CN1578627A - 组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

符合普通营养要求的宠物饮食，并进一步含有抑制所述宠物在其老年智力衰退发作足够量的某种抗氧剂或其混合物。

Description

组合物和方法
发明背景
宠物如狗和猫面临衰老的问题。这在俗语中也有一定的体现。其中之一是“老狗学不会新花样”。该俗语得自如下的观察：随着狗的衰老，它们的智力和体力同样降低。与学习和记忆有关的智力活动似乎降低(Cummings BJ，Head E，Ruehl W，Milgram NW，Cotman CW 1996：犬作为衰老和痴呆的动物模型：Neurobiology of aging 17：259-268)。此外，在老龄动物中可以显现与智力改变有关的行为变化。引起此类能力降低的原因很多。
这些能力丧失一般会在衰老的犬和猫科动物中观察到。7岁或7岁以上的狗及猫被认为是衰老的并可能出现此问题。
在成年宠物的饮食中显著水平的至少一种抗氧剂的存在或者在宠物的饮食之外给与，可以抑制衰老宠物智力衰退的发作和/或将成年宠物的智力水平维持到老年期。
发明概述
按照本发明，提供了一种符合成年宠物一般营养要求的宠物饮食，且其中进一步含有抑制所述宠物老龄期智力衰退初起有效量的一种抗氧剂或其混合物。
本发明的另一方面是抑制老龄化宠物智力衰退发作的方法，该方法包括给老年宠物喂食水平足以完成此抑制的一种抗氧剂或其混合物。
本发明还提供了符合成年宠物一般营养要求的成年宠物饮食，其中进一步含有选自如下的抗氧剂：维生素E、维生素C、α-硫辛酸、1-肉毒碱及其任何混合物，其含量足以抑制所述宠物在其老年期的智力衰退。
本发明的另一方面是提高年老宠物智力的方法，其中包括给成年宠物喂食用量足以提高智力的抗氧剂或其混合物。
本发明的另一方面是增加成年宠物智力的方法，其中包括给该宠物喂食用量足以增加所述宠物智力的抗氧剂或其混合物。
在所有这些方法中，需要将该抗氧剂或其混合物加入到该动物的饮食中进食。
发明详述
给成年宠物如犬和猫喂食的饮食是喂给该年龄的动物的标准正常饮食。下面是1至6岁的犬的典型食物。
表1
组分    含量
蛋白质(％干重)     23
硫辛酸(％干重)     15
磷(％干重)     0.6
钠盐(％干重)     0.3
向成年宠物食物中加入有效量的抗氧剂或其混合物可以延迟老年宠物中行为的显著变化，特别是智力的衰退的发作，特别如解决问题的能力所示。术语成年一般指至少1至6岁的犬和至少1至6岁的猫。老年化狗或猫7岁或7岁以上。
对犬和猫智力的丧失已观察了数年。此种智力丧失以若干途径显示。例如，对于犬，可以显示为失去方向感、室内便溺、睡眠-清醒方式改变、与人及其它宠物交往减少或改变、以及学习能力丧失和无法集中注意力。这些情况也可表现在猫中。在犬和猫中没有发现如人所患有的早老性痴呆。
对于此类智力丧失，出现了很多理论。迄今，本发明人没有发现抑制此类智力丧失或者可以确实带来如在狗和猫中通过目标参数检测的智力良性变化的任何饮食作用途径。
本发明人在延迟此类衰退的发作方面获得了成功。通过使用其发明的饮食，在成年宠物中，可以表明年老宠物的智力可以维持较长的时间。智力的这种衰退基本上可以停止或延迟。记忆及学习能力可以得以改善。整体智力水平得以提高。与年老相关的认知能力下降可以减缓。对于认知障碍综合征，在年老的狗中其进展可被减缓，且与该综合征有关的临床症状可得到控制。需要预防和需要这些组分的宠物是目的组。
饮食中完成此作用的组分是某种抗氧剂或其混合物。抗氧剂是能减少自由基的物质。此类物质的实例包括食物如银杏叶、柑橘果肉、葡萄酱、番茄酱、胡萝卜和菠菜，所有这些优选干燥的，以及其它物质如β-胡萝卜素、硒、辅酶Q10(泛醌)、叶黄素、生育三烯酚类、大豆异黄酮、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰基半胱氨酸、维生素E、维生素C、α-硫辛酸、l-肉毒碱等。维生素E可以以生育酚或生育酚混合物以及其多种衍生物如酯的形式使用，如维生素E醋酸酯、琥珀酸酯、棕榈酸酯等。优选α形式，但是可以包括β、γ、δ形式。优选d型，但是外消旋混合物是可以接受的。宠物摄入后，这些形式和衍生物将发挥维生素E样活性。可以在此饮食中以抗坏血酸及其衍生物的形式使用维生素C，衍生物如磷酸钙盐、胆固醇基盐、2-单硫酸盐等，在宠物摄入后，它们将发挥维生素C样活性。它们可以是任何形式，如液体、半固体、固体和热稳定形式。α-硫辛酸可以以α硫辛酸或美国专利5621117中的硫辛酸衍生物、其外消旋混合物、盐、酯或酰氨的形式使用于食物中。在饮食中可以使用L-肉毒碱，可以使用肉毒碱的多种衍生物如盐酸盐、富马酸盐和琥珀酸盐，以及乙酰化的肉毒碱等。
