PL220839B1 - Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb - Google Patents
Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych glebInfo
- Publication number
- PL220839B1 PL220839B1 PL404376A PL40437613A PL220839B1 PL 220839 B1 PL220839 B1 PL 220839B1 PL 404376 A PL404376 A PL 404376A PL 40437613 A PL40437613 A PL 40437613A PL 220839 B1 PL220839 B1 PL 220839B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- arsenic
- shewanella
- plasmid
- strain
- psheb
- Prior art date
Links
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 103
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 102
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 47
- 239000011707 mineral Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 239000002689 soil Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 239000002699 waste material Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 241000490596 Shewanella sp. Species 0.000 claims abstract description 80
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 20
- DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-K Arsenate3- Chemical class [O-][As]([O-])([O-])=O DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- GCPXMJHSNVMWNM-UHFFFAOYSA-N arsenous acid Chemical class O[As](O)O GCPXMJHSNVMWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 59
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims description 44
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 36
- 229940000489 arsenate Drugs 0.000 claims description 31
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 30
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 27
- 238000005188 flotation Methods 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 claims description 12
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 claims description 12
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 claims description 12
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 9
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 58
- 241000863430 Shewanella Species 0.000 description 45
- DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-L Arsenate2- Chemical compound O[As]([O-])([O-])=O DJHGAFSJWGLOIV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 29
- MHUWZNTUIIFHAS-XPWSMXQVSA-N 9-octadecenoic acid 1-[(phosphonoxy)methyl]-1,2-ethanediyl ester Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 18
- 229940047047 sodium arsenate Drugs 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 150000001495 arsenic compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 11
- 229940093920 gynecological arsenic compound Drugs 0.000 description 11
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 10
- 229910001779 copper mineral Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108090000444 Arsenate reductases Proteins 0.000 description 6
- 244000166071 Shorea robusta Species 0.000 description 6
- 235000015076 Shorea robusta Nutrition 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 5
- UKUVVAMSXXBMRX-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-trithia-1,3-diarsabicyclo[1.1.1]pentane Chemical compound S1[As]2S[As]1S2 UKUVVAMSXXBMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910052971 enargite Inorganic materials 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 arsenic sulfide compound Chemical class 0.000 description 3
- AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N arsenite(1-) Chemical compound O[As](O)[O-] AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001479 atomic absorption spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 150000004763 sulfides Chemical class 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710159527 Maturation protein A Proteins 0.000 description 2
- 101710091157 Maturation protein A2 Proteins 0.000 description 2
- 229910003328 NaAsO2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000878021 Shewanella baltica Species 0.000 description 2
- 241000947626 Shewanella baltica OS195 Species 0.000 description 2
- 241001538194 Shewanella oneidensis MR-1 Species 0.000 description 2
- 241001333726 Shewanella putrefaciens CN-32 Species 0.000 description 2
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 2
- 238000003723 Smelting Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 2
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- BWFPGXWASODCHM-UHFFFAOYSA-N copper monosulfide Chemical class [Cu]=S BWFPGXWASODCHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M sodium arsenite Chemical compound [Na+].[O-][As]=O PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 108050006855 Acriflavin resistance proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- GOLCXWYRSKYTSP-UHFFFAOYSA-N Arsenious Acid Chemical compound O1[As]2O[As]1O2 GOLCXWYRSKYTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017013 As4O6 Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000190909 Beggiatoa Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019054 CoSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910019099 CoSO4—7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001464948 Coprococcus Species 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100378121 Drosophila melanogaster nAChRalpha1 gene Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001559576 Halothiobacillus Species 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000858634 Leptothrix ochracea Species 0.000 description 1
- 108050004064 Major facilitator superfamily Proteins 0.000 description 1
- 102000015841 Major facilitator superfamily Human genes 0.000 description 1
- 241000604449 Megasphaera Species 0.000 description 1
- 241000122248 Methylophaga Species 0.000 description 1
- 229910017234 MnSO4 H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017237 MnSO4-H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017228 MnSO4—H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 229910019501 NaVO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000008021 Nucleoside-Triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241001464820 Pseudomonas viridiflava Species 0.000 description 1
- 108010070648 Pyridoxal Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 241000311449 Scheffersomyces Species 0.000 description 1
- 101100071632 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) hsp9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 1
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220471545 Single-stranded DNA cytosine deaminase_S26A_mutation Human genes 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004133 Sodium thiosulphate Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605118 Thiobacillus Species 0.000 description 1
- 241001453270 Thiomonas Species 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 241000190807 Thiothrix Species 0.000 description 1
- 108700039208 TraU Proteins 0.000 description 1
- 108010070663 Transposon Resolvases Proteins 0.000 description 1
- 241000287433 Turdus Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WMYHHNZQCHFESF-UHFFFAOYSA-N [Ca].[Rb] Chemical compound [Ca].[Rb] WMYHHNZQCHFESF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- XRFXFAVKXJREHL-UHFFFAOYSA-N arsinine Chemical compound [As]1=CC=CC=C1 XRFXFAVKXJREHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000009388 chemical precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940021019 disal Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052752 metalloid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002738 metalloids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004058 oil shale Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000009853 pyrometallurgy Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 1
- CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N sodium metavanadate Chemical compound [Na+].[O-][V](=O)=O CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- FOEYLTKIJNXAIO-UHFFFAOYSA-N trisilver;trioxidoarsane Chemical compound [Ag+].[Ag+].[Ag+].[O-][As]([O-])[O-] FOEYLTKIJNXAIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
- C22B—PRODUCTION AND REFINING OF METALS; PRETREATMENT OF RAW MATERIALS
- C22B3/00—Extraction of metal compounds from ores or concentrates by wet processes
- C22B3/18—Extraction of metal compounds from ores or concentrates by wet processes with the aid of microorganisms or enzymes, e.g. bacteria or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
- C02F3/342—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used characterised by the enzymes used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y120/00—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20)
- C12Y120/99—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20) with other acceptors (1.20.99)
- C12Y120/99001—Arsenate reductase (donor) (1.20.99.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
- C12Y306/03016—Arsenite-transporting ATPase (3.6.3.16)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
- C22B—PRODUCTION AND REFINING OF METALS; PRETREATMENT OF RAW MATERIALS
- C22B1/00—Preliminary treatment of ores or scrap
- C22B1/11—Removing sulfur, phosphorus or arsenic other than by roasting
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F2101/00—Nature of the contaminant
- C02F2101/10—Inorganic compounds
- C02F2101/103—Arsenic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/28—Anaerobic digestion processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y120/00—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20)
- C12Y120/04—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20) acting on phosphorus or arsenic in donors, with disulfide as acceptor (1.20.4)
- C12Y120/04001—Arsenate reductase (1.20.4.1), i.e. glutaredoxin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Geochemistry & Mineralogy (AREA)
- Geology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest plazmid pSheB, szczególnie plazmid zawierający fragment pSheB obejmujący moduł arr, oraz szczepy zawierające taki plazmid, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S, które są zdolne do usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego oraz gleb, w szczególności pokopalnianych w warunkach beztlenowych poprzez rozpuszczanie minerałów i redukcję arsenianów do arseninów. Przedmiotem wynalazku jest również sposób i zastosowanie takich szczepów bakteryjnych lub kompozycji je zawierającej do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub z gleby.
Arsen jest pierwiastkiem, który bardzo często współwystępuje w minerałach miedziowych i stanowi ich swoiste zanieczyszczenie. Podczas procesów pirometalurgicznego prażenia i wytapiania koncentratów miedziowych do atmosfery uwalniane są lotne związki arsenu, co ze względu na toksyczność tych związków, stanowi istotne zagrożenie środowiskowe. Podczas procesu wytapiania większość arsenu jest usuwana w postaci lotnego związku As4O6 w stężeniach do 0,5 mg/l, natomiast w stałej, stabilnej postaci wraz z żużlami usuwane jest tylko 0,04%-0,06% [Piret, 1999]. Poza lotnymi związkami arsenu, wysokie stężenia arsenu znajdowane są także w pyłach. Z tego powodu niezwykle istotnym, zarówno z ekonomicznego jak i środowiskowego punktu widzenia, jest opracowanie skutecznej metody kontrolowanego usuwania arsenu ze złóż miedzi i produktów ich przeróbki.
Aby usuwanie arsenu z minerałów miedziowych przyniosło oczekiwane ekonomiczne i środowiskowe korzyści, proces ten musi być przeprowadzany na pierwszych etapach obróbki złóż miedzi, takich jak flotacja. Tradycyjne układy do flotacji miedzi są niewystarczające i nieodpowiednie do separacji i rozdziału minerałów siarczkowych zawierających arsen (np. enargit Cu3AsS4 czy tennantyt (Cu,Fe)12As4S13) od siarczków miedzi niezawierających arsenu występujących w rudach. Wspomaganiem konwencjonalnych sposobów flotacji są metody zaproponowane w ostatnich latach. Jedna z metod dotyczy selektywnego utleniania siarczków opartego na właściwościach elektrochemicznych rozdzielanych związków [Fornasiero et al., 2001]. Inna metoda selektywnej flotacji wykorzystuje różnice w potencjałach pulpy flotacyjnej [Guo and Yen, 2005]. Stosując rozdział oparty o różnicę potencjałów pulpy można oddzielić minerały zawierające arsen, np. enargit (Cu3AsS4) od siarczków miedzi nie zawierających arsenu. W wyniku takich procesów powstają dwie frakcje koncentratów: (i) z niską zawartością arsenu oraz (ii) z wysoką zawartością arsenu. Te pierwsze mogą być wykorzystywane w procesach pirometalurgicznych, natomiast druga frakcja koncentratów zawierająca minerały miedziowe zanieczyszczone arsenem nadal wymaga odpowiedniego traktowania [Senior et al., 2006].
Jednym ze sposobów, które mogą pomóc rozwiązać problem usuwania arsenu z minerałów miedziowych jest zastosowanie metod biohydometalurgicznych, wykorzystujących mikroorganizmy do odzyskiwania metali z minerałów i złóż. Zastosowanie mikroorganizmów do ekstrakcji miedzi czy złota z ich rud oraz koncentratów jest procesem dobrze poznanym i często opisywanym w literaturze [Xia L. et al. 2010; Xia L. et al. 2009; Oison et al. 2003; Rawlings and Johnson, 2007]. Większość procesów biohydrometalurgicznych opiera się na procesach utleniania minerałów i prowadzi do (i) zwiększenia dostępności dla chemicznych rozpuszczalników (bioutlenianie) lub (ii) ich bezpośredniego rozpuszczania (bioługowanie) [Rawlings and Johnson, 2007]. Niestety metody te są niespecyficzne, ponieważ opierają się na utlenianiu siarki i/lub żelaza z minerałów i wiążą się z uwalnianiem wszystkich metali związanych z tego typu minerałami. Kolejnym ograniczeniem tradycyjnych metod biohydrometalurgicznych jest stosowanie bakterii kwasolubnych do ługowania ze złóż neutralnych i lekko zasadowych, co jest często mało wydajne, a czasami nawet niemożliwe, ze względu na potrzebę zastosowania znacznych ilości kwasu siarkowego do zakwaszenia złóż. W literaturze są opisane mikroorganizmy, głównie chemolitoautotroficzne bakterie utleniające siarkę, należące do rodzaju: Thiobacillus, Halothiobacillus, Thiomonas, oraz bakterie utleniające żelazo, takie jak: Galionella feruginea czy Leptothrix ochracea, Thiothrix i Beggiatoa, które mogą być wykorzystane do procesów bioługowania w neutralnych pH, ale są bardzo trudne do hodowania i nadal są słabo poznane. Ponadto, bioługowanie z wykorzystaniem tych mikroorganizmów jest czasochłonne i procesy te prowadzi się nawet przez kilka miesięcy [Skłodowska i Matlakowska, 2007]. Potwierdzeniem braku odpowiednich mikroorganizmów zdolnych do odzyskiwania metali w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych jest obecna sytuacja na rynku górniczym. Obecnie nie są znane i komercyjnie dostępne biotechnologiczne sposoby usuwania
PL 220 839 B1 metali szlachetnych występujących w postaci siarczków w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych złóż.
Alternatywą dla procesów utleniania są selektywne procesy bioredukcji, w których uwalniane są wybrane pierwiastki związane z aktywnością metaboliczną mikroorganizmów. Pomimo, kilku przykładów zastosowania procesów bioredukcji, nie są znane sposoby usuwania arsenu z minerałów miedziowych za pomocą mikrobiologicznej redukcji. Zidentyfikowanych zostało wiele szczepów bakterii dysymilacyjnie redukujących arseniany, ale zastosowanie większości z nich ogranicza się do transformacji rozpuszczalnych związków arsenu [Newman i wsp., 1998] lub wtórnych minerałów arsenowych powstałych ze związków żelaza [Zobrist et al. 2000]. Opisane zostały także szczepy zdolne do usuwania arsenu z koncentratów miedziowych i odpadów flotacyjnych [Mantur i wsp. 2011], ale prowadzony przez wspomniane szczepy proces dysymilacyjnej redukcji arsenianów nie jest w pełni zbilansowany i część arsenu może być usuwana poza komórki w formie lotnych, toksycznych związków arsenu (dane niepublikowane). Poza tym szczepy opisane przez Mantur i wsp., 2011, jednocześnie uwalniają miedź i arsen z minerałów, przez co obniżają wartość otrzymanego koncentratu miedzi.
W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie plazmidu zawierającego informację genetyczną zapewniającą zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów i selektywnego usuwania arsenu, szczególnie ze złóż miedziowych. Celem wynalazku jest dostarczenie nowych szczepów bakteryjnych zawierających taki plazmid, kompozycji je obejmujących i ich zastosowań oraz sposobów selektywnego usuwania arsenu wykorzystującego takie szczepy. Ponadto pożądane jest aby takie mikroorganizmy posiadające zdolność do redukcji arsenianów nie produkowały lotnych, a zarazem toksycznych związków arsenu. Takie właściwości posiada szczep Shewanella sp. O23S, który został wyizolowany z mat mikrobiologicznych z kopalni złota w Złotym Stoku [Drewniak, 2009]. Szczep Shewanella sp. O23S został zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS w Warszawie pod nr depozytu KKP 2045p. Szczep ten jest zdolny do beztlenowego wzrostu z wykorzystaniem arsenianów jako ostatecznego akceptora elektronów oraz może mobilizować arsen ze skał z kopalni złota w Złotym Stoku [Drewniak i wsp. 2010]. Nieoczekiwanie okazało się, że właściwości te zapewnia wyizolowany z Shewanella sp. O23S plazmid pSheB którego sekwencja została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1, szczególnie jego region obejmujący fragment od 63978 do 72599, który koduje m.in. dysmilacyjną reduktazę arsenianową warunkującą te właściwości.
Szczepy bakteryjne zawierające plazmid obejmujący fragment od 63978 do 72599z SEKW. ID. NR 1, pSheB lub ich funkcjonalne pochodne, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S (KKP 2045p) są zdolne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów i do selektywnego usuwania arsenu, szczególnie z surowców mineralnych i odpadów przemysłu surowcowego oraz z gleby, szczególnie korzystne jest to, że są zdolne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów i do selektywnego usuwania arsenu ze złóż miedziowych, korzystnie w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych. Szczepy bakteryjne zawierające plazmid obejmujący fragment od 63978 do 72599z SEKW. ID. NR 1, pSheB lub ich funkcjonalne pochodne, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S (zdeponowany jako KKP 2045p) nie produkują toksycznych, lotnych związków arsenu i stabilnie utrzymują się w środowisku.
Wynalazek dotyczy więc wyizolowanego plazmidu obejmującego fragment sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1.
Wynalazek dotyczy również plazmidu pSheB przedstawionego na SEKW. ID. NR 1.
Termin „funkcjonalna pochodna plazmidu” lub „funkcjonalna pochodna sekwencji” obejmuje plazmidy/sekwencje o sekwencji nukleotydowej kodującej otwarte ramki odczytu, które kodują produkty zawierające identyczną lub wysoce homologiczną sekwencję aminokwasową lub nukleotydową do sekwencji kodowanych przez wskazane sekwencje, których sekwencje kodujące lub inne sekwencje plazmidu/sekwencji zostały zmienione np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów tych otwartych ramek odczytu i umożliwia zachowanie funkcjonalnych właściwości niesionych przez taki plazmid/sekwencję. Wskazaną sekwencją będzie więc region obejmujący fragment od 63978 do 72599 SEKW. ID. NR 1, równie korzystnie będzie nią sekwencja plazmidu pSheB przedstawiona na SEKW. ID. NR 1. Sekwencja wysoce homologiczna oznacza, że sekwencja jest homologiczna, korzystniej identyczna, w co najmniej 70%, korzystniej 80%, bardziej korzystnie 90%, najkorzyst4
PL 220 839 B1 niej, w co najmniej 95%. Termin „funkcjonalna pochodna plazmidu” oznacza więc plazmidy o sekwencji nukleotydowej kodującej otwarte ramki odczytu, które kodują produkty zawierające identyczną lub wysoce homologiczną sekwencję aminokwasową lub nukleotydową do sekwencji kodowanych przez fragment od 63978 do 72599 SEKW. ID. NR 1 i/lub sekwencję plazmidu pSheB przedstawioną na SEKW. ID. NR 1, których sekwencje kodujące lub inne sekwencje plazmidu zostały zmienione np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów tych otwartych ramek odczytu i umożliwia zachowanie funkcjonalnych właściwości niesionych przez taki plazmid.
Istota niniejszego wynalazku opiera się, więc na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że możliwe jest wykorzystanie szczepu zawierającego plazmid obejmujący fragment nukleotydowy od 63978 do 72599 SEKW. ID. NR 1, pSheB przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, szczególnie szczepu Shewanella sp. O23S zdeponowanego jako KKP 2045p, do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego oraz gleb, korzystnie w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych. Nieoczekiwanie stwierdzono, że szczep zawierający plazmid pSheB przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S jest zdolny do: (i) wzrostu na podłożach mineralnych zawierających łupki bitumiczne, odpady flotacyjne oraz gleby pokopalniane zawierające arsen, (ii) selektywnego uwalniania arsenu z minerałów miedziowych zawierających arsen, (iii) tolerowania toksycznego działania metali ciężkich uwalnianych w wyniku rozpuszczania minerałów, (iv) braku zdolności do produkcji lotnych związków arsenu, (v) braku zdolności do mobilizacji miedzi z surowców mineralnych. Niniejszy wynalazek dotyczy więc również szczepu Shewanella sp. O23S obejmującego plazmid pSheB zdeponowanego pod nr KKP2045p w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno Spożywczego w Warszawie .
Wynalazek dotyczy również kompozycji obejmującej wyizolowany plazmid według wynalazku i/lub szczep bakteryjny według wynalazku lub ich kombinację.
Wynalazek dotyczy również zastosowania szczepu bakteryjnego według wynalazku, kompozycji według wynalazku do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub z gleby.
Szczególnie korzystne jest zastosowanie szczepu bakteryjnego Shewanella sp. O23S zawierającego naturalny plazmid pSheB, który niesie: (i) wszystkie geny niezbędne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów, (ii) geny oporności na arseniny i arseniany oraz (iii) geny kodujące system replikacyjnostabilizujący do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego oraz gleb pokopalnianych. Pełna sekwencja plazmidu pSheB z Shewanella sp. O23S została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1.
Przedstawione rozwiązania według wynalazku umożliwiają usuwanie arsenu z surowców mineralnych, odpadów surowcowych oraz z gleb pokopalnianych, korzystnie w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych, korzystnie o pH w zakresie około 6 do około 8 z wykorzystaniem szczepu zawierającego plazmid pSheB lub jego pochodną, korzystniej Shewanella sp. O23S, bez konieczności zakwaszania „środowiska” oraz bez ryzyka uwalniania toksycznych lotnych związków arsenu. Dzięki wynalazkowi możliwe jest selektywne usuwanie arsenu bez niepożądanego efektu uwalniania metali docelowych np. miedzi czy złota.
Wynalazek dotyczy więc sposobu selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleby, w którym etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego według wynalazku i/lub kompozycji według wynalazku. Korzystnie etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych. Korzystnie surowcami mineralnymi są złoża miedzionośne.
Wynalazek dotyczy korzystnie sposobu selektywnego usuwania arsenu z różnorodnych surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleb, w którym usuwanie arsenu prowadzone jest przez dysymilacyjną redukcję arsenianów z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego według wynalazku, korzystnie zawierającego plazmid pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1, korzystniej szczepu Shewanella sp. O23S zdeponowanego jako KKP2045p, który to sposób obejmuje następujące etapy
a) przygotowania surowców mineralnych, odpadów lub gleb i zmieszania z odpowiednią pożywką hodowlaną umożliwiającą hodowlę szczepu,
b) dodanie innokulum szczepu i prowadzenia hodowli w warunkach umożliwiających jego wzrost i prowadzenie dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
PL 220 839 B1
Korzystne jest jeśli po etapie b) następuje etap c) selektywnego usuwania uwolnionego arsenu z roztworów uzyskanych w etapie b). Takie usuwanie arsenu z roztworów (płynów hodowlanych) korzystnie będzie prowadzone z wykorzystaniem już opracowanych metod np. przez flotację, korzystnie przez selektywne wytrącanie arseninów siarczkami, w konsekwencji czego powstaje stabilny, nie rozpuszczalny w wodzie związek siarczek arsenu As2S3 [Robins 1985].
W korzystnym sposobie etap a) przeprowadza się przez: (i) rozdrabnianie i frakcjonowanie surowców mineralnych, odpadów lub gleb, korzystnie do frakcji 125-250 μm (o średniej wielkości cząstek) ze względu na uzyskiwaną najwyższą wydajność w tym przedziale wielkości cząstek. Równie korzystne jest (ii) przygotowanie jako odpowiedniej pożywki hodowlanej pożywki R1-R2 z dodatkami odpowiednich substratów wśród których są mleczan sodu jako źródło węgla i energii, ekstrakt drożdżowy jako dodatkowe źródło węgla i witamin, sole Tuoviniena jako źródło mikroelementów. Ponadto
3- 3+ w korzystnym sposobie pożywka nie zawiera NO - i Fe .
Równie korzystne jest jeśli w etapie b) hodowla prowadzona jest w warunkach odpowiedniej beztlenowej atmosfery, co uzyskuje się przez prowadzenie hodowli z przepłukiwaniem pożywki mieszaniną gazów N2:CO2, korzystnie w stosunku 4:1. Przepłukiwanie pożywki mieszaniną gazów N2:CO2, korzystnie w stosunku 4:1 może być równie korzystne już na etapie a) sposobu dysymilacyjnej redukcji arsenianów. W korzystnym sposobie w celu uzyskania największej wydajności dla szczepu Shewanella sp. O23S etap b) prowadzi się w temperaturze w zakresie 15°C do 30°C, korzystnie około 22°C z wytrząsaniem 160 rpm, przez co najmniej 21 dni. Korzystne jest jeśli gęstość hodowli na początku procesu wynosi co najmniej około 106 komórek/ml. W korzystnym sposobie innokulum szczepu Shewanella sp. O23S kilkukrotnie przepłukuje się roztworem soli fizjologicznej lub kilkukrotnie pasażuje na podłożu R1-R2 wzbogaconym arsenianem sodu.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone jako referencje. Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Fig. 1. Przedstawia organizację genetyczną plazmidu pSheB. Na schemacie opisano poszczególne moduły budowy plazmidu i regiony fenotypowe: REP/STA- moduł replikacyjno-stabilizujący, TA - moduł toksyna/antytoksyna, TRA - moduł koniugacyjny, SIDERO - moduł produkcji sideroforów, STA - dodatkowy moduł stabilizujący, ARS - moduł metabolizmu arsenu, oraz SOS - moduł systemu naprawczego SOS.
Fig. 2. Przedstawia porównanie zdolności do dysymilacyjnej redukcji arsenianów przez dziki szczep (wt) Shewanella sp. O23S zdeponowany jako KKP2045p (niosący plazmid pSheB) oraz jego pochodną pozbawioną plazmidu pSheB. W celu porównania zdolności badanych szczepów do redukcji arsenianów do arseninów prowadzono beztlenowe hodowle na podłożu minimalnym R1-R2 zawierającym 2,5 mM (187,5 ppm) arsenianu sodu. Na wykresie przedstawiona jest zawartość As(V) i As(III) w płynach hodowlanych pobieranych z hodowli co 24 godziny, • zaznaczono stężenie As(V), - zaznaczono stężenie As(III), linią ciągłą zaznaczono kinetykę redukcji As(V) prowadzoną przez szczep dziki, natomiast linią przerywaną przez pochodną pozbawioną plazmidu pSheB.
Fig. 3. Przedstawia wykres obrazujący wydajność procesu usuwania arsenu z surowców mineralnych przez szczep Shewanella sp. O23S, dla A) odpadów flotacyjnych, B) łupków bitumicznych. Jako próby kontrolne zastosowano sterylne podłoże R1-R2 wzbogacone odpowiednimi surowcami mineralnymi: (A) odpadami flotacyjnymi („middlings”) i (B) łupkami bitumicznymi („łupkami”).
Fig. 4. Przedstawia wykres obrazujący wydajność procesu usuwania miedzi z surowców mineralnych przez szczep Shewanella sp. O23S dla odpadów flotacyjnych („middlings”) oraz łupków bitumicznych („łupków”). Jako próby kontrolne zastosowano sterylne podłoże R1-R2 wzbogacone odpowiednimi surowcami mineralnymi: odpadami flotacyjnymi („middlings”) i łupkami bitumicznymi („łupkami”).
Fig. 5. Przedstawia wykres obrazujący wydajność procesu usuwania arsenu z gleby skażonej arsenem przez szczep Shewanella sp. O23S. W celu sprawdzenia zdolności badanego szczepu do usuwania arsenu z gleby wykorzystano próbkę gleby pochodzącą z okolic Złotego Potoku i przeprowadzono beztlenową hodowlę na podłożu minimalnym R1-R2. Na wykresie przedstawiona jest zawartość arsenu w płynach hodowlanych pobieranych z hodowli co 24 godziny. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże R1-R2 z dodatkiem gleby.
Fig. 6. Przedstawia wykres obrazujący wydajność usuwania arsenu przez szczep Shewanella sp. O23S w podłożu zawierającym 2,5mM (187,5 ppm) arsenian sodu oraz 5 mM tiosiarczan sodu. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże R1-R2 z arsenianem sodu i tiosiarczanem sodu.
PL 220 839 B1
Fig. 7. Przedstawia porównanie zdolności do dysmilacyjnej redukcji arsenianów przez szczep Shewanella sp. O23S w podłożu minimalnym R1-R2 o pH 8 (A) i pH4 (B). W celu porównania zdolności badanego szczepu do dysmilacyjnej redukcji arsenianów w różnych warunkach pH prowadzono beztlenowe hodowle na podłożu minimalnym R1-R2 zawierającym 2,5mM (187,5 ppm) arsenian sodu oraz 5 mM mleczan sodu.
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. i D.W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Charakterystyka plazmidu pSheB i określenie jego pełnej sekwencji
Plazmid pSheB o wielkości 81 kpz został wyizolowany ze szczepu Shewanella sp. O23S. W celu zsekwencjonowania plazmidu wyizolowano plazmid pSheB z 200 ml nocnej hodowli Shewanella sp. O23S metodą lizy alkalicznej. Plazmid pSheB zsekwencjonowano metodą pirosekwencjonowania stosując strategię typu „shotgun” na sekwenatorze GS FLX Titanium (454) (w centrum Oligo Pl.). Do konstrukcji biblioteki DNA wykorzystano ok. 5 μg DNA pSheB i zastosowano dostarczone przez producenta zestawy odczynników (GS FLX Titanium Library Preparation Kit, Roche). Skonstruowana biblioteka została zsekwencjonowana i poskładana z wykorzystaniem programów z pakietu Newbler de novo assembler (Roche). Uzyskane sekwencje zostały następnie złożone w kontigii z wykorzystaniem programów Seqman z pakietu Lasergene package (DNAStar). Adnotację plazmidu (wyróżnienie otwartych ramek odczytu i określenie ich potencjalnych funkcji) wykonano z wykorzystaniem programu Artemis oraz programów BLAST (z bazy NCBI). Pełna sekwencja plazmidu została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1. Sekwencjonowanie plazmidu pSheB wykazało, że jest to cząstka DNA o wielkości 81 591 pz i zawartości par GC 44,04%. W jej skład wchodzą 87 otwarte ramki odczytu (ORF), co stanowi 89,6% sekwencji plazmidu. Poniżej w Tabeli 1 przedstawiono szczegółowy opis wyróżnionych ORF w obrębie SEKW. ID. NR 1.
