CN1587266A - 一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鬼臼毒素的提取纯化工艺。本发明采用溶剂结晶法和减压层析法提取纯化鬼臼毒素，操作简单，易于工业化生产，可以方便地得到纯度不低于97％的鬼臼毒素。可以从桃儿七直接提取，或者由桃儿七提取物进一步精制而成。

Description

一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺
                          技术领域
本发明涉及一种中间体的制备方法，更具体的说是涉及到一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺。
                          背景技术
桃儿七(Podophyllum emodi Wall.var.chinense Sprague)又称桃耳七、鬼臼、小叶莲，为小檗科植物，生长于山中林下阴湿的地方，分布四川、陕西、甘肃、青海、云南、西藏等地，地下部分或果实入药，其性温味苦，有和血、止血、除风湿、解毒、消肿之功效。
从桃儿七根茎中可提取出鬼臼毒素(podophyllotoxin)。长期以来，对鬼臼毒素的研究主要集中在其癌症治疗的药理药效方面上，其抗癌机理在于鬼臼毒素能抑制细胞有丝分裂于中期。国内外对鬼臼毒素结构及其衍生物作了许多研究工作，以它为前体合成了一系列衍生物，如抗癌药物VP16、VM26等对何克金氏、非何克金氏、白血病、脑瘤、肺癌均有相当的疗效。近年来高纯度鬼臼毒素(纯度＞90％)用于治疗尖锐湿疣取得显著效果。人们还发现鬼臼毒素及其衍生物对HIV病毒、疱疹病毒有一定抑制作用。
桃儿七中鬼臼毒素的分离纯化方法传统上大致可分成化学提取分离法和柱层析分离法两类。传统的化学提取法具有操作简单、产量大的优点，但提取纯化过程中都需要用到有毒溶剂—苯，且所得产品纯度低；传统柱层析法虽然能得到高纯度的产品，但操作繁琐，且产量较低，需消耗大量洗脱剂。
                          发明内容
本发明的目的是提供一种用无毒溶剂结晶法提取鬼臼毒素粗品，用减压柱层析法快速纯化得到鬼臼毒素精品的方法，为鬼臼毒素的进一步开发利用，特别是在抗癌药物开发方面的利用提供基础。
技术方案如下：
将桃儿七根茎粉碎后，加入90％乙醇溶液，在70℃回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得棕红色浆状物；在棕红色浆状物，加入石油醚，搅拌使其充分萃取，静置分层，弃去下层棕红色液体，将上层淡黄色液体静置结晶，离心过滤，得白色至淡黄色针状晶体，此即为鬼臼毒素粗品，继而用柱层析分离与纯化，得到鬼臼毒素精品；
在柱层析分离与纯化时，先用氯仿溶解鬼臼毒素粗品，再流过装有硅胶的减压层析柱；用醇类或酮类与氯仿的混合液进行洗脱，收集部分洗脱液，减压浓缩至干，得白色提取物，即鬼臼毒素精品。
所用减压层析柱内径为3～15cm，层析柱层径高比为1∶3～10，负压为0.01～0.2Mpa。
洗脱液所用的醇类为甲醇、乙醇；酮类为丙酮，其与氯仿的体积比为1～4∶10。
收集部分洗脱液为在292nm波长下有吸收的部分。
减压层析柱所用填料为柱层析用硅胶，粒度为200～300目。
所述的硅胶重复利用4次后要进行再生；再生的过程为依次用正己烷浸泡，晾干，再用甲醇浸泡，晾干，最后烘干。
本发明有益效果如下：
1.使用的溶剂价格低廉，工业应用广泛，并且无毒，更符合环保要求；
2.由于使用减压层析柱系统，操作更加方便，上样量大，速度更快，所需时间是传统层析柱系统所需时间的1/10，溶剂消耗更少，溶剂消耗是传统层析柱系统溶剂消耗的1/20。
                        具体实施方式
本发明内容通过以下的实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1
称取1kg桃儿七根茎，粉碎后，加入7kg 90％乙醇溶液，热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得棕红色浆状物约316g。
称取100g棕红色浆状物，加入500g石油醚，剧烈震荡，萃取，静置分层，弃去下层棕红色液体，将上层淡黄色液体置入一1000mL烧杯中，于室温静置12h后约有2.9g白色至淡黄色结晶析出。经HPLC测定，其鬼臼毒素纯度为78.6％。
取一定量柱层析用硅胶(粒度为200～300目)，装入内径为5cm的玻璃柱中，硅胶柱高为15cm(层析柱层径高比为1∶5)，使其床体积为300mL，玻璃柱下端接一个三通，三通一端接真空泵，另一端接一个接受瓶。将鬼臼毒素粗品氯仿溶液10mL缓慢加入硅胶柱，鬼臼毒素粗品氯仿溶液浓度为0.1g/mL，待溶剂渗透过柱床后，开始减压抽干柱床，负压真空度为0.2MPa，得到第一流分，继续用极性逐步增强的溶剂(甲醇与氯仿的混合溶剂，体积比为10∶90)洗脱，洗脱速度为35mL/min，每份40mL，共得到20份洗脱液，收集第4～14份洗脱液，减压浓缩至干，即得白色粉状提取物约720mg，经HPLC测定，其鬼臼毒素纯度为98.75％。
实施例2
称取1kg桃儿七根茎，粉碎后，加入10kg 95％乙醇溶液，热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得棕红色浆状物约396g。
称取100g棕红色浆状物，加入800g石油醚，剧烈震荡，萃取，静置分层，弃去下层棕红色液体，将上层淡黄色液体置入一1000mL烧杯中，于室温静置16h后约有2.1g白色至淡黄色结晶析出。经HPLC测定，其鬼臼毒素纯度为75.3％。
取一定量柱层析用硅胶(粒度为200～300目)，装入内径为3cm的玻璃柱中，硅胶柱高为15cm，层析柱层径高比为(1∶5)，使其床体积为100mL，玻璃柱下端接一个三通，三通一端接真空泵，另一端接一个接受瓶。将鬼臼毒素粗品氯仿溶液10mL缓慢加入硅胶柱，鬼臼毒素粗品氯仿溶液浓度为0.1g/mL，待溶剂渗透过柱床后，开始减压抽干柱床，负压真空度为0.1MPa，得到第一流分，继续用极性逐步增强的溶剂(丙酮与氯仿的混合溶剂，体积比为20∶80)洗脱，洗脱液流速为22mL/min，每份40mL，共得到20份洗脱液，收集第8～16份洗脱液，减压浓缩至干，即得白色粉状提取物约570mg，经HPLC测定，其鬼臼毒素纯度为97.9％。
实施例3
称取1kg桃儿七根茎，粉碎后，加入4kg 50％乙醇溶液，热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得棕红色浆状物约286g。
称取100g棕红色浆状物，加入400g石油醚，剧烈震荡，萃取，静置分层，弃去下层棕红色液体，将上层淡黄色液体置入一1000mL烧杯中，于室温静置6h后约有3.4g白色至淡黄色结晶析出。经HPLC测定，其鬼臼毒素纯度为71.6％。
取一定量柱层析用硅胶(粒度为200～300目)，装入内径为10cm的玻璃柱中，硅胶柱高为70cm(层析柱层径高比为1∶7)，使其床体积为5500mL，玻璃柱下端接一个三通，三通一端接真空泵，另一端接一个接受瓶。将鬼臼毒素粗品氯仿溶液10mL缓慢加入硅胶柱，鬼臼毒素粗品氯仿溶液浓度为0.1g/mL，待溶剂渗透过柱床后，开始减压抽干柱床，负压真空度为0.01MPa，得到第一流分，继续用极性逐步增强的溶剂(乙醇与氯仿的混合溶剂，体积比为10∶100)洗脱，洗脱液流速为9mL/min，每份40mL，共得到20份洗脱液，收集第7～15份洗脱液，减压浓缩至干，即得白色粉状提取物约613mg，经HPLC测定，其鬼臼毒素纯度为97.1％。