在饮食中的用量，都以该饮食的重量百分数(基于干重)表示，以活性物质计算，特别是以游离物质计算。最大用量不会带来毒性。可以使用至少约100ppm或至少约150ppm的维生素E。可以使用的优选范围是约500至约1000ppm。虽然不是必需的，但是最大值一般不超过约2000ppm或约1500ppm。对于维生素C，使用至少约50ppm，优选至少约75ppm，并更优选至少约100ppm。可以使用无毒的最大量。α脂酸的量可以为至少约25，优选约50ppm，更优选约100ppm。最大量可以为约100ppm至600ppm或者对宠物无毒的量。优选的范围为约100ppm至约200ppm。对于L-肉毒碱对犬来说约50ppm，优选约200ppm，更优选约300ppm是有用的最小值。对于猫，L-肉毒碱可以使用的最小值稍高，如约100ppm、200ppm、及500ppm。可以使用无毒的最大量，例如，小于约5000ppm。对于犬，可以使用较低量，例如，小于约5000ppm。对于犬优选范围是约200至约400ppm。对映猫优选范围是约400ppm至约600ppm。
可以使用约1-15ppm的β-胡萝卜素。
可以使用约0.1至约5ppm的硒。
可以使用至少约5ppm的叶黄素。
可以使用至少约25ppm的生育三烯酚类。
可以使用至少约25ppm的辅酶Q10。
可以使用至少约50ppm的S-腺苷甲硫氨酸。
可以使用至少约1000ppm的牛磺酸。
可以使用至少约25ppm的大豆异黄酮。
可以使用至少约50ppm的N-乙酰基半胱氨酸。
可以使用至少约50ppm的半胱氨酸。
可以使用至少约50ppm的银杏叶提取物。
下列是具有高ORAC(氧自由基吸收能力)的原料。当以1％的含量(对于ORAC低的组分如玉米总含量代之以5％)加入时，它们增加了整个饮食的ORAC，并增加了食用含这些组分食物的动物的血浆ORAC值。如果以1％的量并与其它四种1％组分联合共占5％，加入到饮食中，优选可以使用ORAC值大于25umol的每克干重Trolox当量的任何组分。
菠菜酱
番茄酱
柑橘果肉
葡萄酱
胡萝卜颗粒
花茎甘蓝
绿茶
银杏叶
玉米麸质粉
实施例1
将2至4岁的17只成年小猎兔犬随机分为对照组或富集食物组(对照n＝8，抗氧剂富集组n＝9)。对照组食物含有59ppm维生素E和小于32ppm的维生素C。被测食物含有900ppm维生素E和121ppm维生素C、260ppm的L-肉毒碱和135ppm的α脂酸。开始此种饮食约1个月后，给狗安排的第一个解决问题的任务是标记识别学习任务，这是空间注意力试验(Milgram等，1999，Milgram，N.W.，Adams，B.，Callahan，H.，Head，E.，Mackay，B.，Thirlwell，C.，&Cotman(1999)，C.W.，狗对标记的识别学习，Learning & Memory，6：54-61)。
标记识别学习要求对象根据近似的目标选择特定的目标。但是，最初的学习是基于狗学习目标识别任务的能力。我们首先发现年龄对识别学习的作用依赖于任务的难易程度。
当学习标记0试验时，较食用对照食物的成年狗，食用富集食物的成年狗犯更少的错误(对照组平均＝31.1，富集组平均＝15.1)。成年狗进行标记1和2试验，其中该标记被移动得距正确的孔更远。食用富集食物的成年狗比食用对照食物的学习标记0-2犯的错误少(标记0+1+2对照组平均错误数＝132.9；标记0+1+2食用富集食物的狗平均错误数＝87.1)。
实施例2
