JP4529015B2 - 金属結合タンパク質と関連した方法 - Google Patents

Description

発明の背景
１．発明の分野：
本発明は、重金属への高い結合アフィニティーを有するユニークな金属結合タンパク質に概して関する。より特別には、本発明は、ユニークな金属結合タンパク質を包含する組成物と、関連した産生の方法、並びに重金属の低下又は回収が所望される場合の使用に向けられる。

２．背景と技術水準
金属回収及び金属救済（remediation）と金属廃棄物の浄化の効率的で安全な方法への関連ニーズは、金属汚染物質によりもたらされるヒトの健康への毒性及び潜在リスク、並びに貴重な重金属の経済価値のために、不断の環境及びビジネス上の関心事となっている。実際、農業、工業、及び他の商業活動からの重金属のような有毒廃棄物の放出が続くにつれて、有効かつ安全で低コストの金属救済法へのニーズが高まっている。米国環境保護局（ＥＰＡ）による最近の報告書において、金属汚染は、多くの汚染地域で依然として重要な関心事であり、これまでもそうであった（ＵＳＥＰＡ 作業アサインメント番号０１１０５９、１９９７年３月５日、契約番号６８−Ｗ５−００５５）。さらに、汚染した土壌又は廃棄物質からの金属中毒の結果としてヒトの健康への危険だけでなく、野生生物、家畜、植物への損害に関する数多くの公表報告がある（「鉛汚染土壌の公衆衛生に及ぼす影響（Impact of Lead-Contaminated Soil on Public Health）」Xintaras, C. 著、１９９２年５月、http://www.atsdr.cdc.gov/cxlead.html）。例えば、ヒトへの主要な懸念は、鉛（Ｐｂ）汚染により創出される健康被害である。鉛への曝露は、食物、水、土壌からの鉛の摂取、又は粉塵の吸入といった多様な方法を介して起こり得る。鉛中毒はきわめて危険で潜在的に致命的であり、発作、精神遅滞、及び行動障害を含む症状を伴う。故に、金属救済の方法は、我々の環境の保護と疾患からの保護の両方できわめて貴重である。

様々な廃棄物、放棄物、又は再利用の努力から回収された金属は、環境汚染制御を強めることだけでなく莫大な経済価値を提供する。金属回収は、廃棄電子部品（トランジスタ、チップ、変圧器、母線、カソード、及びマイクロプロセッサー、集積コンピュータ回路板、ＰＣＢ、マザーボード）のような数多くの様々な供給源に由来し得る。金属救済が存在しない産業廃棄物の危険な処理に関連したコストは、莫大である。故に、金属の再利用、又はスクラップや放棄された金属含有物から抽出した金属の再使用は、専門化した処理及び取扱いの努力を必要とする金属廃棄物の量及びコストを低下させるだけでなく、再生された金属はまた再販売又は再使用されて付加的な経済価値を提供する場合がある。

金属汚染を処理する先行技術の営為は、これまで、主に物理的に除去してから汚染物質を処理することからなる浄化技術を利用してきた。これらの方法論は、労働集約的で非効率であるだけでなく、大型又はバルク量の汚染廃棄物の除去及び処理に関連した高い経費を伴う。化学物質又は有機物質のような他のタイプの廃棄物と違い、金属は直に破壊又は変換することができないので、金属汚染は救済することが特に困難である。例えば、金属汚染土壌を救済する現行の技術は、主に埋立て処理するか又は土壌を掘って金属汚染物質を物理的又は化学的に分離することからなる。汚染地下水の処理は、通常、フラッシング、濾過、又は化学抽出して汚染金属を除去することを伴う。結果として、土壌又は地下水の救済コストは高く、各地域あたりの予測５ヵ年コストは数億〜数十億ドルに及ぶ（米国環境保護局、１９９３年）。

さらに、重金属汚染からのヒト及び環境へのリスクは、土壌や地下水にとどまらず、工業廃棄物、汚泥廃棄物、排水、放射性核種（研究及び医療廃棄物からのような）、及び採鉱廃棄物のような他の供給源も含まれる。除去すべき金属汚染物質の物理及び化学形態、並びに特別な救済アプローチの費用便益分析に依存して、特別な地域にどの既存技術がより適しているかはまちまちである。しかしながら、これまでの浄化技術の高コストにより、さほど高額でなくて安全で有効な重金属回収及び浄化技術への大きなニーズがあることに変わりはない。

重金属汚染廃棄物の回収又は救済に現在利用可能ないくつかの技術がある。一般に、これらの技術は、以下の一般アプローチの１以上を組み合わせる：単離、固定化、毒性低下、物理的分離、又は金属汚染物の廃棄製品からの抽出。単離技術は、汚染した地域若しくは領域を封じ込めて有毒な金属廃棄物のさらなる拡散を防ぐ試みにおいて、封じ込め戦略を利用する。固定化技術は、金属汚染物質の移動を抑制し、基底層の土壌（金属汚染物質を含有する）を表土から分離するための不浸透バリアーを提供する系が含まれる。また、非汚染地下水の汚染地域を通過する流れを制限する物理バリアーも使用される。さらに、化学若しくは生物学の技術を概して使用して金属汚染物質の毒性又は移動を減らす毒性低減方法もある。毒性低減方法に含まれるのは生物学的処理技術であり、これはより新しい生物技術アプローチに適用される。

金属救済は生物学的処理技術の比較的新しい応用であり、生物蓄積、植物救済、植物抽出、及び根濾過（rhizofiltration）が含まれる。これらの生物学的処理は、いずれも特定の植物及び微生物を使用して、汚染金属イオンの吸着、吸収、又は濃縮により金属を救済する。例えば、生物蓄積では、植物又は微生物が汚染環境から金属を活発に取り込んで蓄積する。

植物救済では、金属イオンを土壌から選択的に除去する能力を発達させた特定の植物を使用する。こうした植物には、高山 pennycrass 植物のような「高蓄積体（hyperaccumulator）」種が含まれ、これは毒性症状を示す前に、ほとんどの植物より２６０倍高いレベルで金属を蓄積することが可能である。しかしながら、ほとんどの高蓄積体植物は、非常に生育が遅く、特定の生育要件を有する。これら生育要件の中には、金属の回収若しくは救済が必要とされる地域又は状況においてこれらの植物を使用することに向かないものがある。さらに、回収若しくは救済の使用に知られているか又は利用可能な植物種はほとんどない。故に、環境及び廃棄物の地域で永続的で高発生率の金属汚染があるとすれば（特別融資用地（Superfund Sites）の約７５％は、汚染の形態として金属イオンを含有する、米国環境保護局、１９９６年）、重金属を汚染源から除去するのにより有効な方法及びアプローチが依然として必要とされる。

より最近、上記のニーズを満たす試みにおいて、バイオテクノロジーのアプローチが金属の回収及び救済への代替戦略として利用されてきた。これらのバイオテクノロジーアプローチに含まれるのは、メタロチオネイン遺伝子を発現するように操作されたタバコ植物の使用である（Maiti et al., 1991）。メタロチオネイン（ＭＴ）は、動物界全体に普遍的に分布している小さな金属結合タンパク質である。それらは高い金属結合アフィニティーを有し、フリー金属イオンの細胞内レベルを制御するのに重要であると考えられている。しかしながら、その機能や生物学上の目的については他にほとんどわかっていない。ＭＴは、１９５７年にウマの組織において初めて発見された。それ以来、それらは、真菌及び甲殻動物からマウス及びヒトに及ぶ種において確認されてきた。

ＭＴの構造特徴には、高いシステイン組成と芳香族アミノ酸の不足が含まれる。システイン残基は、このタンパク質の高アフィニティー金属イオン結合能力の原因である。一般に、先行技術のＭＴは、高い度合いのアミノ酸配列類似性を有する。しかしながら、このタンパク質やこの先行技術タンパク質をコードする既知の遺伝子配列は、研究の場か又は疾患治療の方法論のいずれかで主に使用されてきた。

従って、本発明の目的の１つは、新規の金属結合タンパク質とその産生に関連した方法を提供することである。本技術は、環境廃棄物や他の重金属汚染材料から重金属を効率的、費用効果的、安全かつ簡略に除去することを可能にするだろう。

発明の要約
先行技術のメタロチオネイン（ＭＴ）タンパク質は、一般に約６０〜６８アミノ酸残基のサイズであり、異なる種の間で高い度合いの配列保存性を有する。この高い度合いの配列保存性及び類似性はこのＭＴ遺伝子の発見の容易さに大いに貢献したが、本発明の新規金属結合タンパク質は配列が実質的に異なるが故に、入手するのがずっと困難で、より多くの忍耐を必要とした。

