CN106138037A - 一种抗生物细胞氧化损伤的组合物及其应用 - Google Patents

一种抗生物细胞氧化损伤的组合物及其应用 Download PDF

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汪善锋
李凌云
史俊
徐超
席刚俊
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Abstract

本发明公开了一种抗生物细胞氧化损伤的组合物及其应用。所述的组合物包括维生素C、维生素E和R‑(+)‑硫辛酸，所述维生素C、维生素E和R‑(+)‑硫辛酸的质量比为1：1～3：1～12。本发明还提供了所述的组合物在非治疗目的的抗生物细胞自由基氧化损伤中的应用。本发明提供了一种抗生物细胞氧化损伤的组合物，维生素E、维生素C和R‑(+)‑硫辛酸协同作用，提高抗氧化效果，可用于非治疗目的的抗生物细胞自由基氧化损伤中，具体的，该组合物对猪骨骼肌卫星细胞具有抗氧化保护效应，能够减少猪骨骼肌卫星细胞的氧化应激。

Description

一种抗生物细胞氧化损伤的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗氧化损伤合剂，尤其涉及一种抗生物细胞自由基氧化损伤的组合物及其应用。
背景技术
动物机体在正常的生理状态下，氧自由基不断产生，同时也在不断地被清除，因此，动物体内氧自由基一直维持在一个较低的水平，不会对机体产生不利影响。但是许多外源性或内源性刺激均可使体内氧化还原的平衡状态被打破而趋向氧化，氧自由基的生成量大幅度增加，显现出对机体极大的损害作用。氧化应激常常会带来畜禽生产性能下降，动物产品品质下降，甚至发生动物疾病等诸多问题。抗氧化剂被广泛应用于畜牧生产中。
骨骼肌卫星细胞是一种肌源性干细胞，当其被激活后，可以通过增殖、分化为成熟肌细胞并融合进入邻近的肌纤维，从而影响肌纤维的发育。所以卫星细胞与肉品质密切相关。越来越多的研究直接用培养的骨骼肌卫星细胞作为实验对象，为进一步阐述骨骼肌纤维形成、转化机制及其能量代谢规律奠定基础。利用H2O2诱导细胞氧化应激，并加入抗氧化剂研究其作用机制也成为动物科学研究的一种重要方法。
目前抗生物细胞氧化损伤的抗氧化剂，多达数十种。大部分抗氧化剂的作用都有相似之处，这些抗氧化剂都能提供电子中和有害的自由基。但是，由于分子结构的差别，不同的抗氧化剂在细胞中的分布不同，因此，它们的抗氧化作用就存在很大的差别。因此，有必要提供一种抗氧化剂，提高抗氧化效果。
发明内容
发明目的：针对现有技术中的问题，本发明提供了一种抗生物细胞氧化损伤的组合物，用于提高生物细胞对自由基的抵抗能力和清除能力；本发明的另一个目的是提供所述组合物在非治疗目的的抗生物细胞自由基氧化损伤中的应用。
技术方案：本发明所述的抗生物细胞氧化损伤的组合物，包括维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸，所述维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸的质量比为1：1～3：1～12。
硫辛酸(LA)容易吸收，给药后可通过胃、小肠和结肠多处吸收；结构中含有羧基使它既能溶于水相又能溶于脂质中，使它能进入细胞的所有部分去中和自由基；在体内LA和二氢硫辛酸(DHLA)可相互补充、相互协调，发挥高效的抗氧化作用；LA可与VC、VE组成一个机体内的抗氧化循环，协同发挥抗氧化作用。
优选的，所述维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸的质量比为1：2：1～12，具有更好的抗生物细胞自由基氧化损伤作用。进一步优选的，所述维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸的质量比为1：2：6～8。
本发明还提供了所述组合物在非治疗目的的抗生物细胞自由基氧化损伤中的应用。
所述的应用包括：在体外培养的生物细胞中添加所述的组合物至其终浓度为150～300mg/L，优选为200mg/L。
本发明中，上述的生物细胞具体可以为猪骨骼肌卫星细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种抗生物细胞氧化损伤的组合物，维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸协同作用，提高抗氧化效果，可用于非治疗目的的抗生物细胞自由基氧化损伤中，具体的，该组合物对猪骨骼肌卫星细胞具有抗氧化保护效应，能够减少猪骨骼肌卫星细胞的氧化应激。
附图说明
图1为不同抗氧化剂对猪骨骼肌卫星细胞存活率的影响；
图2为不同抗氧化剂对猪骨骼肌卫星细胞MDA的影响；
图3为不同抗氧化剂对猪骨骼肌卫星细胞SOD的影响；
图4为不同抗氧化剂对猪骨骼肌卫星细胞GSH-Px的影响；