T a b e l a 1 Wyznaczenie potencjalnych sekwencji kodujących plazmidu pSheB w odniesieniu do SEKW. ID. NR 1. *Numery podane w sekwencji kodującej odpowiadają nr nukleotydów z SEKW. ID. NR 1
| Nr ORF | Sekwencja kodująca (start-stop kodon) | Wielkość białka (aa) | Przewidywana funkcja białka | Największe podobieństwo (porgram BLASTP) | ||
| IdenL (%) | Organizm | Numer w GenBank | ||||
| l | 1-813 | 270 | Deoxyrybonuelease I (EndA) | 97 (233/240) | Shewanella batlica OS 195 (pS19501) | YP 0015569 93 |
| 2 | 826-1061 | 77 | 1 lypolhelical protein | 100 (77/77) | Shewanella bal/ica BAI75 (pSBAL!7501) | YP 0060186 02 |
| 3 | 1454-3328 | 624 | ParB like nuclease | 99(618/624) | Shewanella ballica BAI 75 (pSBAL17501) | AEG 13 584 |
| 4 | 3453-3908 | 151 | Hypolhetical protein | 99(149/151) | Shewanella ballica OS 195 (pS 19501) | YP 0015569 96 |
| 5 | 4113^4397 | 94 | Hypolhetical protein | 97(91/94) | Shewanella ballica BAI75 (pSB ALI 7501) | YP 0060185 98 |
| 6 | 4428-4649 | 73 | Hypothelical protein | 97(71/73) | Shewanella ballica OS 185 (pS18501) | YP 0013554 38 |
| 7 | 5014-5358 | 114 | Hypothetical protein | 100 (114/114) | Shewanella ballica OS 195 (pS 19502) | YP 0015570 25 |
| 8 | 5321-5944 | 207 | Hypolhetical protein | 99 (204/207) | Shewanella ballica BA 175 | YP 0060185 |
PL 220 839 B1 (pS BALI 7501) 95
| 9 | 5946 6347 | 133 | Hypothetieal protein | 99 (132/133) | Shewanella baltica OSI85 (pS18501) | YP 0013554 40 |
| 10 | 6545-6790 | 81 | Toxin protein (HicA) | 100 (81/81) | Shewanella ballica OS 195 (pS 19501) | YP 0015570 01 |
| 11 | 6790-7125 | 111 | Antitoxin protein (HicB) | 100(111/111) | Shewanella ballica OS 195 (pS 19501) | YP 0015570 02 |
| 12 | 7423-7767 | 114 | Hypothetieal protein | 98(112/114) | Shewanella ballica OS 195 (pS19502) | YP 0015570 25 |
| 13 | 7730-9058 | 442 | Hypothelieal protein | 98 (4432/442) | Shewanella ballica OS625 | EHC04198 |
| 14 | 9656-9967 | 103 | Hypothelieal protein | 99 (102/103) | Shewanella ballica OS625 | EHC04199 |
| 15 | 10260-10445c | 61 | Hypothelieal protein | 34(13/38) | Scheffersomyces siipitis CBS 6054 | XP 0013840 86 |
| 16 | 10524-10883 | 119 | Hypothelieal protein | 100(119/119) | Shewanella ballica OSI 85 (pS18501) | YP 0013554 46 |
| 17 | I0904-I6857C | 1979 | Conjugative transfer relaxa.se (Trał) | 99(1945/1969) | Shewanella ballica OS 195 (pS19502) | YP 0015570 30 |
| 18 | 17109-1923 5c | 708 | Type IV conjugative transfer system coupling (TraD) | 98 (694/708) | Shewanella ballica OS223 (pS22302) | YP 0023603 31 |
| 19 | 19908 2272Ic | 937 | Sex pilus assembly and mating pair (TraG) | 95 (892/937) | Shewanella ballica OS223 (pS22302) | YP 0023642 50 |
| 20 | 22724-241I2c | 462 | Type IV conjugalive transfer system protein (TraH) | 99(460/462) | Shewanella ballica OS625 | EHC04207 |
| 21 | 24296-24736c | 146 | Type-F conjugativc transfer system pilin assembly thioldisulfidc isomerase (TrbB) | 97(141/146) | Shewanella baltica OS 195 (pS19501) | YP 0015569 45 |
| 223 | 24750-25622C | 290 | Type-F conjugattve transfer system pilin assembly protein (TraF) | 99 (287/289) | Shewanella ballica OSI 85 (pS18501) | YP 0013554 54 |
| 23 | 25622-27433c | 603 | Conjugal transfer mating pair stabilization protein (TraN) | 87 (530/607) | Shewanella ballica OS223 (pS22302) | YP 0023642 56 |
| 24 | 27430-28170c | 246 | Typc-F eonjugativc transfer system pilin assembly protein (TrbC) ' | 100 (246/246) | Shewanella baltica OS 195 (pS19501) | YP 0015569 48 |
| 25 | 28193-29200c | 335 | Sex pilus assembly and synthesis protein (TraU) | 99 (332/335) | Shewanella ballica BAI75 (pSBAL1750I) | YP 0060185 ” 70 |
| 26 | 29187-2989 Ic | 234 | Type-F conjugative transfer system protein (TraW) | 99 (232/234) | Shewanella ballica OS625 | EHC04215 |
| 27 | 29R88-30259c | 123 | Conjugal transfer protein (Trbl) | 98(120/123) | Shewanella ballica OS223 (pS22302) | YP 0023603 19 |
| 28 | 30261-32849C | 862 | Typc-!V secretion system protein (TraC) | 99 (856/862) | Shewanella baltica BA17S (pSSAL17502) | YP 0060228 65 |
| 29 | 32853-33296c | 147 | Type IV conjugative transfer system protein (TraV) | 100(147/147) | Shewanella ballica OS 195 (pS19501) | YP 0015569 53 |
| 30 | 33329-34855c | 508 | Sex pilus assembly and synthesis protein (TraB) | 98 (500/508) | Shewanella ballica OS67E | YP 0052804 01 |
| 31 | 34852-35667c | 271 | Type-F conjugative transfer system secretin (TraK) | 95 (258/271) | Shewanella ballica OS223 (PS22302) | YP 0023642 64 |
| 32 | 35807-36232c | 141 | Type IV canjugative transfer system protein (TraE) | 97(118/122) | Shewanella ballica OS223 (pS22302) | YP 0023642 65 |
| 33 | 36273-36575C | 100 | Type IV conjugative transfer system protein (TraL) | 94(94/100) | Shewanella ballica OS 195 (PS195O1) | YP 0015569 57 |
| 34 | 36579-36953c | 124 | Type IV conjugativc transfer system pilin (TraA) | 87(111128) | Shewanella ballica BAI75 (pSBAL17502) | YP 0060228 71 |
| 35 | 37O17-372O5c | 62 | Hypothelieal protein | 100 (62/62) | Shewanella ballica OS223 (pS22301) | YP 0023602 54 |
| 36 | 37307-37564c | 85 | Hypothelieal protein witli helix-tum-helix domain | 100 (85/85) | Shewanella ballica OS 195 (pS19501) | YP 0015569 ” 59 |
| 37 | 37684-37866 | 60 | Hypothetieal protein | 100 (60/60) | Shewanella ballica OS 195 (pS19501) | YP 0015569 60 |
| 38 | 38139-38321 | 60 | Hypothelieal protein | 32(18/56) | Siapliylococcns aureus subsp. awetts USA300_FPR3757 | YP 494132 |
| 39 | 38308-39240 | 310 | Hypothetieal protein | 97(301/310) | Shewanella ballica OS 195 (pS19503) | YP 0015571 03 |
| 40 | 39774-40076c | 100 | Pyridoxamine kinase Tamily protein | 27(28/104) | Megasphaera micronuci/armis F0359 | ZP 0775718 7 |
| 41 | 40161-40442c | 93 | Hypothelieal protein | 86 (75/87) | Shewanella oneidensis MR-1 (megaplasmid) | NP 720395 |
| 42 | 40448-40975 | 175 | N-Acyltransferase superfamily protein | 91 (160/175) | Shewanella oneidensis MR-1 | NP 720396 |
(megaplasmid)
PL 220 839 B1
| 43 | 41417-41647c | 76 | Hypothetical protein | 100 (74/74) | Shewanella baliica OS223 (pS22301) | YP 0023602 50 |
| 44 | 41822-43012 | 396 | Plasmid partition protein (ParA) | 99 (392/396) | Shewanella baliica BA 175 (pSBAL1750l) | AEG13539 |
| 45 46 | 43012-44169 44256-44402 | 385 48 | Plasmid panilion protein (ParB) Hypothetical protein | 97(347/356) | Shewanella baliica BA 175 (pSBAL1750l) | YP 0060185 54 |
| 47 | 44438-48298 | 1268 | NTPase with transtnembranc hellces | 25 (321/1284) | Bacillus subtilis subsp, subtilis str. 168 | NP 389778 |
| 48 | 48454-49113 | 219 | Hypothetical protein | 60 (131/218) | Methylophaga tliioaxydans DMS010 | 7.P 0510295 2 |
| 49 | 49234-49623 | 129 | Hypothetical protein | 39(49/125) | Methylororus glucoselrophus SIP3-4 | YP 0030501 41 |
| 50 | 49640-50545 | 301 | Hypothetical protein | 34(102/300) | delta pmteobacterium MLMS-I | ZP 0129054 4 |
| 51 | 50655-51623 | 322 | Hypothetical protein | 66(212/322) | Pseudoaheromonas arclica A 37-1-2 | ZP 1027990 6 |
| 52 | 51781-52386 | 201 | Hypothetical protein | 25 (44/176) | Entembacter ctoacae SCF1 | YP 0039413 96 |
| 53 | 52593-53222c | 209 | Resolvase domain-containing protein (TnpR) | 98 (204/209) | Shewanella baliica OS 185 (pS 18501) | YP 0013554 08 |
| 54 | 53345-53827 | 159 | Transposase(TnpA) | 72 (32/46) | Vibrio fumissii CIP 102972 | ΕΕΧ38686 |
| 55 | 53836-54123 | 95 | Hypothetical protein | 83 (79/95) | Martnomortas sp. MWYL1 | ABR70068 |
| 56 | 54532-54840 | 102 | ArsR family transcriptional regulator | 94(96/102) | Shewanella sp. ANA-3 | YP_869986 |
| 57 | 54901-55143 | 80 | Thioredoxin - redox-active disal fide protein 2 | 93 (74/80) | Shewanella sp. ANA-3 | YP_869985 |
| 58 | 55162-55695 | 177 | Hypothetical protein | 95(169/177) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869984 |
| 59 | 55706-56386 | 226 | Cytochrome c biogenesis protein | 99(225/226) | Shewanella sp. ANA-3 | YP_869983 |
| 60 | 56554-57555 | 333 | RND family eftlux transporter MFP subunit | 93(311/333) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869982 |
| 61 | 57552-60625 | 1023 | Acriflavin resistance protein (AcrB) | 98(1002/1023) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869981 |
| 62 | 60743-61177c | 144 | Arsenate reductase (ArsC) | 94(131/140) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869980 |
| 63 | 61265-62512c | 415 | Arscnical pump membrano protein (ArsB) | 98 (407/414) | Shewanella sp. W3-18-1 | YP 964320 |
| 64 | 62613-64385c | 590 | Arsenite-activatcd ATPase (ArsA) | 92(543/590) | Shewanella sp. W3-18-1 | YP 964319 |
| 65 | 64420-64782C | 120 | Arsenical resistance operon trans-acting repressor (ArsD) | 85(102/120) | Shewanella sp. W3-18-1 | YP_964318 |
| 66 | 65155-67719 | 854 | Respiratory arsenate reductase, Mo binding subunit (ArrA) | 96(818/854) | Shewanella sp. ANA-3 | YP869976 |
| 67 | 67731-68435 | 234 | Respiratory arsenate reductase, FeS subunit (ArrB) | 97 (228/234) | Shewanella sp. ANA-3 | YP_869975 |
| 68 | 68506-69936e | 476 | Glutathirme synthase | 86 (409/476) | Shewanella pulrefaciens CN-32 | YP 0011827 43 |
| 69 | 70092-71144c | 350 | Peimease | 76(271/358) | Shewanella pulrefaciens CN-32 | YP 0011853 28 |
| 70 | 71369-71656 | 95 | ArsR family transcriptional regulator | 92 (87/95) | Shewanella sp. ANA-3 | YP.869972 |
| 71 | 71755-72171 | 138 | Transcriptional regulator tyrosine phosphatase (ArsR) | 93(127/138) | Shewanella sp. ANA-3 | YP_869971 |
| 72 | 72164-72511 | 115 | ArsR family transcriptional regulator | 97(112/15) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869970 |
| 73 | 72590-73102 | 170 | Protein tyrosine phosphatase (ArsC2) | 84(141/167) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869969 |
| 74 | 73195-74192 | 332 | Permease | 96 (318/332) | Shewanella sp. ANA-3 | YP 869968 |
| 74204-74440 | 78 | Redox-activedisulfide protein 2 | 97 (76/78) | Shewanella putrefaciens CN-32 | YP 0011853 22 | |
| 75 | 74448-74939 | 163 | Dual specifici ty protein phosphatase | 86(140/163) | Shewanella putrefaciens CN-32 | YP 0011853 21 |
| 76 | 74996-76006 | 336 | Glyccraldchydc-3-phosphate dehydrogenase | 99(332/336) | Shewanetla sp. W3-18-1 | YP 964294 |
| 77 | 76012-77250 | 412 | Major facilitator superfamily prutein | 99(409/412) | Shewanella pulrefaciens 200 | YP 0060091 70 |
| 78 | 77357-77656 | 99 | Hypothetical protein | 92 (91/99) | Shewanella pulrefaciens CN-32 | YP 0011853 18 |
| 79 | 77964-78146 | 60 | Hypothetical protein | 32(13/41) | Slreplocoacus pneumoniae | CAI34I25 |
| 80 | 78249-78683 | 144 | Peptidase S24/S26A/S26B | 97(139/144) | Shewanella baliica BA175 (pSBALI7501) | YP 0060186 10 |
| 81 | 78671-79924 | 417 | UMUC domain-contaming protein DNA-repair protein | 93(389/417) | Shewanella baliica BA175 (pS BALI 7501) | YP 0060186 09 |
PL 220 839 B1
| 82 | 79975-80238 | 87 | Vitamin B12 dependent incthionine synthasc | 30(24/81) | Coprococcus cotnes ATCC 27758 | ZP 0379871 0 |
| 83 | 80344-80994 | 216 | Hypothctical protein | 68(150/219) | Aciomonas hydrophila | YP 0029955 63 YP 0060352 06 |
| 84 | 81035-81253 | 72 | Hypothetical protein | 93 (67/72) | Shewanella ballica OS 117 (pSBAL11701) | |
| 85 | 81273-81591 | 106 | Hypothetical protein | 96(102/106) | Shewanella ballica BA 175 (PSBAL17501) | YP 0060186 03 |
P r z y k ł a d 2. Konstrukcja szczepu bezplazmidowego oraz analiza funkcjonalna plazmidu pSheB
Aby wykazać, że plazmid pSheB oraz zlokalizowany w jego obrębie moduł genowy kodujący potencjalne białka są zaangażowane w oporność na arsen oraz dysymilacyjną redukcję arseninów, skonstruowano bezplazmidową pochodną szczepu Shewanella sp. O23S i przeprowadzono jego analizę funkcjonalną. Jako czynnik stresowy stymulujący mechanizmy usuwania plazmidów z komórek gospodarza wykorzystano roztwór Bromku Etydyny (EtBr) o końcowym stężeniu 5 μΜ.
Nocną hodowlę dzikiego szczepu Shewanella sp. O23 prowadzoną na podłożu LB z dodatkiem 5 mM arsenianu sodu przepasażowano na podłoże LB z 5 μΜ EtBr. Gęstość optyczna hodowli na starcie eksperymentu wynosiła OD=0,1, a hodowlę prowadzono 24 godziny, w 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. Po 24 godzinach inkubacji przygotowano rozcieńczenia hodowli 10-4,-6,-8,-10, odpowiednio i wysiano po 100 μΐ każdego z nich na podłoże LB zestalone agarem. Następnie, losowo wybrano 96 kolonii i przepasażowano metodą replik na:
i. stałe podłoże LB, ii. stałe podłoże LB z dodatkiem arsenianu sodu (50 mM), oraz iii. płynne podłoże minimalne R1-R2 (sól R1: NaCl-1,17g/l; KCl-0,3g/l; NH4Cl-0,15g/l; MgCl2 x 6H2O-0,41g/l; CaCl2 x 2H2O-0,05g/l oraz sól R2 (KH2PO4-0,17g/l; NaHCO3-2, g/l; Na2SO4 x 10 H2O-0,07g/l zmieszane w stosunku 1:1), wzbogacone mleczanem sodu o końcowym stężeniu 5 mM, solami wg Touvinena* (2 ml/l) (pH 6,0; o składzie: Na2EDTA 50 g/l; ZnSO4-7H2O 11 g/l; MnCl2-7H2O 5,5 g/l; FeSO4-7H2O 2,5 g/l; (NH4)6Mo7O24-4H2O 5 g/l; CuSO4-5H2O 2 g/l; CoCl2-6H2O 0,5 g/l; NaOH 11 g/l) (Touvinien et al., 1973), ekstraktem drożdżowym o końcowym stężeniu 0,004% oraz 2,5 mM arsenianem sodu.
Hodowle na podłożach stałych inkubowano 72 godziny, natomiast hodowle na podłożu płynnym prowadzono w 200 μl w 96 dołkowych płytkach titracyjnych w pojemnikach typu Anaerocult® (Merck) zapewniających warunki beztlenowe przez 168 godzin.
Hodowle prowadzone na podłożu płynnym miały na celu określenie zdolności wybranych szczepów do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. Po 5 dniach inkubacji w warunkach beztlenowych, do hodowli dodawano 100 μl 0,1 M roztworu azotanu srebrowego. Wynikiem reakcji pomiędzy AgNO3 a As (III) lub As (V) jest wytworzenie kolorowego osadu. Brązowy osad świadczy o obecności Ag3AsO4 (ortoarsenian srebrowy), podczas gdy żółty osad świadczy o obecności Ag3AsO3 (arsenin srebrowy). W przypadku testu na zdolność do redukcji arseninów obecność żółtego osadu świadczy, więc o redukcji As(V) do As(III).
Hodowle prowadzone na podłożu stałym LB wzbogaconym arsenianem sodu miały na celu sprawdzenie oporności na As(V). Z kolei, hodowle prowadzone na podłożu stałym LB (niewzbogacanym dodatkowymi substancjami) miały na celu zabezpieczenie (kontrolę pozytywną) potencjalnych mutantów. Wszystkie szczepy, które wyrosły na podłożu LB, a nie były zdolne do wzrostu na podłożu LB wzbogaconym As(V) oraz na podłożu minimalnych R1-R2 zawierającym arsenian (ostateczny akceptor elektronów) i mleczan (donor elektronów), zostały wytypowane jako potencjalne mutanty pozbawione plazmidu pSheB.
W celu weryfikacji wyselekcjonowanych konsorcjów sprawdzono profil plazmidowy dzikiego szczepu (Shewanella sp. O23) oraz potencjalnych bezplazmidowych mutantów. Za pomocą metody mini-lizy alkalicznej wyizolowano plazmidowe DNA i przeprowadzono analizę elektroforetyczną (0,8% żel agarozowy). Porównanie wzorów plazmidowych wybranych szczepów pozwoliło na identyfikację, bezplazmidowych mutantów. Dodatkowym potwierdzeniem braku obecności plazmidu pSheB w komórkach skonstruowanych mutantów była analiza PCR. W genomach potencjalnych mutantów przeprowadzono reakcję PCR z zastosowaniem starterów:
endA-L GCTGTTGCTTCCAATACGAC (SEKW. ID. NR 2) oraz endA-R GGCGCTGCGACTTACTCATC (SEKW. ID. NR 3)
PL 220 839 B1
Starter endA-L odpowiada odpowiednio pozycji nukleotydu 127, a endA-R pozycji 679 plazmidu pSheB w odniesieniu do SEKW. ID. NR 1. Do dalszej analizy zostały wybrane szczepy (potencjalne mutanty), które w reakcji PCR dały negatywny wynik z zastosowaniem opisanych powyżej starterów.
Następnym etapem weryfikacji szczepów nieposiadających plazmidu pSheB była ich analiza funkcjonalna. Ponownie sprawdzano czy wybrane szczepy są zdolne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. W tym celu przeprowadzono testy na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym arsenianem sodu i mleczanem sodu oraz z wykorzystaniem testu z 0,1M roztworem azotanu srebra. Szczepy, które nie były zdolne do redukcji, były wrażliwe na As(V) i As(III) oraz nie posiadały plazmidu pSheB okazały się dowodem, że plazmid pSheB warunkuje zdolność do oddychania arsenianowego oraz oporność na arsen. Fig. 2. przedstawia wykres obrazujący kinetykę redukcji arsenianów szczepu dzikiego i mutanta pozbawionego plazmidu pSheB. Szczep pozbawiony plazmidu nie był zdolny do wzrostu na podłożu minimalnym z dodatkiem 2,5 mM arsenianu sodu, w związku z czym nie był w stanie redukować As (V) do As (III). W ten sposób wykazano, że informacja genetyczna zawarta na plazmidzie pSheB (SEKW. ID. NR 1) warunkuje nabycie zdolności do wzrostu w warunkach beztlenowych z wykorzystaniem arseninów jako ostatecznego akceptora elektronów, a więc zdolności do dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
P r z y k ł a d 3. Konstrukcja wektora niosącego moduł genowy kodujący białka zaangażowane w dysymilacyjną redukcję arseninów
Aby wykazać, które geny zlokalizowane na plazmidzie pSheB kodują białka odpowiedzialne za dysymilacyjną redukcję arsenianów, sklonowano moduł arr, obejmujący m.in. geny dysymilacyjnej reduktazy arsenianowej arrAB, w wektorze pBBR1-MCS2 (Kmr) w szczepie Escherichia coli TOP10 i sprawdzono jego funkcjonalność.
W celu sklonowania modułu arr przeprowadzono reakcję amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 8634 pz (obejmującego region od pozycji 63978 do 72599 w genomie pSheB) na matrycy DNA plazmidu pSheB wyizolowanego za pomocą metody mini-lizy alkalicznej. Jako startery w reakcji PCR wykorzystano następujące oligonukleotydy:
She_Mph1103F: GAAATCTTGCAGTAGCGATGCATC (SEKW. ID. NR 4) [pozycja w genomie plazmidu pSheB: 63978-64001; podkreślona sekwencja to miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez enzym Mph103I (Nsil)] oraz
She_XmaJR: GTTGTTCCTAGG CTGGTGCCATATCAACCTCTAG (SEKW. ID. NR 5) (pozycja w genomie plazmidu pSheB: 72578-72599; sekwencja zapisana italikiem to sekwencja dodana; podkreślone miejsce jest rozpoznawane przez enzym restrykcyjny XmaJI). Do amplifikacji wykorzystano Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific).
Uzyskany produkt PCR (8634pz) wklonowano w wektor plazmidowy: pBBR1MCS-2 (Kmr) [Kovach et al., 1995] strawiony (uliniowiony) Smal. Mieszaninę ligacyjną produktu PCR oraz wektora pBBR1MCS2 strawionego enzymem Smal wprowadzono za pomocą transformacji chemicznej, metodą rubidowo wapniową wg Kushnera (1978), do komórek szczepu Escherichia coli Top 10 [merA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <p80/acZAM15 AlacX74 recA1 araD139 &(ara-leu)7697 galU galK rpsL end A1 nupG]. Jako podłoże selekcyjne zastosowano podłoże pełne LB z kanamycyną (30 μg/ml), IPTG (0,5 μg), oraz X-gal (40 μg/ml).
Z puli uzyskanych transformantów (białych kolonii opornych na kanamycynę), wybrano szczepy, które niosły plazmid o odpowiedniej wielkości: 13778 pz (pBBR1MCS2 - 5144pz + moduł arr 8634pz). Obecność skonstruowanego plazmidu potwierdzano poprzez analizę restrykcyjną (trawienie enzymami XmaJI oraz Mph1103I), analizę elektroforetyczną i sekwencjonowanie. Do dalszej analizy wybrano szczep Escherichia coli MR1 (pochodna szczepu E. coli TOP10) niosący plazmid pARRIA (pochodna pBBR1MCS2 z wklonowanym modułem arr).
W celu sprawdzenia funkcjonalności skonstruowanego plazmidu pARR1A przeprowadzono analizę fenotypową szczepu E. coli MR1 na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym 2mM arsenianem sodu i 5 mM mleczanem sodu oraz z dodatkiem 0,004% ekstraktu drożdżowego. Hodowlę prowadzono przez 120 h w warunkach beztlenowych (w atmosferze CO2:N2) w temperaturze 37°C. Po pięciu dniach hodowli przeprowadzono test z 0,1M roztworem azotanu srebra, który wykazał, że badany szczep zredukował arseniany do arseninów. Potwierdzeniem redukcji arsenianów do arseninów przez szczep E. coli MR1 (pARRIA) była analiza jakościowa HPLC na specjację arsenu. Przeprowadzona analiza wykazała, że po 120 h inkubacji szczepu E. coli MR1 w podłożu zidentyfikowano arseniny. W reakcji kontrolnej ze szczepem E. coli TOP10 (bez plazmidu) nie zaobserwowano redukcji As(V) do As(III).
PL 220 839 B1
Uzyskane wyniki wykazały, że wprowadzenie genów modułu arr, pochodzące z genomu plazmidu pSheB, na wektorze pBBRIMCS do szczepu E. coli TOP10 prowadzi do nabycia zdolności do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. Wprowadzony do E. coli TOP10 moduł odpowiadał fragmentowi sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1. W ten sposób wykazano, że jest to fragment plazmidu odpowiedzialny za jego zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. Wykazano również, że inna bakteria niż ta od której pochodzi plazmid pSheB, czyli inny gatunek bakterii lub szczep bakteryjny, do którego wprowadzono fragment sekwencji obejmujący fragment sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1 nabywa zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
P r z y k ł a d 4. Usuwanie arsenu z minerałów miedziowych z wykorzystaniem szczepu
Shewanella sp. O23S
Aby wykazać, że szczep zawierający plazmid pSheB (SEKW. ID. NR 1), przykładowo szczep Shewanella sp. 023S niosący plazmid pSheB może być wykorzystany w biometalurgii, w procesach selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych przeprowadzono eksperyment z wykorzystaniem dwóch typów minerałów: miedzionośnego łupka bitumicznego typu „Kupferschiefer” oraz odpadów flotacyjnych pierwszego ciągu uzyskanych z Zakładu Górniczego Lubin (KGHM, Polska). Średnia zawartość arsenu w miedzionośnym łupku bitumicznym oznaczonym jako „Łupki” wyniosła 1000-3000 mg/kg łupka, natomiast zawartość arsenu w odpadach flotacyjnych oznaczonych jako Middlings wynosiła 250-350 mg/kg odpadów. Poza arsenem, oba typy minerałów zawierają Cu w zakresie 35000-110000 mg/kg suchej masy oraz inne cenne metale np. Co - 500-2500 mg/kg, Zn 15-2800mg/kg, Ni - 250-500 mg/kg.
Eksperyment usuwania arsenu z opisanych powyżej surowców mineralnych prowadzono w podłożu R1-R2 wzbogaconym 5 mM mleczanem sodu jako źródło węgla i energii, solami Touvinena* (2 ml/l) oraz ekstraktem drożdżowym o końcowym stężeniu 0,004%. Substrat mineralny (łupki lub odpady flotacyjne) o wielkości frakcji 125-250 mm był dodawany do końcowego stężenia 10%. Hodowle były prowadzone w 100-ml butelkach w warunkach beztlenowych w atmosferze mieszaniny gazów N2:CO2 (4:1), przez 21 dni w temperaturze 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. W celu uzyskania inokulum szczepu Shewanella sp. O23S założono hodowle nocne na płynnym podłożu pełnym LB. Hodowlę nocną szczepu O23S kilkukrotnie wirowano i przepłukiwano roztworem soli fizjologicznej, a następnie pasażowano na odpowiednie podłoże do uzyskania gęstości około 106 komórek/ml. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże z dodatkiem odpowiedniego substratu, nie zaszczepione bakteriami.
Na początku eksperymentu oraz co 7 dni pobierano próbki do oznaczeń zawartości miedzi oraz arsenu, które to oznaczenia prowadzono przy pomocy atomowej spektroskopii absorbcyjnej - techniką płomieniową; (AA Solaar M6 Spectrometer, TJA Solutions, UK).
Przeprowadzone analizy wykazały, że najwyższe stężenie arsenu w płynach hodowlanych na podłożu wzbogaconym odpadami flotacyjnymi zanotowano po 14 dniach inkubacji (324,75 μg/l) (Fig. 3A). W kolejnym tygodniu inkubacji stężenie arsenu spadło (192,75 mg/l), co może być związane z wytrącaniem arsenu w postaci wtórnych minerałów.
W próbkach kontrolnych stężenie arsenu było na dużo niższym poziomie (nie przekroczyło 153,75 μg/l) i odzwierciedlało chemiczne procesy ługowania. Z kolei, w płynach hodowlanych na podłożu wzbogaconym łupkami bitumicznymi, najwyższe stężenie arsenu zanotowano po 21 dniach eksperymentu (678,25 μg/l). W tym samym czasie w próbie kontrolnej odnotowano ok. 14 krotnie niższe stężenie arsenu (47,25 μg/l). Wyniki te wskazują że szczep Shewanella sp. O23S z plazmidem pSheB (SEKW. ID. NR 1) jest zdolny do uwalniania arsenu z minerałów miedziowych. Niezwykle istotne było więc sprawdzenie jak uwalnianie arsenu wpłynie na mobilizację miedzi. W przypadku analizy zawartości miedzi nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy zawartością Cu w płynach hodowlanych a próbą kontrolną. Na starcie eksperymentu zanotowano, że część miedzi została wypłukana z minerałów w wyniku chemicznego (stymulowanego przez składniki podłoża) rozpuszczania minerałów miedziowych (Fig. 4). Uwalnianie miedzi zachodziło z niezwykle niską wydajnością, a stężenia Cu w płynach hodowlanych i w próbach kontrolnych nie przekraczały 3,5 ppm. Ponadto wraz z upływem czasu stężenie miedzi spadało (po 21 dniach hodowli stężenie Cu było poniżej 0,5 ppm (Fig 4.), co było zapewne związane z chemicznym wytrącaniem miedzi.
PL 220 839 B1
Przeprowadzony eksperyment pozwolił wykazać, że szczep zawierający plazmid pSheB (SEKW. ID. NR 1), tj. szczep Shewanella sp. O23S zdeponowany jako KKP2045p usuwa arsen z miedzionośnych łupków bitumicznych jak i odpadów flotacyjnych w sposób selektywny przy jednoczesnym braku mobilizacji miedzi ze złóż miedzionośnych.
P r z y k ł a d 5. Mobilizacja arsenu z gleb zanieczyszczonych arsenem z wykorzystaniem szczepu Shewanella sp. O23S
Aby wykazać, że szczep niosący plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1 lub jego funkcjonalną pochodną, taki jak Shewanella sp. O23S niosący plazmid pSheB może być wykorzystany w bioremediacji, w procesach selektywnego usuwania arsenu z gleb skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment z wykorzystaniem gleby pochodzącej z okolic kopalni złota w Złotym Stoku. Średnia zawartość arsenu w glebie wyniosła 17955,7 mg/kg gleby.
Eksperyment usuwania arsenu z gleby prowadzono w podłożu R1-R2 wzbogaconym 5 mM mleczanem sodu (źródło węgla i energii), solami Touvinena* (2 ml/l) oraz ekstraktem drożdżowym o końcowym stężeniu 0,004%. Rozdrobniona próbka (o wielkości frakcji < 3 mm) była dodawana do podłoża do końcowego stężenia 10%. Hodowle były prowadzone w 100-ml butelkach w warunkach beztlenowych w atmosferze mieszaniny gazów N2:CO2 (4:1), przez 21 dni w temperaturze 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. W celu uzyskania inokulum szczepu Shewanella sp. O23S założono hodowle nocne na płynnym podłożu pełnym LB. Hodowlę nocną szczepu 023S kilkukrotnie wirowano i przepłukiwano roztworem soli fizjologicznej, a następnie pasażowano na odpowiednie podłoże do uzyskania gęstości około 106 komórek/ml. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże z dodatkiem gleby, nie zaszczepione bakteriami.
Na początku eksperymentu oraz co 7 dni pobierano próbki do: (i) oznaczeń zawartości arsenu (oznaczenia za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej - techniką płomieniową) w płynach hodowlanych (ii) monitorowania wzrostu bakterii, poprzez analizę liczby jednostek tworzących kolonię (jtk (ang. cfu)) (wysiewy na podłoże stałe LB wzbogacone 5 mM arsenianem sodu). Przeprowadzone analizy wykazały, że najwyższe stężenie arsenu w płynach hodowlanych zanotowano po 14 dniach inkubacji (166,53 mg/l), natomiast po kolejnych 7 dniach inkubacji stężenie arsenu nieznacznie spadło (123,03 mg/l), co może być związane z wytrącaniem arsenu w postaci wtórnych minerałów. W próbkach kontrolnych stężenie arsenu było na dużo niższym poziomie (nie przekroczyło 25 mg/l) i odzwierciedlało chemiczne procesy ługowania. Wykazano, że szczep zawierający plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1 tj. szczep Shewanella sp. O23S usuwa arsen z gleb nim zanieczyszczonych i może być wykorzystanych w bioremediacji np. przy rekultywacji gleb skażonych arsenem czy usuwania arsenu z innych zanieczyszczonych środowisk.
P r z y k ł a d 6. Analiza akumulacji arsenu przez szczep Shewanella sp. O23S
Eksperyment wzrostowy oraz analiza wydajności dysymilacyjnej redukcji arsenianów prowadzona w podłożu R1-R2 (Fig. 2) wykazała, że szczep niosący plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1. lub jego funkcjonalną pochodną taki jak Shewanella sp. O23S całkowicie redukuje arseniany do arseninów, które są całkowicie usuwane poza komórkę. Aby potwierdzić, że szczep Shewanella sp. O23S nie jest zdolny do akumulacji arsenu w komórkach, przeprowadzono dodatkowy 24 godzinny eksperyment wzrostowy na podłożu płynnym LB. Podłoże LB zostało wzbogacone roztworem arseninów sodu (NaAsO2) bądź arsenianów sodu (Na2HAsO4) o stężeniu końcowym 2 mM. Hodowle były prowadzone w objętości 50 ml w warunkach tlenowych w temperaturze 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. Jako kontrolę zastosowano sterylne podłoże LB z roztworami badanych soli. Po 24 godzinach inkubacji hodowle zwirowano i oznaczono zawartość arsenu w płynach hodowlanych oraz biomasie (osadzie bakteryjnym) za pomocą absorpcyjnej spektroskopii atomowej (AA Solaar M6 Spectrometer, TJA Solutions, UK).
Przeprowadzone analizy nie potwierdziły eksperymentów wzrostowych na podłożu R1-R2 i wykazały, że związki arsenu mogą być częściowo akumulowane w komórkach szczepu Shewanella sp. O23S. Efektywność tego procesu jest jednak na bardzo niskim poziomie, poniżej 3% dla związków As(III), natomiast poniżej 8% dla związków As(V).
PL 220 839 B1
T a b e l a 2. Porównanie zdolności do akumulacji arsenu przez szczep Shewanella sp. 023S hodowany na podłożu minimalnym (R1-R2) oraz pełnym (LB).
| Podłoże LB | Podłoże | R1-R2 |
| Aslll AsV | Aslll | AsV |
| Zawartość arsenu w płynach hodowlanych [ppm] | 144,8119 | 163,8377 | 204,8073 | N/O |
| Zawartość arsenu w biomasie [ppm] | 5,809583 | 13,97905 | 4,1078 | N/O |
| Wydajność akumulacji [%] | 7,861492 | 1,9636 | N/O |
N/O - nie oznaczano
P r z y k ł a d 7. Analiza produkcji lotnych związków arsenu przez szczep Shewanella sp. O23S
Aby sprawdzić czy szczep Shewanella sp. O23S zawierający plazmid pSheB jest zdolny do produkcji lotnych związków arsenu przeprowadzono beztlenową (w atmosferze N2:CO2; 4:1) hodowlę na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym 5 mM mleczanem sodu oraz 2,5 mM arsenianem sodu. Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 22°C pobrano próbki gazów do analizy składu chemicznego w chromatografie gazowym GC-MS i GC-AED. Przeprowadzone analizy wykazały, że jedynym lotnym związkiem produkowanym przez szczep Shewanella sp. O23S z plazmidem pSheB jest dimetylomonosiarczek (DMS). Nie zaobserwowano produkcji lotnych związków arsenu.
P r z y k ł a d 8. Strącanie AS2S3 (siarczku arsenu(III)) przez szczep Shewanella sp. 023S w podłożu zawierającym As(V) i tiosiarczan
Aby wykazać, że szczep niosący plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1 lub jego funkcjonalną pochodną, taki jak Shewanella sp. O23S niosący plazmid pSheB może być wykorzystany w bioremediacji, w procesach selektywnego usuwania arsenu z gleb skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment, w którym arsen był wytrącany z podłoża w postaci siarczku arsenu (III) (As2S3). W tym celu przeprowadzono eksperyment usuwania arsenu z podłoża R1-R2 wzbogaconego 5 mM mleczanem sodu (jako źródło węgla i energii) i solami Touvinena* (2 ml/l) oraz 2,5 mM arsenianem sodu oraz 5 mM tiosiarczanem sodu jako ostateczne akceptory elektronów. Podłoże zaszczepiano uzyskując wyjściową gęstość hodowli 106 komórek/ml. Hodowle prowadzono w warunkach beztlenowych, w temperaturze pokojowej. Zwartość arsenu w roztworze mierzono w czasie T0 oraz w 1, 2, 3, 4 oraz 7, 14 i 21 dniu hodowli. Obserwowano również pojawianie się żółtopomarańczowego osadu siarczku arsenu III (As2S3). Po 7 dniach zanotowano ubytek 47,8% arsenu w roztworze i pojawianie się charakterystycznego osadu nierozpuszczalnego w wodzie. Po 21 dniach hodowli ubytek arsenu sięgał 82,3% (Fig. 6). W kontrolach zawierających sterylne podłoże tiosiarczan lub siarczek sodu lub siarczany (IV) lub siarczany (VI) oraz arseniany (III) lub arseniany (V) nie obserwowano ubytku arsenu w roztworze, ani pojawiania się osadów siarczków arsenu. Niniejszym wykazano, że szczep zawierający plazmid pSheB (SEKW. ID. NR 1), tj. szczep Shewanella sp. O23S zdeponowany jako KKP2045p jest zdolny w obecności mineralnych związków siarki do usuwania arsenu z roztworów (np. glebowych) w postaci siarczku arsenu III a tym samym jego immobilizacji.