既知の先行技術のＭＴと異なり、ブラインシュリンプ（ｂｒｉｎｅ ｓｈｒｉｍｐ）（アルテミア）由来のＭＴは、ずっとサイズが小さく（約４８アミノ酸残基）、明瞭にユニークなアミノ酸及びＤＮＡの配列を有する。先行技術のＭＴからの配列におけるこれらの分岐性の結果として、本発明に先立って、本発明の新規金属結合タンパク質は入手するのがきわめて困難で、これらの新規金属結合タンパク質をコードする核酸配列は知られていなかった。本発明の新規金属結合タンパク質は、高い能力と高アフィニティー金属結合が可能である。このことにより、それらは、汚染制御、金属再利用、金属採掘と他の金属回収及び金属救済技術における使用に特に適したものになる。

上記と他の目的は、重金属の様々な発生源からの効率的で信頼し得る封鎖をもたらす、本発明の組成物及び方法により達成される。本発明の新規金属結合タンパク質は、金属救済、金属再利用、金属採掘、又は１以上の重金属の結合が所望される他のタイプの方法といった目的のために容易に発現及び産生することができる。

本発明の教示によれば、新規な金属結合タンパク質が提供される。本発明には、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの実質的に精製された金属結合タンパク質が含まれる。実質的に精製された金属結合タンパク質は：

［配列番号４］
のようなアミノ酸配列と、配列番号２又は配列番号４の１以上の保存性（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を取り込む配列を包含することができる。本発明を金属回収及び金属救済の文脈で今後論じるが、本発明は、重金属の除去、回収、又は単に結合が所望される、多くの他の使用にも容易に適用可能であることに留意すべきである。

本発明の金属結合タンパク質には、多数の異性型を有する金属結合タンパク質のファミリーも含まれる。従って、金属結合タンパク質のファミリーには、少なくとも５つの金属結合タンパク質の異性型が含まれる。これら金属結合タンパク質異性体のいずれか及びすべてが重金属の除去又は回収における使用に適している。本発明の「異性体」は、それらを金属結合タンパク質として分類する必須の構造特徴を有する。これらの特徴には、その高システイン含量が含まれ、それによりその金属結合能力が与えられる。故に、本発明の金属結合タンパク質は、その異性型も含め、金属救済、金属再利用、金属採掘、又は金属結合が関わる他のタイプの方法のような目的のために発現され、容易に産生することができる。

本発明の新規金属結合タンパク質はまた、本発明の方法におけるその使用をさらに高め、それらを先行技術からさらに識別させる特徴も有する。これらの有利な特徴により、本発明の新規金属結合タンパク質とその関連方法は、多種多様な金属回収及び金属救済の場において特に有用になる。例えば、金属結合タンパク質は、中等度の温度〜高温の条件下のような条件の範囲の下で重金属結合が可能である。金属結合活性は、約４℃〜約１００℃で起こる。本発明の金属結合タンパク質が実践される特別な応用又は操作に依存して、特別な温度範囲が好ましい場合がある。故に、本発明によれば、好適な温度の範囲には、約４℃〜約１００℃ならどこでも含まれる。いくつかの先行技術の方法論とは不適合であるこの温度範囲の条件により、我々の実質的に精製された金属結合タンパク質は、金属回収、金属救済、又は重金属結合を必要とする他の方法における使用にとってより汎用的で好ましくなる。さらに、本発明の金属結合タンパク質は、多様な化学条件において金属へ結合することができる。例えば、金属結合活性は、約ｐＨ４．０〜約１０．０で起こる。結合した金属イオンは、ｐＨを約１．０へ低下させることによって、本発明の金属結合タンパク質から解離させるか又は除去することができる。例示の方法は、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤の存在下でｐＨを約７．０へゆっくりと高めることを含む。これにより金属結合タンパク質の金属結合活性が回復するので、金属結合タンパク質を、所望されるならば、再使用することができる。

さらに本発明の教示によれば、金属結合タンパク質をコードする単離核酸が提供される。これらの単離核酸は、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する金属結合タンパク質をコードする。本発明の単離核酸は：

［配列番号１］
のようなＤＮＡ配列を包含することができる。

あるいは、本発明の単離核酸には、機能的な金属結合タンパク質の翻訳を可能にするのに十分である最小のＤＮＡ配列が含まれる場合がある。本発明の機能的な金属結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、完全なネーティブの金属結合タンパク質遺伝子配列を含む必要はないが、重金属への結合を与える配列番号１の部分若しくは領域だけであり得る。例えば、本発明には：

［配列番号３］
を含んでなるＤＮＡ配列を包含することができる。

さらに、本発明にはまた、配列番号１の配列を有するＤＮＡ分子、又は配列番号１のヌクレオチド残基１〜６６の配列を有するＤＮＡ分子に対して少なくとも８０％以上の配列同一性を有するＤＮＡが含まれる。

本発明の単離核酸にはまた、開示される金属結合タンパク質の異性型若しくは代替型のいくらか及び全部をコードする核酸も含まれる。さらに、本発明の単離核酸には、ＭＴ異性体の全体コード配列を含む必要がないが、例えば、本発明の金属結合タンパク質異性体の機能的又は金属結合領域のような、ＭＴ異性体をコードするコード配列のドメイン若しくは部分をコードする核酸配列が含まれる場合がある。

さらに本発明の教示によれば、新規金属結合タンパク質は、そのままの（naked）組成分として利用してよいか、又は本明細書に開示されるような金属回収、金属救済、又は金属結合の方法において金属結合タンパク質の分散、取扱い、包装、又は機能のいずれかを促進する、支持体、基質、又は、他の搬送系と結合して提供してもよい。故に、本発明のどの金属結合タンパク質も、金属を含有する流体（ｆｌｕｉｄ）が接触する膜又はフィルターのような支持体へ連結させてよい。

本発明は、金属回収、金属救済、又は金属再利用の処理及び方法での使用に特によく適している。これらの方法には、少なくとも１つの重金属のある濃度を有する基質若しくは材料と、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する本発明の金属結合タンパク質を接触させて、この金属を金属結合タンパク質へ結合させること；及び、次いで、結合した金属を基質若しくは材料から分離することが含まれる。

例えば、本発明の方法は、少なくとも１つの重金属のある濃度を有する物質の処理と結びつけて有用である。当業者により理解されるように、こうした重金属含有物質は、ある濃度の金属を含有する、地下水、飲料水、汚染土壌、廃棄物、等のような環境若しくは産業上のあらゆる物質であってよい。同様に、本発明の方法は、除去することが望まれる金属を含有する産業若しくは都市廃棄物を処理するのにも等しく有用である。この広い有用性により、本発明の組成物と関連した方法は、多種多様な環境において特に有用になる。

さらに本発明の新たな教示によれば、本発明の新規金属結合タンパク質を産生する発現系が提供される。開示される発現系により産生されるこれらの新規金属結合タンパク質には、先に論じたように、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する金属結合タンパク質が含まれる。これらの発現系には、より大規模な商業若しくは工業プラント、並びにより小規模な地域特定の応用において機能し得るこれら組成物の生産若しくは製造用のシステムが含まれる。本発明の教示にまた含まれるのは、修飾された生物及び宿主細胞のような、生きた、又は生きている産生体（production entities）の発現系である。これらには、トランスジェニック植物、トランスジェニック動物及び細菌と、本発明の新規金属結合タンパク質を産生するように遺伝子工学的に処理された他の修飾生物が含まれる。

従って、本発明は、既知の先行技術の金属結合タンパク質とは異なるユニークな特性及び配列を有する、ユニークで比較的小さな金属結合タンパク質を提供する。さらに、本発明の新規金属結合タンパク質は、様々な条件において重金属への高い結合アフィニティーを保持するので、ある基質、又は金属を含有するか又は金属で汚染されたあらゆる源からの重金属の除去若しくは回収が所望される状況においてそれらは特に有用になる。本発明の新規金属結合タンパク質とその関連方法は、多種多様な基質からの重金属の効率的、費用効果的で安全な除去及び回収をもたらす。

以下の詳細な説明は、本発明のさらに可能な開示を提供し、当業者に対してその追加の特徴及び利点を明らかにする。

発明を実施するための形態

好ましい態様の詳細な説明
ヒト、齧歯動物、細菌、カニ、ニワトリ、等のような様々な種より単離された既知の金属結合タンパク質（ＭＴ）は、類似のサイズ（約６．０〜６．８ｋＤａ）、高いアミノ酸配列保存性、及びタンパク質の全アミノ酸組成中の高比率のシステイン残基のような非常に類似した構造特徴を有することが知られている。亜鉛、銅、カドミウム、水銀、コバルト、鉛、ニッケル、白金、銀、及び金のような重金属へのこのタンパク質の結合アフィニティーを説明するのは、これらの既知ＭＴのシステイン組成である。