其中，注：#:与其他抗氧化剂组相比，P＜0.05；*:与氧化应激组相比，P＜0.05。**:与氧化应激组相比，P＜0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一种抗氧化损伤合剂(即抗生物细胞氧化损伤的组合物)，按重量份数包括以下组分：维生素C 3份、维生素E 6份、R-(+)-硫辛酸20份。将上述合剂按照200mg/L加入进行体外传代培养至第2-3代新生猪骨骼肌卫星细胞培养液中。
实施例2
一种抗氧化损伤合剂，按重量份数包括以下组分：维生素C 4份、维生素E8份、R-(+)-硫辛酸24份。将上述合剂按照200mg/L加入进行体外传代培养至第2-3代新生猪骨骼肌卫星细胞培养液中。
实施例3
一种抗氧化损伤合剂，按重量份数包括以下组分：维生素C 2份、维生素E 4份、R-(+)-硫辛酸16份。将上述合剂按照200mg/L加入进行体外传代培养至第2-3代新生猪骨骼肌卫星细胞培养液中。
实施例4
一种抗氧化损伤合剂，按重量份数包括以下组分：维生素C 2份、维生素E 4份、R-(+)-硫辛酸2份。
实施例5
一种抗氧化损伤合剂，按重量份数包括以下组分：维生素C 2份、维生素E 4份、R-(+)-硫辛酸24份。
对比例1
一种抗氧化损伤合剂，按重量份数包括以下组分：维生素C 2份、维生素E 4份、R-(+)-硫辛酸1份。
对比例2
一种抗氧化损伤合剂，按重量份数包括以下组分：维生素C 2份、维生素E 4份、R-(+)-硫辛酸32份。
实施例6抗氧化合剂对猪骨骼肌卫星细胞的抗氧化效果
一、猪骨骼肌卫星细胞氧化应激模型的建立
1、H2O2对猪骨骼肌卫星细胞的存活率的影响
96孔板用0.1％明胶包被后，以1×106个细胞/mL分别接种第3代的骨骼肌卫星细胞(SC)，37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞80％贴壁后，分别向培养板中滴加相应浓度的H2O2，培养6h、12h、24h，测定细胞数量，计算存活率。其中，0μmoL/L组为对照组。以细胞存活率为主要指标初步筛选H2O2作用时间和作用浓度。
SC的存活率影响结果如表1所示。
从表1可知，H2O2浓度越高，导致猪骨骼肌卫星细胞的应激程度越重。随着处理浓度的升高和处理时间的延长，各处理细胞存活率显著降低。使用200μmoL/L和400μmoL/L的H2O2处理12h后，SC存活率显著降低，出现明显拐点，可作为应激模型处理浓度。
表1 H2O2对猪骨骼肌卫星细胞的存活率影响
备注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。
2、氧化应激指标的筛选
采用筛选得出适宜H2O2浓度和作用时间12h，收集细胞和培养液测定抗氧化指标，进一步筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H2O2浓度及可作为反映氧化应激的敏感指标。其中，0μmoL/L组为对照组。
H2O2对猪骨骼肌卫星细胞抗氧化状态的影响如表2所示。
表2 H2O2对猪骨骼肌卫星细胞抗氧化状态的影响
备注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。
从表2可以看出，随H2O2浓度升高，丙二醛(MDA)和ROS产生量显著升高(p<0.01)，超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性极显著降低(p<0.01)，过氧化氢酶(CAT)活性显著降低(p<0.05)。
以上说明H2O2浓度为200μmoL/L、400μmoL/L处理12h能使猪骨骼肌SC产生一定的氧化应激。SOD，GSH-Px，CAT活性(含量)和MDA、ROS产生量可作为反映氧化应激的敏感指标。
二、本发明抗氧化合剂的抗氧化效果
96孔板用0.1％明胶包被后，以1×106个细胞/mL分别接种第3代的猪骨骼肌卫星细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞80％贴壁后，根据细胞是否接受H2O2氧化应激和抗氧化剂干预，将培养的细胞随机分为15组。空白对照组；氧化应激组(400μmoL/L H2O2处理，不加抗氧化剂)；抗氧化剂+H2O2组(分别加入VC、VE、R-(+)硫辛酸、VC+VE(质量比例1:2)、VC+R-(+)硫辛酸(质量比例1:6)、VE+R-(+)硫辛酸(质量比例1:4)、以及实施例1、实施例2、实施例3氧化合剂、VC+VE+R-(+)硫辛酸(质量比例1:2:0.5)、VC+VE+R-(+)硫辛酸(质量比例1:2:1)、VC+VE+R-(+)硫辛酸(质量比例1:2:12)VC+VE+R-(+)硫辛酸(质量比例1:2:16))200mg/L作用2h，再加入终浓度为400μmoL/L H2O2作用12h)。分别测定猪骨骼卫星细胞的存活率，以及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性(含量)。
