CN1566956A - 微生物高效中和抗原的筛选和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

涉及一种筛选和鉴定微生物高效中和抗原蛋白的方法，利用2－D技术使细菌或病毒蛋白质展示在一个平面上，再采用Western blotting确定具有免疫原性的蛋白质，取这些蛋白质分别免疫易感试验动物。然后进行免疫攻毒保护试验，根据保护率确定具有中和作用的免疫原，最后利用质谱技术和生物信息分析确定具有中和作用的蛋白质。其可迅速确定具有中和保护作用的免疫原，达到高效、快速、经济、实用的优选保护性免疫原的目的。一方面可以确定具有中和保护原性的位点，另一方面避免了基因克隆的盲目性，为基因克隆奠定了扎实基础，提高了制备高效疫苗靶点的效率。

Description

微生物高效中和抗原的筛选和鉴定方法

(1)技术领域

本发明涉及一种筛选和鉴定微生物高效中和抗原蛋白的方法。

(2)背景技术

人类和动物的传染病是由微生物所引起，可以通过免疫接种来预防。目前，预防用疫苗的发展趋势是增强免疫效果、简化接种程序、提高预防接种效益。研制疫苗必须获得具有免疫保护作用的高效中和蛋白。但采用常规方法从全部微生物蛋白质中鉴定全部具有免疫中和功能的蛋白质，并比较其免疫保护效率十分困难。目前主要采用的方法包括热灭活法、福尔马林灭活法、减毒活疫苗法、用细菌生物膜制备法等，热灭活或福尔马林灭活后对有效成分进行提取、超声波制备分离有效成分，上述方法并非在对所有保护性抗原进行比较的基础上，优选出最佳中和抗原进行制备。另外，为了尽可能减少接种后的副作用，往往利用DNA重组技术制备仅含中和原性的纯化疫苗，这就需要先选定病原体编码的具有高效中和原性的基因片段。但采用常规方法从全部微生物蛋白质中鉴定免疫原性蛋白十分困难，且并非所有免疫原性蛋白均具有中和原性。蛋白质组学(proteomics)具有高通量筛选的特征，是功能基因组研究的重要平台，通过由蛋白质组学与Western blotting技术相结合而发展起来的免疫蛋白质组学(immunoproteomics)技术，已在患者血清中鉴定了白色链球菌(Candida albicans)和砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的免疫原性蛋白质。这些免疫性抗原可作为监测疾病进展的一种指标，将成为研制新疫苗的对象，有助于摆脱传统的疫苗研制的束缚，加快新疫苗的研制。由于并非所有免疫原性蛋白均具有中和原性，故采用免疫蛋白质组学技术只能从众多的微生物蛋白质中筛选出免疫原性蛋白却不能确定其是否具有中和原性。

(3)发明内容

本发明的目的旨在提供一种利用双向电泳(2-D)技术使微生物蛋白质展示在一个平面上，再确定具有免疫原性的蛋白质，最后通过免疫和攻毒保护试验，根据保护率确定具有中和作用的免疫原的快速筛选和鉴定微生物高效中和抗原蛋白的方法。

本发明所说的微生物高效中和抗原的筛选和鉴定方法的具体步骤如下：

1)2-D电泳分离微生物蛋白质：将微生物收集后，超声波破碎，加入裂解液，离心处理2次，然后进行双向电泳(2-D)。

2)Western blotting：2-D电泳后，进行免疫转印，分别采用抗目的微生物的特异性抗体和酶标抗体为第一和第二抗体。用DAB或ECL显色，阳性点即为具有免疫原性的蛋白质。

3)中和抗原及其中和能力的确定：根据Western blotting的结果，取出具有免疫原性的全部蛋白质，累积收集，每种蛋白点免疫一组易感试验动物，7-10天后，加强免疫1-2次，每次间隔7-10天，然后取50倍半数致死量的微生物进行免疫保护性攻毒试验，根据保护率确定具有中和抗原的蛋白点及其保护效果。