将30只随机来源的成年狗用于此研究。这些狗至少10个月大，没有怀孕、没有授乳且在试验开始前体重合理。将动物随机粉为5组进行饮食试验，每组3只雄性和3只雌性。
在喂养期前2周内，所有的狗喂食对照食物(0ppm dl-α-脂酸)，该食物符合或超出由美国饲料控制职员协会(AAFCO2000)推荐的所有营养标准(表1)。此喂养前期后，将它们随机分为5个试验组，其中dl-α-脂酸目标含量(基于干重)分别如下：0ppm、150ppm、1500ppm、3000ppm、4500ppm。在所有饮食中，对照和α脂酸组在都加入维生素E，含量600-1000国际单位，并以100-200ppm的含量加入维生素C。
除了水以外，被测食物是营养的唯一来源。随意提供新鲜水。选择狗并称量了起始体重后，基于食物预计的ME为每只狗计算食物量。起始食物量计算基于狗的维持能量需求(MER)，并用考虑正常活动的因素修正，由下式计算：
MER(kcal/天)＝1.6×RER(静止能量需求)
其中：RER(kcal/天)＝70×体重(kg)0.75
每周给狗称重并按照需要调整食物量以便给与足以维持它们的最佳体重的食物。最佳体重以3比5的比例确定。如果一只狗在调整食物量后不能维持在体重降低在起始体重的约10％以内，则从该研究中将其排出。记录体重或食物摄入的所有检测值。
将样本磨碎并用5.0ml磷酸盐缓冲液(10mM磷酸氢二钠、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.9％氯化钠，pH 7.4)4两次提取0.100±0.001g样本。将250μL的提取物加入到带有特氟龙帽的5ml玻璃离心管中。加入15μL EDTA溶液(100mM EDTA、用约1M氢氧化钠调节pH至7.8)和50μL新制备的5mM二硫赤藓糖醇(DTE)。搅动溶液并在室温下孵育5分钟。然后加入10μL的1M磷酸和2.0mL的乙醚。室温下盖上试管，摇动，并以1500xg离心3分钟。将醚层转移至另一个5mL玻璃离心管中，同时用1.5mL乙醚再将水层萃取两次。将该样本的所有萃取物合并。然后在室温下水浴中的氮气蒸发器中干燥提取物。此时，将样本盖上盖并冷冻。
然后，将干燥的提取物解冻并用70μL SDS/EDTA溶液(0.11％十二烷基硫酸钠(SDS)、15mM EDTA、0.9％氯化钠)和5μL新制备的1mM DTE再溶解。然后，向各试管中加入新制备的硼氢化钠50μL。摇动试管并在室温下孵育10分钟。10分钟后，将样本在-70℃下冷冻。该溶液解冻前，加入20μL 2M HCl。将溶液解冻后，加入800μL 100mM碳酸氢铵。摇动溶液并加入5μL的100mM Momobromobimane的乙腈溶液(mBBr)。然后，将溶液在暗处室温下孵育90分钟。
孵育后用1.5ml二氯甲烷提取，从样品中除去过量的mBBr和DTE衍生物。将水层置于HPLC。用30％乙腈、1％乙酸、用约2M氢氧化铵调节至pH3.95的流动相并每次上样以流速1.0mL/min用无梯度洗脱液洗脱15分钟分离脂酸。此制备假设挤出食物的密度为1g/ml。
无菌采集血样以进行完全血细胞计数，在开始前2周并在该研究的第0、28、56、84、112、140和168天进行血液生化分析。此外，在食物干预的第0、28和84天采集15mL全血以分离淋巴细胞。
将肝素抗凝的全血加入到50ml Accuspin圆锥形离心管(SigmaChemical)中分层并加入等量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。以700g将样本离心30分钟，不刹车。收集单核细胞层，转移至15ml圆锥形离心管中，再悬浮于1-3ml的PB中，并如以前那样离心(第一次洗涤)。如第一次洗涤所述进行第二次洗涤。最后，收集细胞并悬浮于过氯酸(10％w/v)中，并在-70℃下冷冻直到分析。
将样本从-70℃冷冻箱中转移至干冰冷藏箱中。在低温离心机中以12000rpm离心5分钟。将1等份谷胱甘肽(GSH)分析用上清液转移至圆锥形试管中。
用由Jones(Jones等)改良的Reed及其同事(Fariss等)的方法将酸溶性提取物的衍生化。
