的危害不仅限于土壤和地下水，还包括其它来源如工业废弃物、泥污废弃物、污水、放射性核素(如来自研究和医疗废弃物)和矿采废弃物。根据要去除的金属污染物的物理和化学形式，以及对特定治理方法的成本效益分析，能较好适用于特定地点的现有技术也是多种多样的。但是由于传统清除技术成本高昂，这就仍然非常需要低费用、安全而有效地回收和清除重金属的技术。
现在有一些技术能用于回收和治理重金属污染废弃物。通常，这些技术要联合一种或多种下述的一般方法：从废弃物中分离、固定、减毒、物理分离或提取金属污染物。分离技术使用遏制策略(containment strategy)而试图阻止污染地点或区域有毒金属废弃物的进一步扩散。固定技术降低了金属污染物的迁移，该技术包括的系统能提供从顶部土壤层分离下面的土壤层(包含金属污染物)的非透过性载体。还要使用物理载体，该载体限制未污染的地下水流经污染地点。另外，还包括减毒步骤，该步骤通常使用化学或生物技术来降低重金属污染物的毒性和迁移。减毒步骤中包括生物处理技术，该技术应用了较新的生物技术方法。
金属治理是生物处理方法一个相对新的应用，包括很多方法如生物蓄积、植物治理、植物提取和根过滤。所有这些生物处理方法都使用特定植物和微生物通过或吸附、吸收、或浓缩污染金属离子来治理金属。例如，在生物蓄积中，植物或微生物主动从污染的外界环境中吸收和蓄积金属。
在植物治理中要使用特定植物，该植物被赋予了从土壤中选择性去除金属的能力。所述植物包括特定的“超富集植物(hyperaccumulator)”品种如alpine pennycrass植物，该植物能在出现毒性症状前蓄积超过大多数植物260倍的金属。但是，大多数蓄积植物生长非常缓慢且需要特殊的生长条件。所需的部分生长条件使得这些植物不能用于需要回收或治理金属的地点或环境。而且，已知的植物品种非常少或者很少能用于回收或治理的用途。因此，由于环境或污染地点存在持续而高发生率的金属污染(～75％的美国超级基金(Superfund)地点包含污染形式的金属离子，美国，EPA，1996年)，故仍然需要更有效地从污染源中去除重金属的方法和技术。
近来，为达到这样的要求，生物技术方法已被用作金属回收和治理的替代策略。这些生物技术方法中包括使用烟草植物，该烟草植物经处理而能表达金属硫因(metallothionein)基因(Maiti等，1991)。金属硫因(MTs)是普遍分布于整个动物界的小的金属结合蛋白。它们具有高度金属结合亲和力而且被认为在控制细胞内游离金属离子水平上发挥重要作用。但是，对它们的功能或生物学目标仍然所知甚少。MTs最早于1957年从马组织中发现。自此，从真菌和贝类直至鼠和人这些物种中都已经鉴定出了MTs。
MTs的结构特点包括高半胱氨酸组分和缺少芳香族氨基酸。所述半胱氨酸残基是造成蛋白对金属离子高亲和性结合能力的原因。现有技术中的MTs一般都具有高度的氨基酸序列相似性。但是，蛋白或编码现有技术中蛋白的已知基因序列基本上只用在研究方法中或疾病治疗方法学中。
因此，本发明的一个目的为提供新金属结合蛋白及其相关制备方法。这一技术将能从环境废弃物及其它被重金属污染的物质中有效地、低成本地、安全而简单地去除重金属。
                     发明概述
现有技术中的金属硫因(MT)蛋白的大小一般为约60～68个氨基酸残基，其在不同物种间具有高度的序列保守性。尽管该高度序列保守性及相似性在很大程度上使得这些MT基因易于被发现，但本发明的新金属结合蛋白在序列上非常不同，因此获得它会更加困难而且需要更大的毅力。
与现有技术中已知的MTs不同，源自咸水虾(卤虫(Artemia))的MTs要更小(约48个氨基酸残基)而且其具有确切的独特氨基酸和DNA序列。由于这些在序列上与现有技术中的MTs的差异，在本发明前，要获得本发明的新金属结合蛋白是非常困难的，而且编码这些新金属结合蛋白的核酸序列也是未知的。本发明的新金属结合蛋白具有高的金属结合能力并能进行高亲和性金属结合。这使得它们特别适合用于控制污染、金属循环再利用、金属采矿以及其它金属回收和金属治理的技术中。
本发明的组合物和方法可以实现这些以及其它目的，本发明提供了能有效而可靠地从多种来源中分离重金属的方法。本发明的新金属结合蛋白可以很容易地表达和制备而实现如下目的，如金属治理，金属循环再利用、金属采矿或其它类型的需要结合一种或多种重金属的方法。
根据本发明的教导，提供了新的金属结合蛋白。本发明包括至少一种基本上纯的金属结合蛋白，所述蛋白具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列。基本上纯的金属结合蛋白可包括氨基酸序列如：
MET ASP CYS CYS LYS ASP GLY CYS THR CYS ALA PRO ASP CYS LYS CYS
ALA LYS ASP CYS LYS CYS CYS LYS GLY CYS GLU CYS LYS SER ASP PRO
GLU CYS LYS CYS GLU LYS ASP CYS SER CYS ASP SER CYS GLY CYS HIS
STOP[SEQ ID NO：2]；MET ASP CYS CYS LYS ASP GLY CYS THR CYS ALA PRO
ASP CYS LYS CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS[SEQ ID NO：4]；
和SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中掺入一个或多个保守性氨基酸替代的序列。需要指出的是，虽然本发明将在文中论述金属回收和金属治理，但本发明可很容易地用于其它很多需要去除、回收或简单结合重金属的用途
本发明的金属结合蛋白还包含具有多种异构形式的金属结合蛋白家族。相应地，金属结合蛋白家族包括金属结合蛋白的至少五种异构体形式。这些金属结合蛋白异构体中的任一和全部都适用于去除或回收重金属的用途。本发明的“异构体”具有必要的结构特点从而可将其归类为金属结合蛋白。这些特点包括它们的能提供其金属结合能力的高半胱氨酸含量。因此，本发明的金属结合蛋白(包括其异构形式)可以表达和很容易地制备而实现如下目的，如金属治理，金属循环再利用、金属采矿或其它类型与结合金属有关的方法。
本发明的新金属结合蛋白还具有能增强其在本发明的方法中用途的特征，且该特征能将其与现有技术区分开。这些优势特征还使得新金属结合蛋白及相关方法特别适用于种类繁多的金属回收和金属治理装置(settings)中。例如，金属结合蛋白能够在一定条件范围内例如在中度以下至高温条件下结合重金属。从约4℃～约100℃存在金属结合活性。根据实施本发明的金属结合蛋白的特定应用或操作，可优选一个特定温度范围。因此，根据本发明，适用的温度为约4℃～约100℃。这一温度条件范围与某些现有技术中的方法是不相容的，这使得我们的基本上纯化的金属结合蛋白在金属回收、金属治理或其他需要结合重金属的方法中更加通用而且更加适用。另外，本发明的金属结合蛋白能够在多种化学条件下结合金属。例如，从约pH4～约pH10.0都能表现出金属结合活性。结合的金属离子可通过降低pH至约1.0而从本发明的金属结合蛋白上分离或除去。一种示例性方法包括在存在还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)的条件下，缓慢增加pH至约7.0。这能够恢复金属结合蛋白金属结合活性，因此如有需要金属结合蛋白可以再次使用。
进一步根据本发明的教导，提供了编码金属结合蛋白的分离的核酸。这些分离的核酸编码具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列的金属结合蛋白。本发明的分离的核酸可包括DNA序列如：
5′-ATG GAC TGC TGC AAG AAC GGT TGC ACC TGT GCC CCA AAT TGC AAA
TGT GCC AAA GAC TGC AAA TGC TGC AAA GGT TGT GAG TGC AAA AGC AAC
CCA GAA TGC AAA TGT GAG AAG AAC TGT TCA TGC AAC TCA TGT GGT TGT
CAC TGA-3′[SEQ ID NO：1].