4)中和抗原的定性：取出具有中和原性的全部蛋白质，按质谱样品处理方法进行分析样品制备，然后进行质谱和生物信息分析，以确定抗原的蛋白质种类。

本发明先利用2-D技术使细菌或病毒蛋白质展示在一个平面上，再采用Westernblotting确定具有免疫原性的蛋白质，取这些蛋白质分别免疫易感试验动物。然后进行免疫攻毒保护试验，根据保护率确定具有中和作用的免疫原。最后利用质谱技术和生物信息分析确定具有中和作用的蛋白质。本发明可迅速确定具有中和保护作用的免疫原，达到高效、快速、经济、实用的优选保护性免疫原的目的。一方面可以确定具有中和保护原性的位点，另一方面避免了基因克隆的盲目性，为基因克隆奠定了扎实基础，提高了制备高效疫苗靶点的效率。

(4)附图说明

图1为嗜水气单胞菌细胞外膜蛋白质的2-D电泳图谱。

图2为嗜水气单胞菌膜蛋白中免疫原性蛋白的Western blotting结果。

图3为代表性(P5)肽质量指纹图谱。

图4为P2点的Q-TOF肽序列分析图。

图5为溶藻弧菌细胞外膜的2-D电泳图谱。

图6为溶藻弧菌细胞外膜的Western blotting结果图。

(5)具体实施方式

实施例1

1、细菌培养、计数、收集和破碎：实验采用的嗜水气单胞菌PPD(134/91)，由新加坡国立大学生物学系Sin YM教授惠赠。将嗜水气单胞菌接种于LB培养基，28℃摇床培养18h，作为种子菌。而后以1∶50(菌液∶培养基)比例接种于上述同种培养基，28℃摇床培养18h。培养结束后，取2mL菌液进行平板菌落计数。其余培养液于4000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次，称菌体重，再用以1∶3(重量∶体积)的比例加入超声破碎缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA)。用Virsonic 475超声细胞破碎仪(VirTis公司产品)超声破碎。

2、抗嗜水气单胞菌抗体的制备：培养18h的嗜水气单胞菌，4000rpm离心10min；用0.65％生理盐水悬浮，血球计数板计数，将菌液稀释至1×10⁸个/mL；注射小鼠，每只0.1mL，对照组注射生理盐水；每隔1周注射1次；第3周免疫后的第10天处死小鼠取血，静置；4000rpm离心10min，取出血清，分装，-20℃保存。

3、外膜蛋白的提取：超声破碎后的细菌液，2500g，4℃离心10min，收集上清。上清液100,000g，4℃离心40min。弃上清，沉淀用2％月桂酰基氨酸钠(配于50mmol/LTris-HCl，pH7.4)洗涤，室温放置20min。沉淀溶于一定体积超声缓冲液中。用Bradford法测定样品中蛋白质浓度。

4、双向凝胶电泳：双向电泳操作步骤：第一向预电泳200V 15min，300V 30min，400V 2h，上样后电压400V，18h.等电聚焦后迅速取出胶条，平衡后移至10％ SDS-PAGE胶上继续电泳，其一端外侧加上标准蛋白质，1％琼脂糖封固。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，扫描，输出照片。见图1，结果显示，比较清楚的蛋白点有54个。

5、Western-blot方法：双向电泳结束后，进行电转，恒压40V电转过夜；电转结束后，用丽春红染色检测电转的效果；洗去丽春红，加封闭液封闭，室温孵育1h；TTBS洗膜3次，每次5min；加入鼠抗嗜水气单胞菌抗体(用封闭液配制)，室温孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；加入HPO-山羊抗鼠抗体(用封闭液配制)，室温孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；50mmol/L pH7.4 Tris-HCl洗膜5min；DAB显色；终止反应，扫描，封好膜，保存。Western-blot分析，结果有8个抗原出现明显的结合反应(见图2)，分别编号为P1-8，图2A为具有免疫原性蛋白在膜蛋白2-D分子解剖图谱中的位置；图2B为Western blotting结果显示的免疫原性蛋白。