简言之，将150μl提取物或内标物加入到1.5ml微量离心管，接着加入20μl的γ-glu-glu内标物和50μl IAA，接着混合。用氢氧化钾-碳酸氢钾工作液调溶液pH为约10(紫色)。室温下在暗处将溶液孵育1小时。加入与总体积相同的Sanger氏试剂，并将溶液在暗处孵育过夜(20小时)。
孵育后，以12000rpm将溶液离心5分钟，将上清液转移至另一个1.5ml微量离心管中。将200μl上清液加入到琥珀自动瓶中，其带有一个300μl入口，顶部用折皱器固定以进行HPLC分析。
溶剂和分离条件如上所述(Fariss，Jones)。相对于可靠标准定量测定GSH和GSSG水平。用γ-glu-glu作为内标物评价衍生化效率。
通过Windows SAS软件成对t检验分析临床化学、血液学和体重对基线值的数值比较，其显著性差异P＜0.05。每个检测时间点的平均值通过单侧ANOVA分析，显著性差异P＜0.05。组别间第84天和基线值之间GSH∶GSSG的差异用Windows SAS软件以单侧ANVOA分析，显著性P＜0.05。
结果
在7个连续检测(0、28、56、84、112、140、168天)所得的食物中的脂酸(ppm)浓度在预计的检测灵敏度内，而产生参数一般与我们的仪器相符(表1)。
食物摄入数据不值得注意。平均而言，在所有组别中大多数动物在第6个月比试验开始时摄入更多的食物。除了在4500ppm浓度组中起初发生的一些体重减少(但是6个月时该变化似乎逆转)，体重数据不直到注意。
常规体检没有发现与营养有关异常或dl-α-硫辛酸毒性的任何证据。在该试验群体中所有动物在整个研究过程中保持正常。在该研究过程中观察到若干动物偶尔呕吐；但是，没有观察到得出此种呕吐可能归因于脂酸的推论的倾向。在含量最高的组别中，在试验第21天被排除，原因是体重减轻和白细胞增多。此动物中的白细胞增多直到试验结束时也没有解决，怀疑是由于一些其它疾病引起的。
对于同一组狗，当第28、56、84、112、140和168天的血清生化数值与起始数值比较时，一些统计学差异值得注意，但是，这些都不能被看作具有生物学显著性，因为这些数值都在试验室参考范围内或非常接近，并注意到几个月内一致性倾向。每个时间段中对照组与其它处理组之间的比较，也揭示出若干统计学差异；但是，这些都不能被看作具有生物学显著性，因为这些数值都在试验室参考范围内或非常接近，并且不存在任何倾向。
对于同一组狗，当第28、56、84、112、140和168天的血液学数值与起始数值比较时，一些统计学差异值得注意，但是，这些都不能被看作具有生物学显著性，因为这些数值都在试验室参考范围内或非常接近，并注意到几个月内一致性倾向。每个时间段中对照组与其它处理组之间的比较，也揭示出若干统计学差异；但是，这些都不能被看作具有生物学显著性，因为这些数值都在试验室参考范围内或非常接近，并且不存在任何倾向。
GSH∶GSSG比
在饲养84天内GSH∶GSSG比的变化表现出饮食的显著整体作用(P＝.024)，其中所有强化食物组该比例升高(表2)。ANOVA表明含量最低和最高组与基础食物组相比表现出显著差异，但是在最低含量水平中数量增加最大。就是说，最高含量和最低含量组中GSH∶GSSG比的变化与同样时间段在基础食物中观察到的变化显著不同。在第84天无法检测4个点(1个对照组，3个处理组)的比例，因为在这些样本中检测不倒GSSG。照此，强化组可能显示出更高的GSH∶GSSG比，如果该检测灵敏度足以检测出在第84天的低水平GSSG。
表1
含量(ppm) 平均 标准偏差 目标物百分含量
 0  24  17  NA
 150  151  13  101
 1500  1471  113  98
 3000  2869  250  96
 4500  4176  642  93
表2
食用挤出饲料中dl-α-硫辛酸的狗第0至84天GSH∶GSSG平均比例的变化
含量(ppm) 与基础食物相比第0至84天GSH∶GSSG比的差异  N P值
 0  -9.2±26  5* NA
 150  70±20  6 .003
 1500  24±7  6 .16
 3000  10±4  4* .46
 4500  50±36  4* .03