另外，本发明的分离的核酸可包含足以使功能性金属结合蛋白进行翻译的最小DNA。编码本发明的功能性金属结合蛋白的DNA序列不需要包含全长天然金属结合蛋白基因序列，而可以是那些编码能够使得结合重金属的SEQ ID NO：1的部分或区域。例如，本发明可包括含有如下序列的DNA序列：
5′-ATG GAC TGC TGC AAG AAC GGT TGC ACC TGT GCC CCA AAT TGC AAA
TGT GCC AAA GAC TGC AAA TGC-3′[SEQ ID NO：3].
此外，本发明还包括这样的DNA，其与具有SEQ ID NO：1的序列的DNA分子或具有SEQ ID NO：1的1-66位核苷酸残基的序列的DNA分子具有至少80％或更高的序列一致性。
本发明的分离的核酸还包括编码被公开的金属结合蛋白异构体或变体(alternative forms)中任一或全部的核酸。另外，本发明的分离的核酸无需包含MT异构体的全长编码序列，而可以只包含编码一种编码序列的结构域或部分的核酸序列，所述编码序列编码MT异构体，例如本发明的金属结合蛋白异构体的功能性或金属结合区域。
进一步根据本发明的教导，新金属结合蛋白可被用作单独(naked)组合物或与支持物、基质或其它传递系统联合以便在本文公开的金属回收、金属治理或金属结合的过程中辅助金属结合蛋白的分布、处理、包装或发挥功能。因此，本发明的任何金属结合蛋白可结合在支持物上，如膜或滤器，包含金属的流体通过这些支持物而得以接触。
本发明特别适用于金属回收、金属治理或金属循环再利用的过程和方法。这些方法包括将本发明的具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列的金属结合蛋白与具有一定浓度至少一种重金属的基质或材料相接触，以便使金属与金属结合蛋白结合，随后从基质或材料中分离出结合的金属，
例如，本发明方法可处理任何具有一定浓度至少一种重金属的物质。本领域技术人员会意识到，所述包含重金属的物质可以是含有一定浓度的金属的任何环境或工业材料如地下水、饮用水、污染的土壤、废弃物等。相似地，本发明的方法同样适用于处理包含欲去除金属的工业或城市废弃物。这一广阔的用途使得本发明的组合物及相关方法特别适用于种类繁多的情况中。
进一步根据本发明的新教导，提供了制备本发明的新金属结合蛋白的表达系统。这些用被公开的表达系统制备的新金属结合蛋白包括具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列的金属结合蛋白，如前述。这些表达系统包括能制备或制造可用于大规模商业或工业工厂，以及小规模、地点特异用途的这些组合物的系统。本发明的教导中还包括有生命的或活的制备实体如修饰生物体或宿主细胞的表达系统。它们包括转基因植物、转基因动物和细菌，以及其它经转基因工程处理而能制备本发明的新金属结合蛋白的修饰生物体。
相应地，本发明提供了独特的，相对小的金属结合蛋白，其具有独特的特性和不同于现有技术已知金属结合蛋白的序列。此外，本发明的新金属结合蛋白在多种条件下保留了对重金属的高结合亲和力，这使得它们特别适用于需要从基质中或从任何含有金属的或金属污染的来源中去除或回收重金属的情形。本发明的新金属结合蛋白及相关方法能够有效、低成本而安全地从种类繁多的基质中去除和回收重金属。
下面的“发明详述”提供了对本发明进一步有效的公开，这将使它的附加特征和优点对本领域技术人员来说是显而易见的。
                         附图简述
图1.本发明示例性的金属结合蛋白的洗脱图，显示了用重金属，锌进行金属结合蛋白的共洗脱。
图2.根据本发明教导的包含金属结合蛋白基因序列的示例性克隆盒图。
                         发明详述
已经从很多物种如人、啮齿动物、细菌、蟹、家禽等中分离出已知的金属结合蛋白(MTs)，并且已经知道其具有非常相似的结构特点比如相似的大小(～6.0-6.8kDa)、高氨基酸保守性和蛋白全部氨基酸组分中高百分比的半胱氨酸残基。这些已知的MTs的半胱氨酸组分是蛋白具有对重金属如锌、铜、镉、汞、钴、铅、镍、铂、银和金的高结合亲和力的原因。
本发明的新金属结合蛋白与其它所有已知的MTs显著不同，因为本发明的蛋白具有独特的不同的氨基酸序列和DNA序列。而且，与来自其它物种的已知MTs相比，本发明的蛋白的大小要小很多。尽管有这些差异，本发明的蛋白仍保留了结合金属的活性，而且具有意料不到的亲和力。这一特殊的序列差异还使得本发明的新金属结合蛋白比现有技术中的MTs更难被分离和定性。例如，本发明的新金属结合蛋白特别适用于从工业、城市和环境废弃物中有效而低成本地去除重金属。这些金属结合蛋白用于金属治理的用途在控制污染中具有特别的重要价值而且特别能够从地下水、被污染的土壤、饮用水和任何含重金属污染物的物质中去除重金属。
另外，本发明的新金属结合蛋白还适用于回收金属，特别是稀有金属。例如，本发明的新金属结合蛋白可被用于金属矿采中，来分离和去除稀有金属如金、铂和银。这样就可以减少从矿石中纯化金属最终阶段中使用有毒金属如汞的需求。这些相同的新技术可被用于从工业或城市废弃物中回收所述金属。由于一次性和其它电子设备的使用增加，所述废弃物源中所述重金属的量也在增加，这使得回收成为一种有价值的行为。
另一方面，由于这些蛋白较小和本文提供的独特的特异性序列信息，本发明的新金属结合蛋白可以很容易而有效地从自然界中分离出来或用本文描述的方法合成，而被用于金属回收、金属采矿、金属循环再利用、金属治理、污染控制或其它任何包含金属分离的用途中。因此，本发明的新金属结合蛋白及相关方法提供了一种用于任何金属结合方面的方法的、通用、便于制备、有效和可靠的资源。
本发明的新金属结合蛋白最初是从咸水虾(卤虫)中分离的。它们是一个金属结合蛋白家族，被称为“异构体”。对这些蛋白独特氨基酸组分的分析显示每个异构体都是基本上等效的。根据本发明的教导已经鉴定了至少五种不同的异构体。与来自其它生物体的具有高度序列同源性或相似性的MTs不同，本发明的新金属结合蛋白具有意料不到的结构特点差异，但彼此之间具有高度的序列同源性。本发明的这些新金属结合蛋白的序列特点差异使得它们难于被分离和定性。
在使用基于现有技术教导和MT序列信息上的传统方法对分离编码咸水虾MT基因进行了大量不成功的尝试之后，下面的技术被用于提供编码本发明的新金属结合蛋白的核酸序列。首先，分离并纯化来自咸水虾(卤虫)的本发明的新金属结合蛋白样品。对该包含金属结合蛋白的样品进行N-端氨基酸序列分析。这一氨基酸序列分析显示了，与马和人的MTs相比，靶咸水虾(卤虫)金属结合蛋白在最初6个半胱氨酸残基的位置是保守的，这提示这些氨基酸残基在蛋白的金属结合功能上的重要性。