6、实验用鱼：实验鲤鱼购自集美大学水产学院养殖场，外表健康无病，平均体重约50g。每天分早晚2次按体重1％投喂人工配合饲料，并用增氧泵增氧。驯养15天，确定无异常后开始实验。实验期间控制水温为27±1℃。

7、凝胶抗原免疫实验：收集与免疫原性蛋白点对应的蛋白条带切成碎片，于少量蒸馏水中透析过夜。胶碎片反复冻融后与等体积完全佐剂(卡介苗∶羊毛脂∶石蜡油＝1∶4∶16v/v)混合，用注射器反复抽吸后，超声处理2min。将买回已饲养2星期的鲤鱼分组，每组16条。制备好的凝胶抗原腹腔注射免疫鲤鱼，10μg/尾，对照组不加免疫处理。注射3次，每次间隔10天，实验组第2次和第3次使用不完全佐剂。第3次免疫结束后的第10天取血，玻片凝集法测定免疫效价。结果以t检验进行统计学处理。

8、攻毒菌液制备：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophia)复苏后转接普通斜面培养基，28℃培养24h，用0.85％无菌生理盐水洗下菌苔。然后在显微镜下用10倍稀释法计数，推算菌悬液的活菌数。按50倍于半数致死量(LD₅₀)进行攻毒。

9、攻毒实验：每一实验组再分成2小组，每组16尾，于免疫结束后的第10天分别腹腔注射制备好的嗜水气单胞菌和温和气单胞菌活菌液，前者为1.5×10⁸个细菌/尾，后者为109个细菌/尾。对照组代之于等量生理盐水。观察其2周病死率，计算凝胶抗原的免疫保护率，结果进行卡方检验。表1为其免疫保护作用的结果。从表1可见，8种免疫原蛋白质的免疫保护作用相互间具有明显差异，其中第8号无任何保护作用，而第6号的保护作用高达71.4％。保护作用与抗体效价无明显关系。

                表1攻毒的免疫保护性试验

蛋白质号                      嗜水气单胞菌         温和气单胞菌尾数  抗体效价  死亡率(％)  保护率(％)  死亡率   保护率(％)

对照组  16    1∶2      100.0                   12.51       16    1∶128    100.0       0           100.0    02       16    1∶128    37.5        62.5*       100.0    03       16    1∶256    75.0        25.0        62.5     28.64       16    1∶128    42.9        57.1*       37.5     57.1*5       16    1∶128    62.5        37.5        57.1     34.76       16    1∶128    28.6        71.4*       25.0     71.4*7       16    1∶128    75.0        25.0        87.5     20.48       16    1∶128    100.0       0           100.0    0

^*P＜0.01

10、质谱样品的制备：用一干净解剖刀切下目的蛋白点，从无蛋白质污染区切下一块大致相同的胶块为对照，把胶块切成约1mm³大小，置于0.5ml Eppendorf中，接着按以下步骤进行：用50％ACN洗胶块以脱掉考马斯亮蓝(2-3次×15min)，弃50％ACN；100％ACN覆盖胶块至白色，弃ACN；接着用0.1mol/L NH₄HCO₃泡胀，然后反复用ACN/0.1mol/LNH₄HCO₃洗至无色，真空离心干燥。用10mmol/LDTT/0.1mol/LNH₄HCO₃于56℃还原45min后，再用新鲜配置的55mmol/L碘乙酰胺/0.1mol/L NH₄HCO₃烷基化，避光30min。重复上述步骤至脱色干净。真空离心干燥后加入Trypsin(12.5μg/mL)冰上孵育45min，吸掉多余酶液后加入无酶消化液，37℃过夜。依次用5％TFA和50％ACN/2.5％TFA反复抽提1-2次，合并上清液，真空离心干燥。点样前加1-2μl 0.1％TFA溶解样品。

11、肽质量指纹图谱的样品的分析和数据库查询：质谱样品使用德国BRUKER公司的ReFlex^TM III MALDI-TOF质谱仪进行分析，反射模式，离子源加速电压1为20kv，加速电压2为23kv，N₂激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取2000ns，真空度1.4×10^-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱(见图3)。从图中可以看出，肽质量指纹图谱信号都较强且基线平稳，适合于下一步的数据库检索鉴定。