Claims (6)

1.一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺，将桃儿七根茎粉碎后，加入90％乙醇溶液，在70℃回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得棕红色浆状物；在棕红色浆状物，加入石油醚，搅拌使其充分萃取，静置分层，弃去下层棕红色液体，将上层淡黄色液体静置结晶，离心过滤，得白色至淡黄色针状晶体，此即为鬼臼毒素粗品，继而用柱层析分离与纯化，得到鬼臼毒素精品，其特征在于，在柱层析分离与纯化时，先用氯仿溶解鬼臼毒素粗品，再流过装有硅胶的减压层析柱；用醇类或酮类与氯仿的混合液进行洗脱，收集部分洗脱液，减压浓缩至干，得白色提取物，即鬼臼毒素精品。
2.如权利要求1所述的一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺，其特征在于所用减压层析柱内径为3～15cm，层析柱层径高比为1∶3～10，负压为0.01～0.2Mpa。
3.如权利要求1所述的一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺，其特征在于，洗脱液所用的醇类为甲醇、乙醇；酮类为丙酮，其与氯仿的体积比为1～4∶10。
4.如权利要求1所述的一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺，其特征在于，收集部分洗脱液为在292nm波长下有吸收的部分。
5.如权利要求1或2所述的一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺，其特征在于，减压层析柱所用填料为柱层析用硅胶，粒度为200～300目。
6.如权利要求1或2所述的一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的改进工艺，其特征在于，所述的硅胶重复利用4次后要进行再生；再生的过程为依次用正己烷浸泡，晾干，再用甲醇浸泡，晾干，最后烘干。
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