P r z y k ł a d 9. Zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów przez szczep Shewanella sp. O23S w warunkach lekko kwaśnych
Aby sprawdzić czy szczep Shewanella sp. O23S jest zdolny do dysymilacyjnej redukcji arsenianów w warunkach lekko zasadowych przeprowadzono hodowlę na podłożu minimalnym R1+R2 o pH 4, wzbogaconym 2,5 mM arsenianem sodu, 5 mM mleczanem sodu oraz 0,004% ekstraktem drożdżowym. Hodowlę prowadzono przez 168 h w temperaturze pokojowej. Jako kontrolę przeprowadzono analogiczny eksperyment w podłożu o pH 8. Przeprowadzone badania wykazały, że najbardziej optymalnych warunkach w podłożu o pH 8, Shewanella sp. O23S całkowicie zredukowała obecny w podłożu As(V) w ciągu 4h (Fig. 7A). Natomiast w podłożu o pH 4 metabolizm Shewanella sp. O23S oraz kinetyka procesu redukcji arsenianów do arseninów zostały spowolnione i całkowita redukcja As(V) nastąpiła po 48h (Fig. 7B). Niemniej jednak, uzyskane wyniki wykazały, że szczep Shewanella sp. O23S jest zdolny do dysymilacyjnej redukcji arsenianów w warunkach lekko kwaśnych.
PL 220 839 B1
P r z y k ł a d 10. Oporność na metale ciężkie szczepu Shewanella sp. O23S
Aby zastosować szczep w mobilizacji arsenu ze złóż polimetalicznych, koncentratów miedziowych czy odpadów flotacyjnych wykorzystywany szczep musi charakteryzować wysoką opornością na metale ciężkie. W związku z powyższym sprawdzono zdolność Shewanella sp. O23S do tolerowania obecności metali ciężkich oraz zdolność do redukcji As(V) do As(III) w obecności metali ciężkich.
W celu sprawdzenia zakresu tolerancji na obecność metali ciężkich szczep Shewanella sp. O23S hodowano na podłożu pełnym LB z dodatkiem odpowiednich roztworów metali ciężkich:
T a b e l a 3. Metale i ich związki wykorzystane do oznaczeń minimalnego stężenia hamującego (MIC).
| Analizowany metal | Związek chemiczny | Stężenie [mM] | Stężenie [mg/l] |
| As (III) | NaAsO2 | 0,5-5 | 37,5-375 |
| As (V) | Na2HAsO4 | 1-600 | 75-45 000 |
| Cr (III) | Cr2(SO4)3-18H2O | 2-12 | 104-624 |
| Zn (II) | ZnSO4-7H2O | 1-6 | 65,5-393 |
| Se (VI) | Na2SeO4-10H2O | 1-20 | 79-1580 |
| Cu (II) | CuSO4-5H2O | 1-6 | 63,5-380 |
| Co (II) | CoSO4-7H2O | 1-6 | 59-354 |
| Mn (II) | MnSO4-H2O | 1-20 | 55-330 |
| V (V) | NaVO3 | 1-20 | 51-1020 |
| Cd (II) | CdSO4-8H2O | 1-6 | 112-672 |
Nocną hodowlę Shewanella sp. O23S pasażowano na podłoże LB wzbogacone odpowiednim związkiem metalu lub metaloidu (do uzyskania gęstości około 106 cfu/ml) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 22°C. Następnie przeprowadzono pomiary OD600 i wyznaczono wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC, ang. minimal inhibitory concentration), które jest definiowane jako najniższe stężenie Men+, które całkowicie hamuje wzrost bakterii. W celu sprawdzenia czy obecność metali ciężkich hamuje zdolność do redukcji arsenianów do arseninów przeprowadzono test na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym 2,5 mM arsenianem sodu, 5 mM mleczanem sodu, 0,004% ekstraktem drożdżowym oraz dodatkiem odpowiednich roztworów metali ciężkich.
Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że szczep Shewanella sp. 023S oprócz oporności na As(III) i As(V) jest także oporny na Cu, Cd, Cr, Co, Mii, Zn, Se, V (Tabela 4). Ponadto, jest także zdolny do dysymilacyjnej redukcji arsenianów w obecności metali ciężkich. Tylko w obecności żelaza (III) nie wykazano zdolności do dysymilacyjnej redukcji, 5 ponieważ szczep ten jest zdolny do redukcji Fe(III) i wykorzystywania go jako ostateczny akceptor elektronów (Tabela 4).
T a b e l a 4. Wartość minimalnego stężenia metali ciężkich hamującego (MIC) wzrost bakterii oraz wartość maksymalnego stężenia metali pozwalającego na dysymilacyjną redukcję 2,5 mM arsenianu sodu przez szczep Shewanella sp. O23S.
| Pierwiastek | Wartość MIC [Mm] | Redukcja arsenu w obecności metalu [Mm] |
| Cd(II) | 1 | 1 |
| Co(II) | 2 | 2 |
| Cr(III) | 5 | 3 |
| Cu(II) | 3 | 2 |
| Fe(III) | 5 | - |
| Mn(II) | > 20 | > 5 |
| Se(VI) | > 20 | 5 |
| Zn(II) | 3 | 2 |
| V(V) | > 20 | > 5 |
PL 220 839 B1
Literatura powoływana w opisie, włączona jest niniejszym w całości jako referencie:
Bultreys A. i I. Gheysen. 2000. Production and comparison of peptide siderophores from strains of distantly related pathovars of Pseudomonas syringae and Pseudomonas viridiflava LMG 2352. Appl. Environ. Microbiol. 66:325-31.
Drewniak L. 2009. Charakterystyka bakterii arsenowych wyizolowanych z kopalni złota w Złotym Stoku. Praca doktorska. Wydział Biologii. Uniwersytet Warszawski.
Drewniak L., Matlakowska R., Rewerski B. i Skłodowska A. 2010. Arsenic release from gold mine rocks mediated by the activity of indigenous bacteria. Hydrometallurgy 104 (3-4): 437-442
Fornasiero D., Fullston C.L. i Ralston J. 2001. Separation of enargite and tennantite from nonarsenic copper sulfide minerals by selective oxidation or dissolution. International Journal of Mineral Processing, 61 (2): 109-119
Guo H. i Yen W.T. 2005. Selective flotation of enargite from chalcopyrite by electrochemical control, Miner Eng. 18 (6):605-612.
Kovach M.E., Elzer P.H., Hill D.S., Robertson G.T., Farris M.A., Roop R.M., Peterson K.M. 1995. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-6.
Kushner S.R. 1978. An improved method for transformation of E. coli with ColE1 derived plasmids, str. 17-23. Boyer H.B. i S. Nicosia (ed.). Genetic engineering. Elsevier/North-Holland, Amsterdam
Mantur A., Rajpert L., Rewerski B., Ruszkowski D., Skłodowska A. i Drewniak L. 2011. New dissimilatory arsenate reducers - isolation, characteristic and potential application in biometallurgy. Prezentacja na konferencji BioMicroWorld 2011, Malaga, Hiszpania
Newman D.K., Ahmann D. i Morel F.M. 1998. A brief review of microbial arsenate respiration. Geomicorbiol. J. 15:255-268
Olson G.J., Brierley J.A. i Brierley C.L. 2003. Bioleaching review part B: progress in bioleaching: applications of microbial processes by the minerals industries. Appl Microbiol Biotechnol. 63(3):249-257
Piret N.L. 1999. The removal and safe disposal of arsenic in copper processing. JOM, 51(9) 16-17
Rawlings D.E. i Johnson D.B. 2007. A Rewiew: The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiol. 153:315-324
Robins R.G. 1985. The aqueous chemistry of arsenic in relation to hydrometallurgical processes. Proceedings of the 15th Annual CIM Hydrometallurgical Meeting, Vancouver, Canada, pp. I1-126.
Sambrook J. i Russell D.W. 2001 Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Schwyn B. i J.B. Neilands. 1987. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Anal. Biochem. 160:47-56.
Senior G.D. Guy P.J. i Bruckard W.J. 2006. The Selective Flotation of Enargite from Other Copper Minerals - A Single Mineral Study in Relation to Beneficiation of the Tampakan Desposit in the Philippines. Internation Journal of Mineral Processing, 81:15-26
Skłodowska A. i Matlakowska R. 2007. Bioleaching of metals in neutral and slightly alkaline environment In Microbial Processing of Metal Sulfides Edts.: Edgardo R. Donati Wolfgang Sand Published by Springer, Dordrecht, The Netherlands. ISBN-10 1-4020-5588-9 (HB); ISBN-13 978-1-4020-5588-1 (HB)pp. 121-130
Tuovinen O.H. i D.P. Kelly. 1973. Studies on the growth of Thiobacillus ferrooxidans, I. Use of membrane filters and ferrous iron agar to determine viable numbers, and comparison with 14 CO2fixation and iron oxidation as measures of growth. Arch. Mikrobiol. 88:285-98.
Xia L., Yin C., Dai S., Qiu G., Chen X. i Liu J. 2010. Bioleaching of chalcopyrite concentrate using Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans in a continuous bubble column reactor. J Ind Microbiol Biotechnol. 37(3): 289-295.
Xia L., Dai S., Yin C., Hu Y., Liu J., i Qiu G. 2009. Comparison of bioleaching behaviors of different compositional sphalerite using Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus caldus. J Ind Microbiol Biotechnol. 36(6):845-85.
Zobrist J., Dowdle P.R., Davis J.A. i Oremland R.S. 2000. Mobilization of Arsenite by Dissimilatory Reduction of Adsorbed Arsenate. Environ. Sci. Technol. 34:4747-4753.
PL 220 839 B1
Na poniższym wykazie sekwencji:
-SEKW. ID. NR. 1 odpowiada pełnej sekwencji nukleotydowej plazmidu pSheB z Shewanella sp. O23S
Wykaz sekwencji <110> Uniwersytet Warszawski <120> Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb <130> PK/2014/AGR <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <21θ> 1 <211> 81591 <212> DNA <213> Shewanella sp.
<400> 1
| atgcaatttg | gccaaatcgc | attattaaaa | tcgatttgcg | agctagcgaa | tattgtgatt | 60 |
| tgcttgaaaa | aaggaaagat | atttgaatcg | ttttttattt | caatcattgc | ggtaattccc | 120 |
| ctttttgctg | ttgcttccaa | tacgaccaat | cagtcgttta | atcaggctaa | aaaacagctg | 180 |
| ttatcggtct | atcaagatca | gcgggaaacc | ctctattgcg | gtgctgcatt | tgacgcaaaa | 240 |
| gggcaggtaa | tctctccgcc | aggatttact | actaaaacac | atttagcgcg | cgctaaaaaa | 300 |
| atagaatggg | aacacgttgt | acccgccgaa | aattttggca | aagcatttat | tgagtggcgt | 360 |
| gatggccatg | ggcaatgtgt | cgatagcaaa | ggtaagtcgt | tcaagggccg | caagtgtgcc | 420 |
| gagaagatga | atgttgagta | tcgatacatg | caagcggata | tgcacaatct | atttccggcc | 480 |
| attggcgctg | tgaatgcgct | gcgcagtaat | tacaattttg | ccttgttacc | gtcggctaaa | 540 |
| tctgattttg | gtgcctgtga | tatgcgcatt | gatggtagca | aagctcaacc | tcccgaagac | 600 |
| gctagagggc | gcattgctcg | gtcctatctg | tatatggacc | aaagttatcc | taaatattcg | 660 |
| atgagtaagt | cgcagcgcca | gcttatgagt | gcgtgggata | agcaatatcc | ggtgaatatc | 720 |
| caagagtgcc | agcgggctaa | aaaaattgcc | gccattcagc | tcaatgataa | tgagatcgtc | 780 |
| aaaagtcgtt | gtcagcaagc | caatatttgg | taaacatacg | agaagctatg | aattatattg | 840 |
| ataataacac | cttgtcagag | ttggatttgg | tttggttgcg | taagtttaaa | gccagtaaga | 900 |
| atctcgatac | gctattaatc | caagtgaccg | gcgctgagcg | taaaatagat | caagatcctg | 960 |
| cgctcactca | acgtgagaag | tttgataatc | taacgtcgat | taatacggcg | ttttgtcttc | 1020 |
PL 220 839 B1 p2014-sekwencje_ST25.txt
| gtgaaacgga | agtaaaacag | ctcaccggag | attggtctta | aactgggcgt | tcccttcggt | 1080 |
| cgggcttttc | gcttcgctcc | ccgcgataac | gtgatccact | gatggcaagc | aagcttgccg | 1140 |
| tggctctacg | ttcctgcttg | ccaatcccta | acgcaatcac | caagccccaa | acaaaagcaa | 1200 |
| acatcaactt | cctaaagcac | tgtccggttc | attgccggct | aaagtgtgag | taagcgtgcg | 1260 |
| cttctctatc | gcttgtcatc | gtttccctgc | caataccgtt | cacgtctgcg | ctgtcacttc | 1320 |
| ttatctgtct | catttcacaa | cctgcccgcc | aagggaggct | tcgccgctgc | gcgcccttgt | 1380 |
| ctgtcagaac | gtgaaatgag | tcaggaagtt | aggcgaagac | gagaacgata | tttaaacgac | 1440 |
| aggaaaacaa | gcaatgacaa | actcaattca | agcgcaagca | actcacacta | aagccaccac | 1500 |
| tttacctgcc | agcccaaaga | ctcaagcagg | ctctcacaag | cccgatattg | ctcaaaaatc | 1560 |
| agcaactgcg | gctaacgctg | tggtggcatt | ggcttcaaca | gcaaagccag | tgttactgca | 1620 |
| attgcagatt | aaccagttgg | tgttgtctga | gaagaacgcg | cgtaaagaaa | atgcgtctaa | 1680 |
| ggctgacgat | gaacagttgt | atgcctccat | tttggcgcat | ggcattttac | aaaatctgat | 1740 |
| tgtcgagccc | atgaacgcgc | aaggcttata | cccagttttg | ggcggtggtc | gtagactgag | 1800 |
| acagctcatt | aaagcggtca | aaaataataa | gctgaaaccg | aaaacgcttg | tgcctgttaa | 1860 |
| gttgctgaca | gccgaagaag | tggccaacta | tgccaccgag | ctatcaatga | ctgaaaattt | 1920 |
| cacacgtgca | aagatgcacc | cagtcgatga | atttcacgct | tttgctgaca | tggtgaataa | 1980 |
| gggcgctagc | attgctgatg | ttgcgacgcg | gtttggcgta | acagcgaaat | tcgtgcagca | 2040 |
| gcgcatgaag | ttaagcatgg | tcgcccctgt | tgtgctcgat | gcgtacaaag | cggggaacgt | 21Θ0 |
| gtcgcttgat | gttgtgatga | tattcacgat | tgccagtgte | gaaaaacaag | tcgaagtgtg | 2160 |
| ggagctggca | ggcgatagac | gttacaacga | aaaccagttc | cgcaatatgc | ttaaagacgc | 2220 |
| cgctgtgaat | gctgatcact | atttggctca | gtttgttggc | caagaagaat | acgaaaaagc | 2280 |
| gggcggggtt | gtgacctcag | acttgttcag | tgacgaagtc | tatcttgatg | ataaagcgtt | 2340 |
| gctcgaatca | ttagcgaccg | caaaattgga | aatcgaagca | gcaaagttaa | tcgcgcgtgg | 2400 |
| ctggaagtgg | acacagataa | agttagtttc | tgaatacgat | gaacttgcag | ggtttgggct | 2460 |
| tctagactca | aaagagggtg | agtatgatcc | cgctgaaatg | gcgctagcgg | ggtgtatgct | 2520 |
| cgtgttaaaa | agttatggtg | agcctgtcag | tatctatatt | gggttagtgc | ataaggacga | 2580 |
| taaaaaggcg | ctggcacaat | taaaagccag | tgtgcaatca | gacccactca | acgtgggtga | 2640 |
PL 220 839 B1
| cgtgaaaaaa | attgaagaaa | aggatactag | cggttattcc | gctgcgctta | atgacgactt | 2700 |
| acgggcgcag | cgtttgatta | tcacgaaaca | tgcgttaatg | agtgcgccaa | gcgttgcgct | 2760 |
| tgatacgttg | catttttctg | tctgtgtaag | cgcgttcact | gattcacatt | atggcagtcg | 2820 |
| tccactgcat | atcagcgtta | acgacaccac | ttgccatcct | aaaacgggat | cgctcacgga | 2880 |
| taacaaagcg | gtgcagttaa | tcgagggtgt | aaaagccagc | ctaaatttag | cgtgggttgg | 2940 |
| tctgcccacg | gtcgctgaac | gctttaacgc | tttttgcgcc | ctcgatgtaa | aagagaaaga | 3000 |
| aaagcaggtg | gcttacgcca | cggcttccat | gttcgaggcg | tcaattgata | atagtcataa | 3060 |
| agctgttgag | gccgtgatat | ccacgctcga | tgtgaaatgg | tctaactact | ggcgacctac | 3120 |
| tgcggaaacc | ttctttaagc | gCgt gclgttt | gtcttgttta | attgatatgg | ctcagcctgt | 3180 |
| catgggtgag | cagtgggcat | tacaagccgc | tgcacteaag | aaaaaggatt | tagcaaatca | 3240 |
| ggttgatagc | ttagtgaacg | gtgagcgaaa | agggctagat | gatgcacaaa | aagcctactt | 3300 |
| tgatgcgttg | atgccagctg | gattttaagc | cgcatactga | tgcagattta | ccctgttaat | 3360 |
| tcagggtaaa | tctgagcaag | aattaactaa | ataaattgag | ttgtgtgtat | gcgtgtgtat | 3420 |
| aatggttcaa | cggttaacgc | agaggtttta | caatgctatt | tatggtcggg | atcgaaagcc | 3480 |
| ctgctgatga | aacgcaggcg | tttggtatcg | ttatccccgt | gtttgaaaaa | ttaggctatg | 3540 |
| gctgtttttc | ggcggcggat | tgccaagaag | aaatcttgtt | taaggctaaa | gaagccattt | 3600 |
| tattaatggc | tgaggaagtg | atcaacgatg | gtcatttagt | cgatagtttg | aatgaaggat | 3660 |
| atcgcgacta | tcaggcattg | catcccaagt | tcgaccaatg | gctggcctta | gaggtgccac | 3720 |
| tagaggcgct | taaagccaaa | caaaaacgcc | tcaatatcac | attgtcagaa | tcgcagattg | 3780 |
| tacgtatcga | tagctttgtg | gcgtttcatc | gcgagttcaa | agaccgttcg | gacttcttgg | 3840 |
| ccaaggcggc | cgataagtta | atgaacagcg | cagactcagt | aagatcgtgt | tcaaaagtgg | 3900 |
| gagattgata | tgggcaaagt | aaccggtatt | ccattttcag | aggtgaaagc | gcagcttatg | 3960 |
| gataatcccg | aggttgtcgc | agcctatgag | caagcagtac | aagccgatga | accgatccac | 4020 |
| attattccag | tgcaacacag | tgagggcgtt | atcatgccaa | tcaacaatat | cgtgagttgt | 4080 |
| actcgtgaag | gtcatcatgt | ttattttcct | ttgtgaatct | gtttggtggc | catcactatc | 4140 |
| cagtgacgat | gatttttatg | ccctctggcg | cggtgaatgt | cgttgtcggt | ggggcgcggt | 4200 |
| atcgatgcca | agccaatcaa | gtgcagcgcg | tgattgatga | gtctgggctt | gagcatgagg | 4260 |
PL 220 839 B1
| gcttagcgtg | tttgaagtat | ttgattgaag | cgggggagtt | gaattttcat | attcccgctg | 4320 |
| atgttcacga | gcagcttaaa | gtgcatccag | agtttcaaaa | ataccgcctc | atcgagtggg | 4380 |
| aagatgaaga | catgtgagtg | ttgcgataac | gacaaggaga | attaggcatg | tctcaacgtg | 4440 |
| cgatagagat | tgtaaagata | agtgatctca | agtccgtcaa | acagggtgaa | gtgtttgagt | 4500 |
| ggtgtattga | ttatgaagaa | tttcaatggc | gcaagggaga | tgactttcta | aggagtcgaa | 4560 |
| caggcgtcga | ttctccttgg | gaaatttggc | cgttgactga | taacaccaaa | accgctgcta | 4620 |
| atcgcaaagt | ctttaagctg | ataaaatgaa | aggacaaaat | gatgatggcg | ttcttggata | 4680 |
| atgtactatt | ggtgatttgt | tggctgttca | ttgccatttc | tgctatttat | ttcgtcgcag | 4740 |
| ccgcattcag | gctcgttttt | attggccgcc | gatagtcgct | attccctgtt | agttccccgc | 4800 |
| aaaacgcgaa | acaagcggcg | gctgcgccgc | ccttttccgt | ttatctgaca | ataccccttg | 4860 |
| gtgtgctttg | aaacgtgcct | cggcggttaa | tctatttact | ctgagtgtct | attggctgct | 4920 |
| gtcgcgctat | gtcatctaaa | gacaactgat | gaacttgggc | gttcccttcg | gtcgggcttt | 4980 |
| tcgcttcgct | ccccgcgata | acgtgatcca | ctgatggcaa | gcaagcttgc | cgtggctcta | 5040 |
| cgttcctgct | tgccaatccc | taacgcaacc | accaaaccgc | caagcacagt | cctactcact | 5100 |
| gcgcggcaag | tgtggctaag | ctggtcgttt | cattcggcat | catggccgct | cctggtgcta | 5160 |
| tccctttcgt | ttacgcttcc | gtcttatctg | tcgctcacca | caacccgctt | gccaagggtt | 5220 |
| cgcttcgccg | ctgcgcgccc | ttgtcaatca | gaacgatggc | gagcgagcag | gacgtcaggc | 5280 |
| gaaaacgaag | atgatagacc | ccaaacggag | caagcagccc | atgacacact | caatcactac | 5340 |
| cccagcaagc | cacactaagc | ctttcagcga | gcaagccagc | ttacaagcga | caagcaggct | 5400 |
| ctccaaagac | gatattcaac | agcaaaaaag | gggcgagttg | acgatcattg | ttttaactga | 5460 |
| aatgaatttc | tttcacttct | gcggcctcgg | acttgagggc | gtggctaatg | aggcatggta | 5520 |
| tccctattca | caagggttat | tgtttgaagc | ggtcgagcgg | tacttagtcg | cggcaaaagt | 5580 |
| ggctcaaaat | gtcgtatcaa | tcgatcaacc | tcgacgcaat | ggcgcaagta | ttgattatcg | 5640 |
| cgtgcgtttt | aatgtgttta | gcactgacaa | aaaacgggtt | tcggttcgtt | ttcctgtcgt | 5700 |
| gattaagaat | tttggcaacg | atacgcaatg | cctctcagtc | gatgaactaa | cgagggcgtt | 5760 |
| aagtctgaac | tatcgaaata | agcacgtttc | aatcatgtgg | tctttaccct | cggggatcac | 5820 |
| atcaacggtt | tatgtgtcgg | tggcggctga | cggggggata | agcgattgct | atacacatca | 5880 |
PL 220 839 B1
| tgccctttgg | tttgtgatgg | aagggggttg | cattgagttg | gccactaaca | cgggggcgat | 5940 |
| atgatatgtg | caaaccctca | gtgacgtttg | aagaaatgaa | cacctattta | caagggcaat | 6000 |
| ataaacatga | acgtttatat | ggtcgcaccc | ctgcaacggg | ttggcctgcg | gactatgcaa | 6060 |
| catcggttgt | cagtagccac | atggatgatt | tgaatgctaa | cgggatcggg | tacattggcc | 6120 |
| atcacgaatc | cgcgacaggt | caggcgatcc | gttataccgt | ggacgaggtt | aaatattccc | 6180 |
| cccgcttttt | tattgttggc | tatgactccg | aaaacgatat | tgcccaaaaa | caatgctatt | 6240 |
| ttattgattc | agcgatcaat | atcgaaaggg | ctcgcgctaa | atgcttagag | agtgctaatc | 6300 |
| gctatccgat | agtgagaatt | aaggatctac | aagggcagtt | tgtgtaaaca | gcctgaacgt | 6360 |
| cttacagggg | aacatgcgtt | cccctttctc | gttaattcac | atcatgaccc | acttcgtttt | 6420 |
| tttcgtctta | agttcaaacc | gttcgatagg | ttaagtctcg | aaaatatcct | tttttgcaac | 6480 |
| tatatatagt | tgcacttttt | gcggttgatt | tggtataatg | atcccctata | tagcaggggg | 6540 |
| cattatgacg | aaaacggata | aattattagc | aaagctcaaa | tcgtccaaaa | cactgacttg | 6600 |
| gaatgaatta | gcgggggcgt | taaaagtgct | cggctatcaa | caagtcgagg | gtgatggttc | 6660 |
| gagggttaag | tttgataatg | gcattccgaa | ggagttaatc | aacctgcata | aaccgcatcc | 6720 |
| taaaaatgaa | ttaaaggctt | acgcattgcg | ccaagtgaga | gacaaattaa | ccgaatgggg | 6780 |
| gaaactatga | tgcaaaatac | aatgacatat | aagggttatc | acggctctgt | agaaatcagc | 6840 |
| ccagaggata | atattctgtt | tgggcaggtg | ctattcattt | caccgttgat | caactatgag | 6900 |
| gccgaaacag | ccaaagggtt | agagcaagcc | tttcaagagg | cgattaacgc | ttatcttgct | 6960 |
| gactgtgctc | aacaggacat | tcaaccagag | aagccttgta | agggatcgct | taatgtcaga | 7020 |
| ttaggccatg | acttgcattt | ggctgcgtct | atcgcggcat | ttcaggcatc | gactagcacg | 7080 |
| aatgagttta | tcaaaagggc | agttcaaaaa | agcgtgggtt | tgtaggctgc | aaatcgttgt | 7140 |
| cgagcaatga | tatcagcctg | agccatgtga | tctacttaaa | ctgaacatta | ccccctgtta | 7200 |
| gctccccgca | aaacgcgaaa | caagcggcgg | ctgcgccgcc | cttttccgtt | tatctgacaa | 7260 |
| taccccttgg | tgtgctttga | aacgtgcctc | ggcggttaat | ctatttactc | tgagtgtcta | 7320 |
| ttggctgctg | tcgcgctatg | tcatctaaag | acaactgatg | aacttgggcg | ttcccttcgg | 7380 |
| tcgggctttt | cgcttcgctc | cccgcgataa | cgtgatccac | tgatggcaag | caagcttgcc | 7440 |
| gtggctctac | gttcctgctt | gccaatccct | aacgcaacca | ccaaaccgcc | aagcacagtc | 7500 |
PL 220 839 B1
| ctactcactg | cgcggcaagt | gtggctaagc | tggtcgttca | tttcggcatc | atggccgctc | 7560 |
| ctggtgctat | ccctttcgtt | tacgcttccg | tcttatctgt | cgctcaccac | aacccgcttg | 7620 |
| ccaagggttc | gcttcgccgc | tgcgcgccct | tgtcaatcag | aacgatggca | agcgagcagg | 7680 |
| acgtcaggcg | aaaacgaaga | tgatagaccc | caaacggagc | aagcagccca | tgacacactc | 7740 |
| aatcactacc | ccagcaagcc | acactaagcc | tttcagcgag | caagccagct | tacaagcgac | 7800 |
| aagcaggctc | tccaaagacg | ataaattgaa | aggctttaaa | gatgggaaac | tacgtaaaaa | 7860 |
| cgcaaaaagt | aaaattgcag | tgttgttgtc | aatggcgaca | aagatcgtac | tcagaaccca | 7920 |
| aacaatgggg | atggatgatt | gttttaatga | taatgccccg | cagatcgttg | atataaattt | 7980 |
| cttttggagc | tggtacgaga | aggaatactc | agagctagaa | atttatgtaa | ccgtgattga | 8040 |
| tggtgtatta | actaaagtgc | gtttttctga | ttgtccctat | catttttctg | acgatatcgt | 8100 |
| tttgaccttt | gaagaagtca | aagcgaaaaa | gccgcatttt | acctatgcac | aagttaaaca | 8160 |
| ggcattgtta | gacggctatt | tatgcccgtt | gtcgaacgat | tccaaagccc | ctgagccaac | 8220 |
| accgccaaac | gatgacaaca | ctcgcaaagt | ggttagtttt | ggcgattatc | aagatcgcct | 8280 |
| cgaaagcaag | cgtgaccgct | tagagagcgc | cgcaggtaaa | gcggcggcag | actcaaacaa | 8340 |
| attttatgag | tcgtctagaa | gccttgcttc | ttgtattccg | ttcggccagc | caattttggt | 8400 |
| tggacaccat | agcgagaaac | gcgcgagacg | ccacgcagac | aagattttta | atgatatggg | 8460 |
| taaatctgtt | gcggcaagca | aaaaagcggg | ttattacgct | gacagagcgg | ccagcgttgg | 8520 |
| cactaatggc | attgcatcgg | atgatcccga | agctatcgcc | aaactaaaag | aaaaactcgc | 8580 |
| aggcttggag | cgttcacaag | aaacgatgaa | agcgatcaat | aaagttatcc | gctctaagca | 8640 |
| tatgacggac | gccgacaaaa | tcgagtacat | gacgcaaacg | cataagctaa | ccgaaaaaga | 8700 |
| agcggaagaa | ttactaaagg | gggatttttg | cggtcgggta | gggtttgcta | gttactcaat | 8760 |
| cgcaaataac | agcgcgacta | ttcgcaccgt | aagggatcga | attgaagatt | tggaaaagtt | 8820 |
| acataatcaa | gttgcattga | gtgcaagcgg | tgaaattgag | gggatttctt | gggcgttata | 8880 |
| tgaggaagat | ggacgtatta | aaataacttt | tgatgatata | ccaagcgagg | cgctacggtt | 8940 |
| aacaataaaa | aaacatgctt | ttaaatggtc | gcgatattct | aaagcttggg | ttcgtaaaat | 9000 |
| aacacctaat | gccatttata | gcgcaaaaca | attgataggc | aagttggcag | aaaagtagca | 9060 |
| gctgtcaaaa | tgtgaaatcc | ttgctaatta | ttaatggtta | aagtggcggc | tctgccgtca | 9120 |
PL 220 839 B1
| tctaatttac | aactggtttt | aaatggagga | ggttgaggcg | ttaaaaattt | cagaggtcgg | 9180 |
| cgcgattgaa | tgaaataaga | ttaatttcac | cttgctatgt | gtagattttt | tataataaat | 9240 |
| tttggtgagt | aaataaacgg | agaagtacgg | cggggattgt | gttgccatca | atcaatgtaa | 9300 |
| aatgccattt | tttagttgtt | taaagttttg | cgatttttac | gaggcagcat | tgcacgattt | 9360 |
| aactcaccta | gcaggatatt | aagatcgttt | tgatagaaat | aaaggattta | actttcgctc | 9420 |
| atgtaattgc | caattttaaa | agccattcgc | cgaattagga | gcaagttctt | ttaatggttt | 9480 |
| agttaagtgt | taacggtaac | gttcaacatg | attcctatat | agcaagttgg | ctagaaatgt | 9540 |
| tgaaagggat | aatcgcagca | tctaaggcac | atcattattt | aatcgaatta | acgttataaa | 9600 |
| taaaaagcca | tctagtttaa | tgagttcagt | ttaaataaat | agtaatggga | tttttatgtt | 9660 |
| agaaacaata | gaagaaaaag | ccgcaagaga | aaagagggtg | ttagcgtggc | ttggggctgg | 9720 |
| gtatgtctcg | caaggcgtac | ttgcgctaat | cgaaaattca | agcaatgaag | aactggcagt | 9780 |
| attattttac | cgtcacgcgt | tgggagattg | ggggctcgtt | cctgatgagg | ataggcaatc | 9840 |