使用该N-端氨基酸序列信息，按照现有技术中已知的方法构建与N-端氨基酸序列相应的寡核苷酸引物。这些寡核苷酸引物被用于PCR扩增编码至少一种来自咸水虾(卤虫)的靶金属结合蛋白MT基因序列的潜在候选者。用QiaPrep旋柱(Qiagen公司)纯化PCR产物，并按照用户指南将其克隆到TA克隆载体CR2.1(InVitrogen)中。用该重组载体转化电感受态(electrocompetent)大肠杆菌(来自InVitrogen的Sure Shot细胞)，并将其铺板于包含氨苄青霉素(100μg/ml)和1％葡萄糖的LB琼脂板上。将所述平板置于37℃过夜。挑选单个克隆，将其接种于加入了氨苄青霉素和1％葡萄糖的5ml LB培养基中。培养物于摇动培养器中温育，37℃过夜。按照用户指南用上述QiaPrep旋柱(Qiagen公司)从2ml细胞悬液提取质粒。然后用M13通用正向和反向异物在Li Cor 4200L上进行质粒测序。一经证实和确定其编码金属结合蛋白的序列后，将该咸水虾MT基因亚克隆至细菌表达载体pTMZ中。根据已鉴定的MT编码序列，确定了第一个本发明的新金属结合蛋白的氨基酸序列。图1显示了使用本发明的示例性金属结合蛋白的示例性洗脱图。该图是通过使用下述示例性操作步骤得到的。
用包含pTMZ中MT基因序列[SEQ ID NO：1]的质粒表达载体转化大肠杆菌(ER 2566株)。在包含1％葡萄糖的LB培养基中于37℃培养细菌直至A600为0.60。收集细菌细胞，在包含1％葡萄糖的LB培养基中重悬，然后在相同温度下培养45分钟。加入异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPGT)至终浓度为0.1mM。培养细菌细胞大约16小时。以无转化细菌作为参照物。离心收集细胞，在10mM Tris，pH8.0，5mMDTT和0.5mM PMSR中超声波降解细胞。150,000×g，4℃离心匀浆1小时。收集上清，将其在室温下于含2μCi的109Cd中培养。随后将放射标记的上清过G-50分子分离柱，用50mM Tris洗脱，pH8.0。以5ml为分段收集洗脱液体，并进行放射性活性(CPM)和锌(PPB)实验，锌是与由转化菌表达的内源性金属结合蛋白相关的内源性金属。从柱子洗脱的每一分段洗脱液都用ICPMS(感应耦合等离子源质谱Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy)进行锌实验。按照由本发明教导所提供和公开的内容，也可使用编码功能性金属结合蛋白的DNA序列，如[SEQ ID NO：3]。
因此，本发明提供了基本上纯的金属结合蛋白，该蛋白含有相似于至少一种源自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列。本文使用的术语“基本上纯的”是指核酸、氨基酸或蛋白已从其天然状态取出，离析或分离而至少60％不含、优选75％不含、90％或更高百分比不含在天然状态下与其相关联的其它成分。
根据本发明的教导，基本上纯的金属结合蛋白所含的氨基酸序列相似于：
MET ASP CYS CYS LYS ASP GLY CYS THR CYS ALA PRO ASP CYS LYS
CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS CYS LYS GLY CYS GLU CYS LYS SER
ASP PRO GLU CYS LYS CYS GLU LYS ASP CYS SER CYS ASP SER CYS
GLY CYS HIS STOP[SEQ ID NO：2].
本发明的范围还包括如下基本上纯的金属结合蛋白，即上述SEQID NO：2序列的变体并仍然保持蛋白的金属结合亲和力。特别地，本发明的范围包括以下任一种保守性氨基酸替代：(1)异亮氨酸替代亮氨酸或缬氨酸、亮氨酸替代异亮氨酸、及缬氨酸替代亮氨酸或异亮氨酸的任一种替代；(2)天冬氨酸替代谷氨酸及谷氨酸替代天冬氨酸的任一种替代；(3)谷氨酰胺替代天冬酰胺及天冬酰胺替代谷氨酰胺的任一种替代；(4)丝氨酸替代苏氨酸及苏氨酸替代丝氨酸的任一种替代。
本文使用的“保守性氨基酸替代”是指通过替代具有相似结构或化学特性的氨基酸而改变氨基酸序列。本领域的技术人员可以确定哪些氨基酸残基可被替代，插入或改变而没有本发明的蛋白的金属结合特性。
根据特定氨基酸情况的其它替代同样可被认为是保守性的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可以互换，丙氨酸与缬氨酸(V)同样可以互换。相对疏水的蛋氨酸(M)通常可与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时可与缬氨酸互换。而在主要特性为电荷的氨基酸残基以及这二个氨基酸残基的不同pK和它们的大小差别不大的位点，赖氨酸(K)和精氨酸(R)可以互换。现有技术中已知的其它改变在特殊情况下也可认为是保守性的。
例如，如果蛋白表面的氨基酸并不涉及通过氢键或盐桥与其他分子，如另一种蛋白亚单位或与蛋白结合的配体相互作用，则带负电的氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸可用带正电的氨基酸如赖氨酸或精氨酸进行替代，反之亦然。碱性弱于精氨酸和赖氨酸的且在中性pH时部分带电的组氨酸(H)有时可替代那些碱性更强的氨基酸等。此外，谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺有时可替代它们的羧酸同系物，谷氨酸和天冬氨酸。
本发明的新金属结合蛋白以及其相关制备方法和用途，为具有多种异构形态的金属结合蛋白家族。结果，本发明包括适用于去除或回收重金属的金属结合蛋白的至少五种异构形态。异构体是具有相同化学成分但结构形式不同的两个或多个化合物中的一种。本发明的“异构体”具有必要的结构特点从而可将其归类为金属结合蛋白。这些特点包括它们的能使其具有金属结合能力的高半胱氨酸含量。异构体间的差别在于两个或多个氨基酸残基，这导致不同异构体间不同的pI。该pI的差异使得异构体易于分离和定性。因此，本发明的金属结合蛋白可以很容易而有效的表达和制备。
除了金属结合特性外，本发明的金属结合蛋白还表现出能使其特别适用于多种金属回收和金属治理装置的特性。例如，新金属结合蛋白能够在一定条件范围内例如在适中温度以下至高温条件下结合重金属。所述新金属结合蛋白具有在室温下结合重金属的能力，因此在很多应用中是特别理想的。所述新金属结合蛋白还具有在一较宽温度范围，例如温度为约4℃～约100℃内结合重金属的能力。本领域技术人员将会根据使用金属结合蛋白的特定应用和操作，根据实际操作和经济原因可优选一个特定温度范围。例如，“现场”或在环境污染地点(这要求特定温度范围，其可在可用成本之内获得)使用金属结合蛋白可能会更实用。另一方面，通过在相对高的温度条件下使用本发明的金属结合蛋白可实现在特定基质上更有效的金属提取。因此，根据本发明的教导，实施本发明的适用温度范围包括约4℃～约100℃。这种温度条件范围使得本发明的金属结合蛋白更通用而且更有用。
进一步根据本发明的教导，金属结合蛋白可被用作单独组合物或联合基质或分布方法(dispersal means)以便在金属回收、金属治理或金属结合的过程中辅助金属结合蛋白的分布、处理、包装或操作。所述金属结合蛋白特别适用于金属回收、金属治理或金属结合过程，因为与其它方法学如化学提取(其将使用者暴露于化学物质的毒性或其它类潜在危险中)相比，它们的使用更容易而且安全。