本発明の新規金属結合タンパク質は、本発明のタンパク質がユニークな異なるアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を有するので、他のすべての既知ＭＴとは異なる。さらに、本発明のタンパク質は、他の種由来の既知ＭＴに比較したとき、サイズがずっと小さい。しかしながら、これらの違いにかかわらず、本発明のタンパク質は、予想外に高いアフィニティーで金属へ結合する能力を保持する。また、この類稀な配列分岐性により、本発明の新規金属結合タンパク質は、先行技術のＭＴに比較して、単離して特性決定することがずっと難しい。例えば、本発明の新規金属結合タンパク質は、産業、都市、及び環境の廃棄物からの重金属の効率的で費用効果的な除去に特に有用である。上記金属結合タンパク質の金属救済への使用は、汚染制御に特に価値があり、地下水、汚染土壌、飲料水、又は重金属汚染を有するあらゆる材料からの重金属の除去に特に適用可能である。

あるいは、本発明の新規金属結合タンパク質はまた、金属、特に貴金属の回収に大変有用である。例えば、本発明の金属結合タンパク質は、金、白金、及び銀のような貴金属の単離及び除去の金属採掘法に使用することができる。そのようにすれば、選鉱からの金属精製の最終段階において水銀のような他の有毒金属を使用する必要がなくなる。上記と同じ新規技術は、産業若しくは都市の廃棄物からそうした金属を回収するために利用してよい。使い捨て部品や他の電子部品の使用が高まるにつれて、そうした廃棄物の供給源は、そうした金属でますます一杯になり、回収を価値のある営為とする。

どの状況においても、本明細書に提供される上記タンパク質のより小さいサイズと、ユニークに特定の配列情報により、本発明の新規金属結合タンパク質は、金属回収、金属採掘、金属再利用、金属救済、汚染制御、又は金属封鎖を含むあらゆる方法における使用のために、本明細書に開示されるように天然の供給源から容易かつ効率的に単離するか、又は合成的に生成することができる。故に、本発明の新規金属結合タンパク質と関連した方法は、金属結合の側面を有するあらゆる方法における使用への汎用的で、容易に産生され、効率的で信頼し得る資源を提供する。

本発明の新規金属結合タンパク質は、当初、ブラインシュリンプ（アルテミア）より単離された。それらは、「異性体」と呼ばれる金属結合タンパク質のファミリーである。これらタンパク質のユニークなアミノ酸組成の解析により、それぞれのアイソフォームが本質的に同等であることが示された。本発明の教示によれば、少なくとも５つの個別アイソフォームが同定された。高い度合いの配列相同性若しくは類似性を共有する他の生物由来のＭＴと異なり、本発明の新規金属結合タンパク質は、予想外に異なる構造特性を有するが、相互に高い度合いの配列相同性を保有する。本発明のこれらタンパク質のこれらの独特な配列特性は、それらのより早期の単離及び特性決定を妨げた。

先行技術の教示とＭＴ配列情報に基づいた慣用のアプローチを使用してブラインシュリンプＭＴをコードする遺伝子を単離する、数多くの不成功な試みの後で、以下の技術を利用して本発明の新規な金属結合タンパク質をコードする核酸配列を提供した。はじめに、ブラインシュリンプ（アルテミア）からの金属結合タンパク質の試料を単離して精製した。この金属結合タンパク質含有試料についてＮ末端アミノ酸配列解析を実施した。このアミノ酸配列解析は、ウマ及びヒトのＭＴと比較したときに標的ブラインシュリンプ（アルテミア）金属結合タンパク質の最初の６つのシステイン残基の位置が保存されていることを示し、このタンパク質の金属結合機能におけるこれらのアミノ酸残基の重要性を示した。

このＮ末端アミノ酸配列情報を使用して、当該技術分野において知られているように、このＮ末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを構築した。これらのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の標的金属結合タンパク質の少なくとも１つをコードするＭＴ遺伝子配列の潜在的な候補物をＰＣＲ増幅した。製造業者のプロトコールを使用して、ＱｉａＰｒｅｐスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＰＣＲ産物を精製してＴＡクローニングベクター、ＣＲ２．１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。この組換えベクターで電気反応性（electrocompetent）E. coli（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎからのＳｕｒｅ Ｓｈｏｔ細胞）を形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及び１％ グルコースを含有するＬＢ寒天プレートへプレート培養した。このプレートを３７℃に一晩置いた。個別コロニーを摘出し、アンピシリンと１％グルコースを補充した５ｍｌのＬＢブロスに接種するために使用した。この培養物をロータリーインキュベーターにおいて３７℃で一晩インキュベートした。製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコール通りにＱｉａＰｒｅｐスピンカラムを使用して、２ｍｌの細胞懸濁液よりプラスミドを単離した。次いで、Ｍ１３普遍フォワード及びリバースプライマーを使用して、Ｌｉ Ｃｏｒ ４２００Ｌでこのプラスミドを配列決定した。金属結合タンパク質をコードする配列であることを証明して決定したならば、ブラインシュリンプＭＴ遺伝子を細菌発現ベクター、ｐＴＭＺへサブクローニングした。同定したＭＴコード配列に基づいて、本発明の第一の新規金属結合タンパク質のアミノ酸配列を決定した。図１は、本発明の例示の金属結合タンパク質を利用する例示の溶離プロフィールを詳述する。このプロフィールは、以下の例示プロトコールを利用して入手した。

E. coli（ＥＲ２５６６菌株）を、ＭＴ遺伝子配列［配列番号１］を（ｐＴＭＺ）に含有するプラスミド発現ベクターで形質転換した。１％グルコースを含有するＬＢブロスにおいて３７℃でＡ_６００が０．６になるまで細菌を増殖させた。この細菌細胞を採取し、０．１％グルコースを含有するＬＢブロスに再懸濁し、同じ温度で４５分間インキュベートした。イソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの最終濃度になるまで加えた。この細菌細胞を約１６時間インキュベートした。非形質転換細菌を対照として使用した。細胞を遠心分離により採取し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，５ｍＭ ＤＴＴ，及び０．５ｍＭ ＰＭＳＦにおいて音波処理した。このホモジェネートを４℃で１時間、１５０，０００ｇで遠心分離した。上清を採取し、２μＣｉの^１０９Ｃｄとともに室温でインキュベートした。次いで、この放射標識した上清をＧ−５０分子排除カラムにかけ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で溶出させた。５ｍｌの分画を採取し、放射活性（ＣＰＭ）と亜鉛（ＰＰＢ）についてアッセイしたが、亜鉛は、形質転換細菌により発現される外因性金属結合タンパク質と会合する内因性金属である。カラムから溶出する各分画についてＩＣＰＭＳ（誘電共役プラズマ質量分析法）によりＺｎをアッセイした。本発明の教示により提供されて開示されるように、機能的な金属結合タンパク質をコードする、［配列番号３］のようなＤＮＡ配列を利用してもよい。

故に、本発明は、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する、実質的に精製された金属結合タンパク質を提供する。本明細書に使用される用語「実質的に精製された」は、その本来の環境から除去され、単離されるか又は分離されて、それが本来結合している他の成分から少なくとも６０％フリー、好ましくは７５％フリー、９０％以上フリーである、核酸、アミノ酸、又はタンパク質を意味する。

本発明の教示による実質的に精製された金属結合タンパク質は：

［配列番号２］
に類似したアミノ酸配列を有する。本発明の範囲内にはまた、タンパク質の金属結合アフィニティーを保存する、上記配列番号２の配列の変異体である、実質的に精製された金属結合タンパク質もある。特に、本発明の範囲内の保存性アミノ酸置換は、以下のいずれを含んでもよい：（１）イソロイシンのロイシン若しくはバリンでの置換、ロイシンのイソロイシンでの置換、そしてバリンのロイシン若しくはイソロイシンでの置換；（２）アスパラギン酸のグルタミン酸での置換とグルタミン酸のアスパラギン酸での置換；（３）グルタミンのアスパラギンでの置換とアスパラギンのグルタミンでの置換；並びに（４）セリンのスレオニンでの置換とスレオニンのセリンでの置換。

本明細書に使用される「保存性アミノ酸置換」は、類似した構造若しくは化学特性を有するアミノ酸を置換することによるアミノ酸配列の改変を意味する。当業者は、本発明のタンパク質の金属結合特性を変えずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、又は改変することができるかを決定することができる。