| taatgatcac | gcacttcgaa | ataatgaacg | ggtaatatca | tcctatttat | tcgcagggat | 9900 |
| taagattttg | atcatcactg | aggcagacag | agcacgaacc | accgcattat | tgccaagcga | 9960 |
| atattaagcc | gccacgcttg | cagaaaacgc | actcattgag | tgcgtttttt | tggcttgaaa | 10020 |
| atcccccgat | acctttgccg | cttcatacgg | cagcagccta | gcaaaaatcg | aaaattccca | 10080 |
| aaaaatcccc | aaaaaatgaa | aagtgcaaaa | ccctggcgaa | atagtgaagt | tggaaccttg | 10140 |
| agaataagac | cacaccccac | gcaagaattg | ataaatcaat | tcttatggtt | gtttgtggtg | 1Θ200 |
| taaattattg | aaattaaatg | tttaaatatc | aaaatagttt | aaatattttt | tttgaaaatt | 10260 |
| catttcgttt | ttacactaaa | tcgtattaaa | ggtgtattaa | taaaataata | caatcgtatt | 1Θ32Θ |
| aaaagccctt | gtaccaatgg | tttcaggcgg | attaatacag | tattaatacc | gtgtgtatta | 10380 |
| tttagtatta | aagtgatgtt | tataaaagaa | ttacttatta | actcattttg tgagtgtatt | 10440 | |
| aaactttaat | acactggtta | atacagttat | aatgcaaacc | gatacgttgt | taatacactt | 10500 |
| ttaatacatt | ggataatgtc | actatggcca | gaagtaaagt | tgtgcaagtc | ccctgcgatg | 10560 |
| cagatctcta | tgccaagatt | gttgcttatc | gagaagagaa | ggggttagaa | aaagatgctg | 10620 |
| ctgccgcgcg | agatttgatc | ttgtttgctc | tgcgtattct | tgagcataaa | gatgatgccg | 10680 |
| aggggttatc | tactcgcgaa | ctgttagagg | tgattttgac | ctatacagtt | aaggcacaac | 10740 |
PL 220 839 B1
| acactagcag | tttggtctat | taccagacat | acaatgcggc | tcctgtagat | atacagaatg | 108Θ0 |
| caggtattaa | gcataaggac | actatgagaa | aggcagagga | aaaagttgag | cagattttag | 10860 |
| cgggcgaaaa | taaagaggac | taagtgtcct | ctttatatat | tcattacatg | gtcttttccc | 10920 |
| caatatccaa | tttaggattg | tcgatgttgg | gggagtattc | tttcgtcgtt | gaacggtggc | 10980 |
| tatccattgc | taaatgttga | tagtgttcat | cgtgctttat | tttattcgtc | gttacgttag | 11040 |
| tgctgtcatc | tttcatcgtg | atattttttg | tgcctgcaat | atcatgactc | aatgattgaa | 11100 |
| tggctttaga | tagggtatta | tcttttgtcg | tgatgctata | gatcgcttcg | ttgactaatt | 11160 |
| gctttgtcgt | ttcgactttg | tttaagccgt | caggtatcag | gctgggttca | ataataaccg | 11220 |
| catgtatatt | ttCCttgCtg | aatttttcgg | taaggtcatt | agccagtttt | gcagtgtctt | 11280 |
| gtgaattatc | aagtaccact | atcacgtttt | cgcgcaattc | atttgtattg | aatgttttgg | 1134Θ |
| tgtcattatt | attgttaagc | gcaataacgt | cagccccgtt | tttattatca | gcatttatct | 11400 |
| taagcgcgtt | ctctacaccg | acagcgacaa | tgctatagtc | taaattattg | cctttgttga | 11460 |
| tcgtcgtgct | gttccccgat | ttggagccga | gtatgcgctt | atttatttta | agcgctgcaa | 11520 |
| tgtcaccgct | ggatttatca | aggtaagcaa | tttctactgc | cttggtctca | tctttatcat | 11580 |
| tggtgatgtt | cgcaattaat | gcggggaagg | ttccacgttt | ttctgacgaa | taaacggcat | 11640 |
| cgtgaaaacg | taagttttca | tgctgcttaa | cgtcgatgcc | ttgcttgttt | aaatacgtct | 11700 |
| gtgcgagcga | gttttctata | ggttttgctt | cgttaaagta | ttgcttcgcg | cgcgcttcta | 11760 |
| attggctttg | cttaaccgga | atggcatgtg | ttaattcatc | atgctgtggg | ttttttacca | 11820 |
| gattatattt | atcgggttcg | ttcatcattt | tatcggcttt | ataaagtgca | tccttataac | 1188Θ |
| tgcatttttc | agcgaccata | atcaggttaa | ttagggtgcc | tttatcgccg | gttttccagt | 11940 |
| ctttaaaata | gccacgatat | tggcccgttg | tggtcaatgt | taggctcccc | tctttgccaa | 12000 |
| atgtcaggtt | atctttgtct | gatttatcgc | ggttcggctc | acctaaaagc | tgcgttgcca | 12060 |
| gcgattcact | gtaggccgga | agcttggcat | ttagctcagt | ggccatccgt | tttagatcca | 12120 |
| catatccatt | cacatcgagg | tactttgggt | tttcctgcgg | caagggtttg | tcattaaata | 12180 |
| gcggggtatg | ttcagggtaa | tacttatctc | ttgtctcaag | tgcagagact | ttattgggat | 12240 |
| cgttattgac | ccatgagagc | atcatttttt | gcgggttatc | ggtgatgatt | tttacgtgct | 1230Θ |
| tactggcacg | ggtgatatcg | atatacgcgc | gccttacgtt | agttaatgca | ccttggccct | 12360 |
PL 220 839 B1
| taatcgcagt | aatgacattC | tcataggttg | ccccttgcgc | catatcggcg | gtgcgggtgt | 12420 |
| atgcataatc | ccaatgagca | tctttcaact | ctttggttga | gagcgttaat | gtgtggttat | 1248Θ |
| ccgtggattt | gagctgcatt | tgtttatcgt | caatgcggct | aacggtatag | gttttgttgc | 12540 |
| cctgcatttc | acggtcaata | tcgcttttgc | ggagcatgat | actgtcgcct | tctgcgagag | 126ΘΘ |
| gttgctcact | cttagcccaa | aggttcgtga | atttgtggcc | atgatttttg | gggaagaaat | 12660 |
| gcttttcctc | gccggttttc | atatccgcga | gggtgagcat | gttattgagc | ttatcgacct | 12720 |
| tcataatttc | aaaataactg | tctttactgg | tcgttaggat | taacccctgc | tgatagggca | 12780 |
| acatggtcgc | caattccgcc | ttactggcat | gaacaccgcg | taatctcggt | acggtgaatt | 12840 |
| gttcggtact | gaggcttttt | tgttgctgta | acccttggcg | gatttcgtgg | gtaatgtcgt | 12900 |
| cgcgttcctt | gttggtgtac | gcaatgataa | gggtattttc | acgcgcttta | ggtgttctgg | 12960 |
| ccaagtattc | cagtgccacc | gtggcgggca | gggcttcggt | cgccagttgc | tggtttttct | 13020 |
| tcgggttatc | ggttatcgac | tgcaaagtcg | aaatgatatt | caaactttga | ttgatgttag | 13080 |
| cggtagcctg | cttttcgggc | gttaccgcgt | cgttcgcggt | gggcgcgatg | tattggtcaa | 13140 |
| agggtaattg ttgctgaatt | ttatcaatag | cgctttcgcc | ttggcgatcg | acaatattgt | 13200 | |
| gtactgcact | cagtagcgtg | ctgttctgtt | ggcgcacaat | gtctttcatg | gtgacgctat | 13260 |
| tgattgcgcc | tttgtttaac | gcgagttcaa | aaggtttacc | cgcttcttgg | gacgttaact | 13320 |
| gtttagtgtc | acccaagaac | acggcgcgcg | cgcctgttgt | ctcaatcaaa | tgggtaaatt | 13380 |
| tatccatttg | ggcgttactg | gtcatcgagg | attcatcgag | caagaacacg | gtgttagcgt | 13440 |
| attggtctgg | tttcgcatct | tggcttaaaa | agttgcttag | gagtgattgc | acagtttggc | 13500 |
| tttcgacgtt | cttgtctttg | agttcgttaa | cggcggcgtg | tgtcggcgct | agacctatga | 13560 |
| attgtgtcgg | tgtcttattg | ggttgtgagt | tgagaatgga | ttcgctttgt | ttaacaagat | 13620 |
| cgatacccgt | ttcaagcatg | gtcgatttac | ccgtacccgc | taacccttga | acacctacaa | 13680 |
| atcggtcttt | ggtggtggtg | ataagcaagg | tcgcgtcttt | ttggccatcg | gtcaggtttt | 13740 |
| gattttgact | gagtacctgc | gcggcgtgtt | caacgctggt | aaggggcgca | agttgatctt | 13800 |
| tgcccgcttg | tagtctgtct | aaaatacgca | cttcggtatc | gatggcggct | tgggtggtcc | 13860 |
| agcgggtgcc | gtcgtggtat | tcggcgctca | ggagtgaggg | cgcgccttta | tccgtgctgt | 13920 |
| tcgtggccat | gtgttgcagg | gtgttgatga | tttcatgttg | ggtaatgctg | gtgccttttt | 13980 |
PL 220 839 B1
| cctcaaaggc | gtacttgatc | gcattaacaa | tcagttcttt | ttgtgagtaa | ccggcttctt | 14040 |
| tctcgctaat | gtgctggatg | gcaaaatcca | cggcattgtg | aataagccct | ttgtcttgat | 14100 |
| gctgggcacc | aatggcattc | agtgctgcgg | tcacatcttg | ggtgagcagg | gccgtagttt | 14160 |
| ggctattcac | gaacttttct | ggcatatcag | cggcttgcat | gatgcgcgaa | atactggatg | 14220 |
| gtttcacttc | acttttttct | aatcggtcat | caaattgtgt | gccttgtcgg | tgaatatatc | 14280 |
| aatgtgtttg | atgccttgtg | tcagcgtgtc | atgtaaccac | tcttttgagg | cgctataggc | 14340 |
| tttaatattg | acgatgtggt | gacttgcatt | agggctggca | ttgcttggcg | tggtggcgta | 1440Θ |
| accatgattg | agcggcgcat | ggtgcaatgc | actggcttta | acgctgtgtt | gtttgccgct | 14460 |
| ttcgtctttg | agcgtgaccc | attctttgga | cagggcgttg | atcgtataaa | tttgtttgct | 14520 |
| caaaccactg | tcttgatggt | ttgtggccat | gatgagtttg | tcgccgttgg | cgatatgtaa | 14580 |
| attgtccggt | ttagcgatcg | cgtactctgc | ggctttaaag | gctttgctgc | tggggttaat | 14640 |
| ctcggacgct | ttaccgtttt | tgtctatcag | cgtgagggtg | ttgttatcgc | ggtttacact | 14700 |
| gtccaccgtc | aattgctgct | gttgattgcg | gccaccgact | ttttgccatt | gggtgagtac | 14760 |
| catgcccttg | gtgtactggc | cgacgacttc | ccgttgctgc | gcggataaga | acacgggatt | 14820 |
| aagggtaggg | atgttgagcc | caaggcgcga | tacgtcacct | tgattttgca | gttctgcgcg | 14880 |
| gatcgcgctg | ttaagctgct | tcacgtcttt | atgggtgccc | gcaatgactt | gggtgtgttg | 14940 |
| cttctcgggc | agttgcgcgt | aagtttttgc | aatcaggtta | accctgtcac | tgtctttgct | 15000 |
| ttcatgcagt | cgcatggctg | tgttgctttg | tttggtggcg | acccagttgc | tttcgtttac | 15060 |
| gttgcctttt | ttaagtacct | cgatagcgtt | accggctttc | atgccttgct | tggcattggc | 15120 |
| gtgattgagc | aaaatcactt | tactgttacc | cgctttggct | tgcgcgagca | gggcattaaa | 15180 |
| gtcgttaagg | ccgagtttat | tggcgttctc | aaccactaaa | atatcgcggt | tagtgttgtt | 15240 |
| ggccgtttta | gtaaagctgc | tgagtgtatg | ggtgtggtca | ggtttgaagt | ggttcattat | 15300 |
| ccacttgcca | atagtcgatg | aatcccgttg | tacccgttca | ctggtgtgca | gtttgctttt | 15360 |
| catgtcaggg | gtaatgatgt | gaatacgttt | accgttggct | tcaccgacat | tgagcagggc | 15420 |
| tgtggcgagt | tgttcgctac | tgccaaagac | gttcactagg | ttaacttgtt | ttgtgctggc | 15480 |
| gaacagttca | gagactttct | tttggttgtc | cgcatttaag | cctttgcctt | gaagcgtgtt | 15540 |
| ggtatcgacc | acttggcgca | tgttggccgt | tttgggcttg | atgctctcta | gcaggttggt | 15600 |
PL 220 839 B1
| ttctgctttg | atgtgggcgg | cgctggtaaa | ggttgcagac | tctttatcaa | gtggaatgag | 15660 |
| tgcgccatct | tcaatgtgct | tatcgagtgc | caatttaata | tcgagcgcat | cgagcttctg | 1572Θ |
| gccttgcgta | aattcaagcg | tggctgattc | cactaatttc | gcgtaattaa | aacggttttg | 15780 |
| ggtgttactg | gcgtgctcaa | tcgcgcgact | caccgcatcg | atagcggcgg | gtttgagcgc | 15840 |
| taacgcattg | agtgatgttt | ctcgtgacat | gctgtttgtt | acaaagcctg | tcaggttaaa | 15900 |
| gccgctgtta | ttggctttgt | ttttccattg | ctcaaacaag | gtggcttcgc | tggtataggc | 15960 |
| tttgctcttg | cgggtatcct | ttgcggccac | gtcccgcgcg | gcttgtgagt | ctaaacctaa | 16020 |
| gctttgggtt | tgttcgttga | tttgctggct | acgggttgaa | aatgtatcga | gtaaggactg | 16080 |
| cgggacacct | tccacttcaa | acaaattatt | acccagtgaa | cgagtttgat | aacccgcttg | 16140 |
| ttcaacactg | cgggctaagg | cgctttgata | gagcgaggta | tagtattttt | gatggttata | 16200 |
| aacccgctca | cctgtgccat | tgatgatgcc | gcctttttgt | ttaaagctac | ttgccagagc | 16260 |
| gcgcaatgtg | ccctcgctgt | ccttggtcat | gttggcggtg | agtgagtggg | tgtgcagctg | 16320 |
| cggatcttct | tcacggctgg | ttttgtggcg | caccatcgca | aacagcaaat | ttcccgtgtt | 16380 |
| ttcaaaagag | gtcgctttgg | tatcagggtt | ggtttgtctg | gcctgcgccg | catctttctc | 16440 |
| gatatgcgat | aacgcgaatt | ttaccgcgtc | atcgtgcgct | gtcattaagc | gtttatcgcc | 16500 |
| gcccacgagt | gcaagtaaac | tgaccgattt | aggcgccgaa | aaggtaaagt | caaaaccgtt | 16560 |
| gcgggcgttg | ctgttttggg | ttttaagcgt | ttggtcgttc | aggctaccgg | ctaacacctc | 16620 |
| tttgagttga | tgttcttcaa | cgggcttacc | tagcattccc | tcttgctctg | ccagtttgcc | 16680 |
| aaaccattgg | gtattgggct | cggcgctctg | ctctttcaag | taatagttgg | tttccccttc | 16740 |
| tttggcgtcc | gctgcttttt | ctaacgacac | gtcaggcaaa | ttgaggttct | tttcttcact | 16800 |
| gaggtagtag | ctggccgcgc | cgccagcgct | cgacgcaatg | ggactgatgg | aaagcataat | 16860 |
| gatattcctt | tsgdgggacc | “t cgcgcgggg | cacgaggtga | actaatccgg | taggtttatt | 16920 |
| ctgagtcgag | ttgggctttg | atttcgtcag | acgtgaagcc | cagcgctttg | agttccttga | 16980 |
| tggcttcaat | tcgacgcatg | acgttcatcc | gttcattgtc | atttttagag | gctttacgtg | 17040 |
| agggcttttt | cgccgacaat | tcgggcactc | gtactgtggt | gttgaatgag | gtcatcgttt | 17100 |
| tagctccttt | agtcgagcga | tatttcttca | tgtactgagg | ctatttgttg | ctcttcaagt | 17160 |
| cgctgtgcat | cctcaatgtg | ctggtcattg | gccttttgtt | tttcagcggc | ttttttcttc | 17220 |
PL 220 839 B1
| tctgcatctt | tgagcgctaa | ctctgtcggt | ttggcctttt | tcgcatcgat | gaggctttgg | 17280 |
| gcgaccgcat | cggttttttc | agcaagtttg | gtcatgcgct | gcgcttccgc | gctgcgttca | 17340 |
| tcattgtttt | catccccttc | atacatggtg | tcatgaatgc | tttggagctt | ggttttatcg | 17400 |
| gccttatcga | gatgttgtgc | cgcgctgaat | tggtgatagt | taaggcttat | ctctaatttc | 17460 |
| ttcactttct | cagatggtgt | gtaatcccgc | ttaataaacg | gggcgcacag | tgagcgcatt | 17520 |
| tggttaaaga | ctaaatccac | tcttaccacg | ggataattgc | caggcgtgcg | cagccaaaat | 17580 |
| tgtaaatctt | caagctgcat | gatttcagag | ggcgtgacca | cagggcgggt | aattgtttga | 17640 |
| tggcccagtg | atacgccatc | cctgatttca | ttagcgccgt | agctgtattg | ctctttagag | 17700 |
| acatcgactt | cttgctcacc | taaatcgtga | gacgagattt | tggccatttc | gttagagggt | 17760 |
| gagcggaaaa | atagccgagt | gttgagcaag | tcgaacattt | caagcgccgc | attttcgcca | 17820 |
| tagacttttt | taagctgcgc | aaaagactga | atacctatga | cataacagcc | gccgaacttg | 17880 |
| cgcacttctg | cgattgtttc | ggcaagttca | ggtaacttgt | gcaagcttgg | tgcttcatcc | 17940 |
| atcaacaccc | aaattctgcg | gtccggatct | tcgtcttgtt | ctaaaatggc | ggtcgaggca | 18Θ00 |
| atggatagcc | acattgagat | cagtggccgc | aatgaagcat | gttgctgtgc | gttactggac | 18060 |
| agaaatagaa | agcctctttc | ggcatcgttt | ttcacccact | cacgaataga | aaatttgcgg | 18120 |
| cgaagaagtt | ttccctgttc | gtccttttca | tccagtccgg | caaggaatcg | taatgatttg | 18180 |
| atgtaggccg | cgaggaccga | tttaatcgat | atcgccgttt | tttggatttt | atctgatacc | 18240 |
| agtgaggccg | attcggtccc | ttttaagtat | tcacttaagg | actcaagttc | gctggtcagc | 18300 |
| atgagttcaa | gcagtcgttc | agtggtttgg | ttctttttag | gttcatcttg | catcttaaat | 18360 |
| gcagtagatg | aaaaaatggt | acgtgctgat | tgcacccaaa | atggatcgcc | ctcgccgtgt | 18420 |
| tggggaatga | gcgcgctcgc | catgttctca | aaatctgagg | gttcatgtgc | atcacaccac | 18480 |
| acatcccaat | aggcacagcg | ttcatcaaac | gggtttagta | gtacgtccgt | tgccggatta | 18540 |
| taaaatttac | tgacaaaggt | acagcctttg | tcatagataa | tggctttgtc | gccccgttca | 18600 |
| cgtatccacg | t t a a a a a c tt | acgcagcgcc | acggactttc | ctgcgcccgt | ggtgccatca | 18660 |
| agtaacaagt | gttgtacttc | aaagcgttct | ttgaaaatac | cgataccatc | gagcttgaaa | 18720 |
| tcggactggc | gcttgtcctt | tttaagctgt | tttgctaatt | ccttcggcgt | ggctttttgc | 18780 |
| atcccccgaa | taaagtgttc | ctcggtttgc | tcatcgcctt | ttttcttgaa | ataccacatg | 18840 |
PL 220 839 B1
| gccactgaca | ggaaaacgat | gccaatcaca cagctaataa | ggaggtaaat | ttgtgtccat | 18900 |
| aaccaaaagc | ggctgttggc | cgcaatcagt atcgggtttt | ctaattgaga | ccctaacgta | 18960 |
| ctggtataga | cagtgccttg | ccattcagtc tgcataacat | gactttctgg | tctaaacacg | 19020 |
| ctaaccgttt | ggtttatcca | ataataataa gcgcccgtta | aggtgtcttt | atcaaggaag | 19080 |
| agatagcata | gcagcgctgt | taagatgagc acgccaaaac | acgtccagcg | gacaagcacg | 19140 |
| gcgttaatct | gcagaaacat | ccgcaaattg tgaaataaaa | tctggccacc | acgggtgtag | 19200 |
| ttactgcctt | tagtacgttt | ggggtttaag gtcattagtg | aggctcctta | tctaagagat | 19260 |
| tttcaataaa | ggagttaagt | tcttcatcat ggcggatgta | gtcatttagc | gctttgttgt | 19320 |
| tagtatcttg | taagttttgt | ttacttatgc tttgaacttt | agctataaat | ggcttaatag | 19380 |
| taatatcctg | aatttgtaat | ttcccagagt tgatgttgtt | aattagcttg | tcacaagcaa | 19440 |
| taattttttt | atcttgcaat | tcaaatttat tttttaaata | cggtggcata | atttgctgcg | 19500 |
| caaaattttc | agattttgat | ttaaccaaat cactttcgta | aaagtttttt | agtaaatcat | 19560 |
| ttcgtaaatt | taaattttcg | atagtttctc cagcaaaaat | cttgctgcaa | ttatctggat | 19620 |
| acagtttaca | aatgaaatct | ataaaatctt gagtgaagtc | atagttgtag | tttatttggc | 19680 |
| cgcttttgag | catacttgcg | atgctagtat agtaatctgc | taagtcttct | tgcttttgtt | 19740 |
| gacctgtttt | gtacttgtag | gtgttaataa tacctacaag | aaaatctttt | tcttgtagcg | 19800 |
| atagcggtgc | tgcttgagat | actgaactta ataagcaaat | taataatagg | catgttttta | 19860 |
| tgatattcat | taggttatct | ctttttgatt gaaggtcatg | gctattatca | catttttggt | 19920 |
| cctgtattaa | agggacttga | ttgacgcact gtttctgcca | ttttttcatc | gtcacttcga | 19980 |
| ttgtctggct | gtattagggt | gtgcgccgct tttgcgtctg | cacgggcctg | ttccatatca | 20040 |
| atgctcggga | cgctagacgc | gttatgagtc tgttcttcgt | gtaacacatc | ttgtctaatt | 20100 |
| tccgcgttgc | cttgcgctgc | atggccttgg atgcgctcaa | attcgcccgt | ttggtagagg | 20160 |
| ctgtcattga | acggcgcagg | ggcatactgt ggtgattgct | gtttattgaa | atcaatatcg | 20220 |
| gcggcatagc | gctcctgagc | ttgcacaatg tcatcgcggt | tttgcggtaa | cgctgcgttt | 20280 |
| ttgtattgct | cagcaatggc | tttcacttca gggctgttcg | taaattcagc | cgcaagtttg | 20340 |
| gttcgctctt | gctgcatttc | tggcgtttgc cccctgatca | ccgccatgaa | atcaccttgc | 20400 |
| tcatctcttg | atcttccaac | gaattccaca aagtcttgat | ttaaatcgtg | actaatactg | 20460 |
PL 220 839 B1
| atagatccac | ttttcacgcg | attagccgca | tcggtgtagc | tttgggcttc | agtgagctgg | 20520 |
| gattgggagt | ttttggcgtg | ggtagtcgct | tcgttaagtc | cttgtaggaa | ggtttgtgtt | 20580 |
| tcaccttcgt | ttttactgtt | ggttgtactg | gcttgttcgc | cgctgttata | ggatttgacg | 20640 |
| gtgttaacgt | tagcgctgaa | ctggtcaagg | tagctttgct | gtagactgtc | acgttcgctt | 20700 |
| tcactggtac | gggctgtgct | gacatcatcg | gttgagcctt | tagtgccagt | attggcggat | 20760 |
| acgtgcgcac | tagaaccaag | aaatccactc | ccaggtgtgc | cgagtttcac | ccctgcttct | 20820 |
| gctccgacat | acattgataa | taaggtactt | gtggcttggt | cttctgtcag | gttgaagtcc | 20880 |
| ttagcaaaag | acttaaccgt | actacgcata | tctgcgaagc | ctttgttatg | ggtgccgcta | 20940 |
| tcgctggtgg | cgctattgct | gccataactg | ttcgaggtat | tgaccccgct | catttgactt | 21000 |
| agtgcggcat | tcttgacggt | ggcgaggctt | tcgcttgcta | gctcactctc | aattttgctc | 21060 |
| gcactgatcg | cgtttgatcc | agattgcgat | aaggagtttg | agaccacatc | gttactgctg | 21120 |
| atattcactg | gcaagctacg | gcttaaagca | ttttggccat | taatgacttg | tctgccatca | 21180 |
| tcaaaggtgg | tggtttcata | gccagttgca | tcttgcttgg | tgttgccatg | aatacgttca | 21240 |
| acgccagtgg | tgtcgatttt | attgccgttg | gtgttgttgt | agctgtagtt | atccacctga | 21300 |
| gcgttaccca | aattgatatc | accacttgcc | gcactcgcag | aggtgcgcgc | gttaacgctg | 21360 |
| ctcatcatgc | ccgcgaactg | atgcgacata | ctgctcatta | ccgacgcgcc | gcctttcata | 21420 |
| atgagcggga | caattaatgt | cggtacgctc | atcattaaaa | agccggtcat | ggccgcatag | 21480 |
| cgggagtgca | tttcttgtaa | gggatcaacg | ttgcttaacg | tgataccgcc | gtaaatgtta | 21540 |
| gtgatttcgg | tggcgttaag | ggataagcgc | gtggtcatga | tgaagttaat | gagggcaaac | 21600 |
| atcaccggcc | atgtgccaag | gtagataaag | cctttgaaat | agttgccgag | cacttgaaac | 21660 |
| gtgagtgagg | ggatcatggc | aatcgccacc | actaaaaagg | cgacagagct | aaacagcaaa | 21720 |
| aacaaaatcg | attgcagcat | gggcaaaaat | tcccgcgcct | gcagggccat | tcccgcccac | 21780 |
| atcgatgtgg | tttgcatttt | gttttgcgta | taggcgtagt | tgaatgcggc | ggcggtgttg | 21840 |
| ttgctcaccg | ctgcatcatc | tgcaaggcca | tttcgcaggg | cgttaatcgt | catgttttgc | 21900 |
| agcgtgattt | gcgacgcgct | ttgactgata | ttggcgtatt | tttgataacc | actgctgatg | 21960 |
| ctggtattca | aaaagctttg | ttggcttgtg | gccttttcac | cataaatcca | actgcccagt | 22020 |
| aacttgatgc | tttttgcgct | gtctgcttgg | aatagctgct | tgaggcgcgg | aagggcttct | 22080 |
PL 220 839 B1
| ttgcaggtag | gatagtcatt | aggacccatt | tgaatcgccc | gtagtggcga | agggttgtga | 22140 |
| gtcgctagaa | agtcccaaat | atccggcgca | ctggctaaat | ctcgccatgt | gtatttatta | 22200 |
| ttgagtagca | tatctccgcg | aatacaactg | ctgatgtagt | gctgccaata | gcctttaagt | 22260 |
| tgggtgtttt | ctatctcgct | ttgtctggat | aacttgtaca | gctcagagcc | aaacatcatg | 22320 |
| cccgttttac | tgtattgttg | atcatccggt | acgtgaaaaa | tatcttccac | cgtttgggtg | 22380 |
| gtggcataca | tataatgcga | tgcccatgag | gccggaaatg | ccactatcgc | gggcacattg | 22440 |
| tccacgcgat | agttacccgt | cggattggtt | aaatcggtaa | tttgcactgt | ggcggtggtg | 22500 |
| ttcatggcaa | gcaatggcac | ggcaaagtaa | accgcgcacc | atttcataat | cgcgttatgg | 22560 |
| tcacgcttga | tgaaaaagtg | cagcgcggtg | gccaccacgg | c a a a c a 1— c | acagatgctt | 22620 |
| atcatgctgg | caaatgaatc | ggacttgaac | agcacggcaa | tggcattcat | cacttgcttg | 22680 |
| gctacgtcac | cgttgctgta | cgtgaaaatc | tcaaccgcca | tggttatcgc | tccccaaaat | 22740 |
| tcaagttggc | cttagcttta | gcgctcatgg | cgcccgttat | ttgctgtttg | atttgctggt | 22800 |
| tttgcataat | gagctggtgc | tgtgatatcg | cctcattttg | agctttagcg | gtgagtcctt | 22860 |
| ctaaaaagcg | gttagcgttg | ataatgtctt | tctcgatgcg | gtcaatgtct | ttgggatcat | 22920 |
| tgttcgtggc | cgtgattgaa | gatttcacaa | tcgacagcat | gttttgcaga | tagagggtaa | 22980 |
| taaactgcac | gctgatgatt | ttggcgtaag | tattggtttg | gggcgtgagt | cctgcctcca | 23040 |
| attcggtacg | taaaaaggtc | atgatgggca | gtgtggtgta | ttcgagcagc | gacttgtcgt | 23100 |
| tatctgttag | tggctggtcg | ttttgcatct | tgctggcgat | acctctgagt | aaggtttcta | 23160 |
| cgcggtattg | caggccgtga | ttactttgga | tggtgatcgt | ttgttgtgtc | ggtgctaagc | 23220 |
| attggtcaat | ggcttgattg | gtgcattgat | agctttcagc | tttgccgccc | tctaacagac | 23280 |
| tattaatcag | gttattgttg | tcggtcagca | gtgagccata | accgcgcgca | ttgccggtcg | 23340 |
| cgtcatagat | atacgtgccc | gaaatcgaca | tgagaaattc | tgccaaggtg | ggatcgctgg | 23400 |
| caaggaaggt | gttttttaaa | atggcggccc | acacaatatt | ggtgtttttg | cgcaccatgt | 23460 |
| cttttagtgc | gggatctttc | tttgcgttat | cgagctgatt | gttagcttga | ccgcccgcgc | 23520 |
| cgcattcttg | ctggccagat | acccaatccg | caaacgcgtt | attttgtgtg | cccatagtgg | 23580 |
| cacaaatgta | tttttgactg | ccaacacctg | caaaccccgc | cagtgcagat | acgcccgctt | 23640 |
| gggcactctc | gcaagaattg | atcgactgat | tgagatactt | atcagcaatg | gccgttagcg | 23700 |
PL 220 839 B1
| tgtccttaat | ctgtttgatt | tgcggtgccc | acgtctgcag | ggctaaatcg | actgcgaacg | 23760 |
| gtgcagcgtt | ggcgataata | gccttgcctt | gttgcacaag | ggcgtcagag | ttaatgtggc | 23820 |
| tgaatccccc | cataaacata | tcaataccgc | cacagcctgc | ggcaatgctg | ggcatttgca | 23880 |
| cactcacgag | ctgcgcgtcg | cgaatggggc | tacgcacaaa | gagattgccg | ccgctgtagt | 23940 |
| agttggcgct | ttggcctttg | aatgagcccg | gattggtcac | gttagtgcca | tagcctaggc | 240ΘΘ |
| cattgaaaaa | atcgtttagt | gaacctgaaa | cccccgcgct | ataggcgtgt | gttgtcagca | 24060 |
| aacatgaaat | agtgacgccc | agtagtgtgc | gcgtcagtgc | taagcgtttc | atgatttacc | 24120 |
| tccggtattg | ccgtttatgc | tgccgcttat | gttgccgtta | tgacgcgggt | ttagtgtgcg | 24180 |
| tagcgcacgc | aagcaaacgg | cacttaacaa | tgcatgcact | gggacgagta | cgaatttata | 24240 |
| aatggctaag | gccagtaaaa | tattgatgat | taacatcgtg | tccatgagat | tgctcctaac | 243ΘΘ |
| gcatgcttgc | aatgacttgt | gggtcattga | gggattgaag | gtaactttgt | tgaagctgcg | 24360 |
| agggcgtcac | atcaccgacg | gttaaacgga | caaacttacg | ggtattgacg | ttgattaaaa | 24420 |
| atgtggcagg | cactgtcacg | ctgcgcggat | tctcaaagaa | ggtggcggca | atgtctggcg | 24480 |
| tggaaggtat | cggtacttca | aagcctgcta | tgccttggtt | gtcgagcgaa | aaggcatagg | 24540 |
| tataggtgcc | agtttgcgcc | gcaagctgtt | tcagtttcgg | ggcgaactgg | tggcagtaag | 24600 |
| ggcaatcaga | gcgaaagaaa | aacactaacg | cgtaatcatt | cggattggcc | gcaactgccg | 24660 |
| ccccccccat | aggcgtcgcc | ttagcgctta | aagagaatag | aagagtcatt | aacattactg | 24720 |
| tgatgatgcg | tttcatgggt | attttccgtt | taaaagtcag | gggcgaaatc | ggtggccacg | 2478Θ |
| ttcaggaagc | ggccaagtaa | atcgtcttga | gagataaagc | catacgcgag | cggtttcatt | 24840 |
| tcccccgtgc | caggattaac | taacacgagt | gcgggactaa | acgggacgtt | tatgtgctgg | 24900 |
| tcgttttggc | ggttctgcac | gatggctggc | agtgctacac | catcgagcgt | gacgccaagt | 24960 |
| agctcaatgc | catgctcagt | agcgaactgc | tgcacactgg | gcgctagcgc | aatatcaatt | 25020 |
| tcttcttggc | ctttgtagac | aaagaacagc | ccccatcccg | catcggcaag | gctgcgtact | 25080 |
| gcgcgcatct | tcttgttgcg | ctctaatgat | aaataggtgc | ttcttgccgc | ttgttccgtc | 25140 |
| ggtctatctt | tggtgtaaga | cagctcaggg | ttatctagca | ggaccttttt | aaaggtcatg | 25200 |
| ccgaactctg | acgatttatt | gctgacgtac | tgattaagca | gcatggccct | ttccactttc | 25260 |
| ttgctgtctt | ggctgtttat | cgccgcgtca | ttgagcgtgt | cttggtagta | gctgtgaaac | 25320 |