*对照中和4500ppm组中的1只狗在第84天没有检测到GSSG，而在3000ppm组中2只狗在第84天没有检测到GSSG。
对于α硫辛酸进行了进一步的观察。在饮食中长期进食α硫辛酸是安全有效的。它改善了降低的谷胱甘肽(GSH)与氧化谷胱甘肽(GSSG)比。在饮食中α硫辛酸的长期进食的时间可以持续最少1、2、3、4、5或6个月至1、2、3、4、5年，甚至动物的终生。在饮食中硫辛酸不用进行任何特别保护如包封就可发挥作用，且不必以药物中使用的单位剂型形式存在于饮食中，例如，片剂、丸剂、胶囊等。硫辛酸在饮食中最小浓度约为25、50、75或100ppm。最大范围只要低于其毒性水平即可，自始至终低于约400、300或200ppm。一般来说，每天不超过约6或7mg/kg动物体重，优选不超过约5。α硫辛酸改善了抗氧剂防御功能，并改善了动物抗氧化损伤的能力。适量的其它抗氧剂如维生素E和维生素C的同时存在也能达到所有这些效果。这表明α硫辛酸的作用超出了维生素C和/或维生素E。

Claims (29)

1.符合成年宠物普通营养要求的宠物饮食，其中进一步含有抑制所述宠物老年智力衰退初起足够量的某种抗氧剂或其混合物。
2.权利要求1所述的饮食，其中所述宠物是犬。
3.权利要求2所述的饮食，其中所述犬1至6岁。
4.权利要求1所述的饮食，其中所述宠物是猫。
5.权利要求4所述的饮食，其中所述猫1至6岁。
6.权利要求1所述的饮食，其中在所述饮食中存在至少约100ppm的维生素E。
7.权利要求6所述的饮食，其中选自维生素C、l-肉毒碱、α-硫辛酸或其混合物的抗氧剂存在于该饮食中。
8.权利要求1所述的饮食，其中选自维生素C、l-肉毒碱、α-硫辛酸或其混合物的抗氧剂存在于该饮食中。
9.权利要求8所述的饮食，其中在所述饮食中存在至少约50ppm的维生素C。
10.权利要求8所述的饮食，其中在所述饮食中存在至少约25ppm的α-硫辛酸。
11.权利要求8所述的饮食，其中在所述饮食中存在至少约50ppm的l-肉毒碱。
12.抑制老年宠物智力衰退发作的方法，其中包括给所述宠物在其成年使用达到此种抑制足够量的某种抗氧剂或其混合物。
13.权利要求12所述的方法，其中所述宠物是犬。
14.权利要求13所述的方法，其中所述犬1至6岁。
15.权利要求12所述的方法，其中所述宠物是猫。
16.权利要求15所述的方法，其中所述猫1至6岁。
17.权利要求12所述的方法，其中给该宠物喂食至少约100ppm的维生素E，维生素E含量通过检测饮食测定。
18.权利要求17所述的方法，其中给该宠物喂食选自维生素C、l-肉毒碱、α-硫辛酸或其混合物的抗氧剂。
19.权利要求12所述的方法，其中给该宠物喂食选自维生素C、l-肉毒碱、α-硫辛酸或其混合物的抗氧剂。
20.权利要求19所述的方法，其中存在至少约50ppm的维生素C存在于所述饮食中。
21.权利要求19所述的方法，其中至少约25ppm的α-硫辛酸存在于所述饮食中。
22.权利要求19所述的方法，其中至少约50ppm的l-肉毒碱存在于所述饮食中
23.符合成年宠物普通营养要求的宠物饮食，其中在该饮食中进一步含有至少约100ppm的维生素E、至少约50ppm的维生素C、至少约25ppm的α-硫辛酸和至少约50ppm的l-肉毒碱。
24.权利要求23所述的饮食，其中所述成年宠物是1至6岁的犬。
25.权利要求23所述的饮食，其中所述成年宠物是1至6岁的猫。
26.提高成年宠物智力的方法，其中包括给所述宠物喂食足以提高所述宠物智力量的抗氧剂或其混合物。
27.符合成年宠物普通营养要求的宠物饮食，其中进一步含有足以提高所述宠物智力的抗氧剂或其混合物。
28.改善宠物老年期抗氧化损伤能力的方法，其中包括给所述宠物在其成年期喂食符合营养要求的饮食，所述饮食含有至少约25ppm的硫辛酸，且所述饮食喂食至少一个月。
29.改善宠物老年期抗氧化损伤能力的方法，其中包括给所述宠物在其老年期喂食符合营养要求的饮食，所述饮食含有至少约25ppm的硫辛酸，且所述饮食喂食至少一个月。
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