特別なアミノ酸の環境によっては、他の置換も保守的とみなされる場合がある。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は、アラニンとバリン（Ｖ）のように、相互交換可能であり得る。相対的に疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシン及びイソロイシンと、時にはバリンと相互交換することができる。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫとそれらの異なるサイズが重要でない位置においては、交換可能である。当該技術分野で知られるように、特別な環境においてはなお他の変化が「保存性」とみなされる場合がある。

例えば、タンパク質の表面のアミノ酸が、別のタンパク質サブユニットやそのタンパク質により結合するリガンドのような、他の分子との水素結合又は塩架橋相互作用に関与しない場合、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような陰電荷アミノ酸は、リジン又はアルギニンのような陽電荷アミノ酸で置き換えることができて、逆もまた可能である。アルギニンやリジンより弱い塩基性であり、中性ｐＨで一部荷電するヒスチジン（Ｈ）も、これらより塩基性のアミノ酸に置き換えてよい場合がある。さらに、アミドのグルタミン（Ｑ）及びアスパラギン（Ｎ）は、そのカルボン酸相同体のグルタミン酸及びアスパラギン酸に置き換えてよい場合がある。

本発明の新規金属結合タンパク質とその関連した産生及び使用の方法は、多数の異性型を有する金属結合タンパク質のファミリーに関する。結果として、本発明には、重金属の除去又は回収における使用に適した少なくとも５つの異性型の金属結合タンパク質が含まれる。異性体は、同じ化学組成を有するが、構造形態において異なる２以上の化合物の１つである。本発明の「異性体」は、それらを金属結合タンパク質として分類する必須の構造特徴を有する。これらの特徴にはその高いシステイン含量が含まれ、それがその金属結合能力をもたらす。異性体は２以上のアミノ酸残基により異なり、個別異性体について異なるｐＩをもたらす。このｐＩの違いにより、アイソフォームの容易な分離及び特性決定が可能になる。故に、本発明の金属結合タンパク質は、効率的かつ容易に発現させて産生することができる。

その金属結合特性だけでなく、本発明の金属結合タンパク質は、多種多様な金属回収及び金属救済の場においてそれらを特に有用にする特徴も明示する。例えば、これらの新規な金属結合タンパク質は、中温〜高温の条件下のようなある範囲の条件下での重金属結合が可能である。新規金属結合タンパク質は、室温で重金属結合することが可能であり、故に多くの応用に特に理想的である。新規金属結合タンパク質はまた、例えば、約４℃〜約１００℃の温度範囲のような広い温度範囲内での重金属結合も可能である。当業者は、金属結合タンパク質を利用することが可能である特別な応用又は操作に依存して、ある特別な温度範囲が実践的若しくは経済的な理由で好ましい場合があることを理解されよう。例えば、金属結合タンパク質を（利用可能なコスト内で得ることができる特別な温度範囲が指定される）環境汚染の「現場で」又は場所で使用することは、より実践的であり得る。一方、本発明の金属結合タンパク質の相対的に高い温度条件下での使用により、ある基質に対するより有効な金属抽出が達成される場合がある。故に、本発明の教示によれば、本発明を実施するのに適した温度の範囲には、約４℃〜約１００℃の範囲が含まれる。この温度範囲の条件により、本発明の金属結合タンパク質はより汎用的で有用になる。

さらに本発明の教示によれば、金属結合タンパク質は、そのままの組成分としてか、又は金属回収、金属救済、又は金属結合の方法において金属結合タンパク質の分散、取扱い、包装、又は機能のいずれかを促進する、支持体又は分散手段と一緒に利用もよい。こうした金属結合タンパク質は、有毒であるか又は他の潜在的に危険なタイプの化学品へ使用者を曝露する、化学抽出法のような他の方法論に比較して、より容易かつ安全に使用することができるので、金属回収、金属救済、及び金属結合の方法において特に有用である。

新規金属結合タンパク質の取扱い又は分散を促進する多様な支持体が使用可能であり、それには固形支持体、マトリックス、膜、半透膜、粉体、デバイス、装置、液体、製剤、及び他の材料が含まれる。新規金属結合タンパク質の追加の特徴が、それらが可逆的な重金属結合も可能であることに注目すべきである。例えば、結合した金属は、酸性条件を使用するか、又は瞬時の交換反応若しくは無機キレート剤により、金属結合タンパク質から溶出されるか又は引き離すことができる。例えば、放射活性Ｃｄと金属結合タンパク質のインキュベーションの間に、^１０９Ｃｄ金属は、金属結合タンパク質へ結合する内因性の金属に交換される。約ｐＨ１．０で、この金属はこのタンパク質より放出される。溶液のｐＨを約８．０まで高めると、このタンパク質の金属結合活性が再生される。故に、新規金属結合タンパク質の可逆的な結合特性により、本発明はまた、実質的に精製された金属結合タンパク質を含んでなる組成物、製剤、粉体、液体、デバイス、又は装置を提供し、これは一回以上利用するか、又は再使用することができる。

本発明の新規金属結合タンパク質の遺伝子工学に関する例示の考察に注目すると、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の金属結合タンパク質のアイソフォームの１つのヌクレオチド配列を、上記に論じたように同定した。一般に、この単離方法は：（１）ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の核酸を含有する１以上の試料の調製；（２）アルテミアからの全ＲＮＡの単離；（３）全ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製；（４）金属結合タンパク質遺伝子配列の増幅；及び（５）ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の金属結合タンパク質遺伝子（ＭＴ）としての単離核酸配列のクローニング、配列決定、及び検証を含む。

上記の手順より、金属結合タンパク質遺伝子、ＭＴの１つについて全コード配列を得た。この配列は：

［配列番号１］
である。

故に、本発明はまた、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する、実質的に精製された金属結合タンパク質をコードする１以上の核酸配列を提供する。この核酸配列には、配列番号１の配列；配列番号１に相補的な配列；又はストリンジェント条件下で約１５％以下のミスマッチがある、配列番号１に相補的な配列が含まれる。好ましくは、ミスマッチの度合いは約５％以下であり；最も好ましくは、ミスマッチは約２％以下である。

あるいは、単離核酸は、機能的な金属結合タンパク質の翻訳を可能にするのに十分な最小のＤＮＡ配列を含む場合がある。機能的な金属結合タンパク質は、全体のネーティブな金属結合タンパク質である必要はなく、重金属へ結合することが可能なタンパク質をコードする配列番号１の部分若しくは領域だけであってもよい。故に、本発明にはまた、配列番号１のヌクレオチド残基１〜６６の配列を有するＤＮＡ分子に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む、単離核酸も含まれる。

本発明内にまたあるのは、本発明の新規金属結合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列である。こうした新規金属結合タンパク質は、約５，８００ダルトンの分子量を有する場合があり、亜鉛、銅、カドミウム、水銀、コバルト、鉛、ニッケル、白金、銀、及び金、等のような重金属イオンへ高いアフィニティーで結合することができる。新規金属結合タンパク質には：配列番号２と、その１以上の保存性アミノ酸置換を取り込む配列からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれ、ここで保存性アミノ酸置換は以下のいずれかである：（１）イソロイシン、ロイシン、及びバリンのいずれかをこれらアミノ酸の他のいずれかに；（２）アスパラギン酸をグルタミン酸に、そしてその逆；（３）グルタミンをアスパラギンに、そしてその逆；及び（４）セリンをスレオニンに、そしてその逆。標準的な遺伝暗号を使用して代わりの核酸配列を決定することが可能であり；代わりのコドンは本配列中の各アミノ酸について容易に決定可能である。

注目すべきことに、本明細書に提供される単離核酸は、新規な金属結合タンパク質を産生するか又は発現するために使用可能であるが、それらはまた、本発明の新規金属結合タンパク質をコードする追加の金属結合タンパク質遺伝子の単離及び同定にも特に有用である。例えば、この戦略と、本明細書に提供される例示の方法及び核酸配列を使用して、金属結合タンパク質異性体のいずれかをコードするＤＮＡ配列を入手することができる。故に、本発明には、本発明の金属結合タンパク質の異性若しくは代替形態のいくらか及びすべてをコードする核酸が含まれる。さらに、単離核酸は、ＭＴ異性体の全コード配列を含む必要はないが、それには、本発明の金属結合タンパク質異性体の機能的若しくは金属結合領域のような、ＭＴ異性体をコードするコード配列のドメイン若しくは部分をコードする核酸配列が含まれる。

本発明に記載の核酸配列の構築及び単離は、固相ヌクレオチド合成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、ＤＮＡのＲＮＡからの逆転写、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼの使用、並びに他の技術を含む、当該技術分野でよく知られている技術により達成することができる。本発明の金属結合タンパク質又は金属結合タンパク質の部分をコードするアミノ酸配列を使用して、当該技術分多で知られている遺伝暗号に従って、対応する核酸配列を構築することができる。