为辅助新金属结合蛋白的操作或分布可以使用多种支持物，包括固体支持物、基质、膜、半透膜、粉末、装置、仪器、脂质、制剂及其它物质。应当指出，还具有可逆的重金属结合能力是新金属结合蛋白的附加特征。例如，使用酸性条件或通过瞬时交换反应或无机螯合剂可将结合的金属从金属结合蛋白上洗脱下来或冲洗掉。例如，在用放射性Cd孵育金属结合蛋白时，109Cd金属与金属结合蛋白结合的外源性金属互换。蛋白在大约pH1.0时释放金属。将溶液的pH提升至大约pH8.0即可以恢复蛋白的金属结合能力。因此，由于新金属结合蛋白可逆的结合特性，本发明还提供了包含可被多次使用，或可被再利用的基本上纯的金属结合蛋白的组合物、制剂、粉末、脂质、装置或仪器。
现在将示例性描述对本发明的新金属结合蛋白的基因工程学操作，鉴定了来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的一个异构体的核酸序列，如前述。一般地，分离过程包括：(1)制备一个或多个包含来自咸水虾(卤虫)的核酸的样品；(2)从卤虫中提取总RNA；(3)从总RNA制备cDNA；(4)扩增金属结合蛋白基因序列；和(5)克隆，测序并鉴定从咸水虾(卤虫)中分离的金属结合蛋白基因(MT)的核酸序列。
用上述方法得到了一种金属结合蛋白基因MT的完整编码序列。该序列为：
5′-ATG GAC TGC TGC AAG AAC GGT TGC ACC TGT GCC CCA AAT TGC AAA
TGT GCC AAA GAC TGC AAA TGC TGC AAA GGT TGT GAG TGC AAA AGC AAC
CCA GAA TGC AAA TGT GAG AAG AAC TGT TCA TGC AAC TCA TGT GGT TGT
CAC TGA-3′[SEQ ID NO：1].
因此，本发明还提供了一种或多种编码基本上纯的金属结合蛋白的核酸序列，所述金属结合蛋白含有相似于至少一种源自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列。所述核酸序列包括SEQ ID NO：1的序列；与SEQ ID NO：1互补的序列；或在严格条件下不超过约15％错配的与SEQ ID NO：1互补的序列。优选地，错配度不超过约5％；最优选地错配度不超过约2％。
另外，分离的核酸可包含能使功能性金属结合蛋白进行有效翻译的最小DNA。功能性金属结合蛋白不需要是全长天然金属结合蛋白，而可以是那些编码能够结合重金属的蛋白的SEQ ID NO：1的部分或区域。因此，本发明还包括分离的核酸，所述核酸包括至少80％相似于具有SEQ ID NO：1的1-66位核苷酸残基序列的DNA分子的DNA。
本发明还包括编码本发明的任一新金属结合蛋白的核酸序列。所述新金属结合蛋白的分子量约为5,800道尔顿且能够高亲和性结合重金属离子如锌、铜、镉、汞、钴、铅、镍、铂、银和金等。新金属结合蛋白此处包括的氨基酸序列选自：SEQ ID NO：2及其一个或多个保守性氨基酸替代的序列，其中保守性氨基酸序列可以是下述中的任一种(1)异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中的任一种替代这些氨基酸中的另一种；(2)天冬氨酸替代谷氨酸，反之亦然；(3)谷氨酰胺替代天冬酰胺，反之亦然；(4)丝氨酸替代苏氨酸，反之亦然。使用标准遗传密码可以确定其它的核酸序列，对于这一序列中每一氨基酸易于确定可选择的密码子。
应当指出的是，本文提供的分离的核酸不但可用于制备和表达新金属结合蛋白，它们还特别适用于分离和鉴定编码本发明的新金属结合蛋白的其它金属结合蛋白基因。例如，使用所述策略、本文提供的示例性方法和核酸序列，可获得编码任一金属结合蛋白异构体的DNA序列。因此，本发明包括编码任一或全部本发明的金属结合蛋白异构体或变体的核酸。另外，分离的核酸无需包含MT异构体的全长编码序列，而只要包含编码MT异构体的编码序列的结构域或部分的核酸序列，如本发明的金属结合蛋白异构体的功能性或金属结合区域。
构建和分离根据本发明的核酸序列可通过本领域众所周知的技术包括固相核苷酸合成、聚合酶链反应(PCR)技术、RNA反转录DNA、使用DNA聚合酶和连接酶及其它技术来实施。在使用编码本发明的金属结合蛋白和部分金属结合蛋白的氨基酸序列时，可根据本领域公知的遗传密码构建相应的核酸序列。
本发明的另一个方法为一种载体，其包含根据本发明的核酸序列且所述序列有效地连接至少一种能够控制核酸序列表达或调节的控制序列。所述控制序列是本领域众所周知的，其包括操纵子、启动子、增强子、启动子近端元件和复制起点。构建载体的技术，包括克隆、连接、缺口填补、使用聚合酶链反应(PCR)技术、固相寡核苷酸合成及其它技术是本领域众所周知的，这里无需进一步描述。本发明的载体特别适用于通过修饰的生物体、宿主细胞或其他类型的表达系统来制备新金属结合蛋白。
因此，本发明的另一个方面是使用根据本发明的载体转染的宿主细胞和修饰的生物体。可用的宿主细胞有细菌、植物、藻类、虾、鱼和任何适用于经基因修饰来制备本发明的新金属结合蛋白的生物体。
转染，也称为转化，可以采用适于所用宿主细胞或生物体的标准技术来实施。所述技术描述于，例如Sambrook等，如前。
现在将描述本发明的新金属结合蛋白的用途。这些用途包括金属结合蛋白的控制污染的用途例如金属治理、控制污染、金属回收再利用或金属采矿。例如，新金属结合蛋白可用于降低环境物质中的重金属浓度。物质可以是流体如地下水、泥水、污水等。此外，新金属结合蛋白可置于一个或多个组合物或用于污染控制的装置中。例如，新金属结合蛋白可用在凝絮或粉末形式的位点上，或可被作为膜过滤的一部分而用于处理植物，或用于其它类型的用于从污染的基质中去除重金属的固相支持装置中。
在这些金属结合用途中使用的新金属结合蛋白可获自从其天然形式纯化的产物或可通过生物工程技术来制备。例如，可用转基因或修饰的生物体制备新金属结合蛋白。修饰的生物体包括转基因动物、细菌或植物。例如，修饰的植物可以是基因组经过遗传学改变而能够表达一个或多个本发明的新金属结合蛋白的转基因烟草植物。修饰的生物体还可包括能够生长在需要金属治理的污染位点上或其中的植物或生物质。使用修饰的生物体提取金属污染物还在污染位点浓缩了有毒金属。这提供了额外的优点，即将重金属转换为较小的量，而且提供的终产物可更便于而且更安全地清理或进一步处理。
降低基质中重金属浓度的方法包括将本发明的新金属结合蛋白与含有重金属的基质接触。例如，将含有相似于至少一种源自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列的金属结合蛋白与含有一定浓度的至少一种重金属的基质相接触，使得重金属结合金属结合蛋白。随后，可从基质中分离出结合的重金属，这样就降低了原始基质中的重金属的浓度。