PL 220 839 B1
| caatccatct | gctctgtggg | cgtcagtgtt | tgggtgcgcg | tgagtgtgac | gcttggcgtt | 25380 |
| tcggcctttt | taggtgcttg | cttcttgggg | gcggtcggtt | cgttatacca | gcgccagcct | 25440 |
| tgtgcatccg | tggcgttcgc | gccgaggcaa | aacgttgtca | gcataaggat | cactaacgcg | 25500 |
| ctgcgcttgt | tgaccaccgc | atcccctttt | tttgtggaca | accacgccaa | cggcgcgtgg | 25560 |
| cttgaccacc | gaaaaaaagg | agatactgcg | gcatgttgta | agcggtcatt | taacaacgtc | 25620 |
| atcatggttt | ggttcctcca | accgactgtt | gtaagcgttt | ttgaatttca | tctgtgttgg | 25680 |
| gcagttcgat | ggcgtcgtac | atgtcttcat | aaaaatcaga | aaagtccatt | gaagacatat | 25740 |
| caatgcgttg | cagttcgtta | ggtgaaaagg | cgctgcaatc | aggttgttta | gcgctgccga | 25800 |
| agtttttgcc | caattgcgcg | cggccctcaa | cctgcacaat | gcgcgcgagc | ttgctatcaa | 25860 |
| acgcgcaata | ggcttttttc | ttgcggatac | acacgccaag | cactttctca | gcgcaatatt | 25920 |
| ggccaagtga | tacggtgagc | ttgtcttctt | tggcggtacc | cagcgctttt | tcttcttcac | 25980 |
| tgcaggacgt | taagccgatg | ccgttacccc | aaccgctgtc | ctgacaacaa | ttgctgatcc | 2604Θ |
| ccagcgcttt | atcgctgcac | tccatgatgt | tgcctttgaa | aatgatggcg | ctgttttcgt | 26100 |
| tgatgttggc | tttgtctttc | acatcaccgg | ctgcgtcact | gacggcggcc | agtcctgccg | 26160 |
| cagcatggtt | aaagtcagtg | ctgcgagtgg | cagcaggatc | gtaatagtca | ccactgagcg | 26220 |
| caaagctgtc | agcaccgcag | ataaggcccg | tatcgcggca | ttgctgttta | tcacataggc | 26280 |
| gttgttgttt | atctttaatg | caaacgccgc | caagttgggt | gtcacaactg | gtcgattgaa | 26340 |
| tgctgcaatc | tgcgatggcg | tcgcaggtat | tgggaaaggc | acattgatag | gtggtttgtt | 26400 |
| ctttccagca | atccaatgtc | acggctatcc | cattaatcat | gcgcgtttct | ttaccttcta | 26460 |
| cgcattgaga | ttggacttgt | tggcactcag | gaagaacagc | accacagctg | ttgttgtaac | 26520 |
| cgacttcaac | atgcgtttca | gtggtgatga | tagtgatggg | taaattctgt | aactcaattt | 26580 |
| taaagtaaaa | atcccaattt | gcacttatat | gaaccgctaa | tggggatgct | ttaatatcat | 26640 |
| aattttctgt | ggttaatgaa | ctgtttacac | tcattgcgca | aggttgatta | gcaacacatg | 26700 |
| taccaggggc | tctctctgtt | agaacatgtc | ctataaacgt | accatttaat | gcaattgata | 26760 |
| attcggcatc | aatggctata | gaacgatact | cacctttaaa | ttgaacacgg | acgatcttaa | 26820 |
| cattagggtt | tggtaattta | atgtcaatag | taaacggtgg | tgtgccagtt | aagctgtatg | 26880 |
| aatgcgccac | ttccttaacc | gatgtgcttt | tgacaaaggg | tgttaggtag | cattgcaccg | 26940 |
PL 220 839 B1
| gattattggt | gggcaacgtg | caagaacgtg | gcagagaatc | gacttcacaa | acgagccctt | 27000 |
| tttcacagtc | atgatattta | gatgaaatgc | cgtggctgat | attgtaagca | tcattttgat | 27060 |
| agccaacggc | ggtatggtat | gccggatcgt | tttcatcaat | cgtcgggcgg | ccattattaa | 27120 |
| agccactcgt | cacggcttgg | gcttggccat | ccgtgctcat | gccttgcatt | ttggcactgt | 27180 |
| ccatggcgct | cgggttgttg | tagtaacggc | tttcgcttgg | gttagcgact | tcttgctgac | 27240 |
| atgtcgcatc | tttgcatagg | ctgttaacgt | caaagccggt | gtaacccgct | ttgttctgat | 27300 |
| tctgcttgat | actgtctttg | gcccactgca | cattatcgcg | gtaatccttt | tcgctgttgg | 27360 |
| ccgccataac | aggcaaggcg | gcgctcaatg | tgaggatggc | actgaggatt | aaggcattat | 27420 |
| tcaactgagt | catttcgccc | cctttgctaa | tgtcttagct | gccacatcgg | gaatgctgcc | 27480 |
| gtgttgtgca | agtaagttca | gcgcgtcata | caacgaaacg | ttgccgtaaa | tcacgtcaaa | 27540 |
| gtcatcggta | ctgcagggct | gttttgcctg | acatttgttg | ggtcttacag | caacaaaggc | 27600 |
| gggtacttgg | gtaatgccga | attgcgtaaa | ccactgggga | ttaatcgcaa | aaccgctctg | 27660 |
| tatggtttta | cccttgttat | cgataaggtg | attcatctgt | ttaacggtgg | ctgtaaagcc | 27720 |
| ttgaggcagt | acaccgcgca | caatgagtgg | cacctgtaag | tctgcgcttt | gcatgagtaa | 27780 |
| ctgctgcaaa | ctggtcgcag | gcatacccaa | cgacacaaat | accatcacac | cattagcatc | 27840 |
| ggcgctgggg | ttgggctttg | catcgagcaa | tggtgatagt | gcgttgtcta | attggccttt | 27900 |
| gctttgcgct | tcgaactgac | ggg 't θ t C | aaatagtgcg | g c t t g g c t a | cgttcaatgg | 27960 |
| gggtaatgtg | tgacgttctc | gcatcgacag | cgcttttaat | tcgtcaatac | tgtaatccgt | 28020 |
| ttgggcgaac | acctgtgaaa | ttgatccaag | gcaccataag | ctcacgagca | gggctaagcc | 28080 |
| tttaaatgaa | tgtgaaaata | ggctgttatc | cacaattttt | gtgcataaag | cggtatatgt | 28140 |
| tgttggtaat | ttggtctcaa | actttttcat | cgaaaatccc | tctccttatt | ggtcacaaaa | 28200 |
| acacgcaatt | gcgttttttg | aagttgataa | aaccaaagtt | gtcacccgac | acagggttgt | 28260 |
| cgtggccact | ttcccagatc | accgttgtcg | tggtgtaagg | gtgcgcccat | agcgcatcgg | 28320 |
| gtatggtgtt | ggtcatttga | tagcgatagc | gggatttagg | catgaggggc | atcggcgttt | 28380 |
| gatagcaaat | cgcgccatct | tcaccgtggg | attcccatac | gatgccttgg | cgatgcaatt | 28440 |
| tgtagttcag | gcgctctaaa | atcaacgtac | ccgcctgaat | tggcgtgtcg | cggtaattgg | 28500 |
| tggtgccagt | cagggggtaa | gcactgcctt | gtgagcccat | acaccaaaac | agaaaatcaa | 28560 |
PL 220 839 B1
| aaggcaatat | gctgttagtt | gaggtggcca | cggcttcggt | tgcacaggcg | agttgtgaca | 28620 |
| cgatattgcc | aaataaaatg | gcttcgggat | tgaggataaa | tgacaactcg | tcatcatccc | 28680 |
| acagtgggtc | aatctctgtt | aaataggcaa | tgtcgaaatt | gtccgtggcc | atacaagctg | 28740 |
| cgctttgcat | aatttgcagc | caatagatca | cagggtattt | gtaccagtgc | ccatgataaa | 2880Θ |
| acgcgccatc | actggcatcg | ttatcgcggt | tagtgacgcg | gccgccgatt | tggggggaat | 28860 |
| tactcatgtc | gagcttcatg | cccatgttga | ccatgcagta | agggacgcgc | gtcacgtcca | 28920 |
| ctaaggtatc | aggctcccaa | tagccaatat | tgaggccaat | ttgcataaaa | attggtggcg | 28980 |
| gtttgggaca | aaatgaaatg | ggtgatacgg | ggttgcgcgt | atcgggtagg | ctcccaggaa | 29040 |
| taataggcac | actgccaatg | gtcatcggga | agatacacga | ccaacaaatg | tcggtcatcg | 29100 |
| ggttaacgaa | cgtgcccgta | caggccgctt | gcgcgttgac | ttgtgcggga | atgactccca | 29160 |
| ttaagaatgc | taagagcagc | gcaggtttaa | tgtgtcgcat | ggtttgtttc | ctccatgaat | 29220 |
| acggggaaat | ttgacacatc | tatttcgcgc | acttgccaca | tcacccccgc | ttgcttaatg | 29280 |
| acactcggca | cgcgcttaag | tgttaatgcg | cggctgaggt | ttccttgctg | gtcaaagtaa | 29340 |
| acgcgcgcat | ctaattggcc | atgcagtgtt | tcgggttcgc | cgcccgttaa | aatccatttg | 29400 |
| atggtgtgtg | gcttgtcatg | ggttgttgca | aactctttgg | cccataacac | ttgctgcaca | 29460 |
| tcatccccat | caaaaaacac | cagcgtttta | ctgaactcaa | acttgccgac | gttggccttt | 29520 |
| tgcaatgctg | gccatgtctt | ggtgtcaaat | gggtttacgc | gcgtcccttt | gggataaatc | 29580 |
| aggttgccat | tagcatcatt | gatatctttg | gccagcgtta | aagtgggatc | gactaaaaac | 29640 |
| acttctggtg | ttttagttgt | gataagtccc | actggacgag | ggcgcttaac | accggctttg | 29700 |
| acattctctt | ggaattgctc | gcgcatactg | tctagctcac | ccgttttttc | taaggtttgc | 29760 |
| agacggtttt | caatccactg | cagcatgtca | atttcagcta | tggggaacac | ttggcccacg | 29820 |
| gtgccgatgg | acgcagcctt | gagtggtaag | agtgggcata | gcgctagcat | cagaagcgcg | 29880 |
| aatttattca | tttagccgtg | acctcgttcg | cttgggcgcg | gttcgccttg | ttttgcgctt | 29940 |
| gaagggtttg | cagtagtgac | tgctgaattt | cttgggtgac | attcacggcg | ccactgacga | 30000 |
| cggcggggct | gactaacacc | acgacatggt | tatcaatggc | gtattgctgc | accacatcat | 3ΘΘ6Θ |
| cgagtgtttg | ggtaaatcga | gtgatttctt | tttcgcgttg | ttcgtcggat | agctcgcttt | 30120 |
| gaccgataga | ttggtgaaag | ctcgccacgg | tttcgttaat | gtcatactcg | acaacactgg | 3Θ180 |
PL 220 839 B1
| gttcgcgcgt | cacccagagg | gttatcatga | cgcccagcgt | caccagccat | aaaattgatt | 30240 |
| gtatgatggt | tttttccatt | ttatgcggcc | tctttgtggg | ttgctgcggc | ggacaaaatg | 30300 |
| gcatcaaagc | gggccatatc | atcgggatag | aaatgttggg | ctgtcagttc | aatggcatcg | 30360 |
| agtaacggca | tgccgccttt | aatcaagttt | tcgcaatatt | caaactcttt | gggttcagtt | 30420 |
| gagagcatgg | cgcgcgacca | tggatcggca | aaaatccggt | gaaaggacac | tagcccgccc | 30480 |
| gctttgagca | tgacgcagga | atgacccgca | tcattggcgc | gggggaatga | cttgatcatg | 30540 |
| tgttgctcga | agggcgagaa | gtggtcagga | tgcttgttca | agaaatcccc | aaagccatca | 3Θ6ΘΘ |
| ccttggcgca | atgtgatatg | aatatctgaa | ctgttcagtg | ccgcttcggc | ctcggcgttg | 30660 |
| gcaaagaagt | cgttcatgcc | ttgcgttact | gtggcaaagc | tgccgccgaa | cttacgcact | 30720 |
| gtgcgataac | cttcgttgat | gaaatcctta | ctttgcgcat | tcgcgccgct | catgagtgac | 30780 |
| catgcttctt | caatcacaca | gattttcgga | atagaacgtt | ggcccgataa | gtacatttgt | 30840 |
| tggctgatcg | tcaccatcaa | cgcgaaaatc | accggacgtt | gtagctcgcc | tttaaatcca | 30900 |
| tcaagttcca | gcgtggtgat | atcgatattg | ggatcgagca | tcgagggctt | attgaaaatt | 30960 |
| gcgccatgaa | tgccctgtga | gcagaacttg | tttaattgcg | cggcaatatc | actgatacgg | 31020 |
| gtatcgtcat | ttttttgtgc | ggcaatgtca | tagagtgccg | tttgcacatc | gtcaatcagc | 31080 |
| gtgtcgttac | cgcatttttg | ccatgccagc | aaaatagcat | cgccgagtaa | tgccgtctga | 31140 |
| aatccggtga | gcttttcatc | aggtgatgcc | atggtggcga | taagcgcggt | gatgtttccc | 312ΘΘ |
| aacacttcgg | tgatgggatc | aatggcttga | ccttcatcat | cgaggattgg | gccaaaagta | 31260 |
| cccgcatccc | gcacgcttaa | tactttgcct | aagtgggtaa | acgggtttag | gaaaatctgc | 31320 |
| gaactgtcga | gatagacgcc | gcctaatgtt | tgagtgagtt | ttttataact | ctgacccttg | 31380 |
| tctaaaatcc | atgccttgcc | ccctttggca | aaaatcgatt | ttactaaggc | ttgcatgaag | 31440 |
| aatgacttcc | ctgcccctga | gccgcccgta | atcgccatgt | tgtagttatc | actgccgcag | 31500 |
| ttaaacggat | cgaaatagct | aatttgatgg | cgcattgttg | gcaagagtag | ccctgctgat | 31560 |
| aagcgtttgt | agtctgcaac | aatcggtaag | aaattcacca | agtttgaggt | tttcatcatg | 31620 |
| aaacacaggc | ccgctttttg | gctgtctttc | ataaagcctt | cgctcattga | gaacgggagt | 31680 |
| gtggacaggg | tgcacatgcc | ttgcagttta | ttgtttcgga | ttaaatcaat | gcctgccgtg | 31740 |
| cggaaggtcg | caatcgcttt | tgaggtgtca | tggcgttgtt | tctcttctgt | cgtatacagg | 31800 |
PL 220 839 B1
| gtgacattca | atgtcatggt | ggtgatttta | aaggcgtgtg | agctgagtcc | tttttgtatc | 3186Θ |
| tccttgcgtt | cagccagttc | atccgcggcg | ctggggatta | acaaccgcat | aggggagttg | 3192Θ |
| accgttttcg | ttagtgagcc | aattttgctg | tcgttacggg | tggtttgctc | gccggtttta | 31980 |
| ttaatataaa | aagacacgct | gacacgataa | ggacattgaa | cactgttcat | ggtgtaactg | 32040 |
| agtgatgcaa | tacagttggg | aaacgcatat | agcctaaagt | cgttcggcag | cccctttagc | 32100 |
| ccaagattga | ttaaggtggt | atcgacactg | ttgtcggatt | gcatcggcgt | gtgacggata | 32160 |
| ttgaccgaat | cacgattaat | gatgaactca | ctgtcagggc | tgagaatttg | ggtgttgaga | 32220 |
| ggttgatact | cgttatattt | agcgggcgaa | acgcgatctt | gttgatgcga | aaaatttaaa | 32280 |
| tgctcgcggc | aatgctcaat | caaatcgtca | gcgcctaagc | ggcgaatgtg | catgcctgtt | 32340 |
| tgcgccagtt | ctgactcaac | gccaagacgc | atatccagca | gtgcaggcat | gtcctctgtg | 32400 |
| gttgaaacaa | agaaaaaccc | tttggtgttc | tttaaatcgt | agtggtatgc | gctgctgagc | 32460 |
| ttggtgccaa | agcctttggt | cgaactgtgt | ttggcataga | tagcttcatt | attagcaaat | 32520 |
| ttatcgcaaa | tggcattgcg | accactgagc | agcgcttgat | tttgctcgat | gagttcaccg | 32580 |
| acttggttgt | tacccaccat | gacgaattga | tagtgccatt | tgtcgccctc | tggcagtgtg | 32640 |
| cacaccaagg | cgttcatggt | tttgatcaag | tcgtcattag | ccccgccaaa | cagcgaaatg | 32700 |
| gcaaagccaa | aaccaagcgt | attggcattt | tcaaatactt | gttcggcatc | atcataaatg | 32760 |
| cgatagggca | attcatgatg | cagatggttg | tgctgctgtt | tgctgctggc | atagagtgcg | 32820 |
| ccgagatcgt | ctttaatacg | ttgtttcatg | gcttaatcct | gcttgatgta | tttggcaggt | 32880 |
| ctacccgtcc | aacggctctt | atcgaccacg | atgtagacat | cgctggtatc | aacgtaatca | 32940 |
| ccttgctcat | tgagatacgg | gaagattgtt | actttttgga | ctgactcaga | ggtgcgcagc | 33000 |
| ggtacaccgt | ggrzggtcgcg | gcgtggcaat | gggataaagt | cttgttgttg | gctcgcgagc | 33060 |
| ttgggaagtg | cagttgtgct | ttggccgctt | aaggccgtca | ccgcagggct | ttgtgcttgt | 3312Θ |
| ggctgattga | acacaccact | gtcggtaagt | tgcctcactt | ccatcatatt | ggtacagcca | 33180 |
| ttgatgccgc | ccaccttatc | gcaggaatag | tcaccatcca | gccctgctgc | acagccactt | 3324Θ |
| aatagccatg | aagccagtgc | gataataccg | gtgttacgta | atgcattttt | gctcatgatt | 33300 |
| gggttcaaaa | tgtcactcct | taaatgaatt | aattcgcacg | gccaaaggct | gagttaacag | 33360 |
| gggggcgttg | accttgttgg | ttatattgct | gctgtggtgt | aggcgtgttt | gcgccttggg | 33420 |
PL 220 839 B1
| cctgcggctt | aatattccct | ggcatctgtt | ctaacagtgg | gttgctgata | gtgttgagga | 33480 |
| tttgcgctgt | ggcactgaca | ggattttggg | cttgttgcgc | tagcgcttct | tcatattctt | 33540 |
| gaatgccaac | cggatcgagt | gggaagcctt | tcaaaaacac | gatgttgacg | gtattgcccg | 33600 |
| gattgagctc | aataatcggg | tggtattgct | cagctaattt | gatgtagtaa | tcagcaagct | 33660 |
| tgctacccac | gcttgaactg | gcactgccgg | ctaagttgag | cagtgcatcg | gccccattca | 33720 |
| cgcttgaagt | tgatccaagt | gctgagttag | atgtggtttg | gctcagtgct | ttacctgtct | 33780 |
| caccaatgcc | cgtcaaaatg | ccgctaatgc | ccgccatttg | aacgattttg | ccgttcttca | 33840 |
| taatggcagt | accgcgaatg | ccattgcggc | catagttaaa | tacggtcgcc | tcgacgggaa | 33900 |
| tgtcgatgat | ttcatcttca | aaaatacagc | tgaggcgagt | ggtgcgcaca | atgccgcgac | 33960 |
| tcgatgagat | ttcgccgtaa | gccgcgccta | aaactgtaca | gttgtttagt | tttgagggct | 34020 |
| tgccgttagg | cagtacacct | tggttaatgg | tttggaatac | cattggtacg | gtatcgcctt | 34080 |
| ggccattcac | acccgcattg | gcatctgcgc | cgccagtaac | gacagctgtc | acaaatgaac | 34140 |
| ctgcaggaac | gtagttctca | ggggtgcgtt | tttttggcag | gttttggtct | ggcgtttccc | 34200 |
| aatttagtgc | aaaggaatcg | atgccatttt | gggttgcagg tggcgggata | gcaccgcctt | 34260 | |
| gatagggggc | agcataccca | ctttgtccgt | cacccacgct | cgggcgtggt | ggtagcgttt | 34320 |
| gttcacctaa | gtagcgtgtg | ctttgcctaa | cgggataggc | tgatgcatca | atgccctctg | 34380 |
| tcgaaaattc | atcggtgaca | ttgctatgct | gcattgcatt | tgcggtagcg | gcattaatct | 34440 |
| tatcatcaat | tctttcagtg | atggtcagtt | ggaacgtctc | taaattacgt | tttaaatcaa | 34500 |
| ggcggttagc | ttcattgctg | cgctcaatgg | cttgcatgct | gctcagcatt | ttatcaatcg | 34560 |
| ttttttgttg | cttatctaag | gcaatttgtt | gtgcggtgag | cgcagactga | ttgtctttct | 34620 |
| ctgtgaaatc | tttatcaatc | acggcaccaa | aatcgattgg | attgcccgct | gcggtttcag | 34680 |
| gagcacgttt | aggggcagac | atataggcgt | cgcccgctaa | atagagggca | ccgagtaccg | 34740 |
| tggcccccac | ccctgcaatc | acccaattgc | gttttttatt | ggcttcattt | aacgcactgc | 34800 |
| cttgctcaaa | gtcggcttcg | gggtcttttt | tgaagtagtc | taggagttgc | ttcattgcat | 34860 |
| gctctccccg | cctgagacaa | caaagaggtg | gcctgtttgc | tgtggtgcca | attcataggt | 34920 |
| tgataaggct | gcggctcgcg | tcgttgggga | gtagaactgc | gccgttgtga | gggtgactgg | 34980 |
| gagtgttgcg | tgattggtta | cgcgataaat | gatgccgttg | aaatgcttac | cagtgaacac | 35040 |
PL 220 839 B1
| gaaagcaggt | tctgttgtca | gtcctgctgg | tttgggcatt | tgctcattta | agcgagtaaa | 35100 |
| cataaggtca | tctattgatg | tttctgtgcc | tcttggctcg | ttatttgttg | gttctcgttc | 3516Θ |
| agcaggggca | ctaactatat | gcacacgata | accgtcaatc | ggtttgcctg | tgttcaggta | 35220 |
| acggatcatt | tgcgcggtaa | actccgtcat | catggtgggg | taaggggttt | tcttatcgaa | 35280 |
| aacggagggt | tgttcttctc | gataatgttc | tgctgtgaag | atagaggtca | cggcaggaat | 3534Θ |
| ggctttaggg | ctgatgaata | agccgaaatg | tctgcccttt | tctgttgata | cataggctgt | 35400 |
| gaatggcatg | gccagattga | ggttaacgcg | cgctgcgccg | gatttatccg | atttagtgcc | 35460 |
| agtgacaacg | caaaatcctt | cagggcaatc | aatcgaggtg | attttgtcac | cttcaacgac | 35520 |
| taagcggttg | atatcgacac | tcgacagctc | aataggaacc | gtttcactgt | cattgaatcc | 35580 |
| gtagtgtttt | gggggcgtat | ttgctgctaa | cacgctcata | ggaaaaagcg | cgcaggctgc | 35640 |
| gaaaacaagt | gggttagcaa | tcttcattat | ttaacgtcct | tttgcacttt | cttaatggct | 35700 |
| ttgagcgaca | gttggccatg | gtcataattc | atggcaatga | tgtagctgat | gttttcgggt | 35760 |
| tctagcgcgc | gtttgcccac | atatttgttt | aacgtgcccg | ttatttttac | gagacgatca | 35820 |
| tcaagggcaa | tttgagtttc | attgatggtg | aagtgactgc | tgatgttttg | tttttaatca | 35880 |
| ttgctgcatc | ttcaaccagt | aaaggttgca | tctgatgcca | atcagcttca | tcgatatagt | 35940 |
| ttgcgagctg | tttgtactga | tggtctaccg | aagcgggcgt | gacattgagc | tttagaaagg | 36000 |
| caaagtattc | cgacatctgc | tgtaaatacg | gttcgtctat | agacgtgtct | gatacggtaa | 36060 |
| aggctgcgct | gatggtcggt | ggcacaacgg | tgcggctttt | attgaagtag | gccttccata | 36120 |
| caatacttgc | taggaccgtg | ttactgatca | tggctacggt | aaagccgatt | aacagaagtg | 36180 |
| tgttgaggga | ttttgcaatg | cggataaagt | cgatcttgtt | cttttgtaac | atggggcatc | 36240 |
| cttaggggga | ttggccccct | aattcacatc | atttaacgta | accagtagcg | gcgacatgcc | 36300 |
| gcaggcgttc | gttttaaaaa | tgaagcgcta | aattctgctg | gggcgtacca | ataagcggtg | 36360 |
| aggcgtaata | cgctcatgcc | gtattgcgat | ttcattctgc | gcatccctaa | aaaccatgaa | 36420 |
| gaggcaagcg | caatgccaat | gagcgcttga | ttcatcatga | ataacacgac | aaaaaacact | 36480 |
| aaggcaggag | caagttcatc | catcgcgaac | cctaatagcg | taggggtgtt | attaaggtgt | 3654Θ |
| ttagggatgc | taaaaaactg | agtgggatta | tccacggcct | atagacctac | aaccttcatt | 36600 |
| ccaacgttga | cgaaaatgac | gccaacgata | aagccgccga | tagccccgcc | ccagtttttg | 36660 |
PL 220 839 B1
| gtcagaaagc | ccccgaccgc | ggcggcacat | aaacctacgg | cgagaatggc | gaactgtgca | 36720 |
| gttgagccgg | tgccaacggt | atcaacaatt | tcagatttag | ccggtgcaaa | aggatcagca | 36780 |
| gcatgtacat | cccaagacaa | cagcaaagta | gcgacgacac | aaatgatgaa | taggaaagtg | 36840 |
| cagcgcatta | tgaatatggt | gctatcactg | ggtatatgtt | ttgcgagtct | taggatctct | 36900 |
| gcgtttactt | cagtttgttg | tgcgctaggt | tgtttttgag | tcagagttgt | catataacac | 36960 |
| ttcctttgta | tatatttagg | tgagacttat | gtaattaatt | gtaattactc | gtttaatcat | 37020 |
| tgttgcttaa | ttggtttggg | cggagcatca | acaaaactta | ataaactatg | ttcaattcga | 37080 |
| agctgtattt | cggctcgttt | gctacgtgct | gaacgttcac | atgaattaac | taatttattg | 37140 |
| tgatattcac | ctgttagaat | aattgttatt | cttgagtggt | ttttgttaat | ttttccatcg | 372Θ0 |
| gacatgtaat | cctcatttat | atctggttgt | gcgactatcg | cggcgaagat | aataagtgaa | 37260 |
| aacagatacc | gttattagtt | aggaaattcc | taacttgaaa | tgaaacttaa | attgagttac | 3732Θ |
| gtaatacttg | tattaatagt | ttatttaaaa | agatagttct | aatttcatta | gatgacgtgc | 37380 |
| atccaaattc | tgctctgaga | tcggcaaggt | gcctttcaat | tgccgtgcgt | gagcagtctg | 37440 |
| ctttggcttg | taattgagat | ggtgtcattc | ctagtgaaaa | atccttcatt | acttctagct | 37500 |
| gccgttgcgt | aagagttggg | aacaactcac | ggaaaatagt | gatctcgctt | ttatttagag | 37560 |
| gcatattttt | ttacttcttt | attgaaaaat | cgatatgttc | tatcatgaat | aaaattacaa | 37620 |
| gattactgta | ttacagtaaa | cttactgtat | tacagtaggg | tggtcaatac | aaaatgaatt | 37680 |
| attatgaaaa | aaaattataa | ccctcctact | tcgtctaaaa | ctgagcttgt | gacgtttagg | 37740 |
| tgcccaaaga | agcttaagga | attgatggac | caagctgtaa | aagatggtaa | atatcaaaca | 37800 |
| attacagctt | taactgttga | ggctgttaag | gataaattgc | aattcgaccc | cgattcagat | 37860 |
| gcatagttga | tctgttttgc | attggccttg | caattttttt | gatgagctat | taaaatacga | 37920 |
| agtagatttt | gaagcaaaag | tgcattacat | agcacgctac | tacatagttt | tctatgtagt | 37980 |
| gtatttttca | aaattagagt | gtgttggggg | tggttccctg | acgtgaagca | ttcgacaaca | 38040 |
| aagccgactt | accgaatggg | tcggcttttt | tgtgcctaaa | attcaagaca | ttgaaagatc | 38100 |
| attgatcttt | gcgatcgatc | atattatagt | gtttggcaat | gtttgaacta | accattcaaa | 38160 |
| cagccctaaa | acattcggaa | tcaacaataa | tgcctaattt | cttaaatggc | tgctatttgc | 38220 |
| agcacaagat | ccatatcctc | agatacatat | accctctatg | ccgccagatc | tcgcgatcta | 38280 |
PL 220 839 B1
| tgctgagcta | cagtgggata | gtgtctgatg | caaaactcta | gtcaatcaga | tcttctctat | 38340 |
| tcatcattca | gcagtgatga | ttatcaagaa | catcctcctt | tatctagtta | tgctgatata | 384Θ0 |
| cctcatgttc | atatggcaga | actgccagat | ggcaatgctt | actctgtcga | tgaagaagcg | 38460 |
| attaggttaa | aagttgctag | aaaagctgag | cgtgacaaga | tcaatgccga | aattaagagc | 38520 |
| cttgctaaca | tcgtcaagaa | aaaaggtgta | gctgttggct | ttaaagcaaa | agtagcatct | 38580 |
| tatgctggat | ttaaagctaa | gcgactacct | gattttgtgc | aaacgttatt | aacccaatct | 38640 |
| aaactattgc | ctcaccgcga | cgatttttta | gatcgtggtg | atggattgtg | tagaggaaaa | 387Θ0 |
| actcaggcac | gttctaaagt | gattttaggc | tatatgctct | ctgcatttgt | tgttaactgt | 38760 |
| aatgtcaaca | acggtcatat | tgtcgttgct | actagacatg | gcggcaagaa | cgttactcat | 38820 |
| gatgaactac | gtaaagaagt | ggccatgcgt | cacggtgtct | acataccaga | atcaacatgg | 38880 |
| tacttttacg | ttaatcgatt | agttcaatgc | ggccacattg | aaagccatac | tgtgagcatt | 38940 |
| tatgaagatg | gccacgtagc | ctcttttcat | gctgaagcga | gccataagta | tttatcaaca | 39000 |
| aagcttatgt | caatgttggg | tgctgaccga | ttatctgtaa | gaacagcagc | tgcgaagcat | 39060 |
| aacgttgatc | tgaaactggc | aggaaaatca | tttaagcaaa | aaccccgcta | cgcgagttcg | 39120 |
| cgctatcgtc | gcgatggttc | tcttcgtcaa | aatatgccaa | tcataaaacc | gtctcaagaa | 39180 |
| ttgttggcac | ttattcgctc | tcactatgaa | cgcgaagctt | actacgtacc | tcccaattga | 39240 |
| cattctaagc | ctttttaatt | cttcgactat | caatcagtac | attactgatg | cttctcatgt | 39300 |
| cccaatgtcc | aataagcccc | tcatacccct | aatttattag | gagtatctcc | atcaattctt | 39360 |
| aatattactt | agccaaattg | gattggattg | atcttatttt | atgtatagcc | atactttctt | 39420 |
| tttaataaac | ttaaagtaca | aaaaaaactg | caaagttagt | tgtgatcttt | agtctcacct | 39480 |
| cttttgattt | tttcttttga | tttttagctt | tagaaaatga | aagataaaaa | gatctatagc | 39540 |
| aaaagatata | aaaatgatga | ctgataaatc | agtcgcttct | acaagagatt | aagagaagcg | 39600 |
| ctgcaagtta | attttgtctt | cgaccgttaa | actacaaacg | tgctgtaact | cagttgctaa | 39660 |
| agaaaaaagc | gtctagcagg | actagtttgc | aagctcaatg | ccaaggtaca | taaatagaat | 39720 |
| ggttaaacca | ttctattgag | aaagtcattt | gttaaagtaa | tcccctcaga | tattcaacga | 39780 |
| tccactttat | agttaacgct | tagagaaaga | tcaaaaacac | cgctaacacc | tccttttgtc | 39840 |
| atccgaccgt | ttaacaacaa | acgcgctggc | caatcgttaa | aaaccaaaaa | acggtcttgc | 39900 |
PL 220 839 B1
| agggaaagaa | atttcaaaca | ctgtgccatt | aacaatcgta | cggttttagt | acggctaaat | 39960 |
| ttgactaaaa | tatcatttag | acgtactatg | tacggagttt | tacataaaga | taaaacacaa | 40Θ20 |
| cagagtttgc | tcgcagcaag | taatgaggta | ctaaaaaatg | gaaattttga | ataattttaa | 40080 |
| tgaattagac | aaatttattg | tcttagattg | ttattaagga | ggttacaact | taaaaaattt | 40140 |
| gatccaatga | ggaattcgat | atgagtattc | aaaatacggc | aaatgctgga | gccgtttcaa | 4020Θ |
| aaccagcgcg | gatagaactt | aaaacctcgc | tagaggtaaa | ggaactgctt | gaacgagcgg | 40260 |
| cagctatcaa | tggcatcaat | cttacggcat | ttatcattaa | tcaagcccga | gagagagccc | 40320 |
| atgcaattat | tgaatcagaa | actacactac | atctgaacca | acatgcttgg | actcaatttg | 40380 |
| aaaccatttt | agataatcct | cgtaaagcta | ctccggcact | aaaggcacta | ttttcggagt | 40440 |
| aaaataaatg | agcacaagcg | atgttgatta | tcagctgcta | aacaagatgg | aacgacaacc | 40500 |
| aagtttttca | aattttgatt | gtggtgatct | gtttcttgat | agttttgcgc | ctaagaaatt | 40560 |
| ggcgaaagct | gatgctaata | atgattctcg | ggtctatgtt | gctgtagaca | gagatatagg | 40620 |
| tgttggattt | gcaacgatga | aagtttttat | gctcagtaat | gacgagcatt | caattttatc | 40680 |
| tgggaaatat | ccacgccagg | ttcctgtggt | aatgttagat | caaattgcag | ttgataaagc | 40740 |