抗氧化合剂对氧化损伤猪骨骼肌卫星细胞细胞存活率的影响如图1所示。
H2O2能够促进自由基的生成，引发生物膜的脂质过氧化反应，从而导致细胞的损伤、坏死和凋亡。如图1所示，与对照组比较，氧化组的细胞存活率明显降低(P＜0.05)，经VE、R-(+)硫辛酸、VC+VE、VC+R-(+)硫辛酸、VE+R-(+)硫辛酸保护后的猪骨骼肌卫星细胞存活率显著增加(P＜0.05)，而实施例1、2、3抗氧化合剂及VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:1)和VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:12)保护后细胞存活率极显著提高(P＜0.01)，其中，VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:1)和VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:12)、实施例1、2、3抗氧化合剂与其他实验组相比差异显著。且实施例1、2、3抗氧化合剂存活率达到对照组水平。VC、VE和R-(+)硫辛酸三种抗氧化剂的组合，在培养的猪骨骼肌卫星细胞中发生了协同效应，发挥了高效的抗氧化作用。
抗氧化合剂对猪骨骼肌卫星细胞脂质过氧化、抗氧化酶活性影响如图2、图3、图4所示。
如图2所示，H2O2处理显著提高细胞MDA含量经R-(+)硫辛酸、VC+VE、VC+R-(+)硫辛酸、VE+R-(+)硫辛酸保护后的猪骨骼肌卫星细胞培养液MDA含量显著降低(P＜0.05)，而实施例1、2、3抗氧化合剂及VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:1)和VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:12)保护后MDA含量极显著降低(P＜0.01)，其中，实施例1、2、3抗氧化合剂与其他抗氧化剂组相比差异显著(P＜0.05)。
如图3和图4所示，与氧化应激组相比，经R-(+)硫辛酸、VC+VE、VC+R-(+)硫辛酸、VE+R-(+)硫辛酸保护后的猪骨骼肌卫星细胞培养液抗氧化酶SOD与GSHPx活性显著升高(P＜0.05)，而实施例1、2、3抗氧化合剂及VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:1)和VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:12)保护后抗氧化酶SOD与GSHPx活性极显著升高(P＜0.01)，其中，实施例1、2、3抗氧化合剂与其他抗氧化剂组相比差异显著(P＜0.05)，VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:1)和VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:12)相比于VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:0.5)和VC+VE+R-(+)硫辛酸(1:2:16)有显著提高(P＜0.05)。VC、VE和R-(+)硫辛酸三种抗氧化剂的组合，在培养的猪骨骼肌卫星细胞中发生了协同效应，发挥了高效的抗氧化作用。

Claims (7)

1.一种抗生物细胞氧化损伤的组合物，其特征在于，包括维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸，所述维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸的质量比为1：1～3：1～12。
2.根据权利要求1所述的抗生物细胞氧化损伤的组合物，其特征在于，所述维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸的质量比为1：2：1～12。
3.根据权利要求2所述的抗生物细胞氧化损伤的组合物，其特征在于，所述维生素C、维生素E和R-(+)-硫辛酸的质量比为1：2：6～8。
4.根据权利要求1所述的抗生物细胞氧化损伤的组合物，其特征在于，所述的生物细胞具体可以为猪骨骼肌卫星细胞。
5.根据权利要求1～4任一项所述的组合物在非治疗目的的抗生物细胞自由基氧化损伤中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：在体外培养的生物细胞中添加所述的组合物至其终浓度为150～300mg/L。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的生物细胞为猪骨骼肌卫星细胞。
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