如前述，本发明的新金属结合蛋白的其它优点包括它们具有使用酸提取、无机鳌合剂，和/或交换反应技术就可以释放出结合的重金属的能力。这就允许使用者，若有需要，从新金属结合蛋白上洗脱结合的重金属。重金属从本发明的金属结合蛋白上洗脱下来后，金属结合蛋白可被再生(或再利用)而再次用于提取金属。因此，本发明还提供了通过使用包含新金属结合蛋白的可重复使用的组合物、装置和仪器来降低基质中重金属浓度的方法。
可采用适于特殊用途、场所、施用方式或使用金属结合蛋白的环境的方式来提供(当使用在降低基质中金属离子浓度的方法中时)本发明的新金属结合蛋白。例如，当使用在金属治理，或控制污染中时，金属结合蛋白可结合在支持物如粉末上和例如作为凝絮使用从而提供方便而有效的散布金属结合蛋白的方式。
另外，金属结合蛋白可用膜、半透膜、滤器或其它任何适于能将新金属结合蛋白有效暴露于含有重金属的基质的方式来提供，以便结合或将重金属从基质中分离出来。包含新金属结合蛋白的膜或滤器提供了处理地下水或污水的有效方法，因为污染的水可通过从膜或滤器滤过的方式得以纯化，而且不需要化学提取方法中进一步的清除处理。将新金属结合蛋白结合在支持物或支持基质上还能使处理金属结合蛋白特别是在用于大规模或工业应用中的时候变得更为容易。
本发明的新金属结合蛋白的使用不仅仅限于那些需要去除重金属的方法中，而且可用在将要在物质中实施回收或浓缩重金属的方法中。例如，新金属结合蛋白可用于金属采矿，如回收稀有金属如金、铂或银，或用在危险情况下如从含有放射性金属危险废弃物中浓缩金属。所述危险金属废弃物可来自多种研究、商业或工业用途中。
新金属结合蛋白用于从废弃物中浓缩放射性金属还能降低需要处置的危险废弃物的数额和数量。降低危险金属废弃物的量还能降低特定个体暴露于放射线时放射性水平。例如，由于降低了需要人来处理的放射性废弃物的量和体积，因此将降低以包含危险重金属的物质为工作或在其附近工作的个体对放射性金属废弃物的全面暴露。这提供了本发明的新金属结合蛋白用于金属结合用途中的额外优点。
减少物质中重金属浓度的方法包括在修饰的生物体中制备新金属结合蛋白。修饰的生物体包括，例如转基因生物体或转基因宿主。例如，宿主或生物体如虾、植物、细菌或藻类可通过使用现有技术中众所周知的分子和遗传基因工程技术而被修饰。使用这些技术，其被记载于如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(纽约：冷泉港出版，2001)；Ausubel等，“分子生物学的现有技术”(Wiley Interscience出版社，1995)；USDept Commerce/NOAA/NMFS/NWFSC分子生物学操作规程(URL：http：//research.nwfsc.noaa.gov/protocals.html)；或操作规程在线(URL：http：//protocol-online.net/molbio/index.html)，提供了基因组被修饰以致表达新金属结合蛋白的生物体。本发明的新金属结合蛋白包括含有相似于至少一种源自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列的金属结合蛋白。可以制备修饰的生物体并将其用于制备这些新金属结合蛋白和在本文提供的方法中有用的新金属结合蛋白。
制备本发明的新金属结合蛋白的修饰的生物体包括制备至少一种金属结合蛋白，所述蛋白含有基本上与源自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白相似的氨基酸序列。修饰的生物体还包括制备含有基本上与SEQ IDNO：2或其保守性氨基酸替代的序列相似的氨基酸序列的金属结合蛋白的生物体。
另外，从修饰的生物体中制备或表达本发明的新金属结合蛋白不限于新金属结合蛋白的基因表达，还包括从修饰的生物体中后生表达新金属结合蛋白。从修饰的生物包括例如，腺病毒、腺体相关病毒、质粒中获得后生表达的方法和技术以及瞬时表达技术都是本领域已知的。
当处理来自真核生物的基因时，优选使用cDNA，因为天然基因通常包含不翻译的插入系列或内含子。另外，由于氨基酸序列是已知的，可以通过标准固相寡脱氧核糖核苷酸合成方法，如磷酸三酯或亚磷酸三酯方法来构建编码要挑选的蛋白的人工基因。通过使用基因密码，使用天然存在的每一氨基酸均特异性对应一个或多个密码子来确定合成基因的序列。此外，对于金属结合蛋白的异构体或其它变体，如果异构体的部分蛋白序列是已知的，但基因或信使RNA还未被分离出来，则氨基酸序列可根据已知的遗传密码简并性而被用于构建一组简并引物。一般的克隆方法已经记载于，例如Sambrook等，如前；Perbal，“分子克隆实用指南”(第2版，John Wiley & Sons，纽约1988)；Berger & Kimmel，“分子克隆技术指南”(Methods in Enzymology，152卷，Academic Press公司，圣迭戈，1987)以及D.V.Goeddel，编，“基因表达技术”(Methods inEnzymology，185卷，Academic Press公司，圣迭戈，1991)。
本发明包括制备本发明的新金属结合蛋白的方法。例如，制备含有相似于至少一种源自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列的新金属结合蛋白的方法可以包括提供一种表达系统，使用表达系统制备新金属结合蛋白并纯化或分离新金属结合蛋白以获得本发明的新金属结合蛋白。
表达系统可以是如传统制造植物的系统。例如，培养生物体如咸水虾并从咸水虾组织中纯化或提取出本发明的新金属结合蛋白。另外，采用了遗传工程生物体的能够制备新金属结合蛋白的生物制造体系(如本文所述制备的)可用于制备新金属结合蛋白。例如，包含金属结合蛋白表达载体的细菌能以大或小的规模进行培养(根据特殊需要)。然后可从细菌培养液中分离本发明的新金属结合蛋白，并用于金属结合的过程中。
因此，可以通过在修饰的生物体或宿主细胞中表达编码金属结合蛋白的核酸序列来制备本发明的新金属结合蛋白。所述核酸序列包括，例如MT基因如[SEQ ID NO：1]或编码MT基因片段或其功能性金属结合结构域的序列。采用前述方法分离编码本发明的金属结合蛋白的核酸序列或片段。一经分离，这些核酸序列即被整合到表达载体中。该表达载体随后被用于修饰生物体以制备本发明的新金属结合蛋白。表达和制备通常在多种与载体构建体相关的控制元件的控制下进行。所述元件可包括启动子、操纵子、增强子和反向调节元件，这些元件可以使得使用者能够调节本发明的新金属结合蛋白的表达。在修饰生物体中表达克隆的蛋白序列所需要的条件是本领域众所周知的。
随后采用标准技术纯化表达的金属结合蛋白。克隆蛋白的纯化技术是本领域众所周知的，这里无需更多详述。一种特别适用的纯化方法是使用金属结合蛋白固定抗体的亲和层析。其它蛋白纯化方法包括离子交换树脂层析、凝胶电泳、等电聚焦和凝胶过滤等。另外，本发明的金属结合蛋白可在修饰的生物体中表达后而被纯化，纯化方法为例如使用试剂(例如硫酸铵和硫酸精蛋白以及现有技术中的其它方法)进行沉淀。