本発明の別の側面は、本発明に記載の核酸配列とそれに機能的に連結した、その核酸配列の発現若しくは調節を制御する少なくとも１つの制御配列を含んでなるベクターである。こうした制御配列は当該技術分野でよく知られていて、オペレーター、プロモーター、エンハンサー、プロモーター近傍要素、及び複製起点が含まれる。クローニング、ライゲーション、ギャップ充填、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の使用、固体状態のオリゴヌクレオチド合成、並びに他の技術を含むベクター構築の技術はいずれも当該技術分野でよく知られていて、ここで詳しく記載するに及ばない。本発明のベクターは、修飾された生物、宿主細胞、又は他のタイプの発現系のいずれかにより新規金属結合タンパク質を産生するのに特に有用である。

故に、本発明の別の側面は、本発明に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞又は修飾生物である。使用することができる宿主細胞には、細菌、植物、藻類、シュリンプ、魚、又は本発明の新規な金属結合タンパク質を産生するための遺伝子修飾に適したあらゆる生物がある。

トランスフェクションは、形質転換としても知られていて、使用する宿主細胞若しくは生物に適切な標準技術を使用して実施される。こうした技術は、例えば、Sambrook et al., 同上、に記載されている。

以下、本発明の新規金属結合タンパク質の使用に注目する。これらには、金属救済、汚染制御、金属再利用、又は金属採鉱のような、金属結合タンパク質の汚染制御応用が含まれる。例えば、新規金属結合タンパク質は、環境物質中の重金属の濃度を低下させるために使用することができる。この物質は、地下水、汚泥、廃水、等のような液体であってよい。さらに、新規金属結合タンパク質を、汚染制御に使用される１以上の組成物若しくはデバイスへ取り込ませてよい。例えば、新規金属結合タンパク質は、綿状物若しくは粉末の形態で現場に適用しても、又は処理工場において膜濾過や汚染基質からの重金属の除去に使用される他のタイプの固形支持体デバイスの一部として使用してもよい。

上記の金属結合方法に使用される新規金属結合タンパク質は、その天然源から精製される産物として提供されるか、又は生物工学技術により産生することができる。例えば、新規金属結合タンパク質は、トランスジェニック生物又は修飾生物により産生することができる。修飾生物には、トランスジェニック動物、細菌、又は植物が含まれる。例えば、修飾植物は、本発明の１以上の新規金属結合タンパク質を発現するようにそのゲノムが遺伝的に改変された、トランスジェニックタバコ植物であり得る。修飾生物にはまた、金属救済が所望される汚染地域でか又はその内部で生育させることが可能である植物又はバイオマスが含まれる場合がある。修飾生物による金属汚染物質の抽出はまた、汚染地域から有毒金属を濃縮する。これは、重金属をより少ない量へ変換する追加の利点を提供し、並びに、処理又はさらなる加工のためにより容易かつ安全に取り扱われる最終生成物を提供する。

重金属の基質中の濃度を低下させる方法には、重金属を有する基質と本発明の新規な金属結合タンパク質を接触させることが含まれる。例えば、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質配列に類似したアミノ酸配列を有する金属結合タンパク質を、ある濃度の少なくとも１つの重金属を有する物質と接触させて、この重金属を金属結合タンパク質へ結合させることができる。引き続き、この結合した重金属を基質から分離し、元の基質中の重金属の濃度を低下させることができる。

先に述べたように、本発明の新規金属結合タンパク質の追加の有利な特徴には、酸抽出、無機キレート剤、及び／又は交換反応技術を使用して、結合した重金属を放出するその能力が含まれる。これにより、使用者は、所望されるならば、結合した重金属を新規金属結合タンパク質から溶離させることが可能になる。重金属が本発明の金属結合タンパク質から溶離されたならば、金属結合タンパク質は、金属抽出におけるさらなる使用のために再生（又は再利用）することができる。故に、本発明はまた、新規金属結合タンパク質を含んでなる、再使用可能な組成物、デバイス、及び装置を使用して基質中の重金属の濃度を低下させる方法を提供する。

本発明の金属結合タンパク質は、基質中の金属イオンの濃度を低下させる方法に使用される場合、金属結合タンパク質を使用することができる特別な使用、状況、投与形式、又は環境に適切であるようなやり方で提供することができる。例えば、金属救済又は汚染制御において使用される場合、金属結合タンパク質は、粉末のような支持体へ連結して、例えば、綿状物として使用してよく、金属結合タンパク質を分散する簡便で効率的な手段を提供する。

あるいは、本金属結合タンパク質は、膜、半透膜、フィルター、又は新規金属結合タンパク質の重金属含有基質への十分な曝露を可能にして基質から重金属を結合するか又は封鎖するのに適切な他の手段へ連結して提供してよい。新規金属結合タンパク質を含んでなる膜若しくはフィルターは、化学抽出法において必要とされるようなさらなる浄化を伴わずに、その膜若しくはフィルターを通る通過により汚染水を精製することができるので、地下水又は廃水を処理する特に効率的な手段を提供する。新規金属結合タンパク質を支持体又は支持マトリックスへ連結させることはまた、特に大量スケール又は工業応用に使用されるときに、金属結合タンパク質のより容易な取扱いを提供する。

本発明の金属結合タンパク質の使用は、重金属の除去が所望される方法に限定されず、物質中の重金属の回収若しくは濃縮を達成すべき方法も含まれる場合がある。例えば、新規金属結合タンパク質は、金、白金、及び銀を含む貴金属の回収のように、金属採鉱に使用することができるか、又は放射活性金属を含有する有害廃棄物のように、有害状態にある金属を濃縮するために使用することができる。こうした有害な金属廃棄物は、数多くの研究、商業、又は工業上の使用から生じる場合がある。

放射活性金属を廃棄物から濃縮することにおける新規金属結合タンパク質の使用はまた、処理すべき有害廃棄物の総計若しくは量を低下させる。有害金属廃棄物の量を低下させることはまた、ある個人が被曝する放射活性のレベルを低下させる。例えば、有害重金属を含有する材料を用いて、又はその近くで作業している個人では、ヒトの取扱いが必要とされる放射活性廃棄物の量若しくは容量の減少により、放射活性金属廃棄物への全体被曝量が低下されるだろう。これにより、本発明の新規金属結合タンパク質を金属結合法において使用する追加の有利な側面が提供される。

重金属の物質中の濃度を低下させる方法には、新規金属結合タンパク質を修飾生物において産生することが含まれる。修飾生物には、例えば、トランスジェニック生物又はトランスジェニック宿主が含まれる。例えば、シュリンプ、植物、細菌、又は藻類のような宿主若しくは生物を、当該技術分野でよく知られている分子及び遺伝子工学技術を使用して修飾することができる。例えば、Sambrook et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」（ニューヨーク：コールドスプリングハーバー・プレス、２００１）；Ausubel et al.「分子生物学の現代プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（ウィリーインターサイエンス・パブリッシャーズ、１９９５）；米国商務省／ＮＯＡＡ／ＮＭＦＳ／ＮＷＦＳＣ 分子生物学プロトコール（URL:http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols.html）；又はプロトコール・オンライン（Protocols Online）（URL:www.protocol-online.net/molbio/index.htm）に記載されるこれらの技術を使用して、新規な金属結合タンパク質の発現をもたらすようにそのゲノムが修飾される生物が提供される。本発明の新規金属結合タンパク質には、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質に類似したアミノ酸配列を有する金属結合タンパク質が含まれる。修飾生物を作製及び使用して、上記の新規金属結合タンパク質と本明細書に提供される方法に有用な新規金属結合タンパク質を産生することができる。

本発明の新規な金属結合タンパク質を産生する修飾生物には、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の金属結合タンパク質に実質的に類似したアミノ酸配列を有する少なくとも１つの金属結合タンパク質を産生する修飾生物が含まれる。修飾生物にはまた、配列番号２に実質的に類似した配列又はその保存性アミノ酸置換を有する金属結合タンパク質を産生する生物が含まれる。

あるいは、本発明の新規金属結合タンパク質の修飾生物からの産生又は発現は、新規金属結合タンパク質のゲノム発現に限定されず、新規金属結合タンパク質の修飾生物からの後成的（epigenetic）発現も含まれる。修飾生物からの後成的発現を入手するための方法及び技術には、例えば、当該技術分野で知られている、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、プラスミド、及び一過性発現の技術が含まれる。