| ttaccaaggc | aaaggaattg | gtaaacgcct | gatgcggaaa | gtgatggaag | ctacggtgtt | 4080Θ |
| agttaatgag | cttgctgccg | cgaagggttt | agcgttatgg | gctcacccta | gagctaaaga | 4086Θ |
| tttttatata | tcgttagggt | ttgatgccat | tcctgatgca | accaaacaag | tgcaagacgt | 40920 |
| tgaattagct | ttaatgttta | ttcatgttga | aaccattttg | gatgcattga | agtaactaag | 40980 |
| agttatcaag | aaacggatta | ccaccactaa | accccgcttg | cggggttttt | atttggggtt | 41040 |
| Ctgtgccgga | accgccgaac | gccaaaactt | atgcctcacg | gaaatttcgg | cggttccgac | 41100 |
| gtacaccccc | taaaagcagt | gctgtaagtt | aattttgtct | acgaccgtta | aaattcaaac | 41160 |
| gcgctgtata | gtcagtcgct | aaagaaaaag | cgtctagcag | aagggatttg | taagctaagt | 41220 |
| gccaaagtgg | cgaagaaacg | gagtaaaact | gagattttca | aaagcaaaag | agttgatcta | 41280 |
| tataaaatgg | ttgaaccatt | ttattgtaag | ttcacttgag | tatgagccaa | gtaagtaaga | 41340 |
| aagaaaggtt | aaaaattgag | aaaggtattt | agacctggca | ttaaagagca | ggaacttaat | 41400 |
| ccctgctctc | tatggtttat | tgttgaagtg | ttagttgttt | aaatactcgc | tgttgtaacc | 41460 |
| aatcaggttt | cgttactaac | cattgaatca | acaatcccga | tgggatcatt | ggtaagtcaa | 41520 |
PL 220 839 B1
| ttagacgcgc | tttttcaatt | tggttatact | gaaattgtga | cataagttta | gttaccttta | 41580 |
| ΐ C C t cl g t g | tggcacaggc | cagtgatgat | cttgaccatc | atcattggcc | gtatttttat | 41640 |
| ccgtcatttc | tcatttcaat | accctcaact | tccgtatttc | gttgtttggc | cacattaaca | 41700 |
| gtctgaccaa | attcgggttc | ttttaccttt | aaaatagcaa | ttccattgaa | tataagtata | 41760 |
| caccttaaat | attaaggtat | acacttaaat | ttaattattt | aaggaggatt | tcatggatag | 41820 |
| catgcagact | acagagactt | ttcaagagct | taaaatgggg | gctgatgcct | atattaagcg | 41880 |
| acgtaaccaa | cggttattgt | ctaatcaccg | gaaagagttg | cgaaaattta | cgcgtgcgga | 41940 |
| agcctttacc | tatttggaca | ttgacgcaaa | aacacttgat | aaatatgtat | ctacagcaga | 42000 |
| ttttgatcca | aggcggcatg | aagattctca | atggctaatc | aacatagaag | aaatgtataa | 4206Θ |
| attacgagat | ttgctaccag | ataatttgcg | caaagcatct | aaatttaagc | gcagtgataa | 42120 |
| ccagaaaatg | caggttattg | ttatacaaaa | tcaaaaaggt | ggtgttggta | aaaccgtttc | 42180 |
| tgctgcaaca | attgcttcag | gcttggctac | agagtttcat | caagagtatc | gggtaggcct | 42240 |
| tatcgatatg | gatggtcaag | ctactttgtc | catgtattac | gcaccagaag | cggatctaga | 42300 |
| aggttgttta | tctgttggcg | atctcatgat | gaataatttt | gatctagatg | aaggtgagac | 42360 |
| tcttgaacaa | gtcgtttcaa | acgcattctt | acctacaact | atacctaatc | tccgtatttt | 42420 |
| gccggcatca | caaagtgata | gagctattga | aggttggttt | catgaacaag | tatttggtca | 42480 |
| aaagttaaag | tctccttact | ctcttttgaa | cacgatcatc | aatgctgttc | aagatgaatt | 4254Θ |
| tgatatcatc | attatcgata | cccctccctc | attagggtat | gcaacttata | atgcatattt | 42600 |
| tgccgctacc | agtgtagttt | tcccgttgtc | catcacagaa | aacgacattg | atgctacttg | 42660 |
| ttcctatttt | agttatatcc | ctcaagtgtg | ggctttattg | gcgaatgcta | atcatcgtgg | 42720 |
| ttatgatttt | atgaagattt | taattacaaa | tcatcgcgat | agcgctacaa | caaccgatct | 42780 |
| aatgaatagt | ttatacgatc | attttgcgcc | ttatatgtac | tcaaatgaat | ttaaacatag | 42840 |
| tgaagctatt | cgtcagtcat | cttcgttgct | ttctaccgtg | tttgatatgt | ctaagagtga | 429ΘΘ |
| ataccctaag | agtaaagcga | cgttccaaag | tgcacagcaa | aattgttatg | aagtaaccag | 42960 |
| ccaagtccta | agagatattg | tgaacgtctg | gcgtgaacag | gagcaagcat | aatggctaaa | 43020 |
| aaacgtgggg | taatgagccc | tctaggtaat | gctgttggtg | ccgaagaagc | acaaataaat | 43080 |
| gcagccaaag | ctaatattga | gtctttaaaa | cgccaaatta | caactgaaat | tgaaaaagta | 43140 |
PL 220 839 B1
| agtgaagacg | taacgttatc | tcttcaaaat | ttatttggtt | ttgaatctgt | aggtaaaagc | 43200 |
| ttcttatggc | aattagcttc | tggtgctacc | gctacattta | ccgaagcaac | attatcatat | 43260 |
| gaacaagttc | gcgatagtac | ctatgtgact | ttcgatgtta | acgggcgtga | ccaggcatta | 43320 |
| ttaaatgcag | attctctaca | agatctcgat | tcattagctt | tccagcaatt | ttacccagca | 43380 |
| gtcgctagag | aagtgaatgg | taaactcgat | gtgctagatg | gttctcgacg | cagagcttgg | 43440 |
| tttttactgc | aaaatggtga | agttgatata | tttcgcatac | tggtaactaa | agatgatatt | 43500 |
| tcactttcag | atgctaaagc | tctagctaaa | cagctccaaa | ctgcaaaaga | acataaccta | 43560 |
| cgtgaaattg | gccaacaatg | tttatctttg | gaaaaagcga | atcctaagat | tacacaggct | 43620 |
| gaagtagctg | ctcaacttgg | aatgagtcag | gctggtgtga | gtaaagcttt | aaaagccgct | 43680 |
| aaggtcgatg | aacgtttggt | gaagcttttt | cctgtggcta | atgacttgtc | acacactgac | 43740 |
| tatgctttgc | tgagtaaagt | tatggaagtc | tatgaatttg | aagatgaatt | actatcattc | 43800 |
| atcaatggtt | tgactaaaca | agttgtcatt | attcaggctg | aatattcaag | ggaagaacgt | 43860 |
| aaatcagcta | tcaccaaagc | gataaaagca | gaacttcaga | tcgctaagga | tatgaaaagt | 43920 |
| aaagcacagg | ttagtgttac | taatcttgcg | acatttgata | gctcaggcat | ttacgcaaga | 43980 |
| aagcgtatta | aaggacgcaa | cttcgcttat | gaatttggtc | gactgtcttt | agatattcaa | 44040 |
| ctgcagttag | atgttgctat | tgcagatgtt | ttgaaaaaaa | taaatttaac | acaaaatcag | 44100 |
| atttttaaaa | aatttagttt | tatgtcactg | caattaaatt | atttctccga | ttgtggtact | 44160 |
| acatactaaa | acgccttagt | tacaccttaa | atattgccta | tttataacag | tagataactc | 44220 |
| aggactatct | actgttatct | atctatttgc | tgtatatgac | ttcggttcga | ggtgtacata | 44280 |
| tgagctataa | acaatcgaaa | tttttcagtg | gtggatattt | ccaaaatccc | agcgacccct | 44340 |
| caaacccaca | taaatacctt | aacttgttta | ataaatccac | ttatgacaat | atatctatct | 44400 |
| gatatttata | tattttacta | agggtccttg | gtgttttatg | aaagaagttt | ttaatgctat | 44460 |
| tcgagacctg | ttagttgttt | ttttgcggta | tgccttaaga | tgcgtgctct | ttaaacgaga | 44520 |
| ttttgctgac | cataatgcag | tacctgattt | agccccggtt | atttgtgaga | agggtcatga | 44580 |
| acattacgcg | caacagttgg | aagtatatct | gagccgagcg | gaacgggtaa | aagggattgc | 44640 |
| tgtaaccggt | ccttacgcta | gtggcaagag | tacgtttctc | aatacatatc | aggttcacca | 44700 |
| ccctgaactc | aagtacatta | atatctcttt | agctaatttc | tatgatgagg | atattaaaac | 44760 |
PL 220 839 B1
| agttggtgaa | aacacattat | tagatgctca | acaacggccg | acagttgaac | gcattgaacg | 44820 |
| tgcagtatta | aagcagttat | tatatagaga | aagtgacata | gagagccgag | gctctcgctt | 44880 |
| tgtccgtgca | cctttaacta | acccatctag | accattcgca | atcgctgtca | cgtttactat | 44940 |
| aacgatattt | gggattgcat | tgttgtttgc | gaacctttat | ggcacaaaaa | agatattaga | 45000 |
| ttgggctcaa | ataaactcaa | ccaattttac | tgattcaacc | caccctttat | attggtttgc | 45060 |
| agctttcatg | gtcgcagtgc | caactttatt | acttgctgat | ttggttcgtt | atgttagaca | 45120 |
| gatacgaata | agtaagataa | atcctgttag | tggtgatata | gaggtacagg | gtaaaagtca | 45180 |
| tgactctgtg | ttcaatctat | accttgaaga | tattttggct | tacttcggcc | atgctaaaat | 45240 |
| tgatgtggtt | atatttgaag | atttagatcg | ctttgagtgc | catagaattt | ttgaacggct | 45300 |
| tagagaatta | aataaagtac | tcaacgatag | taatgttgtc | agtcggcccg | tccgttttat | 45360 |
| ctatgctctt | tctgatgatg | tatttgaggg | tcctgatcgg | actaagtttt | ttgatgcgat | 45420 |
| tgttccaatc | cttcctgtgg | ttgcgggggc | taatgcctac | ccacaattca | aacaattact | 45480 |
| ggccaaagct | agtatcacta | tcgcagacaa | tacaagtcat | tgggatgatc | tgtgccgaac | 45540 |
| tatcacgcta | tatattcagg | agatgaggct | tcttaaaagc | attgtggcgg | agtttttatt | 45500 |
| gtacagaaaa | gtgcttgaac | tcaataacac | ccaaggcagc | gaaacaaaat | tattggcgtt | 45660 |
| tatcgcgtat | aagaatttgt | atagtgatga | ttttgcttta | tgccaagaag | gtaaaggctc | 45720 |
| gcttgttgaa | caaatacaac | aaaagaaaaa | ttttataact | ctagagcacc | aaatgcttga | 45780 |
| aaagcaaata | ttagagcttc | gtcaagaaga | gaaagaggcc | gaggcagatc | atttggctga | 45840 |
| tcaaggtgaa | ttggctgagt | tgatgttata | tagagtgaat | tcatctaaag | tcactggagc | 45900 |
| tgattcttct | tatcatccgc | ttctctctat | tgatagtatt | cccctatatg | gtgttgaaaa | 45960 |
| tcctgtggag | gtggttgaaa | gaatgtttaa | cgcgacctgc | agcgagtcat | cgtacggaag | 46020 |
| cgttaatgga | ataacaagga | atggggggtc | tcatggtagc | ctcagaaaat | ggtcagctat | 46080 |
| gcttgagtcg | gcaatgcctg | attatcaaac | acgtctagcg | cggttgaaaa | atcgcaatat | 46140 |
| agaagctcgt | caagcgcggc | agaaaaaaat | aaaacaacta | caacaggaac | aacaggcttt | 46200 |
| gagtttgcta | agcctagcac | aatgcctaaa | gcggcctctc | aaccaggcga | cacctacgcc | 46260 |
| atcgaatgac | aagccaatgc | ttcacgcatt | tctcatagca | ggatttatcg | atgaggatta | 46320 |
| cggcttctac | ttgagtgccc | atgttgaagg | gcatcttact | aaacaagata | tggaattatt | 46380 |
PL 220 839 B1
| aagagcattg | aaggggctga | cagtattcga | ccaaaattat | gaatctggca | actataaaga | 46440 |
| gctggtagca | tttatcaatg | gggaagcatg | tgcttctcct | gcggcatata | acatcggact | 465ΘΘ |
| gatagagtat | ctgtcagact | cgcaaaattc | tgatgctatg | ccttttttca | ttgagatttt | 46560 |
| gaaaaatcaa | tttaaagacc | actcacaggg | gcttgagcga | ttagctcaac | ctatctggag | 46620 |
| taaagtatgc | tttaaatctc | ttattaagca | ttggcctgaa | gtgttatcaa | cattgcaaaa | 46680 |
| taatcaagtg | ttaacaacaa | gcgagactgc | agtattactc | gttagaatac | tacttactat | 46740 |
| tgaggaagta | agagaagatg | agtcattttt | cattcagtca | ataattgatg | cctgtgctga | 46800 |
| tatgcttgaa | atagtcgcag | atagtggcaa | tgtatctaag | gctctaaagt | taatagcaga | 46860 |
| agccgatatt | aaaatcgaaa | ctgtgaatat | tttacctaac | ttatatgtgg | tcattcgaga | 46920 |
| ggcactgaac | tatcaagtgc | taaagctgaa | ctcagtaacg | tttatcgcca | caatatcagc | 46980 |
| aataagagat | aaagacatca | tcacttttcc | tgttgcatat | actaaattac | caattaccaa | 47040 |
| caaagccttt | aaatcatttc | tatattcaga | tattcatgag | tatgcaagat | taatctattg | 47100 |
| tggtgaaatt | tccgaagtgc | cagcaacagt | tatagcttcg | ctattgaacg | atgagtttaa | 47160 |
| atctattttg | actgagaaag | agaagctttc | tctgattgag | gggctagact | ttctgattga | 47220 |
| ggatctcaat | attatggacc | ttggtaattg | caagttgata | gccttagccg | aagagtttcg | 47280 |
| aattgcgcct | acttggtcta | acgtagctgt | gttaataaat | ttctataaca | acgttctaaa | 47340 |
| tgataaaaaa | atagataaaa | agcataacga | aagcactgat | gagttaaaag | tcatggtgct | 47400 |
| gaatttttta | caagcacaga | gtacaaaaga | tgcattatgc | tacaaaggtg | agaagttaga | 47460 |
| acttgaatcg | gtacgcgatg | agtttatttc | atttatcgaa | tctagtgaga | taaacgcgga | 47520 |
| tagttttgct | gaatatatag | ctgcggtaga | gtatcaatat | ggtcctgata | atatttatgg | 47580 |
| tttgcgtgag | gatcaatcct | ccatattgtt | aaagagagga | ttacttttac | catcatttga | 47640 |
| gctttatcag | gcgctaagag | ctgaccagca | aaataatact | gctttagctt | tgatacagat | 47700 |
| gaacgaatca | atattcttta | aacttaatat | tatggaagtg | gatggttctt | ggttaccaga | 47760 |
| gttggagttt | tcgtctgagg | atttgttgaa | attgatcgtc | agtgattctc | tttcggtaat | 47820 |
| agcaaaacaa | gcgttattaa | aaactcatca | agtaaatatt | tataaagata | ttgccccgaa | 47880 |
| agaatggtta | cacttggttt | tacctattca | aaagcaagaa | aaaatatacg | gactgactct | 47940 |
| gataaaaaat | tcagttctga | ctgagcaaat | tgctattgat | ttaggcttga | ttcctgagca | 48000 |
PL 220 839 B1
| gttactattg | gaagacgatg | ttataaaagc | attgcttgca | atgaagtcaa | tttcttcgga | 48060 |
| tgacaaagta | cgtttattga | tagggcaaat | ggctcatcag | aaagcgaaaa | tcttgccaat | 48120 |
| gatcaattcg | tgggactcga | agccagatag | tttctatacc | actagtgatg | gaatattgaa | 48180 |
| tggattgcta | gataataata | ccaattacgc | tttcagttgt | tctttggttt | accatgaagt | 48240 |
| cgtatcttct | tgctctgtca | ggcgtggacg | actacatatc | aattacttta | agggttagtt | 48300 |
| ttatttttca | gccactcttc | aacgatgact | aggttattaa | aaccgttcac | tcgtaatagt | 48360 |
| attgttagtt | taaagtagga | aaatatcgtg | gttatacaag | aacaagcatt | gagtaaatta | 48420 |
| gcgaatgcca | tgaggatata | tggcgaagct | catatgaatt | ttaatcgttt | gaagttagtt | 48480 |
| gatgccgaag | aggctattga | taacttagat | cgagctatgg | aagccaagct | tgaagctttc | 4854Θ |
| catagtctat | atgatgtaac | aaagggcctc | tttgattact | ttgaccatgc | ggatacagca | 486ΘΘ |
| attctcattt | tactgagaaa | tgcagttcac | caccgtaacc | atctgttgtt | taaaacttgg | 48660 |
| aatcaagaga | tgggtttaaa | tgaagggcac | aaaaaatacc | ttggtggtga | gtttttgctt | 48720 |
| gcaagtcacg | acattttgac | taatggtcat | gaaatgaagc | atttgtacaa | gcttgaagat | 48780 |
| ttctatctgc | gaatagaccc | atcactaggg | tcaccttatg | tcgaggatag | aattagtgac | 48840 |
| aaaagtcgag | aaaaattgtt | aaatcagctc | gaaaatgatc | ttagttttgg | tgcgcttaaa | 48900 |
| aaatactcaa | acagtgaaag | atacccgcta | aaacatgtgt | atataaatat | aattcctatt | 48960 |
| tatatttcag | ctactgttaa | ggttttcaaa | gcacttaacg | aaaagggtgt | aaagtttgtt | 49020 |
| ggttttgacg | caaatgcata | caaagaagct | tttacaaatg | aactagctgt | agatttgggc | 49080 |
| tcgtttaatt | attcgacaat | acggatattg | taattaaagt | aacaactgtt | taagagtgat | 49140 |
| tatcaatgca | aagcattttc | actattctat | ctatggtatt | cgggtggatt | gcgttgctca | 49200 |
| cgtcttaaca | ggcagttagc | tttcttatat | taaatggtgc | tatttatgaa | attttttgaa | 49260 |
| gcaggagttc | aatataaaga | tcttgatggt | tctgtccatg | cagaccgaga | tgataatcag | 49320 |
| gatgcaactt | attatctaag | aaaacaccac | agcattcctg | ataatagctt | cgtgcttggt | 49380 |
| attcaagttt | attcgtctgt | acataatgtt | agatataata | cccttacagt | taggtttttt | 49440 |
| cattcaaatg | ttggtagtta | tgacaatatc | caagaaaaga | taaaaactga | aggcgatgct | 49500 |
| ttggttctaa | acgaagttga | aattgaaatg | ccttacaatg | atttttttag | tctgtttaag | 49560 |
| cgctttagtt | taactttatc | atctaatggt | ttactcgaag | gcaagtcata | taccacaata | 49620 |
PL 220 839 B1
| taaaagctaa | caaggcgtta | tgcctatctt | ggagactatc | gtgaataatg | agcaacgtct | 49680 |
| aagaattggg | tactaccgtt | cctctgattt | aaacgatggg | aaaatagatt | ttggtatctt | 49740 |
| aaatgcagat | ttttctttag | attcctatag | agagctttat | cgcaactcga | aggtgattct | 49800 |
| tgatttacag | ccaatagcaa | ttttgttcga | agctgttcaa | attaatttca | acgaattaaa | 4986Θ |
| ttctagtttt | aatattggga | ttaactttac | gaagaatatg | aaacctggta | aaggggttgt | 49920 |
| ttttcaatat | ctttcattga | tgagtgattt | gtctgtaaaa | attacaaatt | ttataacctc | 49980 |
| agcgaataca | tttcttgtca | actcggaatg | caatcttaaa | aagacatctg | agcattttga | 50040 |
| atggaatgaa | tatcgaaata | aactacataa | atcctcattt | tcttacagat | tcacttatga | 50100 |
| gttaagaaac | tattcgcaac | atcatagttt | gccaatatca | tcgctaaatg | tgaaccaaga | 50160 |
| taagacgaaa | gataaaataa | ccttgcttgt | aaacatgaaa | agagatgagt | tacttagttg | 50220 |
| tggttataaa | tggggtaaaa | ttaaaaatga | catccaaagt | tgtgacgagg | tcttcgatct | 50280 |
| ttatcctcat | ttaaataaat | atatgaaaat | tatagaggag | ttattctcta | agtatataga | 50340 |
| cgttaagagt | gctaaactgc | aagaaacaat | catctatttt | gcaaaactaa | atagcacttt | 50400 |
| taagttccct | gaaaaaagtg | ttcctgtagt | ttttgttggt | gaagccgaaa | atgacaaacc | 50460 |
| tgtacctaaa | catcatgaaa | tgataccatt | tgaaaattta | gattggttat | taagtatttg | 50520 |
| taataaggta | ggttcattat | cctgatgaac | agttctaaag | ggaaaattta | ccgtttgcca | 50580 |
| ttttcactta | gttaaatgtt | atcgctaacg | ttaaatttat | cattaactgg | ttcgttaggt | 5064Θ |
| ttctaggaag | tattatgtat | ctattagaca | gatcaaagtt | gaagctcgga | gacatcattc | 50700 |
| tcactcgctc | gaatgaaaag | aacagctcat | taatttgtaa | gattactaat | tcaaatttct | 50760 |
| cacatgctat | tttgtatgtt | ggtgaatcga | gctatattca | ttctgatctc | tatggggtgc | 50820 |
| attctagtaa | tactcagcga | ttactaatag | atgagcttca | atatgtaaaa | gttatgcgag | 50880 |
| tggacgatcc | cgttgtagca | gaaaaagcca | taatttatgc | gcggctacaa | gttggaactt | 50940 |
| cctattcaaa | ggttagtgct | gctaatgcgt | tcgttaaagt | ttttacaaaa | ctagattcga | 51000 |
| aaaggcagtt | ttgttctagt | ttggtcgcaa | aagcttttga | gtcggcaggt | gtcaaacttg | 51060 |
| ttgcaaacag | tgatgcgtgt | ttaccgcaag | aaatcgctga | ttctatgttt | gtaaaagaag | 5112Θ |
| ttaaaggttg | tgtgtatcaa | gctgaaccga | atgaaattga | ctttgctaat | agctatgatc | 51180 |
| ctatcaagaa | tcaagctgaa | attacaaaca | acatactcaa | atctgctaga | aaaatgttag | 51240 |
PL 220 839 B1
| gtaacaaaat | ccaatcactt | tcagatatta | ctaaagctct | tatagcggac | cctaaatacg | 51300 |
| atagcgaaat | cactgatatt | tatgagtcct | ctggatactt | aaccatgtgg | gaatacgagc | 51360 |
| taaaagcaaa | cccatggcga | tataacattg | acttatttga | ggctttacca | ttgtcaaaaa | 51420 |
| gtgaacaata | tgtactagct | acacaagagt | tgaaaaatgc | tgatgggcta | cttgagttgt | 51480 |
| acaagattaa | ctttgaacaa | tacttttata | tcaaagagtt | acaccgtttg | aaatatgcca | 51540 |
| accaacaata | tatcttatac | aaaaaattag | ttgaaaatgc | tcttgaccat | aagtttacag | 51600 |
| ccgaagcaat | tctcgggaaa | tagaccatac | aaagtgttcc | aacaccgttc | cggcgcttcg | 51660 |
| cgcctccact | cgacagtttg | taagtagcgc | atttagcgaa | ttgctgccca | aggtttatcg | 51720 |
| caatgtgcta | cttacaaact | gcggttgaac | acaacgttat | acatcacatg | gagtcaactt | 51780 |
| atgtcctatg | aatgggtaaa | ggatttaatg | ccactggctg | gtgttggttt | aggtgtctat | 51840 |
| ctagttcctt | atatcgaaag | tagaaagtca | aagtcagagt | caaaaagagc | tattgattgt | 51900 |
| ttttatgctg | agttggctga | ttatgaaaag | gcagcatcct | catacgtaaa | aaattattat | 51960 |
| gaatcatact | ggatactttg | gaaggctgat | aaaggtcaaa | agtttaatga | tcgtttttat | 52020 |
| gagcttaccc | tagctcctcg | tctagaattc | ttatctttgg | aaaccttgct | tagcaagtct | 52080 |
| ttgctagagc | tgtctagcga | tcaaagaatg | gctgttaaag | cactaaagtc | tcttgcagat | 52140 |
| aaaattaata | aaaattcaga | cctgattggg | caagcgaaga | gtgcggaaga | ttttgtgctc | 52200 |
| ctaattggaa | aatttagagc | aaatacagaa | atgttagctt | cattttacta | tttggttagt | 52260 |
| cgtatgcatc | atgaagctga | tcggtttgct | tatctagatc | taacaaatag | tgaggtagtg | 52320 |
| aaaaaggtca | atggagttct | tggcatttcg | ttcgaatggg | aggatctagc | gaaagccaat | 52380 |
| gtataacaaa | ttgctgcacg | ctgacacata | ctgctacgct | aatttttgtg | ttttcgctgc | 52440 |
| gctccatttt | atacaaaagc | actctccgca | gcatgtgcag | gtgagaaaga | cgttgtcaaa | 52500 |
| aatgaaccag | tgaatcactc | tacaccagac | tgattttcac | cccgtatctt | ccttccaacg | 52560 |
| gggctttttt | tgccttagaa | tgaatcaaat | ctttagagaa | ttgattcatc | ggtttttagc | 52620 |
| tcattcaact | tagcagcctt | ggcaatggta | gaacgactgc | atttaagcag | actctgcact | 52680 |
| tgtgaccagc | ttttcccttc | atcgagtagt | aaccgaatat | tgtgcctcaa | tccatggtta | 52740 |
| ggctgacgcc | caaggtattt | acctaaggtt | ttggcctttt | cgatgccttg | tgcttgtcgc | 52800 |
| tttcttcttg | tctcgtaatc | atctctggcc | atggccgcgg | ctaaatcaat | catgaactca | 52860 |
PL 220 839 B1
| gtcagtacct | ttgcgatcat | ggtatgttct | tcagtgttat | ttaagatccc | atgtgtcatt | 52920 |
| ggctggtcaa | caacaacaat | atgaatatag | gcttttacca | atttactttt | taggaccttc | 52980 |
| cattgctcaa | aggggaggcg | agacaatcta | tcgacttttt | ctatgagtaa | aacatcacca | 53040 |
| gggtgagagt | ccatgattaa | gcgcccaagt | tcaggccgtt | caattttcgc | ccctgattgc | 53100 |
| gtctcagtat | aaaaactggc | tatgcgaaca | tttttacttt | ctgaaaactg | aaccaactca | 53160 |
| tttctggctc | gattggcatc | ttgttcatct | gttgatgcgc | gtaggtaggc | ccgaataaac | 53220 |
| attttgcctc | atttggtgtt | tttaggatgt | ggtttacgat | gctagtgcga | gtagggtttt | 53280 |
| aaatcaatat | atagcgaacc | aattggcaat | gtgatgtggt | tagtttgctt | ggggtatacc | 53340 |
| ctaaatggtg | gttcgtctag | tggtatcctt | gtgtatagat | atactaatag | cgacctactt | 53400 |
| cggatatgag | caacgtgaca | ctactcaagt | tgtcgatacc | tgcatactct | tgagctcttt | 53460 |
| cttgtggaaa | ccttacgatc | atacttgccg | caatgagaga | gtaaataact | ctttcaggag | 53520 |
| tatagaagct | gtacttagat | tatccccgat | cagcgataaa | cacgtgaaca | tgctggggca | 53580 |
| ttattcgttt | acccttattg | aacaagtact | aagtgggcaa | ctcaggccgc | agaagcaacc | 53640 |
| atcagagcag | aacgaattga | cttagcgtac | gttttgttcc | gttggacttc | acactcctga | 53700 |
| agcaaggctt | aaccagtata | aatatgctac | gctacgccaa | aaagtggcgc | acttacttaa | 53760 |
| ggtgttatgt | gcaatcaatc | agaggtatcg | tattttgact | gaaatgaaaa | ccttagttct | 53820 |
| tttttaatta | ctgctttggc | agagattgtt | ggttgttatt | taccatacct | ttggttgcgt | 53880 |
| gagggaaaat | cgatttggtt | gctgattccg | gccgccatta | gtcttgctgt | gtttgcttgg | 53940 |
| ttgttatcct | tacatccaac | agcagcaggc | agagtttatg | ccgcttatgg | tggtgtttat | 54000 |
| atttttatgg | ctattttgtg | gctgtgggta | gtagatggaa | tcaaaccaac | aacctgggat | 54060 |
| tttgttggct | caggcgtggc | aattttgggt | atggtaatta | tcatttttgc | accacgcacg | 54120 |
| tagtacataa | taagttgttt | aattttgttc | cgcccacaaa | aatcgtagcc | agaactggac | 54180 |
| tggctacgct | gcgccagcca | attagcaaag | cgttacctat | agatattttt | cgccactaga | 54240 |
| tctgaacatc | taacaatttg | tattccagag | taatttagcg | ttgttcagtt | tcgattgtaa | 54300 |
| tcagtaccaa | ttaagcatta | gttttcatag | ttagaaagca | aacttagaaa | tattttcaaa | 54360 |
| gagttcattg | tttatcaaca | acagagaatt | gacattcaat | acttgaattt | agaatcttgt | 54420 |
| gttcagtcaa | taaaatagat | gtcactttgc | gttattcacc | aacgtttttt | tagctcgatt | 54480 |
PL 220 839 B1
| attttatact | tatcactgat | ttagccactg | tagagttaag | ggatgtcagt | aatgaaacaa | 54540 |
| cgcatcatat | taaaagctaa | tattttcaaa | gctctggggc | atccaacgcg | attatggatg | 546ΘΘ |
| gtagagcaac | taacaaaggg | tgaaaaatgt | gtatgtgaat | ttgttgaggg | cgttgatgtt | 54660 |
| gatttttcca | caatttctaa | gcacttatcc | gttttgcgcc | atgctggaat | tgtggatatg | 54720 |
| gaaaaacgag | gtaagcagat | tttttatcgt | ctcaccatgc | catgcttact | gacatcgtta | 54780 |
| cattgcattg | atggtttatt | agatcaacaa | attcagaagc | agatcgcatt | aatggagtag | 54840 |
| tttcagactt | atcatttggt | taaatggcaa | aataacgaag | taaccaagtg | aggctaaatt | 54900 |
| atggatatta | aaattctcgg | tacgggttgt | acaaagtgtc | aaaaattggc | agaggctact | 54960 |
| aatgccgcgg | cgcaagcact | taatcttgat | taccagctaa | ctaaagtgac | tgatattgag | 55020 |
| aaaattatgg | cctacaacgt | aatgtcgaca | ccggcgttgg | tggtcgacga | gcaaataaag | 55Θ8Θ |
| ctgatgggac | gacttgccag | tgttgatgaa | ctcatgacct | tgcttcaagc | ccatacagct | 55140 |
| tagtggcata | aaggagtcgg | catgaacgtt | aaaaaaattg | tccgctacct | gctgctcact | 55200 |
| gtggtttgtg | taggcttagg | gttggttggg | tatcagcaat | ttggcacgat | aaccgctgct | 55260 |
| aaaactaaca | atgcggatat | cgctgccagc | gtgtcacctc | aattaaaaga | tgggctgaat | 55320 |
| gtttattatt | ttcatggaaa | tcagcgctgt | acaacgtgtg | tccgcatgga | aaaattcaca | 55380 |
| cagtctactg | tgatgaatca | gtttttcaag | caagtgcgcg | atggtgaaat | gcagttaaat | 55440 |
| ttggtgaatg | tcgatttgcc | tgaaaaccag | cattacatcg | atgattatca | gttggtattt | 55500 |
| cgtaccgtgg | tgattgctaa | tacccataat | ggcgtggata | cagattggcg | acggttagac | 55560 |
| cgtgtgtggg | agttggccaa | caacgagctg | gcattcagcc | aatatttgac | tgaagagatt | 5562Θ |
| aacgcaatgg | ttaatcaaat | tcaggcaaat | caaaccctcg | cggcgccatc | tcccaaggag | 55680 |
| ctcccccatg | gatgagtggg | cagtcatgct | gttatcggcc | ttttggtttg | gcattttaac | 55740 |
| ctctataagt | ccctgtcctt | tggccaccaa | tgtggcggcc | atttcctata | tcagtaaagg | 55800 |
| aatacaatcg | ccttatcggg | tagtgggtac | tgggcttgcc | tacacgatag | ggcgcatgct | 55860 |
| gagttatttg | gtgattggtg | tgatattggt | tggcagtttg | ctctcgacaa | tgacattatc | 55920 |
| cgtcgcgctt | cagaaatata | tgaacctact | attaggtccg | attttgatat | tggtagggat | 55980 |
| gtttttgctg | gagttattga | cgttgcgtct | accgggtgat | ggtgccttaa | tcgaaaaatt | 56040 |
| aaagtctaaa | atcaaccctc | agggatatgt | aggagcttta | ctgctaggcg | tgttatttgc | 56100 |
PL 220 839 B1
| gctgtcattt | tgtccgactt | ccgccgcgct | cttctttggt | tcgctgctgc | cgcttgcact | 56160 |