对本发明进一步的理解将与本领域技术人员对下述非限制性实施例的认识相一致。这些实施例说明了克隆和表达根据本发明教导的示例性金属结合蛋白，所述蛋白可用于从基质中去除或回收重金属。
需要强调的是，这些实施例用以说明本发明的原则和教导，而并非要将本发明限定于示例性咸水虾(卤虫)金属结合蛋白本身。
                         实施例
实施例1
根据本发明的教导，下述实例性实验指导用以说明适用于制备，纯化和分析本发明新金属结合蛋白的方法。
样本制备
分离新金属结合蛋白的准备步骤是在人工海水(AS)(422.7mMNaCl，7.24mM KCl，22.58mM MgCl2-6H2O，25.52mM MgSO4-7H2O，1.33mM CaCl2-2H2O和0.476mM NaHCO3)中养殖卤虫咸水虾。卤虫包囊(2.5g)在250ml补给了w/抗生素的AS中培养，30℃，125rpm摇48小时。24小时后，收集趋光(phototropic)卤虫，再培养24小时，然后用滤布收集。虾称重后若不立即使用，将其保存于-80℃。
然后在匀浆缓冲液(HB)(10mM Tris-HCl(pH8.0)，0.1mM DTT，0.5mM PMSF和10μg/ml大豆胰岛素抑制剂)中将虾匀浆，并将4ml/gm虾湿重在HB中重悬。用Yamato LH-21匀浆机以800rpm匀浆三次后用Miracloth(Calbiochem)滤过匀浆液，然后滤液用Sorvall SA-600离心机以14,300rpm，4℃离心30分钟。通过真空抽吸，去除上清液上方的脂质层，取下面的上清层用Beckman 50.2TI离心机以40Krpm，4℃离心90分钟。再次去除上层脂质，将低层上清以150K再次离心(150K上清)。随后立即使用150K上清或将其保藏于-80℃。若立即使用，则对该产品进行下述凝胶过滤。采用凝胶过滤研究确定新金属结合蛋白的重金属结合能力
凝胶过滤研究
150K上清液用Sorvall SA-600离心机以8500rpm，4℃离心30分钟。将得到的上清用0.45微米LC13 acrodisc滤器(Gelman Sciences)进行HPLC进行过滤。滤过的150K上清的20ml均份和2μl的109Cd(0.066μCi)于4℃，温育20分钟，放射性标记金属结合蛋白。随后将样品置于预先用50mM Tris-HCl(pH8.0)(用N2饱和)平衡的Sephadex G-50分子量分离柱(2.6×9.4)。在样品上样前，在组分60-100中加入1摩尔DTT(2μl)，以便使包含低分子量金属结合蛋白的组分中保持还原状态。用50mM Tris(pH8.0)以20ml/小时的流率洗脱分离柱，然后280nm检测洗脱物。在洗脱过程中，缓冲液池持续通N2。用于氨基酸分析的样品不作放射性标记。
使用Auto-Logic伽马计数器(ABBOTT实验室)确定柱分离组分的109Cd含量。使用火焰或熔炉原子吸收光谱技术测定锌含量，并表示为PPB锌/组分。前述研究显示了金属结合蛋白表现为两类，一类为高分子量组分。但是用包含金属结合蛋白的低分子量级别的锌洗脱了大部分109Cd。如图1中所述，放射性金属结合蛋白有一个与其对锌的相应的洗脱峰。根据使用手册采用BCA总蛋白实验试剂盒(Pierce)确定交联葡聚糖G-50级分的蛋白浓度。使用比标准方法敏感性更强的强化操作方法确定低分子量级分的蛋白浓度。随后用下述研究方法来确定本发明的新金属结合蛋白的独特结构特征。
金属结合蛋白特征研究
使用亲和层析和分子量的研究方法来测定新金属结合蛋白的结构特点。所使用的全部操作方法都已经记载于B.Harpham“从卤虫中分离金属结合蛋白”，硕士论文，加州大学，长滩图书馆，1998年。使用本领域众所周知的阴离子交换和反相亲和层析技术，其被描述于如B.Harpham“从卤虫中分离金属结合蛋白”中，如前，来纯化来自卤虫的金属结合蛋白，并且确定出其分子量和氨基酸序列长度出乎意料地小于和短于其它已知的金属结合蛋白。在SDS-PAGE条件下，卤虫金属结合蛋白的分子量约为5.8kDa，而来自其它哺乳类物种的金属结合蛋白的分子量为6～7kDa。卤虫金属结合蛋白的蛋白分析显示了序列长度为48个氨基酸。卤虫氨基酸序列出乎意料地而且显著性地在长度上短于其它已知的金属结合蛋白，这些蛋白的长度为60～68个氨基酸残基。
由于新金属结合蛋白出乎意料的独特结构特点，使用现有方法分离编码本发明的新金属结合蛋白的核酸序列的尝试是不成功的。因此，使用另外的策略来分离我们的编码新金属结合蛋白的MT基因。
实施例2
根据本发明的教导，下述内容描述了有效克隆新金属结合蛋白基因的示例性策略。克隆的金属结合蛋白基因及其序列信息特别适用于表达本发明方法中有用的金属结合蛋白。
在这之前，克隆以及获得编码咸水虾(卤虫)金属结合蛋白的尝试都是不成功的。因此，使用例如在B.Harpham“从卤虫中分离金属结合蛋白”(如前)中描述的蛋白纯化技术，可以获得卤虫金属结合蛋白的异构体N-端区域的序列数据。来自四种金属结合蛋白异构体的序列数据显示出相似性氨基酸序列，其氨基酸数目为10。使用这一序列信息，构建与我们的新金属结合蛋白特异的寡核苷酸引物，并用于分离编码新金属结合蛋白的基因，如下述。
编码卤虫金属结合蛋白基因的克隆和测序
使用RNAzol方法从48小时无节幼体中提取总RNA。按照上述实施例1中描述的方法制备48小时无节幼体样品。随后按照PolyTract试验步骤(Promega，WI)从总RNA样品中分离mRNA。使用SuperScript和3’RACE试剂盒试验步骤(目录号：18373，Gibco/BRL，WI)及下述合成反应，由mRNA生成cDNA
cDNA合成反应
卤虫mRNA              25μl(500ng)
DEPC水                30μl
10μM AP              5μl
上述混合体系70℃温育10分钟，然后置冰上1～2分钟。10,000rpm离心10秒钟以收集挥发液体。在上诉RNA混合体系中加入下述试剂以制备PCR溶液：
10×PCR缓冲液         10μl
25mM MgCl2           10μl
10mM dNTP             5μl
0.1mM DTT             10μl
混匀上述PCR最终溶液，42℃温育5分钟。加入5μl SuperScript IIRT，然后42℃温育50分钟以合成cDNA。将反应溶液70℃温育15分钟终止逆转录反应。然后加入5μl RNase，37℃温育20分钟。随后将包含卤虫cDNA的终溶液保存于-20℃直至将其用于如下述的PCR扩增。
卤虫金属结合蛋白序列的PCR扩增
使用的起始PCR引物系列如下述：
命名为“MT-Not I”的5’引物(N-端)[SEQ ID NO：5]由以下序列组成：
5’-ACC TAT  GCG GCC GCA AAT GGA CTG CTG CAA GAA C-3’
(下划线标出的核苷酸为Not I限制性位点)；并且
命名为“dT-Spe I”的3’引物(C-端)为：
5’-GCA CCA ACT AGT GCC TTT TTT TTT TTT TTT A-3’[SEQID NO：6]；或