真核生物由来の遺伝子を取扱う場合、天然の遺伝子は、典型的に、翻訳されない介在配列若しくはイントロンを含有するので、ｃＤＮＡを使用することが好ましい。あるいは、アミノ酸配列が知られているのなら、ホスホトリエステル若しくは亜リン酸トリエステル法のような標準的な固相オリゴデオキシリボヌクレオチド合成法によって、分取すべきタンパク質をコードする合成遺伝子を構築してよい。合成遺伝子の配列は、それぞれの天然に存在するアミノ酸が１以上のコドンにより特定される遺伝暗号により決定される。さらに、異性体や他の変異体の金属結合タンパク質では、異性体のタンパク質配列のある部分は知られているが、遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡが単離されていなければ、遺伝暗号の既知の縮重性に従って、そのアミノ酸配列を使用して、縮重したプローブのセットを構築することができる。クローニングの一般的な側面は、例えば、Sambrook et al., 同上；B. Perbal,「分子クローニングの実践ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）」（第２版、ジョンウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９８８）；Berger & Kimmel,「分子クローニング技術の手引き（Guide to Molecular Cloning Techniques）」（「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」１５２巻、アカデミックプレス社、サンディアゴ、１９８７）；及び D. V. Goeddel 監修「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」（「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」１８５巻、アカデミックプレス社、サンディアゴ、１９９１）に記載されている。

本発明には、本発明の新規金属結合タンパク質を産生する方法が含まれる。例えば、ブラインシュリンプ（アルテミア）由来の少なくとも１つの金属結合タンパク質に類似したアミノ酸配列を有する金属結合タンパク質を産生する方法には、発現系を提供すること、該発現系を使用して新規な金属結合タンパク質を産生すること、並びに、該新規金属結合タンパク質を精製するか又は単離して本発明の金属結合タンパク質を入手することが含まれる。

発現系は、伝統的な製造プラントのような系でよい。例えば、ブラインシュリンプのような生物を増殖させて、本発明の新規金属結合タンパク質をブラインシュリンプの組織から精製するか又は抽出することができる。あるいは、新規金属結合タンパク質を産生することが可能な遺伝子工学処理生物（本明細書に記載のように産生される）を使用するバイオ製造系を使用して、新規金属結合タンパク質を産生してもよい。例えば、金属結合タンパク質発現ベクターを含有する細菌を（特別なニーズに依存して）大量又は小量のスケールで培養することができる。次いで、この細菌ブロスから新規金属結合タンパク質を精製して、金属結合の方法に使用することができる。

故に、本発明の新規な金属結合タンパク質は、金属結合タンパク質をコードする核酸配列の修飾生物又は宿主細胞における発現により産生することができる。こうした核酸配列には、例えば、［配列番号１］のようなＭＴ遺伝子、又はＭＴ遺伝子の断片若しくは機能的金属結合ドメインをコードする配列が含まれる。本発明の金属結合タンパク質をコードする核酸配列若しくは切片の単離は、上記に記載されている。単離したならば、これらの核酸配列を発現ベクターへ取り込ませる。次いで、この発現ベクターを使用して、本発明の新規金属結合タンパク質を産生するための生物を修飾する。発現又は産生は、典型的には、このベクター構築体に関連した様々な制御要素の制御下にある。こうした要素には、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、並びに、本発明の新規金属結合タンパク質の産生を調節することを使用者に可能にする、ネガティブ調節要素が含まれる場合がある。クローニングされたタンパク質配列の修飾生物における発現に求められる条件は、当該技術分野でよく知られている。

次いで、発現された金属結合タンパク質を、標準技術を使用して精製する。クローニングされたタンパク質の精製の技術は当該技術分野でよく知られていて、ここでさらに詳述するに及ばない。１つの特に好適な精製の方法は、金属結合タンパク質への固定化抗体を利用するアフィニティークロマトグラフィーである。他のタンパク質精製法には、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点分離法、及びゲル濾過がとりわけ含まれる。あるいは、本発明の金属結合タンパク質は、その発現に続き、試薬（例、硫酸アンモニウム又は硫酸プロタミン、並びに、当該技術分野でよく知られている他の方法）での沈殿のような方法により、修飾生物から精製することができる。

当業者は、以下の非限定的な実施例の考察より、本発明のさらなる理解を得ることができよう。これらの実施例は、本発明の教示に従って、重金属の基質からの除去若しくは回収に有用である例示の金属結合タンパク質のクローニング及び発現を例示する。

これらの実施例は、本発明の原理及び教示の例示であり、本発明の範囲を例示のブラインシュリンプ（アルテミア）金属結合タンパク質だけに限定する意図はないことを断っておく。

実施例１
本発明の教示に従って、以下の例示プロトコールは、本発明の新規金属結合タンパク質の産生、精製、及び解析に有用な方法を例示する。

試料調製
新規金属結合タンパク質の単離における準備工程として、アルテミア・ブラインシュリンプを人工海水（ＡＳ）（４２２．７ｍＭ ＮａＣｌ，７．２４ｍＭ ＫＣｌ，２２．５８ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ，２５，５２ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，１．３３ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ，及び０．４７６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）に成育させた。アルテミア嚢胞（２．５ｇ）を、抗生物質補充ＡＳの２５０ｍｌにおいて、１２５ｒｐｍで回転させながら３０℃で４８時間インキュベートした。２４時間後、光合成アルテミアを採取し、さらに２４時間培養してから、布濾過により採取した。このシュリンプを秤量し、すぐに使用しなければ、−８０℃に保存した。

次いで、このアルテミアをホモジェナイゼーション緩衝液（ＨＢ）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，及び１０μｇ／ｍｌ ダイズトリプシン阻害剤）においてホモジェナイズし、シュリンプの湿重量１ｇにつき４ｍｌのＨＢに再懸濁した。このホモジェネートを、Ｙａｍａｔｏ ＬＨ−２１ホモジェナイザーに８００ｒｐｍの設定で３回通し、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（カルビオケム）に通して濾過し、濾液をＳｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローターにおいて１４，３００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清の頂にある脂質層を真空吸引により除去し、下部の上清層を採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ ５０．２ＴＩローターにおいて４０Ｋｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離した。再び上部の脂質層を除去し、下部の上清を１５０Ｋで再度遠心分離した（１５０Ｋ上清）。次いで、１５０Ｋ上清を直ちに使用するか、又は−８０℃に保存した。直ちに使用する場合、この産物を以下のようにゲル濾過へかけた。このゲル濾過試験により、重金属へ結合する新規金属結合タンパク質の能力を証明した。

ゲル濾過試験
１５０Ｋ上清をＳｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローターにおいて８，５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。次いで、生じた上清を、ＨＰＬＣ保証０．４５ミクロンＬＣ１３アクロディスク（acrodisk）フィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して濾過した。濾過した１５０Ｋ上清の２０ｍｌアリコートを２μｌの^１０９Ｃｄ（０．０６６μＣｉ）とともに４℃で２０分間インキュベートして金属結合タンパク質を放射標識した。次いで、この試料を、Ｎ_２で飽和した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０分子量排除カラム（２．６ｘ９４ｃｍ）にかけた。試料ロードに先立って１モルのＤＴＴ（２μｌ）を分画６０〜１００へ加え、低分子量の金属結合タンパク質を含有する分画において還元条件を維持した。溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、２０ｍｌ／時間の流速の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）でカラムを溶出した。溶出時間の間、緩衝液リザバーは絶えずＮ_２でパージした。アミノ酸分析に使用する試料は放射標識しなかった。

カラム分画の^１０９Ｃｄ含量（ＣＰＭ）を、Ａｕｔｏ−Ｌｏｇｉｃガンマカウンター（アボットラボラトリーズ）で決定した。亜鉛含量は、炎光若しくは火炉原子吸光分光法（Flame or Furnace Atomic Absorption Spectroscopy）により測定し、ＰＰＢ亜鉛／分画として表した。これまでの試験は、２つの種類（classes）の金属結合タンパク質が存在し、一方の種類が高分子量分画であることを示唆した。しかしながら、^１０９Ｃｄの大部分は、金属結合タンパク質を含有する低分子量の種類の亜鉛とともに溶出された。図１に示すように、放射活性の金属結合タンパク質は、亜鉛に対応する溶出ピーク（ほぼ、分画番号５０）を有していた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０分画のタンパク質濃度は、製造業者のプロトコールに従って、ＢＣＡ全タンパク質アッセイキット（ピアス）で決定した。低分子量分画のタンパク質濃度は、標準プロトコールより高い感度を有する亢進プロトコールを使用して決定した。次いで、以下の試験において本発明の新規金属結合タンパク質の明瞭な構造特徴を同定した。