| agagtcacaa | tcgagtattg | cactgccagc | gatttatggt | tttgcgactg | ggctgccggt | 56220 |
| tttagttttc | gctattttgc | ttggcgttag | cgcccatcgt | gttgctaaag | cctacaacca | 56280 |
| tattttgacg | tttgagcatt | gggccagaaa | aatcactggc | gtggtgttta | tcatcattgg | 56340 |
| tgcctattac | gcttgggtga | atattttcgt | tccatctttg | ttttagcata | attttattcc | 56400 |
| taacaatgct | tatcttgtga | ggtccttcct | gtgaaaaaaa | cgttggtgtt | aatagttgga | 56460 |
| agtaccttta | ttctattaat | tgggatagta | gtttggggtc | ttaatttttc | ctcaaaaaca | 56520 |
| caatatgctg | aaagtaaatt | aacggcagag | atgatggcta | agtcaacgtc | taaaaagtcg | 56580 |
| caactacctc | ctgcagttag | cctttttaaa | gtcacaaatc | aaacgtttag | ccagtatatt | 56640 |
| gtattgactg | gaacaattga | gccaacaaaa | atggcgagtt | tggcctctcc | ggcagaaggt | 56700 |
| ccgattctta | atcttgtggt | gcgcgagggg | gacactgtta | atttaggaca | agagatttta | 56760 |
| cgcattggac | gaactcatgc | ggctaattct | tttcaaacat | ctgccgctga | agaagtacgt | 56820 |
| aaacaagtat | taaatttaaa | gcgtattgaa | actttagtta | agcagcatac | tttacctgag | 56880 |
| gagcagttag | acgaagcact | agcatcatta | gaaaaagcga | aggcggcatt | gagccaagca | 56940 |
| aaacaagctc | ttaatgatta | catcgtgacc | tcgccttggt | cagggattat | atctaaagtc | 57000 |
| ttggtttcag | atggtcattt | cgttataccc | cgtagtccct | tggttgaaat | gtatgatcca | 57060 |
| gatagtttgg | tattacgatt | tagcgtcgca | gaagcccaag | ctttagcgct | taagaagggg | 57120 |
| cataaaatta | aagcgacttt | tgatgggctt | gctgggaagg | aatttgaatt | agagattatt | 57180 |
| cgagcttatc | ccgatttaga | tagaaagtta | cgtacgcgtc | tttttgaggc | ggcgctgcct | 57240 |
| gtaaatgagt | ttattccagg | tatgtttgcg | cggatcagtg | caatacaaca | aaaacacgaa | 57300 |
| aatacccttg | tcataccgat | tgatgcgctt | caagtgcaag | gaaatgacaa | aagtgtgttt | 57360 |
| gtggtgactg | ataatatagc | cactcgacga | ttagtcgaaa | ctggtctaga | gcaggatgat | 57420 |
| caaattgaag | tgttatcggg | actgaaagcg | ggcgagaaga | tcgttctaac | tggcattgaa | 57480 |
| cgggtgaaaa | atggctctgc | agtaagagta | ttggagcaac | ccgctaaaaa | caatagcgcg | 57540 |
| ggtgttgtga | aatgatcatt | aaagccgcta | tttctcgtcg | aatttcaacg | gctgtattgg | 576Θ0 |
| ctttcggttt | agctattttt | ggggcgctaa | atctgaatat | gctacctgtc | gatttcttac | 57660 |
| cttcggttaa | ataccctctc | atcaagttat | cgatagtttg | gcagggtgca | acacctgagg | 57720 |
PL 220 839 B1
| atatagacca | aaacttagcc | gatcctattg | agcgtgaact | cgcctcagta | gatggtctag | 57780 |
| attatctttc | atctagcgcg | atagagggcc | tatatcaatt | ggatgtcaat | taccgttacg | 57840 |
| gtgttgatgt | tgatgttgca | tatcaagata | cgttagcggc | gtttaatcgc | tccaccaagg | 57900 |
| agctgcctgt | tgatattgag | gctgccgtca | tcatcaaagc | cgatccgtca | caattaccga | 57960 |
| tagtacaagc | tgtgtttgag | tcggaacata | tggatttgac | tcagctgcgt | acttgggttg | 58020 |
| attcatggtt | aactcagcga | ctgttatctg | ccggtggcgt | agccgctatt | gatgttgccg | 58080 |
| gcggtcttga | gcgtgaaatt | cgtatttttg | tggatgatga | aaaactagaa | gcccacggat | 58140 |
| tagatctcac | cacgttagaa | cgggtcctcg | ctgctgagaa | tttacaacgg | gttggcggaa | 58200 |
| gggtgactgg | ccaataccgt | gagaatatag | tgagggtgat | gggggagttt | aggcagttag | 58260 |
| ctgttattca | agatctcgta | ttaagccgcg | ataataatgg | caacattgtt | cgtgtcaggg | 58320 |
| atgtggccga | ggttaaagat | agccatgaag | acattcgtat | gctgacccgc | ttaaatggtc | 58380 |
| atccggcggt | taaagttaac | gtgattaaac | aagccgacgc | taatactgtc | acaacggtag | 58440 |
| ataatgttga | ggaccgttta | gcggagttag | cgccatcttt | tcctaaggat | atcaaattca | 58500 |
| ctttagttga | aaaccaagcc | gactatatca | atgattctat | ccgtggtgta | cgtaacactg | 58560 |
| ccttagaggc | tatggcgctg | gttgtgctgg | tattattcgt | atttttaggt | aactcaaggc | 58620 |
| aagtgttaat | tattgcgata | gccttgccat | ttgcattatt | ggtgaatttc | tttttaatgc | 58680 |
| acctcgcagg | cttttcactc | aatatttttt | cccttggtgg | tcttgtcgtt | gcgattgggg | 58740 |
| tgttacccga | cacatcaatt | atagtggttg | aaaatatttc | ccggctgcgt | agtttacatg | 58800 |
| ataaggctaa | cccacaatcc | atctccgagg | aggctacact | ggaagtgggt | ggggcgatta | 58860 |
| tggcagcgac | agtgaccttt | atagcgctgt | ttgttccgtt | tttactcgtg | cctgggctaa | 58920 |
| tcaccttact | atttaaagag | ttagtcctag | ttatccttgg | tttgatgatc | attgcaggtc | 58980 |
| ttgccgctat | cacactgact | cccatgctag | gtggcgtgtt | attaaaagcc | aatcaacgcg | 59040 |
| aatttgcctt | cagtgagaag | attaaccatg | gcttacgctg | ggcttatggc | gtcttgttgc | 59100 |
| atagcgcatt | gcagtttagg | ttaaccacta | tatttatatt | tattggtgtt | gcaatcggtg | 59160 |
| gtgtgctgct | gtttaagtcc | gcagggtctg | aatttttccc | cgctgttgat | gatggccgta | 59220 |
| tagtcgttaa | aattcgaatg | cctgcggggg | cgaatttagc | tcgcatggat | gccatagcac | 59280 |
| agcaagttga | agcattagtg | ataggcgatc | agcgagttcg | tagtgttttt | gcgctttcag | 59340 |
PL 220 839 B1
| gtggtgcggt | caggggactg | tataccaata | aaattggtaa | tgaaggtgaa | gtcgatattg | 59400 |
| aacttgtccc | ctccagtgag | cgtaaaatta | ctactacgga | atacattaaa | gaattgcggc | 5946Θ |
| ctaaggtggc | taagttgcta | gccccggggg | cgatattagc | ggtcaatcag | gcaaagatgc | 59520 |
| ggggtattcg | ctctgtggga | caggccgaaa | ttgaagttga | aattaatggc | tcagaagttg | 59580 |
| atacactttt | tgatgtggcg | aataaattgg | cggcaaaatt | agccgaaagg | cccgaattaa | 59540 |
| ccaatgtcta | tgtctcgctt | gattcttcga | agcctgaatg | gcaagttgat | attgacagga | 59700 |
| ctctggccgc | cgaacatggc | ttatctacta | aggaaattgc | ccacgttctt | aacggctaca | 59760 |
| ttaatggaag | tgtggcgaca | cgttatcgag | aggcgagtga | gttgtatgat | atccgaatca | 59820 |
| ttatgcctga | gtcacagtta | cggtcgcgct | ctgatgttga | aaatatctct | atagccacgc | 59880 |
| cttctggtca | ttatgtgcgc | cttaaagacg | tagctaaagt | gaccgcagca | acaggtcctg | 59940 |
| ttgaaataat | tagaaaaaat | cagataaaac | aagtaattgt | acgttgtgat | ccgtcagcaa | 60000 |
| ctgatcttaa | ctcagcaaaa | gaattggtca | ctaatattct | tacagagaca | acttggccta | 60060 |
| cgggatacac | ttattcgata | ggcggtaagg | cattgcaaat | gacgcaaatg | caaacgacag | 60120 |
| tgcaaagtat | tctgggctat | gcagtatttt | ttcctttatt | gtcttagcgg | tacaatttaa | 60180 |
| tagtattcgc | cttcctttgg | tgatcttatt | tgccgcacct | ttttgcctta | caggtattgg | 60240 |
| atatgggctc | ttcttagcag | gtcaaccgtt | tggagctacc | gtgatcattg | cggctatgat | 60300 |
| agtgctagcg | gccaatgtta | ttgatggtgt | gttactgatc | caaaccgctg | agcgtcaaaa | 60360 |
| acaacagggt | atgaccttgt | tgaaagcgac | atttgatgca | ggtttgagtc | gacttcgtcc | 60420 |
| tcgactgatg | acggtattac | ccgccgtatt | aggctttaca | ccgttagcat | ttgcatttga | 60480 |
| ggaaggaggg | gagttattgc | gtcctatggc | cgctgcagcg | ataggtggtt | tgctattaaa | 60540 |
| tgtctttgtt | gcgctatttc | tggttcctgt | tctgtatact | tttatggcat | ctacaccaga | 60600 |
| accagcatca | gctgatataa | cttaagcggt | agggtaataa | acgcggttat | caaggttaaa | 60660 |
| aaacgcctgc | gaagtcatta | gcttcgcagg | cgtttatttt | gagattaagc | agcgtttagg | 60720 |
| gagtaatcta | taaacgaaaa | tgttattgag | ccactctttg | cccattggca | tcaataacca | 60780 |
| cttcaccgtc | ttctttagta | aaagcaccca | gttggggttt | gggtataata | tccaatacct | 6Θ84Θ |
| gttccgaggg | gcggcagagg | cgagtgccta | atggagtaac | gacgataggg | cgattaatta | 60900 |
| ggatcgggtg | ctcaagcata | aaatcgatta | attcactgtc | gctaaactta | tcttcactta | 60960 |
PL 220 839 B1
| agcctaatac | ggtaaagggc | tcaacatttt | gccgcagtaa | actgcgtacc | gaaataccca | 61020 |
| tctccgcaat | cagttgctgc | agagtttgtc | ggctcggtgg | cgtctcaagg | tagaggatta | 61080 |
| tggtcggttc | aacccctgaa | ttgcggataa | ggcctaaagt | gttgcgcgat | gtgccacagg | 61140 |
| etggattgtg | gtaaatctta | atgctgtcat | caatcatatt | agtcataaca | tgtctctgat | 61200 |
| aaataatcgc | ttataaattt | atccataggc | actaaataga | tgctctagtg | cccatggaag | 61260 |
| aagattagaa | ggagaggcgc | agcgccagtg | ccgctagggt | gacaaatagc | actggtactg | 61320 |
| tcatcacaat | gccgacgcgg | aaataataac | cccaggtaat | attgatattt | ttctgcgcca | 61380 |
| gtacatgcag | ccataacaag | gttgctaaac | tgccgatggg | ggtgattttg | ggacctaaat | 61440 |
| cgctaccaat | tacgttcgcg | taaatcatgg | cctctttaat | cacgccagtt | gcattgctac | 61500 |
| cgtctatcga | cagggcgcca | attaacactg | tgggcatgtt | gttcatgatg | gacgataaaa | 61560 |
| aggcgaccaa | gaagcctgtg | cccatagtgg | cagcccaaag | cccttgttct | gccaagctat | 61620 |
| ttaatacgct | tgataggtaa | tcggttaagc | ctgcgttgcg | aagaccataa | acaaccaaat | 61680 |
| acatgcctaa | tgaaaagact | acgatttgcc | atggcgcgcc | gcgaagtact | ttagtggtat | 61740 |
| ctatggcatg | gccttttttc | gcgacaacaa | acaggatcag | ggcacccacg | gcagccacta | 61800 |
| aactcacggg | cacaccgagt | ggttctaagc | caaaaaagcc | caccaagagc | aagactaata | 61860 |
| caccccaacc | ggttttaaag | gtgttgaggt | cgcgaatggc | ggccttaggc | tcgcgtagtt | 61920 |
| tttgcaagtc | gtaggtcgcg | ggaatatctt | tgcggaaaaa | cagatgcagc | atgactaagg | 61980 |
| tggcgctaat | agcggcaata | tcgacgggca | ccatcactgc | agcatattcg | ttaaagccta | 62040 |
| tgttgaagaa | gtcagccgaa | acgatattca | ctaagttaga | gacgattaac | ggcaaactcg | 62100 |
| cggtatcggc | aataaaaccc | gccgccatta | caaaggctaa | ggtcgctccg | gcgctaaagc | 62160 |
| ccagagccag | taacatcgca | attactatgg | gggtgaggat | cagcgccgcg | ccatcattgg | 62220 |
| cgaacaatgc | ggcaacagta | gcgccgagta | acactatgta | agtaaagagt | aaacggccac | 62280 |
| gacctttgcc | ccaacgggcc | acatgcagcg | cggcccattc | gaaaaatccc | gactcatcta | 6234Θ |
| ataataaact | gatgatgatc | acggcaataa | aggtggcggt | cgcattccag | acaatattcc | 62400 |
| ataccacagg | aatatcccct | aagtgcacca | cacccagtag | tagagccaat | acggcgccca | 62460 |
| aggtggcact | ccaacctatg | cctaatccct | taggctgcca | aattactaac | actatggtga | 62520 |
| gtacaaaaat | tgccccagct | aaccacatac | aagctcctaa | aagggcagat | accgtctacc | 62580 |
PL 220 839 B1
| cgtaacccta | aaataatgcc | cataaggata | cattaatgtt | gttttgccag | taggcttaat | 62640 |
| cgcgtaatac | caatgggttc | aatgggatta | atgccaaccg | agaggctaag | 627ΘΘ | |
| ccctgttgca | ctttctctat | ttgcaccagt | tcatggcgag | cgcgtacttt | taataatggc | 62760 |
| gaggtcgttc | tggcaacggc | gaggctatta | ttgataagcc | atgcccaagg | ttcaatccct | 62820 |
| gcgcggcgca | aatcttcctg | caaattcgcg | gcttcgagca | caggggtagt | ttcgggcaaa | 62880 |
| gtgaccaata | ataccttagt | gcgctctttg | tcttgcaact | gcatcattgg | cgttgaatag | 62940 |
| tgagttgttt | ctcccatacg | tttagctact | tcacggtggt | aggcgccggt | agcgtcaagc | 63000 |
| agcaataagg | tatgccccgt | tggcgcggta | tccattacca | caaagcgttt | ccccgcctcg | 63060 |
| cggataatgc | gcgaaaaggc | ttggaatacg | gcaatttctt | cggtgcatgg | cgaacgtaaa | 63120 |
| tcttcttcta | acaaggcttt | accttggaca | tctaacgctt | tgcccttcgt | tgctaacacc | 63180 |
| tgttcgcggt | agcgagtggt | gacttcgacg | ggatcgattc | tgctgacttg | caaattcgcc | 63240 |
| aattgaccat | gcagcgtttg | ttctagatgc | gcggcaggat | ctgatgtggt | caaatgcaca | 63300 |
| tctaagccca | gctctgccaa | tctgaccgca | atggcggcgg | ccagcgtagt | tttcccgaca | 63360 |
| ccacctttgc | ccatgagcat | gataaggcca | tggtcctgct | gcgcgatttc | actgattaaa | 63420 |
| ctatccagtg | ttggcacttg | gggctgactg | tcttgcttac | attggtcttg | ctcatccatt | 63480 |
| gcgggtaaat | ctatgtcttc | tgcaggcata | aagagttgge | gtaatggcgc | aacgcctacc | 63540 |
| aggttcatcg | attgaagtat | cagcgtttcg | tgaggtaatg | ccgtgagaat | gggggataaa | 63600 |
| ttggtgagca | ccgcttgttc | acgttggtag | agtgctgagg | caaggggatc | attgagtgct | 63660 |
| gcgcctttgg | gcaatacgcc | gttaatcacc | agatattgat | tcttaaggcc | cacttggcgc | 63720 |
| aattcttggt | gagtgcgctc | cacttctatc | agggtggatt | gctgtggacg | cgcaactaag | 63780 |
| atcaagcgtg | ttttgtcggg | attggccagt | gcagctaatg | cttgcgagta | gcgttccgcc | 63840 |
| tgtttttcga | ggcccgctaa | tgggccaaga | caggaagcgc | cctcggggtt | agtctcgata | 63900 |
| aagctgctcc | aagccccagg | gagttgtaac | agcctaatcg | tatgccccgt | tggtgcggta | 63960 |
| tcaaaaataa | tatgatcgaa | atcttgcagt | agcgatgcat | cggttaataa | accggtgaat | 64020 |
| tcatcgaagg | cggcaatttc | agtggtacag | gcaccagaga | gttgttcttc | aatactgcga | 64080 |
| actacatctg | gcggtaatag | gcctttgacg | ggatccacaa | tacgagcgcg | gtattgctct | 64140 |
| gcagctgctt | gaggatcaat | ttccagtgcc | gttagtcccg | caacgctgtc | tattggcgtg | 64200 |
PL 220 839 B1
| agtttattac | ctatggtttg | tccgaaaact | tgacctacat | tggatgcggg | atcggtactg | 64260 |
| accaacaaca | cccgcttacc | actgtcagct | aaggtaattg | ctgtcgcgca | ggatagcgat | 64320 |
| gttttaccaa | caccgccttt | accggtaaag | aagaggaatg | cgggcggatt | ctgaataaat | 64380 |
| ttcattagat | tatccttggt | gtttccaaac | gtgagttgac | taacagcaag | aggttttgcc | 64440 |
| actgcaacaa | ggagcgatat | ttttcgcagg | ttctgcgata | tcgatcttcg | cccaacgggc | 64500 |
| tagttcctgc | cgacttggat | aacggcccgc | taatatcatc | tcaccattta | ggagaataag | 64560 |
| cggtagggat | tctgtaccag | atgtttctaa | aaagcgtctg | acaagggcat | tttctgcaaa | 64620 |
| ggccatgggc | tgttgggata | aattaaagcg | atctactgta | atgtettgtt | gttttagcca | 64680 |
| ttggcaatcg | gcggcaaagg | tgacgagtgc | ttggtcaact | tcagtgccac | acacgccaga | 64740 |
| gctgcaacat | aaagcgggat | cgaatattga | aaattgagtc | ataacttttc | cccataaaat | 64800 |
| tgattttggt | ttgaaagtgg | aggcgataaa | aggtggtaac | aggcgcctta | aaaatcactt | 64860 |
| catataaaca | tatgaatttt | catatatact | atacgcttca | aaaaagggga | gtcaaacata | 64920 |
| ctgaggatat | tcgtcattaa | aatctaaaaa | atctgaaata | gatcatcttt | atacgtgtaa | 64980 |
| atttttttac | taaacttcag | gatattgttc | ttgatcacat | tttttatatt | tttcaactta | 65040 |
| gtttcacaat | tgtaaatttc | agtaaaggat | acttgtgtat | taattgatct | aaatcgcagt | 65100 |
| tacataccct | aaaagatata | tattaaattc | cataccctta | tcaggagtgt | ggaaatgaaa | 65160 |
| aaagaaattc | aagtcaactt | ggggcggcgc | cagctactca | agtcaactgc | ggcgggcacg | 65220 |
| gtattaacag | gtattggtgg | gaccttatcc | tttaccccta | tcgttgatag | tattgctgca | 65280 |
| gaattacctg | cgcctttgcg | tagaaccggc | actggagagt | ggttagcgac | gacctgccaa | 65340 |
| g~t 3 C Ct | catggtgcgc | taagcagatt | tatgtgatgg | atggccgagc | attaaaagtg | 65400 |
| aggggtaatc | caaactccgg | cgtacacggt | atgtccagtt | gccctcgcca | gcacttaagc | 65460 |
| ttacagcagg | tttacgatcc | cgatagattg | cgtacaccaa | tgatgcgaac | taatcctaaa | 65520 |
| aaaggccgcg | atcaagatcc | taaatttgtc | cctattactt | gggataaagc | gctggatatg | 65580 |
| ttagcggata | aaatcattgc | tttacgcgaa | gctaatgagc | cccataaata | tgcgctcctt | 65640 |
| cgcggtagat | attcgcatat | cactgattta | ctctataaaa | agatgaccaa | tctgattggt | 65700 |
| tctcccaata | atatttccca | tagttcagtg | tgtgctgaag | cccataaaat | gggaccgtat | 65760 |
| tatctagatg | gtaactgggg | atataaccag | tacgatatca | aaaatgctaa | atttattttg | 65820 |
PL 220 839 B1
| tcatttggcg | ccgatcccat | tgcgagtaac | cgtcaagtct | cgttttattc | gcagacatgg | 65880 |
| ggtgattccc | tcgatcaggc | tacagtcgtc | gtagtcgacc | caaggctttc | tgcttcggcg | 65940 |
| gccaaagccc | ataaatggat | cccgattgaa | cctggtcaag | acagtgtgct | ggccctagcc | 66000 |
| attgcccatg | tcgccttggt | tgaaggtgta | tggcataagc | cttttgttgg | tgattttatt | 6606Θ |
| gagggtaaaa | acctgtttaa | agcgggtaaa | accgtcagta | tcgagagctt | taaagaaacc | 66120 |
| catacctacg | gtttagtgga | gtggtggaac | caagctctta | aagactatac | gccagaatgg | 66180 |
| gcgagcaaaa | ttactggtat | agaccctaaa | accattattg | ccattgctaa | agatatgggg | 66240 |
| gcggcggcac | ctgcggtgca | agtatggact | tcccgtggcg | cagtgatgca | agcccgcgga | 66300 |
| acatatactt | cgatttcttg | ccatgcttta | aatggcttat | ttggtggtat | cgatagtaaa | 66360 |
| gggggtttat | tcccaggtaa | caaaacgcct | ctcctgaaag | aatatccaga | ggcaaaagcc | 66420 |
| tatatggatg | agattgctgc | taaaggtgtc | aaaaaagaaa | aaattgacca | acgtggtcgt | 66480 |
| ttagcattcc | ctgccattgc | taaaggtaag | cctggaggtg | gggtgatcac | gggtaacgtc | 66540 |
| cctaatggca | tgctcgctgc | tgatccttat | gaaataaaag | tgattttagc | ttattttaat | 66600 |
| aacttcaact | tttccaatcc | tgaagggaaa | cgttgggatg | aagccttaag | caaagtcgat | 66660 |
| ttcatggccc | atgtgaccac | caacgtgtcc | gaattcagtt | ggtttgctga | tgtgttatta | 66720 |
| ccttctagcc | accatatgtt | tgaaaaatgg | ggtgtgttgg | attctatcgg | taatggtgtt | 66780 |
| gcacaggttt | caattcaaca | accctcgatt | aaacgtctat | gggatacccg | tatcgatgaa | 66840 |
| tctgaaatcc | cttacatgtt | agctaaaaag | ctggcagata | aaggatttga | tgcaccatgg | 66900 |
| cgttatatca | atgaacaaat | tgtcgatcct | gaaacaggta | aacctgctgc | ggatgaagct | 66960 |
| gagtttgcga | agttgatggt | cagattcttg | actgcgccgc | tgtggaaaga | agatgcgtct | 67020 |
| aaatacggtg | ataagctcaa | ttcatgggat | gagttcgtgc | aaaaaggggt | gtggaatagc | 67080 |
| tctccttata | agcttgagtc | tcgctggggt | aagttcaaaa | cagaaacctc | taagtttgag | 67140 |
| ttttacagta | agaccttgga | aaaagcgttg | caagaacatg | ctgataaaca | caaagtcagc | 67200 |
| atagatgagg | taatgaaagc | ttgtgactac | caagctcgtg | gtcaattggt | atttatccct | 67260 |
| cattatgaag | aaccctatcg | atttggtgac | gaagccgagt | tcccgctgtt | actcgtggat | 67320 |
| caaaagtcac | gtctaaacaa | agaaggtcga | actgcaaata | gtccttggta | ctacgagttt | 67380 |
| aaagatgtcg | atcctggtga | tgtggcgaat | gaagatgtgg | ctaaattcaa | cccgatagac | 67440 |
PL 220 839 B1
| ggcaagaaat | ttggcctcaa | agacggtgat | gaaatccgca | ttacaagccc | tgtgggtacg | 67500 |
| ctgacctgta | aggcgaagct | atgggaaggt | gtccgtcctg | gcactgtggc | taagtgtttt | 6756Θ |
| ggccaagggc | attgggccta | tggacgttac | gccagtacca | aatttggcat | aaccccaaga | 67620 |
| ggtggctcaa | ataatgaett | gattgcagae | aggtacgatc | gcttaagtgg | cgcgtcggca | 67680 |
| ttctatggtc | atatccgtgt | tcgtgttgag | aaagtgtgag | gtaacccact | atgagattag | 67740 |
| gaatggtgat | tgacctacaa | aaatgtgtag | ggtgtggtgg | ctgtagctta | gcctgtaaaa | 67800 |
| cagagaacaa | cacgaacgac | ggtattcatt | ggtcgcatca | tattgccacc | actgagggga | 67860 |
| tttttcctga | tgtaaaatac | acttatatac | cgaccttatg | taatcattgt | gatgatgcac | 67920 |
| cttgtgtaaa | agtctgcccg | acaggggcta | tgcacaaaga | taagcgcggc | ttaacgctgc | 67980 |
| aaaacaatga | tgaatgtatt | ggttgcaaga | agtgtatgaa | tgcttgccca | tacggcgtga | 6804Θ |
| ttagttttaa | tgcggcaaca | ccacatcgtc | gttggcagga | tgactcagag | gtggtcgcga | 68100 |
| acggaactgt | atctccactg | atgctgctca | aacgcacggg | ggctgctgca | tcacccaatg | 6816Θ |
| aaaacccaga | gcggggtgat | acttaccctg | ttacacgacc | aagacgcact | acagagaaat | 68220 |
| gtactttctg | tgatcatagg | cttgataagg | ggttgaatcc | tgcctgtgtt | gacgcttgtc | 68280 |
| catctgaagc | gcgggtgatt | ggtgatttag | atgatccgca | gagcaaggta | tcccagttga | 6834Θ |
| ttaaattgca | taaaccgatg | cagttgaaac | ctgaagcggg | aacgggacca | agggtatttt | 68400 |
| atattcgcag | ttttggtgtt | aaaaccgctt | attaatcata | taggttaatt | tgttagttaa | 6846Θ |
| agccacagat | gagattctgt | ggctttttac | tttatacgcg | ccctgttaat | cgctaaacat | 68520 |
| cagcgaatct | aatacccctt | ggccgctgtg | aactccaccc | tcagtcacca | tggccgattt | 68580 |
| gctgcgaact | aaatatcccg | cataaccggg | gttgtcgcta | ttagagctat | cctccatcac | 68640 |
| aggctcgcca | tcaatgtgga | tggtgaacat | gcctatttca | gggatcatgt | catttatggt | 68700 |
| ttctatcttg | ccgttacgca | ccactaaggc | tggtgttgct | ctcggtctag | ggtgtaagcg | 6876Θ |
| gcgcatcagt | gaccatgctt | ggtattgcgc | gggttctagc | tcggctaatt | catgtgaaat | 68820 |
| atcggtacca | aacaggcaat | tgccaccgcc | ttcaccttga | ttttttagca | cccaagtgtc | 68880 |
| tattggggat | gcttcgacta | atttgatact | ctctggggta | acggggcgca | tctcgccgag | 6894Θ |
| gagggatttg | accattttgg | cttgttgcag | cgttaaacca | aactgagtca | aggacatttc | 69000 |
| atccatagac | gagagcagca | tctgcatccg | cttactggtt | gccagttgtt | gccctacggt | 69060 |
PL 220 839 B1
| ggcattgacg | gcaacgcgat | gtttttcaat | caatacacgg | atcgccatca | gggcttggca | 69120 |
| gtttttgtta | ccattgatgt | caacggattc | ataatctgta | tattgataac | ccgctcgcag | 69180 |
| ataaacggta | tcaatagtgc | ctatgccttc | gagtatcagt | ctatgttttt | cgcctgtggt | 69240 |
| aacttgttct | tgtagttcac | taaaggttct | gcgaattgtt | tgtatctttt | gttgttgtaa | 69300 |
| cgcgagttcg | agtaaatgtt | ggtcaaacac | attgtcttca | ttttcttgca | ctatcatcaa | 69360 |
| aaatcttgct | ggccccgcat | cttcaaattc | ctgttttatc | ttaaaggttg | ctttagctat | 69420 |
| gcctgcggat | aattgttcaa | tggcatgatt | atcaacaagt | tcacctatag | gcagttgatg | 69480 |
| ccattgctgc | aaataatggt | ggaattgatg | cactctctga | ccaaagggcc | ccataccagc | 69540 |
| cgcaatgcca | ttaaactcca | ctagttttgg | ccctaagtcc | ttatcgtcca | tgaagtcact | 69600 |
| acgcataatg | agcaatggca | ttctctgcgc | tggagtctgc | gagcaatgta | cttgctggtg | 69660 |
| tataccaagc | aaggcggcaa | aaaagggatc | gctagccgta | ataggttgaa | tcgcatcgta | 69720 |
| taagaaggca | tgttcttctg | atatagaatg | aataagttta | ccgagtaaat | gcacagaatc | 69780 |
| ttttaagtat | tgatagtgac | ctcgactgat | taaactcggc | gttaaggtaa | atggcgcgtg | 69840 |
| gcgggcagaa | tattgggttt | ctttaaacgc | catgccatgg | gttagcgccc | attctattgc | 69900 |
| atcatctttg | gcttttagac | taataggtga | attcattatg | cttctcttaa | gcgaggcgaa | 69960 |
| tttattcgca | ataccagtat | gttataggtt | tacgttttag | atgatttaat | cttggggcgt | 7Θ020 |
| aaaggcccta | tggcactcac | tttaggagca | tgcggtgagt | gccatatcga | gttagaacat | 70080 |
| tattttttgt | gttaactaaa | tacatagcta | taaagaaatc | cggcagtcat | tgccatactt | 70140 |
| aaaattaccg | ctaaaaatgc | aataatcatc | tgatttttaa | agagggattt | tagtaaaatg | 70200 |
| acttctgtta | aactcgctcc | tgcactgccg | ataattaagg | ccattacaga | acccatcgcc | 70260 |
| atcccttttt | gcactaatgc | ggcgctgaga | gggattactg | cttcggcgcg | aatataaagt | 70320 |
| ggaataccaa | ttaaagccgc | cacaggaata | gcgtaccatt | ttgcttcacc | ggcatattta | 70380 |
| acgattaaat | ctgtaggaat | aaaaccgtag | atcattgacc | ccaacagaat | gcccacaaat | 70440 |
| agataaggta | gtacttgttt | gaagtccttc | caagtagagt | gccaaactct | tatccagcgg | 70500 |
| ctctgaggct | tacttttggg | tgctatatca | gtagtcgtta | ctggtttagt | atcgcaacat | 70560 |
| gagttcgcaa | cagctgtggg | tttagtatcg | caacatgagt | tcgcaactgc | tgtcgattta | 70620 |
| gtttcgcaac | aggtactgga | aaaggaggaa | ggtttagtgt | cacaacatga | agtgacagtg | 70680 |
PL 220 839 B1
| tcttccagag | tataagcttc | tttacggaca | tacctttcaa | accccagctt | ttcaagcata | 70740 |
| tagcctgcaa | tgacagagac | tcccattgct | actacaaaat | aaaaaagtgc | tacttttaag | 7Θ80Θ |
| ccaaaggtga | caacaaatag | tccgataata | atcggattca | gtaatggact | ggcaaacagg | 70860 |
| aataccatca | tagggccaaa | accggcacga | gccctgagta | agcctttcaa | aaatggaatg | 7Θ920 |
| gtagaacaag | agcaaaacgg | ggtaattgac | ccaagtagtg | cagcaatgac | ataacctctg | 70980 |
| ccgttgcgtg | agcttagcat | cgcttgtatt | ttttgagggg | tgataaattc | ttgtaaaata | 71040 |
| cctactaggt | agcttatgac | aagaaatagt | agggtaagct | caacggcaag | gaaagcgaac | 71100 |
| atgcttgccg | tttctttcat | cataagaatc | atttcaggac | tcattttttt | acctcttcaa | 71160 |
| cttaaagttt | cgaatattct | agaataatag | tgtttgggcg | aagtgttttc | aatatattat | 71220 |
| ttctagaata | atggaaatat | ttggtatacc | tattgatgct | taaacacatg | acaccctgct | 71280 |
| tttgattgtt | tatgagtggt | cgattttgag | gtcgctaggg | taaggatatt | tctggtatta | 71340 |
| tcgaattact | taacgaaatg | aggccgatat | gaatatagag | aatgctgcta | aagtattaaa | 71400 |
| agaactgggc | catccaacgc | gtctcgccct | atttcgatta | ctggtcaagg | gcggatatgc | 71460 |
| tggcgttgcg | gtgggtcagt | tacaagacga | gttgcagatc | cctggttcaa | ctctctcaca | 71520 |
| ccatattagt | gcccttgtgt | cagcgggagt | gatttcccaa | cggcgcgagg | gaagggtgct | 71580 |