5’-GCA CCA ACT AGT GCC TTT TTT TTT TTT TTT C-3’[SEQID NO：7]；或
5’-GCA CCA ACT AGT GCC TTT TTT TTT TTT TTT G-3’[SEQID NO：8]。
上述5’和3’引物用在下述扩增体系中。
PCR反应体系
10×PCR缓冲液            5μl
25mM MgCl2              3μl
10mM dNTP                1μl
10μM dT-Spe I           1μl
10μM MT-Not I           1μl
在管子内PRC反应混合体系上方，加入Gem 50蜡珠，随后将管子置80℃温育2-3分钟。室温10-15分钟使蜡硬化，在硬化的蜡的上方铺覆下述试剂：
无菌水                   36.5μl
cDNA混合体系             2μl
Taq聚合酶                0.5μl
随后将最终的混合体系置于下述PCR扩增反应程序中。
PCR反应程序
95℃，起始变性3分钟，随后进行如下的29个循环：
94℃1分钟
49℃1分钟
72℃1分钟
72℃10分钟
保持于4℃。
扩增后，在1.2％琼脂糖凝胶上确定PCR产物为成功的扩增。随后使用Qiagen QIAquick凝胶提取法(Qiagen，CA)纯化PCR产物以便随后克隆，双消化以产生相容性末端，使用Qiagen QIAquick PCR纯化方法进行纯化。序列中包含修饰的限制型位点的下述引物可用作亚克隆包含来自咸水虾Artemi金属结合蛋白基因序列的纯化PCR产物。
MT Nco I[SEQ ID NO：9](含有Nde I位点的5′引物)：
             Nde I    Nco I
5′-GCT ACA  CAT ATG T CC ATG GAC TGC TGC AAG AAC-3′
MT Sal I[SEQ ID NO：10](含有Sal I位点的3′引物)：
             Sal I
5′-ACG AAC  GTC GAC GCC TTT TTT TTT TTT TTT A-3′
使用Mt Nco I和MT Sal I引物，退火温度72℃，1分钟，扩增卤虫MT核苷酸序列，随后在载体的Eco RI和Sal I位点之间亚克隆至pGEM3载体中。亚克隆后，克隆的金属结合蛋白基因随后可被很容易地修饰或作进一步的处理以用于表达、制备或其它需要使用编码金属结合蛋白的分离的核酸的方法中。
随后用LiCor 4200L DNA测序仪确定MT基因的全长编码序列。来自卤虫的MT基因的序列比较研究显示出与其它已知的金属结合蛋白相比，其具有出乎意料的不同序列。将卤虫MT基因与马和人的MT相比对时，可观察到同源性。随后用下面的研究方法来确定本发明的示例性金属结合蛋白的结合重金属的能力。
实施例3
下面描述了一种示例性研究，该研究能实施于任一种本发明的新金属结合蛋白，从而在或将蛋白验证为新金属结合蛋白，或将蛋白鉴定为新金属结合蛋白中起辅助作用。例如，本发明的金属结合蛋白能够结合重金属如锌、镉和铜。分离的蛋白结合重金属的能力描述于和详细记载于用本发明示例性MT转化所公开的大肠杆菌中，显示于，如图1中。
如前所述，适用于制备本发明的新金属结合蛋白的修饰的生物体可用本文如下提供的教导来制备。一种示例性修饰的生物体包括转基因烟草植物，该烟草植物特别适用于本文描述的方法。下面描述了使用于制备本发明的修饰的生物体的示例性方法。
实施例4
转基因烟草植物
克隆至TOPO.CR2载体的MT cDNA是指pARTmt。MT的编码序列克隆至pUC18，该pUC18基于包含多克隆位点框内的TMV外壳蛋白omega 5’非翻译区的质粒。(参见图2.)。使用包含5’引物Nco I限制型位点和3’引物Sal I位点的PCR引物从pARTmtl中扩增MT编码序列来实现上述目的。PCR产物和载体均用Nco I和Sal I进行限制型酶切并纯化。然后使用T4 DNA连接酶将PCR产物连接至载体内。通过电传孔将连接混合物转化至DH5α细胞。将单个克隆接种于LB培养基上，培养过夜。分离质粒并测序，以确定存在MT编码序列及其完整性。
去除Eco RI/Xba I盒，克隆至植物表达载体pSS的相应位点中。pSS载体包含多克隆位点框架内基本的CMV启动子和转录终止序列。这就保证了将Eco RI/Xba I盒连接至载体中就可以将MT基因置于含有CMV启动子的框架内。我们所指的构建体为pSSmt。pSSmt在DH5α细胞中复制，将其分离并测序以确定存在上述MT编码序列及其完整性。
MT在烟草叶片中的表达
使用电穿孔方法将胞浆性pSSmt构建体转化至根癌农杆菌(A.Tumefaciens)，并在包含抗生素的YEB培养基，pH7.4，27℃培养过夜。收集细胞，在诱导培养基(YEB，pH5.8，20μM乙酰丁香酮)中重悬，27℃培养过夜。次日早晨，离心收集细胞，在渗透培养基(包含抗生素和200μM乙酰丁香酮的MMA缓冲液)中重悬至A600为1.5，然后在室温下孵育2小时。将植物叶片浸入细菌悬液中，然后置于真空干燥器内。在30-40mbar的真空下渗透叶片。将叶片置于室温72小时后，将其在液氮中磨成细粉，用10mM Tris pH＝8.0，0.05mM DTT，1mM PMSF进行提取。30,000×g离心使溶液澄清，使用109Cd金属结合试验测定上清的MT。金属结合力是叶片中含有卤虫MT基因的明显证据。
处理                    结合的Cd(CPM)
缓冲液                  747
未处理的叶片            5052
渗透的叶片I             12874
渗透的叶片II            12763
烟草(Nicotiana tabacum)的稳定转化
pSSmt转化的根癌农杆菌的悬液按照前述方法进行培养。将叶片切成小碎片(去除中央叶脉)，然后转移至含有50-100ml细菌悬液(A600～1.0)的灭菌weck玻璃中，在室温下培养30分钟。然后将叶片碎片转移至用无菌水预湿的无菌Whatman 3MM滤纸上，所述滤纸置于塑料培养皿内。用丝龙卷密封培养皿，26～28℃，于黑暗中培养2天。用包含抗生素的无菌水冲洗叶片碎片，然后转移至MS II琼脂板上。碎片在25℃下以16小时光周期培养3～4周。在开始发芽时，将芽去除然后转移至MS III琼脂板上，于25℃下以16小时光周期培养直至根开始形成。将小株植物转移至包含MS III培养基质的weck玻璃中，于25℃下以16小时光周期培养超过2周。然后将植物幼株植入土内。采集植物的幼叶，然后用前述方法测定MT活性以确定转基因植物。
作为结束，本发明本文公开的实施例应被理解为是对本发明主要方面的说明。本发明范围内的其它修改也是可以使用的，因此本发明并不恰恰限于本发明说明书中所示和所述的内容。
                              序列表
<110>Acey，Roger A.