通过Mascot( http：//www.matrixscience.com.)数据库选择NCBI，种属选择otherproteobacteria.Peptident( http：//www.expasy.org/tools/peptident.htmL)，数据库选择swiss-prot，种属选择other bacteria.用ExPASy Molecular Biology Server网站提供的Peptident软件(http：//www.expasy.org/tools/peptident.html)进行查询。查询条件：肽质量指纹图谱中的肽片段质量控制在800-3500，表观Mr的误差范围为±20％，对表观pI值未做要求，肽片段分子量最大容许误差范围为±0.5Da，每个肽允许有2个不完全裂解位点，物种来源选择细菌，离子选择[M+H]⁺和monoisotopic，最少匹配肽片段数规定为4，半胱胺酸为碘乙酰胺处理。

12、蛋白序列检测样品的处理、分析和数据库查询：质谱样品使用ESI-MS/MS Q-TOF质谱仪进行分析。挖取蛋白点切成碎块，加100μl 50mmol/l NH₄HCO₃/50％(v/v)乙氰脱色5min，去上清，重复3次，加100％乙氰使胶块缩水变白后，去上清，重复3次，抽干。加适量10mmol/lDTT/0.1mol/l NH₄HCO₃，充入N₂，56℃水浴60min，去上清，加等体积55mmol/l碘乙酰胺/0.1mol/l NH₄HCO₃，充入N₂，室温避光60min。去上清，加100μl 0.1mol/lNH₄HCO₃，5min后加等体积乙氰，5min后去上清，重复1次，抽干，加适量消化液(50mmol/l NH₄HCO₃，12.5ng/μl Trypsin)，4℃30min后吸出残余液体，加适量50mmol/l NH₄HCO₃，37℃过夜。6000rpm离心10min，取上清，加20mmol/l NH₄HCO₃，混匀，6000rpm离心10min，加10μl 5％甲酸/50％乙氰，10min，6000rpm离心10min，合并上清，抽干，加0.5％甲酸溶解。溶液经过Zip/Tip纯化和浓缩以后进行质谱分析。肽指纹图谱匹配使用PepIdent( www.expasy.org/tools/peptident.pl)。参数设置为：物种来源-细菌；Mw-表观分子量±30％；pI-不设限制；酶-胰酶；允许忽略的酶切位点-1；修饰类型-碘乙酰化。氨基酸序列结构域匹配使用Prosite Scan( www.expasy.org/tools/prosite scan.pl)。氨基酸序列同源性搜索使用Blast( www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。搜索结果如表2所示。P2点肽序列分析结果见图4，图4a为肽谱图，图4 b、c为部分序列图。

            表2嗜水气单胞菌P1-8部分OMP MALDI-TOF-MS鉴定结果

Spot	Score	Description	Species	Mw(kDa)	pI	Coverage(％)
							1	0.31	Membrane-bound lytic mureintransglycosylase A homolog	Buchneraaphidicola	41.8	9.79	37.3
2	0.25	Flagellar motor switch protein fliM	Borreliaburgdorferi	39.3	5.31	18.2
							3	0.29	Flagellar hook-associated protein 2(HAP2)	Vibrio cholerae	72.3	5.30	16.7
4	0.23	CHAIN 1：S-LAYER PROTEINSAP	Bacillusanthacis	83.8	6.05	15.4
							5	0.28	Flagellar cap protein	Treponemamaltophilum	73.8	5.60	17.1
6	0.25	CHAIN 1：OUTER MEMBRANEUSHER PROTEIN FIMD.	Salmonellatyphimurium	92.2	6.43	11.2
							7	0.20	CHAIN 1：TRANSFERRIN-BINDING PROTEIN 1	Neisseriameningitidis(serogroup B)	98.8	9.22	14.4
8	0.50	CHAIN 1：EXTRACELLULARLIPASE.	Aeromonashydrophila.	67.1	9.40	22.3