| gtactgcgta | cctgactatg | aattattaca | aggattagtg | cattttttac | aagatcaatg | 71640 |
| ttgtagtgct | cagtgaacaa | ttttgttaaa | tgaacagtaa | attattacat | gtggatattt | 71700 |
| acatatatga | taaatcgtat | atagtgacat | tctctttcat | caggactcat | tcccatgaaa | 71760 |
| aaacgtgtac | tttttctctg | tgttggtaat | tctgcgcgtt | cacaactcgc | tgaggcctta | 71820 |
| ttaagacacc | aagcccaaga | gcagtttgat | gtgtttagtg | cgggtacgca | gcctgagccc | 71880 |
| atcgatgagc | gaactcttgc | gcttttgcag | aaaaataatt | tgggtacgag | tgagttacgt | 71940 |
| tcgaagtctg | tcagtgagtt | tagtgggcaa | tcctttgact | ttgtgatcag | tctctgtgaa | 72Θ0Θ |
| aaatcaacgc | aagagtgtca | gagtttcccc | ttggcagata | agattattgc | ttgggattat | 72060 |
| cccgatccca | aaatcgaatc | gggcactcgt | gggtttgaac | aaacttttag | agaactcaac | 72120 |
| gaaagaataa | aaatgtttgt | actcgttcag | tctaaggatc | ttaatgatta | atcctacgca | 72180 |
| attttttaaa | tgtttagccg | atgaaactcg | cttgcgctgt | ttgatgttga | ttcagcacga | 72240 |
| gggtgagctt | tgcgtctgtg | aattgaccga | agccttgcag | gaaattcagc | ccaagatctc | 72300 |
PL 220 839 B1
| gcggcattta | gcccaattac | gtaagtgcgg | attattagtc | gatcgccggc | aggggcaatg | 72360 |
| gattttctat | agtatcagta | atgatttacc | cgaatgggga | aagtcagtgt | tgagtgaggt | 72420 |
| taccagccaa | aatccggtat | tccttgaaga | aaacatgcgt | aatctgtgca | agatgggtgg | 72480 |
| ccgccccgag | cgcgctagag | cctgttgcta | aagattgttt | gtaacaaata | aataaaaaat | 72540 |
| ttaatctaaa | atatatgaaa | attcatatat | taaatcgcta | gaggttgata | tggcaccagc | 72600 |
| tataaaagtg | ctctttctat | gtacccataa | tgcctgtcgc | agcatcctag | ctgaagctat | 72660 |
| aggtcgagat | ctcgtcggta | agcaagcttt | gactactatt | gctcaatggc | aatttgcgag | 72720 |
| tgccggtagt | gaacctgccg | gggtcgttca | tcctcaaact | ctattgcaac | tagcacacag | 72780 |
| aggctatgtt | accgaagggc | tctgcagcaa | aagctgggat | atgatggcgg | atttcactcc | 72840 |
| tgacttagtg | atcactgttt | gtgataatgc | tgcgggagaa | acctgtcctt | tgtggttagg | 72900 |
| tcaaacactt | aaattacatt | ggggtttacc | cgacccaaca | tcaatcgacg | cccccgatat | 72960 |
| agatgagcaa | tttagctatg | ttatagaaac | acttgaaaat | cgtataaagg | cattaatctc | 73Θ20 |
| gttgccgctt | tcggcaggta | tagaagctca | aaaagcatca | ttacaatcaa | ttgcgagtca | 73080 |
| atttccactt | attcaaagat | aaatggtttg | tatttaattg | gtgtttattc | aactaattaa | 73140 |
| aatagcaata | tccttttgct | tcatcgcttt | catgtatacc | aaggaagttt | gattatgctg | 732ΘΘ |
| caactatttt | ccgatttagc | gagctggcta | acctttggag | taatgggttt | agatcccaat | 73260 |
| actaagctcg | ccgacgccat | ccattttttt | attgaagata | ccactaagat | ttttgcgctc | 73320 |
| ctgttgctga | tgatttatgg | catcgctttg | gtgcgggcct | cgctcaatgt | cgagcgcgtt | 73380 |
| cgggattact | tggcgggtaa | aaatcgtttt | gtcggttact | ttatgggatc | gggttttggc | 73440 |
| gcggttactc | cattctgctc | atgttcgagc | attccggttt | tttaggtttc | acctctgctg | 735ΘΘ |
| ggatccccgt | tgggatcact | atggcgtttc | tgattacttc | gccgttaatt | aatgaagtcg | 73560 |
| ccgttctgtt | gcttgtgagt | ctgttgggct | ggaagtttac | tgtgatatac | gtgctggtcg | 73620 |
| gcatgtcagt | gggtatgttg | gcgggggcat | ttttggacac | gatccgcgct | gagcgttggc | 73680 |
| tgcagtcctt | tgccgccaaa | gcactcgagc | aaggaaaggc | acaagcaagt | cacgataata | 73740 |
| gcgagggtat | gacatcaaca | tccatgacgt | taacggaacg | gcatgaattt | gcgaaaggcg | 73800 |
| agaccctaga | gatttttggc | cgagtgtgga | aatgggtcat | tattggggtt | gggcttggcg | 73860 |
| ccgcactcca | tggatttgta | cctgacggtt | ggatcgaagc | ccacttaggc | gatggtcaat | 73920 |
PL 220 839 B1
| ggtggtctgt | tcctgcggcg | gtattgattg gtattcctct | gtattccaat | gccacagggg | 73980 | |
| ttatccctat | catggagagc | cttatcacta | atggcttgcc | cgtagggaca | acattggcat | 74Θ4Θ |
| tttgtatggc | aacggttgcc | gccagttttc | ctgagttcat | tttgctcaag | caggtgatgc | 741Θ0 |
| aatggcgttt | actggccatc | gtttttgcca | ttttattgat | ttcattcacc | ttaataggtt | 74160 |
| ggatctttaa | cgctataggt | cccgttctgt | gagaattata | aaaatgctaa | acatcaaagt | 74220 |
| attaggcagt | ggatgtgcca | aatgcacaaa | aaccgctgag | attattaccg | ccatcgccaa | 74280 |
| cgaaaagggc | atcagtattg | cgctggtaaa | ggaaaccaat | ccagaagtca | tcatgggcta | 74340 |
| taaggtgatg | agtacacccg | ctgtggtgat | tgatgagaag | ctagtgcatt | ggggctccat | 74400 |
| tccccataga | gccatgattg | aatcttggtt | agtggggtaa | cacttaaatg | tcacatccat | 74460 |
| ttgatatttt | gccgctagag | agtggtgcta | ggttgatttt | taccccttgc | ccagggacta | 74520 |
| aatctgtccc | tgtgacagag | gcggtggcaa | ttcttaaagc | ggcgggaact | gaggtcatca | 74580 |
| taaccttaat | gccacttgcc | gaattgcaaa | catttggtgc | tgcattattg | cccgatattt | 74640 |
| gccatgaagc | ggggatccgt | tggttgcatt | tacctataga | agatgatgcg | gcacccgcag | 74700 |
| aggtattcga | gctcgcgttt | gcacgacaca | aagcagaact | gctggcattg | atgcaaactc | 74760 |
| aatccacaat | tgccattcat | tgtcgcggtg | gttccggtcg | cacaggatta | atggcggcaa | 74820 |
| tcttgctgtt | actggcggga | ggcaccttgg | cagaagtgat | tacccaagtg | caatccattc | 74880 |
| gccctaatgc | cttaaccaat | gtgcatcaac | gtggctatat | cgaacagata | acgctttaat | 74940 |
| cttaaacaaa | taatataaaa | cacctaatat | aaaactgagt | gtgaaggatg | caggtatgac | 75000 |
| aatcaaaatc | gggataaatg | gctttggccg | tatgggacgt | ttagcactgc | gcgctgcttg | 75060 |
| gggctgggaa | gaggttgagt | ttgtgcagat | taatgatccc | gccggagatg | cggcgacctt | 75120 |
| agcccatttg | ctgacattcg | attctgtgca | tggccgctgg | caacatgagg | cgagcagcga | 75180 |
| tggcgatgac | atcattatcg | atggcaagcg | tattcgctgt | actcgcaata | aaaccatcgg | 75240 |
| ggaaaccgat | tggtccggtt | gtgatgtggt | gattgaagct | tcgggtaaaa | tgaaaaccaa | 75300 |
| agcagtgctg | caagcttatt | tagatcaagg | cgttaaacgc | gtggt c a | cagcgccagt | 75360 |
| taaagaagag | ggcgtgttaa | acgttgtcat | gggagtgaat | catcaactct | atgacaaagc | 75420 |
| tattcatccg | attgtgactg | cggcctcctg | tactactaac | tgtttggcgc | cgatcgtcaa | 75480 |
| agtgatccac | gaaaacctcg | gcatagtgca | tggttccatg | acgactattc | acgatattac | 75540 |
PL 220 839 B1
| caacactcaa | actattttag | atgcaccgca | taaagatctt | cgccgtgcgc | gggcctgtgg | 75600 |
| tttaagcctt | atccctacga | caacaggctc | agcgacggcc | attacccata | ttttccctga | 75660 |
| actcaaaggt | aagcttaacg | gccatgcggt | gcgggtgcca | ttagcgaacg | cttcattaac | 75720 |
| cgattgcgtg | ttcgaggtga | gtcgcaaaac | gaccgaagct | gaagtcaatc | gcctgttaaa | 7578Θ |
| agaagcggca | gacggaccgc | taaaaggcat | tttaggttat | gaggaacgcc | cattagtctc | 75840 |
| ggtcgattat | aaaaccgatc | cgcgttcgag | cattatcgat | gcgctatcga | ccatgattat | 75900 |
| caatggcact | caggtcaaac | tctacgcttg | gtatgacaac | gagtggggtt | atgccaatcg | 75960 |
| caccgtcgaa | ctggcccgca | tggtcggtct | gatggataag | gcataagctt | tatgggtaag | 76020 |
| ctgacagggt | tcttgtctaa | catatcaccc | gagatccgcc | agtatttggt | ggtcacaggc | 76080 |
| aactattggg | cattcacgct | caccgatggc | gcattacgta | tgttagtggt | gctccatttt | 76140 |
| catggcttag | gttatagccc | gctgcaaatt | gccatgctat | tcctcttcta | tgaaatcttt | 76200 |
| ggggtggtaa | cgaacttagt | cggcggctgg | ctcggggcgc | gtttaggctt | aaataagacc | 76260 |
| atgaatgtag | gcctatttat | gcagattgtc | gcccttagca | tgctgcttgt | gcctagcggt | 76320 |
| atgctcacgg | ttgcttgggt | gatggcggcg | caggccttgt | cgggtatcgc | taaagatctc | 76380 |
| aataagatga | gcgctaaaag | cagtatcaag | ttgttggtgc | ccaatgatgc | tcagggtgag | 76440 |
| ctgtataagt | gggttgccat | gctcactggc | tccaaaaatg | cgctaaaggg | cgcggggttc | 76560 |
| ttcttgggcg | gcgccttact | gaccctgttt | ggattccagc | tggccgtgtt | aggtatggcg | 76560 |
| attggcctat | tactggtgtg | gatttttagt | ctgttaagtt | tgcaacgcga | tttaggtaaa | 76520 |
| gccaaaaaca | aacctaagtt | cacggaaatt | ttctctaaga | gtccggcggt | aaatacgctt | 76680 |
| tctgccgcac | gcatgttttt | gtttggtgcg | cgggatgtgt | ggtttgtggt | ggctttaccc | 76740 |
| gtttatttgg | cctcagcctt | tggttgggat | cattggtatg | tcggcggttt | tctcgcactc | 76800 |
| tgggtaatag | gttatggcat | agtgcaaggc | tttgcacctc | gcttgacggg | gacaaagtcg | 76860 |
| gcgagccaaa | acaaggttcc | cgatggacgt | agcgccttag | gttgggcggc | gatattgagc | 76920 |
| atagtgccgg | caggcattgc | gctggcgata | agttatgact | tccatgccgc | gaatatactg | 76980 |
| atttggggat | tgatgctgtt | tggcgcctta | ttcgcgatca | actcttcatt | acacagctat | 77040 |
| cttatcgtca | gttatgcgga | tgaagatggc | gtatcgttag | atgtgggttt | ttactacatg | 77100 |
| gctaatgcta | tgggacgctt | gatcgggact | gtgttgtctg | gctgggtgta | tcaagtgtat | 77160 |
PL 220 839 B1
| ggcatggcgg | cttgtctgtg | gatatcggcg | gcatttattg | cgctcgcagc | gcttatctca | 77220 |
| attaagcttc | caagacatag | agcgatataa | agacattaaa | cgcgaaaaaa | tgtcacaaac | 77280 |
| aatatgcgaa | ttaacatata | tgtcatattt | catatgtatt | ctagcggtgt | tacataaaga | 77340 |
| cagttaaatg | acacctatgt | ctccaaatga | ggatatcaat | atgaaaaaaa | cagcgttaat | 77400 |
| gtcactgctt | ggtttaggat | tatttgcttg | tgttgctcac | gctagcgagt | tcgatttacc | 77460 |
| gggttttgtc | actgaagtag | aagatggtcg | tctatgggtg | tttaaagaga | attcggctga | 77520 |
| gttaactgag | tttaaacagc | atggtgagcc | agcaaagcaa | tttactgtca | ttggtgttgg | 77580 |
| tcctaagggg | atgacggtta | aagcggccga | tcaaataacc | ttagatgaat | atttagctaa | 77640 |
| ggtaaaagcg | aactaatgta | cttagtgaag | cgttactcga | atttctaaat | cccattttct | 77700 |
| gatgttttac | gagttggaac | tttggttcta | actcgtaata | tctaaaaatt | aggtgaatta | 77760 |
| ctctagccca | gattgactga | gtcagactta | cctattcggg | ttcacgtgcc | aaacccctgc | 77820 |
| tattttgtgc | agccttctta | ctaaccaatt | tttgccccat | tgtgagctat | gaccgattaa | 77880 |
| tcactcagtg | cacagaggat | aattgactta | catttagtca | ttccaaaaat | atggaagtaa | 77940 |
| agtcaaatta | cgcctctatc | taagtgacca | aatttagcgt | accagtacaa | gtcaataatc | 78000 |
| tgtgggtatt | gaccagattt | atgcaactaa | agtggatttg | tctgcaatta | tttaccgttt | 78060 |
| tccatcattc | attgccattt | caagcgaaat | atcactcgcc | accgaaccct | gattttttgt | 78120 |
| ggataacacc | ccaaagagcg | cggtgattat | ccaccgaaaa | aatcacgaac | cggcagcagg | 78180 |
| accgaaattt | tagaattttt | taaatttcct | gctattatta | ctgattattt | atacagtagt | 78240 |
| ttggtgctat | gaaactcata | acatgccatg | cgagtgcagg | aatttcgggt | tttccaagtc | 78300 |
| ctgcagcgga | ttacgttgaa | ttacccctta | gtcttgatca | actgcttgtt | gagcatccta | 78360 |
| gctcgacctg | gtttggtcgt | gctgcgggtt | gctcaatgga | aggggttggg | atctatgatg | 78420 |
| gcgatatact | ggtgattgac | cgtgccgcta | agcgccgtaa | tctctctatt | gttgttgcca | 78480 |
| gctataacgg | agaatttacc | gtaaagctcc | tcgatgaaaa | gcgccggtta | ctggtttcta | 78540 |
| tcgatcaaca | gcaaaacatg | acgtccgttg | caatcgatga | tgcagatacc | ttctcggttg | 78600 |
| aaggggtgat | catcaagtca | atccgacttc | acgagcattc | aagcttactt | gaacaatatc | 78660 |
| tgagtcaatc | atgtacggac | tgattgatgc | taattcattt | tatgtgtcat | gcgaattggt | 78720 |
| gtttagaccc | gacttgcgcg | aacttcccgc | gattgtactc | agcaacaacg | acggttgttg | 78780 |
PL 220 839 B1
| tgtggcagtc | aatcgagcgg | ccaagtccgt | tggcgtgaaa | aaatttgtcc | cttactttga | 78840 |
| gctgcaacat | ttgtgcagac | aacataatgt | gcaggtgttt | tcatctaatt | atgaattgta | 78900 |
| cgcagatctg | tctgcaaaaa | tgatgcaagt | gatcgggcgt | ttcgcacccg | agcaatacgt | 78960 |
| gtactccatc | gatgagtctt | ttgtgtcgtt | taaaggctgt | gctgcaattg | cagacttaac | 79020 |
| ggcacattgt | gctcagctgc | gccgaacagt | ttggcgtgaa | tgccgtttgc | cggtgtgtgt | 79080 |
| gggggttggt | gagacattaa | ccttggcgaa | gttggctaat | catgccgcga | aacaattggc | 79140 |
| tcaatataaa | ggtgtttgcg | ttattgataa | tgatgcgcag | cgtattgaga | ttttaaaatc | 79200 |
| gatgccagtt | gatgaagttt | gggggattgg | ccgcaaacta | acggtcaaac | tgggattact | 79260 |
| gggtgtgcat | actgcctatg | atttggcaca | actggcgccg | aaagtggcgc | gacaacattt | 79320 |
| ttccatcgat | gtagagcgaa | ctgtgcgaga | actcaatggg | cagatctgta | aaacgtggga | 79380 |
| tgtcaccaaa | gcagataagc | agcaaatatt | ttccacccgc | agcctaggcg | aacgaatatg | 79440 |
| tacccgggaa | catttacacc | aagcgttagc | aaagcatgcc | gcaattgccg | gtgcgaaggt | 79500 |
| tcgagaacaa | ggctcattgt | gtaaagcaat | ggtcgtgttt | gccgccaact | cgccacatga | 79560 |
| tccacagcct | gtgtatttta | aaaggcttgt | tcagtttact | tgtgccactg | atgacagtcg | 79620 |
| tgaactgtgc | gccgcggtta | gcagcgagct | atcaaacctt | tatcgcccag | gtgtgcgcta | 79680 |
| ttaccgaatt | ggtgtaggcc | tgattgatct | ttgccctaaa | acgtcagtgc | aatatgactt | 79740 |
| atttaatgcg | ccaaagagcg | atcctaactt | aatgaaaatc | tttgatagtc | tgaataatcg | 79800 |
| ctatggccgt | gatgtgttgt | atattgctgc | acaggggagt | gatcagcatt | ggactatgcg | 79860 |
| ccgtcagttt | ttatcgccgc | agtacaccac | ccgttggtcc | gatattccga | tgattaaagc | 79920 |
| gtaataggat | tttatggtgc | tttatccagg | ccttactcca | cgtatacaac | ctaaaacgtc | 79980 |
| tgtcataggt | tacaattttt | tgagaataag | aggaaaaatc | aaatgtctag | gaacttagaa | 80040 |
| gttaaaaagc | aacaagcgct | aatggttaaa | gagcaagttg | acattatttt | aaagcgttat | 80100 |
| gaactgagtg | atgctgacaa | ggacaaaata | gcaaaggacg | ttgctgatgt | tatcttgact | 80160 |
| gcttgggatc | tacaactcag | tgatttgagc | tttggtaata | cttggtgtaa | acctgagatt | 80220 |
| aacactaaac | agtgttaaat | atttctctag | gtcggcgttg | cgtccatcgt | tctaatatca | 80280 |
| cggaaatgat | ggacacagaa | cgtcgatcta | catctagagc | tacatctata | taaggtataa | 80340 |
| acaatgagaa | caaaagaaga | ttttttcttt | ggtaagacgc | atcaaggaag | caaaggtata | 80400 |
PL 220 839 B1
| acactccaat | tgagcgatat | cgagtctctt | gcggaaaaag | tgtcagataa | tttttttact | 80460 |
| gcacaactga | atagaatgct | gcaggagcat | gggggaaggc | tgactatatc | agatgaaacc | 8Θ520 |
| tcgcttccca | atttctggag | cctcatcgat | aaaattgcca | ttgagcaagt | agggttcgtg | 80580 |
| gaaatttatg | ctcgctatga | cgtcaatgat | agtgttaacg | cgacgctggc | ctgtgacatt | 80640 |
| gtgctgttaa | atggtgtgct | ctcgattaag | tcgcattggt | gcgcgtataa | agaaattaga | 80700 |
| gcgggtgaga | ttgtttcttc | gttattggtg | cccttgcacc | tgaaagctct | tcagaacaaa | 80760 |
| acctatattc | gctgggatga | tggcacaaca | gagtcactgt | tggagatgct | tgattaccag | 8Θ820 |
| acagagctag | aaaaggtgtt | tctgcttgct | aaatatccct | ctgctattaa | tcgtggtgtt | 80880 |
| tcatacatca | ttgatttgga | gtgtgcgaca | gataccggtc | ggcgtggtat | ttcgtcagaa | 80940 |
| ctggtatggg | atgtatatca | agagcttcga | acagaacgat | gtgtcggaaa | gtagcacatt | 81Θ0Θ |
| ggatactaaa | gactgcaaaa | aactaacgga | tctaatgcgc | tctggccgta | aatttggggc | 81060 |
| gacaacttat | actgttaaag | ttatgagtat | tggggctgtt | gatgctgtga | gcgatagtga | 81120 |
| aaaagtagtc | gttatagctc | gtaacgataa | gactggaatg | cttgttatga | acgaacaggt | 81180 |
| tgatgccaaa | aatgttagag | acaatggtat | tcctttgccg | agtattcatg | acataaattc | 81240 |
| agagtttgag | taattagtgc | ggaaaatcac | gaatgttcaa | tttcttaaga | agaaaaccga | 81300 |
| agatatcaat | tcccactata | gatagggttt | cagaagagat | tcaaggttat | cttcctgact | 81360 |
| accaaggccc | gactataaat | tatcgttttt | tctccaattc | aaaatatatc | ggttcagtga | 8142Θ |
| aaactgagtt | gtggaaagag | gataatctct | tattggttca | tgatattagg | gcttccacta | 81480 |
| caggggtaaa | aaatggcact | gctatggtca | gttggttggt | ggctaactct | tctgaaatga | 81540 |
| tacaacccgt | tcatgttatc | tgtggtgggt | tgggtttctg | gtataaattg | a | 81591 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (16)
1. Wyizolowany plazmid obejmujący fragment sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1.
2. Wyizolowany plazmid pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1.
3. Szczep bakteryjny Shewanella sp. zawierający plazmid określony w zastrz. 1 albo 2 albo zawierający sekwenecję nukleotydową obejmującą nukleotydy od 63978 do 72599 z SEKW. ID. NR 1.
4. Szczep bakteryjny według zastrz. 3, znamienny tym, że jest szczepem Shewanella sp. O23S zdeponowanym w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS w Warszawie pod nr depozytu KKP 2045p.
5. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje wyizolowany plazmid określony w zastrz. 1-2 albo szczep bakteryjny określony w zastrz. 3-4 lub ich kombinację.
PL 220 839 B1
6. Zastosowanie szczepu bakteryjnego określonego w zastrz. 3-4 i/lub kompozycji określonej w zastrz. 5 do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub z gleby.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że surowcami mineralnymi są polimetaliczne złoża miedzionośne.
8. Sposób selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleby, znamienny tym, że etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego jak określonego w zastrz. 3-4 i/lub kompozycji określonej w zastrz. 5.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych.
10. Sposób według zastrz. 8-9, znamienny tym, że surowcami mineralnymi są złoża miedzionośne.
11. Sposób selektywnego usuwania arsenu z różnorodnych surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleb według zastrz. 8, znamienny tym, że usuwanie arsenu prowadzone jest przez dysymilacyjną redukcję arsenianów z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego zawierającego plazmid pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1 korzystnie szczepu Shewanella sp. O23S zdeponowanego jako KKP2045p, który to sposób obejmuje następujące etapy:
a) przygotowania surowców mineralnych, odpadów lub gleb i zmieszania z odpowiednią pożywką hodowlaną umożliwiającą hodowlę tego szczepu,
b) dodania innokulum tego szczepu i prowadzenia hodowli w warunkach umożliwiających jego wzrost i prowadzenie dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że po etapie b) prowadzi się etap
c) selektywnego usuwania uwolnionego arsenu z roztworów uzyskanych w etapie b).
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że usuwanie uwolnionego arsenu prowadzi się przez flotację, korzystnie przez selektywne wytrącanie arseninów siarczkami.
14. Sposób według zastrz. 11-13, znamienny tym, że etap a) przeprowadza się przez: (i) rozdrabnianie i frakcjonowanie surowców mineralnych, odpadów lub gleb, korzystnie do frakcji 125-250 pm.
15. Sposób według zastrz. 11-14, znamienny tym, że pożywką hodowlaną jest pożywka R1-R2 uzupełniona mleczanem sodu, ekstraktem drożdżowym oraz solami Tuoviniena.
316. Sposób według zastrz. 11-15, znamienny tym, że pożywka hodowlana nie zawiera NO3- i Fe3+.
17. Sposób według zastrz. 11-16, znamienny tym, że w etapie b) hodowla prowadzona jest w warunkach atmosfery beztlenowej i prowadzona jest z przepłukiwaniem pożywki mieszaniną gazów N2:CO2, korzystnie w stosunku 4:1.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL404376A PL220839B1 (pl) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb |
| HUE13817732A HUE028023T2 (en) | 2013-06-19 | 2013-10-30 | Removal of arsenic by the use of dissimilation arsenic reductase |
| PCT/IB2013/059773 WO2014203046A1 (en) | 2013-06-19 | 2013-10-30 | The removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase |
| EP13817732.4A EP2882851B1 (en) | 2013-06-19 | 2013-10-30 | The removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase |
| US14/678,143 US9328397B2 (en) | 2013-06-19 | 2015-04-03 | Removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL404376A PL220839B1 (pl) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL404376A1 PL404376A1 (pl) | 2014-12-22 |
| PL220839B1 true PL220839B1 (pl) | 2016-01-29 |
Family
ID=49917678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL404376A PL220839B1 (pl) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9328397B2 (pl) |
| EP (1) | EP2882851B1 (pl) |
| HU (1) | HUE028023T2 (pl) |
| PL (1) | PL220839B1 (pl) |
| WO (1) | WO2014203046A1 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114686404B (zh) * | 2022-04-29 | 2023-07-18 | 暨南大学 | 一株具有铁还原能力和产电能力的菌株及其应用 |
| CN114703104B (zh) * | 2022-04-29 | 2023-07-18 | 暨南大学 | 一株具有铁还原能力和电化学活性的菌株及其应用 |
| CN115125166B (zh) * | 2022-06-08 | 2023-06-20 | 北京林业大学 | 一种利用导电载体形成希瓦氏菌电活性生物膜强化厨余垃圾厌氧处理的方法 |
| CN117070424B (zh) * | 2023-10-10 | 2023-12-22 | 华南理工大学 | 一株化能自养型盐硫杆菌菌株及其应用 |
-
2013
- 2013-06-19 PL PL404376A patent/PL220839B1/pl unknown
- 2013-10-30 WO PCT/IB2013/059773 patent/WO2014203046A1/en not_active Ceased
- 2013-10-30 HU HUE13817732A patent/HUE028023T2/en unknown
- 2013-10-30 EP EP13817732.4A patent/EP2882851B1/en not_active Not-in-force
-
2015
- 2015-04-03 US US14/678,143 patent/US9328397B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL404376A1 (pl) | 2014-12-22 |
| US20150267276A1 (en) | 2015-09-24 |
| WO2014203046A4 (en) | 2015-02-19 |
| WO2014203046A1 (en) | 2014-12-24 |
| EP2882851A1 (en) | 2015-06-17 |
| US9328397B2 (en) | 2016-05-03 |
| HUE028023T2 (en) | 2016-11-28 |
| EP2882851B1 (en) | 2016-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bartsevich et al. | Molecular identification of an ABC transporter complex for manganese: analysis of a cyanobacterial mutant strain impaired in the photosynthetic oxygen evolution process. | |
| Young et al. | A bifunctional urease enhances survival of pathogenic Yersinia enterocolitica and Morganella morganii at low pH | |
| Corstjens et al. | Identification and molecular analysis of the Leptothrix discophora SS‐1 mofA gene, a gene putatively encoding a manganese‐oxidizing protein with copper domains | |
| US11279916B2 (en) | Enzyme and application thereof | |
| Chandrasekaran et al. | Exploring the in vitro thrombolytic activity of nattokinase from a new strain Pseudomonas aeruginosa CMSS | |
| JPH03501086A (ja) | パラチオンヒドロラーゼ類縁体並びにその製造方法及び精製方法 | |
| PL220839B1 (pl) | Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb | |
| Binh et al. | Establishment of a new and efficient Agrobacterium-mediated transformation system in the nematicidal fungus Purpureocillium lilacinum | |
| CN101935621A (zh) | 一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌及其应用 | |
| Carson et al. | Siderophore production and iron transport in Rhizobium legummosarum bv. viciae MNF710 | |
| Calugay et al. | Siderophore production of a periplasmic transport binding protein kinase gene defective mutant of Magnetospirillum magneticum AMB-1 | |
| CN113563437A (zh) | 一种药物靶标蛋白pma1及其在农业上的用途 | |
| Zhao et al. | Expression, purification and characterization of pectate lyase A from Aspergillus nidulans in Escherichia coli | |
| Santhanam et al. | A reassessment of flocculosin-mediated biocontrol activity of Pseudozyma flocculosa through CRISPR/Cas9 gene editing | |
| JP2603349B2 (ja) | 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 | |
| Suzuki et al. | Cytoplasmic ATPase involved in ferrous ion uptake from magnetotactic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 | |
| WO2024024427A1 (ja) | シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラム | |
| Durbin et al. | The role of intercellular fluid and bacterial isolate on the in vivo production of tabtoxin and tabtoxinine-β-lactarn | |
| CN114605510A (zh) | 具有亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐结合能力的蛋白a10、含所述蛋白基因的工程菌株及应用 | |
| CN108018305B (zh) | 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法 | |
| Tsaplina et al. | Phenotypic properties of Sulfobacillus thermotolerans: Comparative aspects | |
| CN119592488B (zh) | 一种降解除草剂2,4-d的工程菌及其构建方法和应用 | |
| JP5145506B2 (ja) | バシラス属細菌、及びその用途 | |
| CN102618515A (zh) | 一种重金属镉抗性相关蛋白FKCadA1及其编码基因和应用 | |
| Sugio et al. | Existence of a tungsten-binding protein in Acidithiobacillus ferrooxidans AP19-3 |