<220>金属结合蛋白及相关方法
<130>21089-11
<140>US 09/948,495
<141>2001-09-06
<160>10
<170>FastSEQ for windows version 3.0
<210>1
<211>147
<212>DNA
<213>卤虫
<400>1
atggactgct gcaagaacgg ttgcacctgt gccccaaatt gcaaatgtgc caaagactgc     60
aaatgctgca aaggttgtga gtgcaaaagc aacccagaat gcaaatgtga gaagaactgt    120
tcatgcaact catgtggttg tcactga                                        147
<210>2
<211>48
<212>PRT
<213>卤虫
<400>2
Met Asp Cys Cys Lys Asp Gly Cys Thr Cys Ala Pro Asp Cys Lys Cys
1               5                   10                  15
Ala Lys Asp Cys Lys Cys Cys Lys Gly Cys Glu Cys Lys Ser Asp Pro
            20                  25                  30
Glu Cys Lys Cys Glu Lys Asp Cys Ser Cys Asp Ser Cys Gly Cys His
        35                  40                  45
<210>3
<211>66
<212>DNA
<213>卤虫
<400>3
atggactgct gcaagaacgg ttgcacctgt gccccaaatt gcaaatgtgc caaagactgc     60
aaatgc                                                                66
<210>4
<211>22
<212>PRT
<213>卤虫
<400>4
Met Asp Cys Cys Lys Asp Gly Cys Thr Cys Ala Pro Asp Cys Lys Cys
1               5                   10                  15
Ala Lys Asp Cys Lys Cys
            20
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>卤虫金属结合蛋白序列的PCR扩增所用的5’引物(N
     -末端侧)
<400>5
acctatgcgg ccgcaaatgg actgctgcaa gaac                              34
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>卤虫金属结合蛋白序列的PCR扩增所用的3’引物(C
     -末端侧)
<400>6
gcaccaacta gtgccttttt tttttttttt a                                 31
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>卤虫金属结合蛋白序列的PCR扩增所用的3’引物(C
     -末端侧)
<400>7
gcaccaacta gtgccttttt tttttttttt c                                 31
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>卤虫金属结合蛋白序列的PCR扩增所用的3’引物(C
     -末端侧)
<400>8
gcaccaacta gtgccttttt tttttttttt g                                 31
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>含有掺入其序列中的修饰限制性位点的引物；用于
     亚克隆含有咸水虾(卤虫)金属结合蛋白基因序列
     的纯化的PCR产物。
     (含有Nde I位点的5’引物)
<400>9
gctacacata tgtccatgga ctgctgcaag aac                               33
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>含有掺入其序列中的修饰限制性位点的引物：用于
     亚克隆含有咸水虾(卤虫)金属结合蛋白基因序列
     的纯化的PCR产物。
     (含有Sal I位点的3’引物)
<400>10
acgaacgtcg acgccttttt tttttttttt a                                31

Claims (19)

1.基本上纯化的金属结合蛋白，其具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列。
2.权利要求1的基本上纯化的金属结合蛋白，其包含选自以下的氨基酸序列：
(1) MET ASP CYS CYS LYS ASP GLY CYS THR CYS ALA PROASP CYS LYS CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS CYS LYS GLY CYSGLU CYS LYS SER ASP PRO GLU CYS LYS CYS GLU LYS ASP CYSSER CYS ASP SER CYS GLY CYS HIS STOP[SEQ ID NO：2]；
(2) MET ASP CYS CYS LYS ASP GLY CYS THR CYS ALA PROASP CYS LYS CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS[SEQ ID NO：4]；和
(3)上述序列中掺入一个或多个保守性氨基酸替代的序列。
3.分离的核酸，其包括与一种DNA分子有至少80％序列一致性的DNA，其中所述的DNA分子具有5’-ATG GAC TGC TGC AAGAAC GGT TGC ACC TGT GCC CCA AAT TGC AAA TGT GCC AAAGAC TGC AAA TGC TGC AAA GGT TGT GAG TGC AAA AGC AACCCA GAA TGC AAA TGT GAG AAG AAC TGT TCA TGC AAC TCATGT GGT TGT CAC TGA-3’[SEQ ID NO：1]的1～66位核苷酸残基的序列。
4.权利要求1的基本上纯化的金属结合蛋白，所述蛋白位于支持物上。
5.包含权利要求3的核酸序列的载体。
6.金属结合组合物，其包含基本上纯化的金属结合蛋白，所述蛋白具有相似于来自成水虾(卤虫)的金属结合蛋白的金属结合结构域的氨基酸序列。
7.降低基质中金属浓度的方法，所述方法包括如下步骤：
将具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列的金属结合蛋白与所述基质相接触，使所述金属与所述金属结合蛋白结合；和
从所述基质中分离被结合的金属。
8.根据权利要求7的方法，其中所述基质为流体。
9.根据权利要求7的方法，其中所述基质为土壤。
10.根据权利要求7的方法，其中所述接触步骤在高温条件下完成。
11.从金属污染废弃物中去除金属的方法，所述方法包括如下步骤：
将具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白序列的氨基酸序列的金属结合蛋白与所述金属污染废弃物相接触，使所述金属污染废弃物中的所述金属与所述金属结合蛋白结合；和
从接触的金属污染废弃物中分离结合的金属。
12.根据权利要求11的方法，其进一步包括如下附加步骤：在修饰的生物体中制备金属结合蛋白。
13.根据权利要求7的方法，其中所述金属结合蛋白与支持物相结合。
14.根据权利要求11的方法，其中所述金属结合蛋白与支持物相结合。
15.修饰的生物体，其能够制备金属结合蛋白，所述金属结合蛋白具有基本上相似于SEQ ID NO：2及其保守性氨基酸替代的氨基酸序列。
16.根据权利要求15的修饰的生物体，其中所述修饰的生物体为转基因植物。
17.根据权利要求15的修饰的生物体，其中所述修饰的生物体为转基因虾。
18.根据权利要求15的修饰的生物体，其中所述修饰的生物体为细菌。
19.制备至少一种金属结合蛋白的方法，所述金属结合蛋白具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列，所述方法包括如下步骤：
提供一种能够制备至少一种金属结合蛋白的表达系统；
使用所述表达系统制备至少一种金属结合蛋白，所述金属结合蛋白具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列；和
从所述表达系统中分离所述至少一种金属结合蛋白，所述金属结合蛋白具有相似于至少一种来自咸水虾(卤虫)的金属结合蛋白的氨基酸序列。
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