实施例2除细菌改为溶藻弧菌外，其余均与实施例1相同。结果如下：

1、溶藻弧菌细胞外膜的2-D电泳图谱

采用2-D电泳技术，对鳗弧菌的细胞外膜进行分析，结果发现约40蛋白点，见图5。

2、免疫原性蛋白确定

采用Western blotting技术，分别以鼠抗溶藻弧菌和HP-兔抗小鼠为第一和第二抗体，按试验程序进行Western blotting分析，结果有5个抗原出现明显的结合反应，分别编号为1-5。溶藻弧菌细胞外膜的Western blotting的结果见图6。

3、MALDI-TOF肽质量指纹谱分析和Q-TOF的肽序列分析

采用生物质谱对5个具有免疫原性的蛋白点进行分析，其中对点2和5进行MALDI-TOF质谱分析，点1、3和4进行Q-TOF的肽序列分析，分别得到各自的肽质量指纹图谱和Q-TOF的肽序列分析。

根据获得的肽指纹谱数据和分子量范围及其他一些参数，通过Peptident软件查询SWISS-PROT数据库中与之匹配的蛋白质，搜索结果如表3所示。

                             表3溶藻弧菌P1-5的MALDI-TOF-MS和Q-TOF鉴定结果

Spot	Score	Description	Sequence	Mw(kDa)	AC	E-value	Peptidematches
								1	35	Outer membrane proteinOmpA[V...	ATGNTATLGVSFK		NP_797143.1	0.16
2	0.4	Orotidine 5’-phosphatedecarboxylase(EC 4.1.1.23)(OMOP decarboxylase)(OMPDCase)(OMPdecase).		32241.09	Q97FS5		6
								3	41	Outer membrane proteinOmpA[V..	EFYGTGTFEFDSAK		NP_800696.1	0.002
4	38	Outer membrane proteinOmpA[V..	VSGMENPVADNSTR		NP_800696.1	0.011
								5	0.5	CHAIN 1：OUTER MEMBRANEIPOPROTEIN OMP16HOMOLOG-Rhizobium meliloti		15352	Q926C3		4

注：点1、3、4为和Q-TOF的肽序列分析，点2和5为肽质量指纹谱分析。

1、免疫攻毒试验

按免疫攻毒试验方案，对免疫后的鲤鱼进行攻毒。结果表明，点3、4具有较好的免疫保护作用，参见表4。

         表4溶藻弧菌攻毒的免疫保护性试验

蛋白质号  尾数  死亡数   死亡率(％)    保护率(％)
	对照组    15    13       86.71         15    7        46.7          46.2*2         15    1        6.7           99.2**3         15    7        46.7          46.2*4         15    7        46.7          46.2*5         15    1        6.7           99.2**

^*P＜0.05；**P＜0.01

Claims (2)

1.微生物高效中和抗原的筛选和鉴定方法，其特征在于所说的微生物高效中和抗原的筛选和鉴定方法的具体步骤如下：

1)2-D电泳分离微生物蛋白质：将微生物收集后，超声波破碎，加入裂解液，离心处理2次，然后进行双向电泳(2-D)；

2)Western blotting：2-D电泳后，进行免疫转印，分别采用抗目的微生物的特异性抗体和酶标抗体为第一和第二抗体，用DAB或ECL显色，阳性点即为具有免疫原性的蛋白质；

3)中和抗原及其中和能力的确定：根据Western blotting的结果，取出具有免疫原性的全部蛋白质，累积收集，每种蛋白点免疫一组易感试验动物，7-10天后，加强免疫1-2次，每次间隔7-10天，然后取50倍半数致死量的微生物进行免疫保护性攻毒试验，根据保护率确定具有中和抗原的蛋白点及其保护效果；

4)中和抗原的定性：取出具有中和原性的全部蛋白质，按质谱样品处理方法进行分析样品制备，然后进行质谱和生物信息分析，以确定抗原的蛋白质种类。

2.如权利要求1所述的微生物高效中和抗原的筛选和鉴定方法，其特征在于所说的微生物为病毒，细菌。

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