金属結合タンパク質の特性決定試験
新規金属結合タンパク質の構造特徴を確認するために、あらゆるクロマトグラフィー及び分子量試験を実施した。使用したプロトコールはいずれも B. Harpham,「金属結合タンパク質のアルテミアからの単離（Isolation of Metal Binding Proteins From Artemia）」、修士論文、カリフォルニア州立大学、ロングビーチライブラリー（１９９８）にすでに記載の通りであった。当該技術分野でよく知られていて、例えば B. Harpham,「金属結合タンパク質のアルテミアからの単離（Isolation of Metal Binding Proteins From Artemia）」、同上に記載される、陰イオン交換及び逆相クロマトグラフィー技術を使用して、アルテミア由来の金属結合タンパク質を精製し、他の既知の金属結合タンパク質より予想外に低い分子量とアミノ酸配列長さを有することを決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、アルテミアの金属結合タンパク質は、他の哺乳動物種由来の金属結合タンパク質の６〜７ｋＤａに比較して、約５．８ｋＤａの分子量を有する。アルテミア金属結合タンパク質のタンパク質分析は、４８個のアミノ酸の配列長さを示す。アルテミアのアミノ酸配列は、６０〜６８個のアミノ酸残基の長さに及ぶ他の既知の金属結合タンパク質よりも、長さが予想外に、そして有意に短かかった。

新規金属結合タンパク質の予想外に明瞭な構造特徴のために、これまでの方法論を使用して本発明の新規な金属結合タンパク質をコードする核酸配列を単離する試みは失敗した。故に、新規な金属結合タンパク質をコードする我々のＭＴ遺伝子を単離するために、代わりの戦略を利用した。

実施例２
本発明の教示により、以下に、新規な金属結合タンパク質の遺伝子をクローニングするのに有効な例示の戦略を教示する。クローニングした金属結合タンパク質遺伝子とその配列情報は、本発明の方法に有用な金属結合タンパク質の発現に特に有用である。

ブラインシュリンプ（アルテミア）の金属結合タンパク質をコードする遺伝子をクローニングして入手するこれまでの試みは、すでに不成功であった。故に、例えば B. Harpham,「金属結合タンパク質のアルテミアからの単離（Isolation of Metal Binding Proteins From Artemia）」、同上に記載されるタンパク質精製技術を使用して、アルテミア金属結合タンパク質のアイソフォームのＮ末端領域について配列データを入手した。４つの金属結合タンパク質アイソフォームからの配列データは、アミノ酸番号１０までが同一のアミノ酸配列であることを示した。この配列情報を使用して、以下のように、我々の新規金属結合タンパク質にユニークなオリゴヌクレオチドプライマーを構築し、新規な金属結合タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用した。

アルテミア金属結合タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定
ＲＮＡゾール（ｚｏｌ）法を使用して、４８時間のナウプリウスより全ＲＮＡを単離した。４８時間ナウプリウスの試料は、実施例１において上記に記載のように調製した。次いで、ＰｏｌｙＴｒａｃｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（プロメガ、ウィスコンシン州）を使用して全ＲＮＡ試料よりｍＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ及び３’ＲＡＣＥキット法（カタログ番号１８３７３、ギブコ／ＢＲＬ、ウィスコンシン州）を使用してｍＲＮＡよりｃＤＮＡを産生してから、以下の合成反応へかけた。

上記の混合物を７０℃で１０分間インキュベートしてから、氷上に１〜２分間置いた。１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、揮発液体を採取した。次いで、以下を上記のＲＮＡカクテルへ加えてＰＣＲ溶液を産生した：

次いで、上記の生じたＰＣＲ溶液を混合し、４２℃で５分間インキュベートした。５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを加え、この混合物をｃＤＮＡ合成のために４２℃で５０分間インキュベートした。この溶液を７０℃で１５分間インキュベートすることによって、逆転写反応を終わらせた。次いで、５μｌのＲＮアーゼを加え、この溶液を３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、アルテミアｃＤＮＡを含有する最終溶液を、以下に記載のようなＰＣＲ増幅に使用するまで−２０℃で保存した。

アルテミア金属結合タンパク質配列のＰＣＲ増幅
使用した初発のＰＣＲプライマー配列は以下の通りであった：
「ＭＴ−ＮｏｔＩ」［配列番号５］と命名した５’プライマー（Ｎ末端側）は：

（下線を施したヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位を明示する）からなり；そして
「ｄＴ−ＳｐｅＩ」と命名した３’プライマー（Ｃ末端側）は：

であった。

次いで、上記の５’及び３’プライマーを以下の増幅カクテル中に使用した。

上記のＰＣＲ反応カクテルに対し、Ｇｅｍ５０ワックスビーズをこの試験管へ加え、その管を８０℃で２〜３分間インキュベートした。室温で１０〜１５分の間にこのワックスが硬化したらすぐに、以下のものをこの硬化ワックスの頂面に層状に重ねた：

次いで、この最終混合物を以下のＰＣＲ増幅プログラムへかけた。

ＰＣＲプログラム：
９５℃で３分間の初発の変性に続き、２９サイクルの：

増幅させたならば、このＰＣＲ産物について１．２％アガロースゲルで成功した増幅を検証した。次いで、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州）を使用して、このＰＣＲ産物を後続のクローニングのために精製し、二重消化して適合末端を形成させてから、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製プロトコールを使用して精製した。それらの配列へ取り込まれた修飾制限部位を含有する以下のプライマーを使用して、ブラインシュリンプ・アルテミアの金属結合タンパク質遺伝子配列を含有する精製ＰＣＲ産物をサブクローニングした。
ＭＴ ＮｃｏＩ［配列番号９］（ＮｄｅＩサイトを含む５’プライマー）

ＭＴ ＳａｌＩ［配列番号１０］（ＳａｌＩサイトを含む３’プライマー）

Ｍｔ ＮｃｏＩ及びＭＴ ＳａｌＩのプライマーを７２℃のアニーリング温度で１分間使用して、アルテミアＭＴヌクレオチド配列を増幅してから、引き続き、ｐＧＥＭベクターへ、該ベクターのＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位の間で、サブクローニングした。サブクローニングしたならば、次いで、クローニングした金属結合タンパク質遺伝子は、発現、産生、又は金属結合タンパク質をコードする単離核酸の使用を必要とする他の方法における使用のために容易に修飾するか、又はさらに処理することができる。

次いで、ＬｉＣｏｒ ４２００Ｌ ＤＮＡシークエンサーを使用して、ＭＴ遺伝子の全コード配列を決定した。アルテミア由来ＭＴ遺伝子の配列比較試験は、それが他の既知の金属結合タンパク質遺伝子に比較して予想外に異なる配列を有することを示す。アルテミアＭＴ遺伝子配列をウマ及びヒトのＭＴのそれと並置したとき、相同性が観察された。次いで、本発明の例示の金属結合タンパク質の重金属へ結合する能力を以下の試験において確かめた。

実施例３
以下は、金属結合タンパク質としてのタンパク質の検証か又は新規な金属結合タンパク質としてのタンパク質の同定のいずれかに役立つ、本発明の新規金属結合タンパク質のいずれかについて実施し得る例示の試験を教示する。例えば、本発明の金属結合タンパク質は、亜鉛、カドミウム、及び銅のような重金属へ結合することが可能である。図１に示すように、重金属へ結合する単離タンパク質の能力を、本発明の例示ＭＴでの E. coli の開示される形質転換において記載して詳述した。

先に記載のように、本発明の新規金属結合タンパク質を産生するのに有用な修飾生物は、本明細書に提供される教示に従って作製することができる。例示の修飾生物には、本明細書に記載の方法に特に有用であるトランスジェニックタバコ植物が含まれる。以下に、本発明の修飾生物を産生するのに有用な例示の方法を例示する。

実施例４
トランスジェニックタバコ植物
ＴＯＰＯ．ＣＲ２ベクターへクローニングしたＭＴのｃＤＮＡをｐＡＲＴ_ｍｔと呼ぶ。ＴＭＶコートタンパク質のω−５’非翻訳領域を多重クローニング部位とインフレームで含有するｐＵＣ１８ベースのプラスミドへＭＴのコード配列をクローニングした（図２を参照のこと）。これは、５’プライマー上にＮｃｏＩ制限部位、そして３’プライマー上にＳａｌＩ部位を含有するＰＣＲプライマーを使用して、ｐＡＲＴ_ｍｔ由来のＭＴコード配列の増幅により達成した。このＰＣＲ産物とベクターをそれぞれＮｃｏＩとＳａｌＩで制限酵素処理し、精製した。次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、該ベクターへＰＣＲ産物を連結した。このライゲーション混合物を使用して、エレクトロポレーションによりＤＨ５α細胞を形質転換した。ＬＢ培地に個別コロニーを接種し、一晩増殖させた。プラスミドを単離し、配列決定して、ＭＴコード配列の存在及び完全性を検証した。

ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩカセットを取り出し、植物発現ベクター、ｐＳＳの対応部位へクローニングした。このｐＳＳベクターは、構成ＣＭＶプロモーターと転写ターミネーター配列を多重クローニング部位とインフレームで含有する。このことは、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩカセットのベクターへのライゲーションによりＭＴ遺伝子配列がＣＭＶプロモーターとインフレームに置かれることを確実にする。我々は、この構築体をｐＳＳ_ｍｔと呼ぶ。このｐＳＳ_ｍｔをＤＨ５α細胞において増殖させ、単離し、配列決定して、上記に記載のＭＴ遺伝子の存在及び完全性を検証した。

タバコ葉におけるＭＴ発現
A. tumefaciens を、エレクトロポレーションによりサイトゾルｐＳＳ_ｍｔ構築体で形質転換し、抗生物質を含有するＹＥＢ培地、ｐＨ７．４において２７℃で一晩増殖させた。この細胞を採取し、誘導培地（ＹＥＢ，ｐＨ５．８，抗生物質、及び２０μＭアセトシリンゴン）に再懸濁し、２７℃で一晩増殖させた。翌朝、細胞を遠心分離により採取し、浸潤培地（抗生物質と２００μＭアセトシリンゴンを含有するＭＭＡ緩衝液）において１．５のＡ_６００まで再懸濁し、室温で２時間インキュベートした。この細菌懸濁液に植物の葉を浸漬し、真空デシケーターに入れた。葉は、３０〜４０ミリバールの真空下で浸潤させた。この葉を室温に７２時間置いてから、液体窒素中で微粉末になるまで粉砕し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０），０．０５ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦで抽出した。３０，０００ｘｇでの遠心分離によりこの溶液を澄明にし、上清について^１０９Ｃｄ金属結合アッセイを使用してＭＴをアッセイした。金属結合活性は、明らかに、アルテミアＭＴの遺伝子を含有する葉において明白である。

タバコ（Nicotiana tabacum）の安定な形質転換
ｐＳＳ_ｍｔで形質転換した A. tumefaciens の懸濁物を上記のように増殖させた。葉を（中心葉脈のない）小片へ切断し、５０〜１００ｍｌの細菌懸濁液（Ａ_６００〜１．０）を含有する無菌のｗｅｃｋガラスへ移し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、この葉片を、プラスチックのペトリ皿において滅菌水で予湿した無菌のＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ濾紙上に移した。この皿をサランラップで密封し、２６〜２８℃、暗所で２日間インキュベートした。次いで、抗生物質を含有する滅菌水でこの葉片を洗浄し、ＭＳ ＩＩ寒天プレート上へ移した。この小片を２５℃で３〜４週間、１６時間の日長でインキュベートした。苗条が生じはじめたとき、この苗条を取り出してＭＳ ＩＩＩ寒天プレート上へ移し、２５℃で１６時間の日長でインキュベートすると、やがて根が生えはじめた。ＭＳ ＩＩＩ培地を含有するｗｅｃｋガラスへこの小植物を移し、２５℃、１６時間の日長で、約２週間インキュベートした。次いで、この若い植物を土壌へ植えた。植物からの若葉を採取し、上記のようにＭＴ活性をアッセイし、トランスジェニック植物を決定した。

終わりに、本明細書に開示される本発明の態様は本発明の原理を例示するものと理解すべきである。本発明の範囲内にある他の変更を利用してよく、従って、本発明は、本明細書に正確に示されて記載されるものに限定されるわけではない。

図１は、本発明の例示的な金属結合タンパク質の溶出プロフィールであり、重金属、亜鉛と金属結合タンパク質の同時溶出を例示する。 図２は、本発明の教示による、金属結合遺伝子の遺伝子配列を含有する例示のクローニングカセットである。

配列表

Claims (26)

1. 配列番号２を含むアミノ酸配列をコードする核酸又はそれらの縮重変異体；配列番号４を含むアミノ酸配列をコードする核酸又はそれらの縮重変異体；アルテミア金属結合（ＭＴ）タンパク質をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸；及び、アルテミアＭＴタンパク質の金属結合領域をコードする配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸；からなる群から選択される単離核酸。
2. ブラインシュリンプ（ｂｒｉｎｅ ｓｈｒｉｍｐ）から単離された、請求項１記載の核酸。
3. ブラインシュリンプがアルテミア属由来である、請求項２記載の単離核酸。
4. ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項記載の単離核酸。
5. アミノ酸配列がアルテミアＭＴタンパク質である、請求項１記載の単離核酸。
6. 配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項１記載の単離核酸。
7. 配列番号３のヌクレオチド配列からなる、請求項１記載の単離核酸。
8. 配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクター。
9. さらに少なくとも１の、前記核酸の発現又は調節を制御するコントロール配列を含む、請求項８記載のベクター。
10. コントロール配列が、オペレーター、プロモーター、エンハンサー及びプロモーター近接因子からなる群から選択される、請求項９記載のベクター。
11. 請求項８〜１０のいずれか１項記載のベクターを含む、改変宿主細胞。
12. 宿主細胞が、細菌、酵母、藻類、哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項１１記載の改変宿主細胞。
13. 宿主細胞がアルテミアＭＴタンパク質又は金属結合アミノ酸配列を発現する、請求項１２記載の改変宿主細胞。
14. 基質から少なくとも１の金属を除去するための装置であって、前記基質が接触することができる、少なくとも１の純粋なアルテミア金属結合（ＭＴ）タンパク質が結合する支持体を含み、前記金属が前記少なくとも１のＭＴタンパク質と結合して前記基質から除去され、ここで前記少なくとも１のＭＴタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、前記装置。
15. 基質から少なくとも１の金属を除去するための装置であって、前記基質が接触することができる、少なくとも１の純粋なアルテミア金属結合（ＭＴ）タンパク質が結合する支持体を含み、前記金属が前記少なくとも１のＭＴタンパク質と結合して前記基質から除去され、ここで前記少なくとも１のＭＴタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記装置。
16. 支持体が、マトリックス、膜、半透膜、粉体及び樹脂からなる群から選択される、請求項１４または１５記載の装置。
17. 基質が、水、土壌及び汚泥からなる群から選択される、請求項１４〜１６いずれか１項記載の装置。
18. 基質から除去される少なくとも１の金属が、金、銀、プラチナ、亜鉛、銅、カドミウム、水銀、ニッケル、鉛、コバルト、それらの放射性同位体並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１４〜１７いずれか１項記載の装置。
19. 支持体が膜である、請求項１４〜１８いずれか１項記載の装置。
20. 基質から少なくとも１の金属を除去する方法であって、以下の：
    少なくとも１の金属結合（ＭＴ）タンパク質が結合している１の支持体を提供する工程；
    少なくとも１の金属がある基質を前記支持体と接触させて、前記少なくとも１の金属を、前記少なくとも１のＭＴタンパク質と結合させる工程；
    前記基質から、前記少なくとも１のＭＴタンパク質に結合した前記少なくとも１の金属がある前記支持体を分離する工程；及び
    支持体から前記少なくとも１の金属を回収して、前記基質から前記少なくとも１の金属を除去する工程；
    を含み、ここで前記少なくとも１のＭＴタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、前記方法。
21. 基質から少なくとも１の金属を除去する方法であって、以下の：
    少なくとも１の金属結合（ＭＴ）タンパク質が結合している１の支持体を提供する工程；
    少なくとも１の金属がある基質を前記支持体と接触させて、前記少なくとも１の金属を、前記少なくとも１のＭＴタンパク質と結合させる工程；
    前記基質から、前記少なくとも１のＭＴタンパク質に結合した前記少なくとも１の金属がある前記支持体を分離する工程；及び
    支持体から前記少なくとも１の金属を回収して、前記基質から前記少なくとも１の金属を除去する工程；
    を含み、ここで前記少なくとも１のＭＴタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記方法。
22. 提供する工程がさらに、アルテミア属ブラインシュリンプから、前記少なくとも１の純粋なＭＴタンパク質を得る工程を含む、請求項２０または２１記載の方法。
23. 接触する工程がさらに、水、土壌及び汚泥からなる群から選択される基質と、前記ＭＴタンパク質がある前記支持体と接触される工程を含む、請求項２０〜２２いずれか１項記載の方法。
24. 基質から回収される少なくとも１の金属が、金、銀、プラチナ、亜鉛、銅、カドミウム、水銀、ニッケル、鉛、コバルト、それらの放射性同位体並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項２０〜２３いずれか１項記載の方法。
25. 供給された支持体が、マトリックス、膜、半透膜、粉体及び樹脂からなる群から選択される、請求項２０〜２４いずれか１項記載の方法。
26. 支持体が膜である、請求項２０〜２５いずれか１項記載の方法。

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